SLEDOVÁNÍ POPULACE VINNÝCH KVASINEK BĚHEM KVAŠENÍ VINNÉHO MOŠTU

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

SLEDOVÁNÍ POPULACE VINNÝCH KVASINEK BĚHEM KVAŠENÍ VINNÉHO MOŠTU MONITORING OF WINE YEASTS POPULATION DURING FERMENTATION OF WINE CIDER

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS

AUTOR PRÁCE

Bc. KATEŘINA KRÄTSCHMEROVÁ

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2010

Mgr. DANA VRÁNOVÁ, Ph.D.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-DIP0381/2009 Akademický rok: 2009/2010 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Kateřina Krätschmerová Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) Mgr. Dana Vránová, Ph.D.

Název diplomové práce: Sledování populace vinných kvasinek během kvašení vinného moštu

Zadání diplomové práce: 1. Vypracování literární rešerše na dané téma 2. Výběr metod pro experimentální část a jejich aplikace 3. Zpracování výsledků, diskuse

Termín odevzdání diplomové práce: 14.5.2010 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.

----------------------Bc. Kateřina Krätschmerová Student(ka)

V Brně, dne 1.12.2009

----------------------Mgr. Dana Vránová, Ph.D. Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Tato diplomová práce se zabývá identifikací vinných kvasinek izolovaných v průběhu kvašení vinného moštu a bobulí odrůdy vína Sauvignon pěstovaného v integrované vinici. Identifikace a taxonomické zařazení kvasinkových kmenů se díky rozvoji molekulárních metod zrychlila a usnadnila. K identifikaci těchto mikroorganismů v této diplomové práci byla použita metoda PCR-RFLP. Pro analýzu byly použity úseky kvasinkové DNA, které jsou specifické pro každý druh. Tyto úseky byly pomocí PCR za použití primerů ITS1 a ITS4 naamplifikovány a následně podrobeny restrikční analýze pomocí specifických restrikčních endonukleas. Získané fragmenty byly identifikovány horizontální elektroforézou. Gely byly následně vyhodnoceny programem BioNumerics. Za použití UPGMA klastrové analýzy byl vytvořen dendrogram znázorňující genetickou podobnost vyizolovaných kvasinek. V teoretické části této práce jsou uvedeny základní informace o kvasinkovitých mikroorganismech a metodách molekulární biologie sloužící k jejich identifikaci.

ABSTRACT This thesis deals with identification of wine yeasts isolated during fermentation process of wine cider and grapes of Sauvignon grape variety, grown in the integrated vineyard. The identification and taxonomic classification is faster and easier due to the progress of molecular methods. In this thesis PCR-RFLP method was used for identification of yeasts. Sequences of DNA specific for each species were analysed. These sequences were amplified by means of PCR method and by using ITS1 and ITS4 primers. In following step, they were put through the restrictiction analysis with five restriction endonucleases. Fragments of DNA were separated by horizontal electrophoresis. The electrophoreograms were evaluated by BioNumerics software and final dendrogram representing genetics similarity of isolated yeasts was created by using UPGMA claster analysis. The basic information about yeasts and their identification by molecular methods are described in the theoretical part of this thesis.

KLÍČOVÁ SLOVA Kvasinky, výroba vína, identifikace, PCR-RFLP, dendrogram

KEYWORDS Yeasts, wine making, identification, PCR-RFLP, dendrogram

5

KRÄTSCHMEROVÁ, K. Sledování populace vinných kvasinek během kvašení vinného moštu. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2010. 88 s. Vedoucí diplomové práce Mgr. Dana Vránová, Ph.D.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT. ………………… podpis studenta

Poděkování: Děkuji Mgr. D. Vránové Ph.D za odborné vedení a všestrannou pomoc při realizaci této diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. Haně Šuranské za motivaci a psychickou podporu při vypracovávání této diplomové práce.

