1
Caenorhabditis elegans
(C. elegans)
Caenorhabditis elegans je malý nematoidní organismus, v češtině označovaný Háďátko obecné, který není patogenní a žije v půdě všech kontinentů. Biologie dvacátého století postupovala poznáním mechanismů, které život umožňují na definovaných druzích. Takový blíže specifikovaný druh získal označení modelový organismus. Tento název implikuje skutečnost, že pro poznání pochodů spojených s životem určitého druhu je nutno pochopit mnoho specifických faktů týkajících se právě takového organismu a veškeré poznání, získané studiem takového organismu, má jiné úrovně výpovědní hodnoty pro tento specifický organismus, pro organismy biologicky blízké, pro organismy vzdálenější nebo dokonce velmi vzdálené. Proto všechny situace a biologické poznání odhalené studiem takového modelového systému představují poznání za určitých specifických podmínek. I když bylo vždy zřejmé, že poznání modelových situací je zatíženo tím, že poznatky platí pro námi vybraný model, umožňují na druhé straně pokrok v podobě moderní faktologické vědy a to v tom ohledu, že umožňují odkrytí vztahů, které v nedefinovaných systémech nejsou zřejmé. Sydney Brenner, biolog pracující v MRC (Medical Research Council) v Cambridge hledal v šedesátých letech organismus, který by se dobře hodil na detailní analýzu a mohl by sloužit jako versatilní modelový organismus a vybral právě Caenorhabditis elegans. Tento organismus totiž splňoval některé základní podmínky, které si Sydney Brenner položil, jako např. krátký životní cyklus, velké množství potomků, průhledné tělo a další. Vhodná volba C. elegans jako modelového organismu a skutečnost, že s rozvojem počítačové informatiky začala být data nejen uchovávána, ale také sdílena celou komunitou pracující na C. elegans, vedla k ukázkové šíři a detailnosti postupujícího biologického poznání tohoto specifického organismu. C. elegans se stala prvním mnohobuněčným organismem u něhož byla bioinformaticky poznána nejen vývojová schémata všech somatických buněk, ale také celý genom a byly předpovězeny exprimované geny. Současná kategorizace C. elegans zahrnuje : genom, ESTs, expresi, mutanty, RNA interferenci, interactome a další Práce na C. elegans přinesla množství dílčích objevů, například poznání kaskád a mechanismů řízené buněčné smrti nebo poznání nového mechanismu regulace genové exprese a epigenetické regulace genomu (RNA interference), poznání základů genetické regulace stárnutí organismu. Metody se v současné době rozšířily na celo-genomové přístupy jako například poznání hlavních funkcí všech genů, poznání regulace prvních buněčných dělení, poznání genů účastných v regulaci funkce jednotlivých organel. Síla tohoto přístupu záhy přestoupila hranice samotné C. elegans a metodické přístupy byly a nadále jsou aplikovány na další organismy rodiny Rhabditidae, Caenorhabditis romanei a Caenorhabditis briggsae, Tento přístup pak odhaluje nové spojitosti, například
2 podobnosti v regulačních sekvencích genových promotorů, zachovalé a alternativní funkční použití genů. Přirozeným pokračováním je pak současný stav komplexní biologie. Data a přístupy jaké byly právě jmenovány, se spojují s ostatními organismy (ostatními modelovými organismy a s lidskou biologií). Patří sem bakteriální a kvasinkové organismy, Dictiostelium discoideum, Drosophila melanogaster, a jiné hmyzí druhy, Ciona intestinalis, obojživelníci (Xenopus laevis a další druhy), ryby (Dario rerio), potkan, myš, pes, opičí druhy, primáti a člověk. Tyto systémy jsou také doplňovány databázemi biochemickými, funkční informatikou popisující jednotlivé geny a databázemi strukturálními. Práce na C. elegans pokračuje nejen studiem celo-genomových systémů, ale také postupujícím detailním poznáním funkce jednotlivých genů a jejich produktů. V zásadě, všechna data jsou ukládána do bio-informatického systému jehož analýzou pak vyvstávají nové otázky na které je možné odpovědět jen cíleným experimentálním přístupem. Modelový organismus C. elegans je tak nejen výborným modelovým organismem, který efektivně přispívá k rozvoji komplexní bio-informatické biologie, ale je také průkopníkem v tomto procesu. V přednášce budou uvedeny některé konkrétní příklady přínosu systému C. elegans v biologii, a to regulace apoptosy, úloha RNA interference při studiu funkce genů a při léčbě lidských onemocnění, některé příklady neuro-degenerativních onemocnění a regulace vývoje C. elegans jadernými receptory např. NHR-23 (CHR3).
Caenorhabditis elegans
C. elegans patří mezi nematoda (hlístice). Hlístice se dělí na dvě třídy a to , kam patří živočichové, kteří žijí převážně v půdě a , sem patří živočichové, kteří žijí ve vodě. Třída Secernentea se dělí do 7. řádů z nich téměř všechny obsahují parazity a to jak rostlin, tak hmyzu nebo obratlovců, např. Strongylida (Ascaris lumbricoides) nebo Oxyurida (Enterobius vermicularis). Jediný řád Rhabditida obsahuje nepatogenní organismy a sem patří C. elegans.
C. elegans patří k organismům se kterými se poměrně snadno pracuje v laboratoři. je za standardních Pěstuje se na Petriho miskách s agarem, živí se bakteriemi. laboratorních podmínek krátký a vývoj z oplozeného vajíčka přes čtyři larvální stádia (L1L4) do dospělosti trvá asi 3 dny. Každé larvální stádium končí výměnou kutikuly (tzv. moltem), při kterém se vytvoří nová kutikula a stará se později odloučí. Dospělí jedinci žijí 14 dní. Při nedostatku potravy nebo je-li populace C. elegans příliš početná může ve stádiu L2, když dochází k výměně kutikuly, dojít ke vzniku tzv. dauer larválního stádia. Dauer larva je specializované stádium, ve kterém C. elegans vydrží až dva měsíce bez potravy a vody. Dauer larva je tenčí než normální larva L3, ale po podnětu se pohybuje rychleji.
u C. elegans je asymetrické a dává vzniknout Již první větší buňce AB v hlavové oblasti a menší P1 v oblasti ocásku. Vývoj C. elegans byl přesně zmapován a vývojová schémata pro každou buňku jsou známá (tzv. cell lineages). Během
3 postembryonálního vývoje celkový počet somatických buněk stoupne na 959 u hermafroditů a 1031 u samečků. těla C. elegans je jednoduchá a tkáně a jednotlivé buňky se dají snadno pozorovat. C. elegans má pohlavní dimorfismus, vyskytuje se jako hermafodité a samečci. Hermafrodité produkují jak vajíčka tak spermie a mohou se také rozmnožovat samooplodňováním. Anatomie jak hermafroditů, tak samců je podobná. Dospělí jedinci mají velikost 1mm a samečci jsou trochu menší. Tělo je souměrné podle podélné osy.
tvoří ústa, jícen, vlastního střevo a konečník. Jícen se skládá z 20 svalových buněk, 20 nervových buněk a 18 epiteliálních buněk. Bakterie, kterými se C. elegans živí, jsou drceny v jícnu v tzv. drtiči, který je umístěn v druhém rozšíření jícnu. Potrava dále prochází přes jícno-střevní chlopeň do střeva, které je tvořeno 20 buňkami. U těchto buněk s výjimkou prvních 6 dochází v L1 fázi vývoje (v lethargu) k reduplikaci a stávají se dvou jadernými. U střevních buněk také dochází k endoreduplikaci DNA (v každém larválním stádiu) bez dělení, takže jejich jádra jsou velká a dobře viditelná. Jejich funkcí je sekrece trávicích enzymů, absorpce živin a slouží k uchovávání zásob. Tyto buňky mají mnoho granul, z nichž některé jsou . Slouží také k vyživování zárodečných buněk a to tvorbou žloutkového proteinu, který se tvoří ve střevě a transportuje do oocytů. Mezi střevem a konečníkem (rektem) je další chlopeň střevně-rektální. Dále se zde nachází svaly, anální depresor, svěrač a dva svaly střeva.
Mezi střevem a stěnou těla je pseudocoelom, neboli nepravá dutina tělní. Tělo C. (někdy se také nazývá elegans je tvořeno stěnou, která se skládá z hypodermis), která produkuje kutikulu složenou z kolagenu, vytváří exo-skeleton a chrání organismus proti nepříznivým podmínkám prostředí. Většina epidermálních buněk je mnohojaderných.
mají naopak jen jedno jádro, rhomboidní tvar a jsou organizovány ve čtyřech podélných řadách běžících subdorsálně a subventrálně. Každá řada obsahuje 24 svalových buněk, s výjimkou jedné, která jich má 23. Tyto svalové buňky vysílají výběžky k nervovým buňkám a vytvářejí nervosvalové synapse. Koordinované kontrakce těchto svalových buněk způsobují sinusoidní pohyb organismu.