6

OBSAH 1. ÚVOD ……………………………………………………………………... 10 2. TEORETICKÁ ČÁST …………………………………………………… 11 2.1 Kvasinky …………………………………………………………………….. 11 2.1.1 Morfologie ………………………………………………………………........ 11 2.1.2 Cytologie ………………………………………………………………...…... 12 2.1.2.1. Buněčná stěna ……………………………………….…..………... 13 2.1.2.2. Cytoplazmatická membrána …………………………...………….. 13 2.1.2.3. Cytoplazma …………………………………………...……………. 13 2.1.2.4. Jádro ……………………………………………………...………... 14 2.1.3 Rozmnožování kvasinek …………………………………………………….. 15 2.1.3.1. Vegetativní rozmnožování ………………………………………… 15 2.1.3.2 Pohlavní rozmnožování kvasinek ……………………………….… 16 2.1.4 Základní výživa kvasinek …………………………………………...……… 17 2.1.5 Kultivace kvasinek ………………………………………………………….. 17 2.1.6 Kvasinky účastnící se kvasného procesu u výroby vína ………………….. 18 2.1.6.1 Rod Saccharomyces ……………………………………...………… 18 2.1.6.2 Rod Hanseniaspora ……………………………………...………… 19 2.1.6.3 Rod Rhodotorula ………………………………………...………… 19 2.1.6.4 Rod Pichia ………………………………………………………….. 20 2.1.6.5 Rod Candida …………………………………………….………….. 21 2.1.6.6 Rod Issatchenkia ………………………………………..………….. 21 2.1.6.7 Rod Kluyveromyces ………………………………………………… 21 2.1.6.8 Rod Metschnikowia ………………………………………………… 22 2.1.6.9 Rod Schizosaccharomyces ………………………..………………… 22 2.1.6.10 Rod Zygosaccharomyces ………………………..………………… 23 2.1.6.11 Rod Saccharomycodes ………………………….………………… 23 2.1.7 Metabolismus kvasinek – ethanolové kvašení …………...………………… 24

2.2 Vinařství …………………………………………………………..………… 25 2.2.1 Hrozny vinné révy …………………………………………………………… 26 2.2.2 Zpracování hroznů na mošt ………………………...……………………… 26 2.2.3 Úpravy moštu ………………………………………………………………... 28 2.2.4 Kvašení moštu ……………………………………………………..………… 29 2.2.5 Ošetřování a školení vína …………………………………………………… 29 2.2.6 Odrůda Sauvignon ……………………………………………...…………… 31 2.2.7 Škodlivé kvasinky v kvasném průmyslu …………………………………… 32 2.2.8 Integrovaná produkce hroznů a vína ………………………………………. 32 2.2.8.1 Seznam zakázaných účinných látek pro rok 2009 ………………… 33 2.2.8.2 Seznam přípravků na ochranu rostlin, které lze používat v rámci opatření integrované produkce pěstování ovoce a révy vinné ……………….…………… 33

2.3 Polymerasová řetězová reakce (PCR) …………………………...………… 34 2.3.1 Princip a průběh reakce ……………………………………………………. 35

7

2.3.2 Požadavky kladné na primery ……………………………………………… 37 2.3.3 Termostabilní DNA polymerasy ……………………………….…………… 37 2.3.4 Hořečnaté ionty ……………………………………………………..……….. 38 2.3.5 Termocyklér ………………………………………………………………….. 38

2.4 Princip elktromigračních metod ………………………..………………….. 39 2.4.1 Elektroforéza …………………………………………...……………………. 40 2.4.1.1 Agarózová elektroforéza ……………………...…………….………. 41 2.4.2 Detekce PCR produktu ……………………………………..……….………. 41

2.5 Restrikční analýza ………………………………………………..…….…… 42 2.6 Identifikace kvasinkových kmenů – Metoda PCR – RFLP ….….……….. 42

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST …………………………….………………. 44 3.1 Chemikálie ………………………………………………….…….…………. 44 3.2 Přístroje a pomůcky …………………………………………..…….………. 44 3.3 Suroviny ……………………………………………………….…….………. 45 3.4 Příprava kultur pro izolaci ………………………………….………..…….. 45 3.4.1 Odběry vzorků bobulí a moštu ….……………………………………… 45 3.4.2 Příprava živných půd …………………………………………………….….. 46 3.4.2.1 Příprava sladinových ploten a tekutých živných médií ………...….. 46 3.4.2.2 Příprava šikmých agarů ……………………………………...…….. 46 3.4.3 Izolace kvasinek z bobulí ………………………………………………...….. 46 3.4.4 Izolace kvasinek z moštu ……………………………………….………...….. 47 3.4.5 Kochova zřeďovací metoda …………………………………….………...…. 47