, které se Nervová soustava je provazcová. Hermafrodité mají nacházejí v nervovém kruhu v okolí jícnu, ve ventrální a dorsální neuronální řadě, v hlavové oblasti a v oblasti ocasu. Samečci mají o 79 nervových buněk více. Spojení celého nervového systému bylo potvrzeno jeho rekonstrukcí ze sériových řezů detekovaných pomocí elektronové mikroskopie. Přítomnost jednoduchého nervového systému byla důležitá pro výběr C. elegans jako modelového organismu.
u hermafroditů i samečků jsou tvořeny jednoduchou tubulární trubicí, ve které se dělí jádra zárodečných buněk a tyto buňky tvoří syncytium. Ke zrání a vzniku individuálních zárodečných buněk obalených membránou dochází při jejich průchodu distální částí gonády. U samečků je gonáda tvořena jednoduchou trubicí otevřenou do kloaky , která je blízko ocásku. U hermafroditů je gonáda tvořena dvěma symetrickými laloky, které mají tvar písmene U. Obě gonády ústí do dělohy, která je lokalizována ventrálně ve středu těla a je spojena s orgánem pro kladení vajíček, neboli vulvou. K oplodnění vajíček dochází ve spermathece, která se nachází mezi oviduktem a dělohou.
4 C. elegans patří mezi , jejich tělo je symetrické podle . Dutina tělní C. elegans je tvořena dvěma trubicemi, střevem, podélné osy a potom je pseudocoelom, a vnější trubici tvoří epidermis s bazální membránou, nervové buňky a svaly. Nematoda, kam C. elegans náleží jsou považována za časnou odnož Protostoma. . Její nejbližší příbuzný druh C. briggsae je evolučně vzdálen asi Patří do 100 000 000 let. Tedy podobně jako člověk a myš.
C. elegans
V devadesátých letech se skupina vědců soustředěných kolem Johna Sulstona, Alana Coulsona a Roberta Waterstona rozhodla Původně měl tento proces trvat až do roku 2006. Během sekvenování došlo k velkému rozvoji sekvenovacích technik a přístrojů, takže sekvenování bylo dokončeno v roce 1998. Celý genom je 100 Mbp velký, a když jej porovnáme s lidským genomem, jehož sekvenování bylo dokončeno v roce 2004, je 30x menší. Zajímavá je předpověď počtu genů, která byla původně 19 000 a zdá se, že skutečné množství exprimovaných genů bude větší (asi 22 000 genů). Geny jsou krátké s malými introny a krátkými mezigenovými sekvencemi.
C. elegans genom byl prvním sekvenovaným genomem mnohobuněčného organismu. Znalost sekvencí celého genomu byla velmi důležitá a přispěla k tomu, že C. elegans je tak oblíbeným modelovým organismem. Pomohla například k velmi rychlé identifikaci genů, které jsou postižené u daných mutant. Porovnání tohoto genomu s dalšími genomy nám umožňuje zjišťovat změny, ke kterým dochází během evoluce. Zajímavé je, že více než 40% proteinů je zachováno i u evolučně vyšších živočichů a je často možné najít homology lidských proteinů u C. elegans.
Tato technika, kterou vyvinuli Stinchcomb, Mello a jejich spolupracovníci je velmi populární a vede ke snadné přípravě transgenních organismů. Technika je založena na injekcích DNA do cytoplasmy gonád, do místa, kde jádra vajíček jsou ve fázi mitotického dělení. Gonády C. elegans jsou v těchto místech tvořeny syncytiem. Injikovaná DNA je označena určitou značkou, obvykle genem kódujícím pro zelený fluorescenční protein (GFP), aby se usnadnila identifikace transgenních organismů v potomstvu. Pro snadnější detekci transgenních organismů se obvykle se používá další značka, která se injikuje spolu s experimentální DNA. Nejčastěji se používá plasmid pRF4, který obsahuje mutovaný gen rol-6 (což je jeden z kolagenních genů) a způsobuje změnu pohybu u transgenních organismů (červíci se rolují doprava). Výběrem takto označených živočichů (pohybujících se dokola místo v sinusoidě, rolerů) během dvou generací je možné připravit stabilní transgenní linii. V takové linii se injikovaná DNA přenáší do příštích generací jako extra chromosomální array (tandem arrays)(všechna injikovaná DNA je náhodně linearizovaná, několik stovek kopií plasmidové DNA je navázáno a tvoří umělý chromosom). Array se dědí s frekvencí kolísající od 5 do 90%. Tato technika se používá k analýze studovaného genu. Je možné připravit transgen obsahující reporterový gen řízený promoterem studovaného genu, nebo k expresi mutovaného genu, nebo naopak genu normálního který může zvrátit genotyp mutovaných
5 organismů a tak dokázat skutečnou funkci genu a odpovídajícího proteinu. Expresi transgenů je možné řídit pomocí tepelně regulovatelného promotoru (heat shock regulated promoter).
Hermafordité mají genom organizovaný v 5 párech autonomů a mají dva chromosomy X. Samečci vznikají nondisjunkcí chromosomu X , mají genom 5AA X0 a vznikají asi v 0.3 % potomků hermafroditů. Hermafrodité se mohou křížit se samci a při tomto křížení samčí spermie mají přednost před spermiemi, které se vyvíjejí v hermafroditech. Při tomto druhu rozmnožování vzniká stejné množství samečků jako hermafroditů. Tento typ křížení se používá při genetické analýze. Chromosomy u C. elegans mají difúzní kinetochory a v metafázi nemají žádné viditelné konstrikce, které by označovaly místo centroméry nebo kinetochory monocentrického chromosomu. Mikrotubuly vřeténka se napojují přímo po celé délce chromosomů. Tyto chromozomy se onačují jako homocentrické. je taková situace, kdy dvojitá mutanta má genotyp pouze jedné mutanty. Používá se pro stanovení pořadí daných genů v určité regulační cestě. modifikuje (upravuje nebo opravuje) genotyp získaný jinou mutací, takže ji může modifikovat až úplně korigovat. vznikne spojením dvou různých mutací, které samy nemají fenotypické změny, ale dohromady mají změnu fenotypu. Takže mutovaný genotyp je pozorován jen za přítomnosti obou mutací. Individuum, které má buňky vytvořeny z dvou nebo tří genotypů. je taková, kde druhá mutace, ke které dojde v jiném místě než u první mutace, způsobí alespoň částečnou změnu fenotypu první mutace. Může dojít k intragenové supresi v tom samém genu, ale na jiném místě.
C. elegans, jak již bylo uvedeno, má 22 000 genů. Asi 2000 genů bylo identifikováno pomocí tzv. dopředné genetiky (forvard genetic screens ) fenotypů u mutovaných organismů. Vytváření takových mutant a jejich analýza byla také jedním z důvodů proč byla C. elegans vybrána jako modelový organismus (velmi silným argumentem pro pochopení pozorování fenotypu navozeného kompletním vyřazením funkce genu, tedy nulové alely daného genu). Jednoduchá mutace je přiřazena danému genu na základě V tomto testu, dvě recesivní mutace jsou vytvořeny u trans-heterozygotích organismů. V případě, že vznikne normální zdravý potomek, říkáme, že mutace komplementovaly jedna druhou a že se jedná o mutace přítomné ve dvou různých genech. získáme informaci o daných alelách a genových interakcích. Např. máme-li nějakou mutaci známého genu, provedeme další mutagenesu a hledáme gen, který, je-li porušen, navodí vznik fenotypicky normálního jedince.
Zbývajících 20 000 genů by teoreticky mohlo být analyzováno stejnou cestou, ale to by byl dlouhodobý proces. Dnes, kdy jsou již sekvence všech genů známé, se využívá zpětná genetika (reverse genetics), kde gen je nejprve identifikován podle své sekvence a až později je mutován nebo jiným způsoben vyřazen z funkce. Mnoho pokusů ukázalo, že vyřazení genu z funkce klasickou homologní rekombinací, kde funkční gen je nahrazen mutovaným a která výborně funguje u kvasinek a dalších organismů, u C. elegans nefunguje. Místo toho se úspěšně používá metoda epigenetické inaktivace genu pomocí dvouvláknové RNA (RNA interference).
6
Jedna ze zachovalých regulačních cest, která je zachovaná je Programová buněčná smrt, neboli apoptósa, je přítomná u všech mnohobuněčných živočichů. Liší se od nekrósy, ke které dochází po poranění tkáně mechanicky nebo při zánětu. K apoptóse dochází zejména při vývoji živočichů, ale také během dospělosti, je-li třeba eliminovat buňky, které jsou potenciálně nebezpečné. Je to proces, během kterého buňky zanikají na základě genetického programu. Buňky se jakoby samy rozhodnou, že zahynou. Tento proces je geneticky regulován a jakékoli změny této regulace mohou způsobit patologické stavy. Je-li apoptóza inhibovaná, může dojít ke vzniku nádorů nebo autoimmunních onemocnění, naopak aberantní aktivace tohoto procesu způsobuje zánik většího počtu buněk např. při neuro-degenerativních onemocněních nebo po mrtvici. Regulace tohoto procesu byla objevena právě u C. elegans. Z 1090 buněk u hermafroditů 131 buněk zaniká apoptósou. Většina těchto buněk zaniká během embryogenese. Nejčastěji zanikají buňky ektodermu (epidermální buňky a neurony), méně buňky mesodermu (svalové buňky těla).