3.5 Izolace DNA …………………………………………………………………. 47 3.6 Příprava chemikálií a roztoků ………………………………...…………… 48 3.6.1 Příprava 10×TBE pufru ………………………………………….………….. 48 3.6.2 Příprava 1×TBE pufru ……………………………………………...……….. 48 3.6.3 Příprava 1×TBE pufru s ethidium bromidem ……………………….…….. 48 3.6.4 Příprava EtBr ……………………………………………………….……….. 48 3.6.5 Příprava 3 M octanového pufru …………………………………………….. 48 3.6.6 Příprava 80% ethanolu ………………………………………………..…….. 48

3.7 Příprava délkových standardů 100 bp a 20 bp …………………...……….. 49 3.7.1 100 bp ………………………………………………………………………… 49 3.7.2 20 bp ……………………………………………………………….…………. 49

3.8 Příprava 2% agarózového gelu …………………………….……………… 49 3.9 Příprava reakční směsi pro PCR ………………………………..…………. 49 3.9.1 Průběh reakce PCR v termocykléru ………………………..……….. 50 3.9.2 Detekce PCR produktu pomocí elektroforézy ……………………… 50 3.10 Přečištění PCR produktu ………………………………………….……… 50 3.11 Restrikční analýza …………………………………………………...…….. 51 3.12 Alkoholová tolerance …………………………………………………..….. 51

4. VÝSLEDKY A DISKUZE …………………………………………..…… 52 4.1 Izolace kvasinkové DNA …………………………………………...……….. 52 8

4.2 Amplifikace kvasinkové DNA s využitím metody PCR …………….…….. 52 4.2.1 PCR vzorků …………………………………………………………….. 52 4.2.2 PCR typových kvasinek …………………………………………...………… 54

4.3 Analýza použitím metody PCR-RFLP ………………………..…………… 55 4.3.1 Restrikční analýza s endonukleázou HaeIII …………………………..…… 55 4.3.1 Restrikční analýza s endonukleázou HinfI ………………………………… 58 4.3.1 Restrikční analýza s endonukleázou TaqαI ………………………………… 60 4.3.1 Restrikční analýza s endonukleázou MseI …………………………………. 64 4.3.1 Restrikční analýza s endonukleázou AluI ………………………………….. 66

4.4 Taxonomické zařazení identifikovaných kvasinek ………………..……… 70 4.5 Dendrogram identifikovaných kvasinek izolovaných z vína ……..…...… 71 4.6 Alkoholová tolerance ……………………………………………………..… 72

5. ZÁVĚR …………………………………………………………………..…76 6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY …………………...……………… 77 7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ………………...… 81 8. SEZNAM PŘÍLOH …………………………………………………….… 82 9. PŘÍLOHY ………………………………………………………………… 83

9

1. ÚVOD Kvasinky zaujímají celosvětově první místo mezi průmyslově používanými mikroorganizmy. Jsou široce využívány v řadě oblastí vědy, technologie i medicíny. Některé druhy jsou nezastupitelné v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, jiné jsou využívány jako biologické modelové systémy pro studium obecných regulací metabolizmu eukaryotických buněk. Mikroorganizmy zahrnované mezi kvasinky lze charakterizovat tím, že jde většinou o jednobuněčné organizmy, rozmnožující se převážně pučením a zpracovávající zdroje uhlíku a energie obvykle kvašením. Tato charakteristika však neplatí striktně. Některé kvasinky mohou za určitých podmínek vytvářet mycelia, pak mohou existovat i ve vícebuněčné formě. Kvasinkové organizmy jsou v přírodě velmi rozšířeny. Protože mají většinou pouze sacharolytické schopnosti, vyskytují se především na materiálech obsahujících cukry. Hlavní průmyslový význam kvasinek spočívá v jejich použití pro výrobu alkoholických nápojů, pekařského a krmného droždí. Za procesy při výrobě vína je zodpovědná kvasinka Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, která je pro tyto vlastnosti nazývána jako „vinná kvasinka“. Při výrobě vína se kvasinky významně podílejí na konečných organoleptických a senzorických vlastnostech budoucího vína. Zvedení polymerázové řetězové reakce (PCR) znamenalo pro molekulární biologii značný přínos stejně jako objev restrikčních endonukleáz nebo zavedení sekvencování DNA. Díky těmto technikám se usadila identifikace a taxonomické zařazení jednotlivých mikroorganismů. Při analýze genomu lze využít rozdílů v restrikčních mapách jedinců téhož druhu. Tyto rozdíly, podmíněné různou délkou a počtem resrikčních fragmentů vytvořených štěpením genomové DNA určitou restrikční endonukleázou, se označují jako polymorfizmus délky restrikčních fragmentů.