:
-------I CED-9 -------I CED-4 CED-3
EGL-1
fagocytósa
Geny ced-3 a ced-4 (cell death abnormal) jsou důležité pro apoptósu, říká se jim také pro-apoptotické geny. Protein CED-3 patří do skupiny cysteinových proteáz, kam patří také ICE (interleukin-1 beta –converting enzym). CED-4 je také pro-apoptotický protein, který aktivuje ced-3 (geny se u C. elegans píší s malými písmeny, proteiny s velkými). Jsou –li tyto dva geny mutovány, k apoptóse nedojde, 131 buněk nezanikne, ale již se dál nedělí. Gen ced-9 je negativní regulátor apoptósy (inhibuje expresi CED-4 a CED-3). Jeho zvýšená exprese způsobuje, že buňky, které by měly zaniknout apopósou přežívají, fenotyp je tedy stejný, jako když jsou geny ced-3 a ced-4 mutovány (nebo chybí). Je-li ced-9 mutován nebo vyřazen z funkce, dochází ke zvýšené apoptóse (např. u neuronálních a zárodečných buněk). Homolog genu ced-9 u savců je proto-onkogen bcl-2. Důkazem toho, že oba geny mají stejnou funkci je, že lidský bcl-2 způsobil prevenci apoptosy u C. elegans a substituoval funkci CED-9 u linií C. elegans, které měly mutovaný ced-9. egl-1 inhibuje funkci ced-9 a jeho aktivita je regulována dalšími geny, které specifikují, které buňky mají zaniknout apoptósou.
Porucha regulační cesty insulin/IGF-1 receptoru může signifikantně prodloužit délku života kvasinek, červů, Drosophily a hlodavců. Zajímavé je, že tyto dlouho žijící mutanty sdílí stejné charakteristiky jako např. snížení insulinové signalizace, zvýšenou citlivost k inzulínu, sníženou hladinu IGF-1 v plasmě, mají snížení oxidativního poškození makromolekul a zvýšenou odolnost ke stresu. Tyto podobnosti ukazují, že základní mechanismus stárnutí je evolučně zachován od kvasinek po člověka. Regulační cesta, která ovlivňuje délku života byla po prve popsána právě u C. elegans (Guarente and Kenyon, 2000). U C. elegans se tato (insulin signaling) kaskáda skládá z proteinů, které jsou kódovány geny daf-2, age-1, akt-1, akt-2, daf-16 a daf-18.
7 daf-2 kóduje insulin/IGF-1 receptor like protein a slabá mutanta daf-2 stárne mnohem pomaleji a žije déle než normální organismy. Dále mutace v genu, který je v regulační kaskádě pod ním, age-1, a který kóduje pro protein podobný savčí p110 katalytické pod jednotce PI3K (phosphatidylinositol 3-kinasy), vede v 65% k prodloužení délky života.
Barbieri M. at al Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003
Tyto dva geny fungují v regulační kaskádě, která inhibuje FOXO transkripční faktor DAF-16, který je podobný savčímu forkhead TF a jaternímu jadernému faktoru-3 (hepatocyte nuclear factor 3). Aktivní protein DAF-2 fosforyluje a tedy inaktivuje DAF-16, a způsobí, že DAF-16 zůstane v cytoplasmě. Mutace, která redukuje DAF-2 signaling redukuje tedy fosforylaci DAF-16 a způsobuje, že tento protein se dostane do jádra, kde začne fungovat jako regulátor transkripce. Dojde-li při vývoji C. elegans k omezení množství potravy a jsou –li larvy v larválním vývojovém stádiu L2 může u nich dojít k zástavě vývoje a přchodu do dauer larválního stadia. Tyto larvy jsou tenčí, mají tlustější kutikulu, která je chrání před vyschnutím, nepřijímají potravu, jsou odolné proti stresu a vydrží v tomto stádiu dva až tři měsíce. Když se podmínky pro vývoj zlepší (hojnost potravy), přejdou rovnou do vývojového stádia L4. Bylo prokázáno, že dochází k aktivaci insulin/IGF-1 receptor homolog daf-2 regulační cesty. K podobnému fenotypu, vzniku dauer larev dochází také jsou-li geny daf-2 a age-1 mutované (loss-of-function mutations), jak bylo uvedeno dříve. Nulová mutace DAF16 potlačí fenotypy daf-2 a age-1. V poslední době bylo zjištěno, že polymorfní varianty IGF-1 receptoru (IGF-1R) a phosphatidylinositolu 3-kinasy (PI3K) ovlivňují plasmatickou hladinu IGF-1 a dlouhověkost také u lidí. Práce na C. elegans byla v roce . Dostali ji Sydney Brenner, John Sulston a Robert Horvitz za objevy regulace buněčného dělení a regulace apoptósy.
8
K vyřazení genu z funkce se dříve používala antisensová RNA. Předpokládalo se, že bude dostatečně inhibovat překlad mRNA a tvorbu proteinu. Také se používal ribozyme. U rostlin byl v roce 1990 popsán fenomén PTGS (po transkripčního genového utlumení), který byl způsoben přítomností jiné cizorodé DNA nebo RNA. Mechanismus ale vysvětlen nebyl. V roce 1996 bylo u C. elegans popsáno, že efekt antisense a sense mRNA byl stejný. Při použití sense mRNA došlo k inhibici transkripce, a to bylo velké překvapení (Guo a Kemphues 1996). Později Andy Fire a Craig Mello se svými spolupracovníky prokázali, že inhibici genu způsobuje dvou-vláknová RNA. Za objev mechanismu působení RNA interference jim byla . udělena
Dvou-vláknová RNA působí tímto mechanismem: cizorodá dvou-vláknová RNA je v cytoplasmě rozpoznána enzymem Dicer (RNasa III). Ten naštípe tuto dsRNA na krátké úseky 19-21 nukleotidů dlouhé, zvané siRNA (short interfering RNA), které se zabudují do enzymatického komplexu RISC (RNA induced silencing complex) a zde zůstává. V okamžiku, kdy dochází k transkripci daného genu, RISC komplex je aktivován, dvouvláknová RNA se rozvine, sense RNA je vyjmuta z komplexu a degradována buněčnými nukleasami, antisense RNA směřuje RISC komplex k cílové mRNA sekvenci a komplementárně se na ni naváže. To je signál pro degradaci dané mRNA tímto komplexem, který má endonukleasovou aktivitu. Proces je tedy post transkripční, vlastní mRNA je nejprve vytvořena a potom degradována. Tento proces se zřetelně liší od PTGS (post-transcriptional gene silencing) pomocí ASOs (antisense oligonucleotides). Vazba ASOs na jejich cílovou mRNA inhibuje translaci daného proteinu buď prostorovou překážkou ribosomální mašinérii nebo indukcí degradace mRNA pomocí Rnase H (ribonuclease H). Použití RNA interference u savčích buněk propracoval Thomas Tuschl a spolupracovníci (2001), kteří první prokázali, že siRNAs se může tvořit také v savčích buňkách a že dsRNA může být také přímo dodána buňkám jako siRNAs. Dvou-vláknová RNA může být do těla C. elegans dodána několikerým způsobem: mikroinjekcemi do ovariálního syncytia, namáčením nematod v roztoku dvou-vláknové RNA nebo krmením pomocí speciálních bakterií, které jsou transformované plasmidem obsahujícím sekvenci genu, který chceme inhibovat a mají T7 RNA polymerasu. C. elegans pohlcující tyto bakterie přenáší dvou-vláknovou RNA do střevních i ostatních buněk a podléhá RNA inhibici zaměřené proti danému genu. Andrew Fire a Craig Mello přišli dále na to, že inhibice je specifická pro danou mRNA), sekvence z promotorů nebo intronů nezpůsobí inhibici inhibici mRNA, že mechanismus je post transkripční, k degradaci dochází v cytoplasmě a dvou-vláknová RNA se může šířit mezi tkáněmi. Další příbuzné mechanismy byly objeveny v poslední době. Patří sem regulace uspořádání chromatinu, regulace malými časově exprimovanými RNA a piRNA. Otevírá se před námi zcela nová úroveň regulace genomu a genové exprese na základě regulačních RNA molekul.
9 V poslední době bylo identifikováno velké množství krátkých RNA. Patří sem ( , které se uplatňují při regulaci vývoje C. elegans a dalších živočichů včetně člověka (lin-14, let-7).