10

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Kvasinky Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně i trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý. Kvasinky jsou v přírodě velmi rozšířené. Protože většina má jen sacharolytické schopnosti, vyskytují se především na substrátech obsahující sacharidy, nejvíce na ovoci a na cukernatých potravinách. Přítomné jsou v některých květech, ve vzduchu, v půdě, v trávicím traktu lidí, zvířat a některého hmyzu. Ve vzduchu je nejvíc kvasinek v období květu stromů a dozrávání ovoce.V některých květech bývají nejčastěji přítomné oxidační typy kvasinek, nejvíce zástupci rodu Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces méně Candida. Na povrchu měkkého ovoce převládají kvasné typy - Saccharomyces, Saccharomycodes a Kloeckera. Jako vzdušná kontaminace se nejčastěji vyskytuje Rhodotorula, protože obsahuje karotenoidní barviva, které ji chrání před smrtícím účinkem UV oblasti slunečního záření. Mikroorganismy zahrnované mezi kvasinky lze charakterizovat tím, že jde většinou o jednobuněčné organismy, rozmnožující se převážně pučením a zpracovávající zdroje uhlíku obvykle kvašením. Tato charakteristika však neplatí striktně. Některé kvasinky mohou za určitých podmínek vytvářet mycelia, pak mohou tedy existovat i ve vícebuněčné formě. V důsledku toho se začalo hovořit o kvasinkách a kvasinkovitých mikroorganismech [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Taxonomické zařazení kvasinek: Nadříše: Eucaryota Říše: Fungi Oddělení: Eumycota Třída: Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes Systematika kvasinek: [5,6] Kvasinky a kvasinkovité mikroorganismy zařazujeme do čtyř základních skupin: 1/ kvasinky patřící mezi askomycety, schopné tvořit askospory v ascích 2/ kvasinky patřící mezi basidiomycety, u nichž se životní cyklus podobá cyklu basidiových hub z rodu Ustilaginales (sněti) 3/ kvasinky zařazené do čeledi Sporobolomycetaceae, které speciálním mechanismem ,,odstřelují“ spory zvané balistospory 4/ asporogenní kvasinky, neschopné tvořit askospory, balistospory a spory vůbec, protože neznáme u nich sexuální rozmnožování zatříďujeme je mezi Funga imperfekta 2.1.1 Morfologie Tvar buněk kvasinek souvisí se způsobem vegetativního rozmnožování, jež se děje buď pučením nebo dělením. Nejčastěji je tvar krátce elipsoidní, případně vejčitý až kulovitý. Některé rody tvoří dlouze protáhlé buňky, vyskytuje se však i tvar citronovitý, trojúhelníkovitý a válcovitý. Kvasinky s citronovitým, kosočtvercovými a ogiválními buňkami se nazývají apikulátní kvasinky. Tvar buněk i jejich velikost jsou do určité míry ovlivněny kultivačními podmínkami a stářím buněk. Avšak i v téže kultuře jednoho kmene

11

kvasinek se vyskytuje určitá variabilita tvaru a velikosti buněk. Buňka přenesená do nového živného prostředí si musí nejdříve na nové podmínky zvyknout a musí načerpat látky, aby si utvořila zásobu energie pro své budoucí rozmnožování. Šířka buněk většiny kvasinek je v rozmezí 3 – 15 µm. Kvasinkovité buňky jsou větší než buňky bakteriální [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8].

Obr. č. 1: Tvary buněk kvasinek: a – kulaté, b – oválné, elipsoidní, c – citronovité, d – ogivální, e – lahvovité, f – podlouhlé, g – vláknité [1] Morfologie kvasinek ve většině případů úzce souvisí se způsobem jejich vegetativního rozmnožování (pučení, příčné dělení). Pro většinu kvasinek je charakteristické rozmnožování pučením, při němž se na mateřské buňce vytváří pupen, který se postupně zvětšuje, dochází k fragmentaci všech buněčných organel, z nichž část se stěhuje do pupenu spolu s jádrem po jeho rozdělení. Podle místa, kde pupen na povrchu buňky vzniká, se rozlišuje pučení monopolární, bipolární a multipolární [1, 3, 6, 8].