K dalším patří miRNA (microRNA), malé nekódující (tiny noncoding) RNA, heterochronic RNA nebo malé modulující (small modulatory) RNA. které jsou 70 nukleotidů dlouhé, jsou přepsány z kódujících genů a vytvářejí dvou-vláknové (stem-loop hairpin) molekuly (vlásenky) pomocí vlastního komplementárního navázání. Byly nalezeny u všech mnohobuněčných živočichů od C. elegans po člověka. U lidí je předpovězena přítomnost 250 miRNA sekvencí, přítomnost 175 miRNA již byla potvrzena. Vlásenka je natrávena enzymem Dicer a RNA je inkorporovaná do komplexu RISC. Většina savčích miRNA inhibuje synthesu proteinů tím, že se váží na 3‘ UTR (nepřekládané sekvence) mRNA a tím způsobují zástavu translace. Zatímco jen chyba v jedné basi může kompletně zablokovat utlumení pomocí siRNA, inhibice translace pomocí miRNA toleruje změny v cílové sekvenci, může tedy působit nespecificky a jedna miRNA může regulovat expresi mnoha, možná i stovek různých genů.
Tento mechanismus se pravděpodobně vyvinul jako ochrana proti repetitivním sekvencím nebo transposonům (transposable genetic elements - jumping genes). RNAi funguje jako prevence re-inserce těchto elementů do genomu. RNA funguje také jako část tzv. nucleic-acid-based imunitního systému, protože bylo ukázáno, že RNAi chrání buňky před virovou infekcí tím, že inhibuje virovou mRNA (ničí virový transkript).
Použití u virů Influenzy, Hepatitidy B a C, West Nile, Papilloma a Herpes virů. Dále u HIV-1 RNAi inhibuje replikaci HIV-1 nejen v buněčných liniích, ale také v primárních periferních lymfocytech.
Specifické siRNA umožňují selektivní supresi toxické gain-of-function mutace u ALS (amyotrophic lateral sclerosis) a u Huntingtonova onemocnění (testováno na myším modelu).
V současné době se testuje specifická inhibice oncogenu na buňkách chronické myeloidní leukémie a Ph positivní akutní lymfoblastické leukémie: siRNA je specifická k BCR-ABL transkriptu, zatímco c-ABL a c-BCR transkripty nejsou inhibovány. Utlumení BCR-ABL transkriptu způsobuje silnou apoptotickou reakci v buňkách CML, která je podobná jako při léčbě imatinibem.
RNAi je zkoušena k inhibici MDR1 (multidrug transporter).
10
siRNA které jsou zaměřené proti mRNA FAS nebo CASP8 snižují apoptósu a tím i zánik hepatocytů.
1. Je třeba si uvědomit, že RNA mašinérie je komplexní. Sekvence navržená k vytvoření siRNA musí být pečlivě testovaná před použitím (existují různá doporučení na návrh siRNA, ale tato se stejně musí ověřit experimentálně). Je třeba minimalizovat nežádoucí účinky. 2. Ohnutí cílové mRNA v buňce nebo její spojení s jinými proteiny může oslabit navázání komplexu RISC. 3. Stabilita siRNA duplexu může mít velký vliv na inhibici mRNA. 4. To, že vazba pouhých 7 nukleotidů může způsobit blok translace způsobuje, že i pečlivě navržená si RNA může působit na jiný gen (off-target effect). 5. Důležitý je poločas rozpadu siRNA. siRNA, které jsou k místu působení doručeny transfekcí většinou působí jen krátce, ale zase jsou přítomné ve více buňkách. Druhou možnost tvoří doručení v podobě shRNA (krátké vlásenkové RNA - short hairpin), která je exprimována z plasmidu v lidských buňkách, zde je natrávená enzymem Diser, tím vznikají siRNA s delším poločasem účinku, ale zase většinou se nedostanou (netransfekují) do všech buněk. 6. Bylo zjištěno, že nejlepší výsledky byly dosaženy při lokálním podávání siRNA. Např. při léčbě AMD (age-related macular degeneration), která začala v roce 2004 (Acuity Pharmaceuticals). U tohoto onemocnění se pomocí siRNA inhibuje růstový faktor VEGF (vascular endothelial growth faktor), který jak se zdá způsobuje přerůstání krevních cév. siRNA byly doručeny intravitreální injekcí. Podobně byly testovány další přípravky jako např. Sirna-027 při léčbě stejné nemoci (Sirna Therapeutics). Jedna intra vitreální dávka byla dobře tolerována většinou pacientů, kteří měli stabilizovánu zrakovou ostrost během pokusu. Připravuje se testování siRNA, které by byly zaměřeny na RSV (respirační syncytiální virus). V současné době není žádná efektivní léčba ani prevence tohoto virového onemocnění. Pro léčbu HIV firma Benitec Ltd. připravuje techniku pěstování leukocytů z periferní krve HIV pacientů, jejich léčbu s anti-HIV shRNA- konstruktem a následné navrácení těchto vyléčených leukocytů zpět pacientům.
U těchto onemocnění dochází k poruše proteinového sbalení (konformace proteinu). Takový protein může být toxický a může aktivovat molekulární kaskádu, která způsobí poruchu funkce buňky, např. neuronu. U Alzheimerovy, Parkinsonovy choroby, amyotrofií laterální sklerósy, Huntingtonova onemocnění a dalších neuropatií dochází k tvorbě proteinových agregátů intracelulárně i extracelulárně v mozku postižených osob. U těchto postižených dochází k gain-of-function mutaci, která je spojená se vznikem oligomerů a dalších toxických agregátů, které se skládají z amyloidního beta peptidu, alfa synucleinu, superoxid dismutásy, huntingtinu a dalších.
Cohen a jeho spolupracovníci ukázali, že existují dva faktory, které determinují buněčnou toxicitu mutovaného huntingtinu na modelu C. elegans.
11 Jsou to délka mutovaného polyglutaminového opakování (polyglutamin repeat) - jehož prodloužení způsobuje lidské onemocnění a exprese proteinů insulinové signalizační regulační cesty, která reguluje délku života. Bylo popsáno, že molekulární determinanty dlouhověkosti mohou mít vliv na polyglutaminem zprostředkovanou toxicitu, což je podporováno sledováním že čas, kdy se nemoc objeví koreluje s délkou života. Je známo, že existuje spojení mezi délkou života a buněčnou odpovědí na stress. HSF-1, je aktivátor tepelné odpovědi, která indukuje expresi molekulárních chaperonů (proteinů, které pomáhají při skládání nově vytvořených proteinů a zabraňují jejich špatnému poskládání). Proto inhibice funkce tohoto faktoru (HSF-1) také zvyšuje agregaci polyglutaminu a způsobuje toxický efekt, který má za následek zkrácení délky života C. elegans.
bylo prokázáno, že aktivace insulinové signalizační regulační cesty potlačuje toxicitu beta 42 agregátů amyloidu, peptidu, který se nachází v mozku pacientů s touto nemocí. V pracích na C. elegans bylo prokázáno, že aby došlo k potlačení toxicity agregátů dochází k aktivaci insulin signalizační regulační cesty a dalších dvou regulačních cest. Každá z těchto cest je aktivována transkripčním faktorem HSF-1. Aktivace této cesty způsobuje rozpad agregátů tím, že zvyšuje hladinu ochranných molekulárních chaperonů, DAF-16, tato regulační cesta usnadňuje tvorbu velkých, inertních (nefunkčních) agregátů z toxických oligomerů.
Celogenomové skríningy pomocí RNA interference, techniky využívající mikroarray a proteomické přístupy nám pomáhají získat nové informace o funkci genů a interakci proteinů. Vědci pracující na tomto modelovém organismu sdílejí svá data na rozsáhlých databázích, k nejlepším patří Worm Base.
C. elegans
nhr-23.
1. K čemu slouží modelové organismy? 2. Uveďte příklady modelových organismů a k čemu se používají. 3. Uveďte některé výhody C. elegans jako laboratorního organismu. 4. Jaký je význam sekvenování celých genomů? 5. Uveďte rozdíl mezi apoptósou a nekrósou. 6. Uveďte jména některých vědců pracujících se C. elegans. 7. Co to je RNA interference? 8. Jaký je mechanismus působení RNAi? 9. Uveďte některé možnosti využití RNAi v lidské medicíně. 10. Co to je WormBase?
12
1. Do kterého řádu patří C. elegans A. mezi Strongylida B. mezi Rhabditida C. mezi Oxyurida D. mezi Ascaridida 2. Jaká je vzdálenost mezi C. elegans a její blízkou příbuznou C. briggsae (kdy došlo k jejich oddělení během evoluce) A. 1000 let B. 10 000 let C. 100 000 let D. 100 000 000 let 3. A. B. C. D.
Jak dlouhý je životní cyklus C. elegans 3 dny 10 dní 20 dní déle
4. A. B. C. D.
Jaký je celkový počet somatických buněk u C. elegans 100 500 1000 1500
5. A. B. C. D.
Jaký je počet genů v genomu C. elegans 5 000 10 000 15 000 22 000
6. A. B. C. D.
Který systém nemá C. elegans Oběhový Svaly Zažívací Rozmnožovací
7. A. B. C. D.
Který enzym štěpí cizorodou dvouvláknovou RNA Aicer Dicer Micer Racer
8. A. B. C. D.
Komplex nutný pro RNA interferenci se jmenuje: MIXS LIXS DISK RISK