Obr. č. 2: Růst kvasinek: a – ve svazcích buněk, b – v pseudomyceliu, c – v pravém myceliu [1] 2.1.2 Cytologie Názor na buňku kvasinek se postupem času měnil. Zapříčinil to mino jiné rozvoj metod elektronové mikroskopie. Buňky se dnes považují za vícefázový systém, v kterém membrány ohraničují jednotlivé reakční prostory. Vegetativní kvasinková buňka se skládá ze silné a pevné buněčné stěny, jemné cytoplazmatické membrány, cytoplazmy, jež obsahuje řadu 12

membránových struktur a jádra, které je od cytoplazmy odděleno dvojitou jadernou membránou. Pohybové orgány, tj. bičíky, vegetativní buňky kvasinek nemají. Některé rody kvasinek tvoří pohlavní spory, které mají fyziologické vlastnosti odlišné od vlastností endospor bakterií [1, 2, 7, 9]. 2.1.2.1. Buněčná stěna Původně byla buněčná stěna považována jen za ochranný obal buňky před vlivem prostředí. Buněčná stěna kvasinek má silnou a pevnou strukturu, která dává buňce tvar a chrání ji před mechanickými vlivy a před osmotickým šokem. Velkými póry stěny mohou volně procházet všechny sloučeniny kromě sloučenin vysokomolekulárních, jako jsou polysacharidy a bílkoviny. Hlavní složkou buněčné stěny kvasinek jsou polysacharidy, neboť představují 80 % sušiny stěny. Mají strukturu vláken, která tvoří hustou pevnou spleť. Tato spleť je vyplněna bílkovinami, které představují 6 až 10 % sušiny stěny. Ve stěně kvasinek je také přítomno malé množství lipidů, fosfolipidů (3 – 10 %) a fosforečnanů, vázané esterovými vazbami na polysacharidy. Tyto fosfátové zbytky spolu se skupinami –COOH bílkovin dávají buňkám kvasinek negativní náboj, který ovlivňuje adsorpci látek z živného prostředí (např. barviva z melasy a sladiny, hořkých látek chmele atd.). Dominantní zastoupení z polysacharidů mají glukany, vytvářející mikrofibrilární strukturu. Některé kvasinky obsahují v buněčné stěně mannany, malé množství glukosaminu a chitinu [1, 2, 7, 9]. 2.1.2.2. Cytoplazmatická membrána Cytoplazmatická membrána kvasinek, někdy nazývaná plazmolema, má obdobné složení i funkci jako cytoplazmatická membrána bakterií. Je poměrně tenká, tloušťky 7,5 až 8 nm, složená z lipidů a proteinů. Vytváří četné vychlípeniny vybíhající do cytoplazmy. Je sídlem transportních systémů. Je volně propustná pouze pro malé molekuly bez náboje, a tvoří proto osmotické rozhraní mezi buňkou a vnějším prostředím. Podobně jako u bakterií je sídlem transportních mechanismů, umožňující jednak příjem určitých látek buňkou, jednak transport látek z buňky do prostředí. Na rozdíl od bakterií však neobsahuje dýchací enzymy a systém oxidační fosforylace [1, 2, 9]. 2.1.2.3. Cytoplazma Cytoplazma mladých buněk kvasinek se ve světelném mikroskopu jeví jako průhledná, homogenní hmota, u starších buněk se objevují zrníčka a jemná nebo větší vakuolizace. V elektronovém mikroskopu je patrné, že cytoplazma kvasinek obsahuje systém dvojitých membrán, jenž se podobně jako u rostlin a živočichů nazývá endoplazmatické retikulum. Obě tyto membrány mají poměrně velké póry a vzhledově připomínají membránu jádra. Na vnějším povrchu obou membrán jsou četná zrníčka polynomů, v nichž se syntetizují bílkoviny. Endoplazmatické retikulum tvoří v buňce různé nádobky a oddělení, obsahující různé enzymy a rezervní látky. Dále jsou v cytoplazmě kvasinek přítomny mitochondrie. Jsou to strukturální útvary velmi rozmanitého tvaru široké 0,3 až 0,1 µm a dlouhé až 3 µm. Mitochondrie téže buňky se obyčejně značně liší tvarem i velikostí. Jsou obklopeny dvěma membránami. Vnější membrána má bradavičnatý povrch, vnitřní membrána tvoří hluboké vchlípeniny směrem

13

dovnitř mitochondrie. Tyto vchlípeniny se nazývají kristy. Mitochondrie jsou sídlem dýchacích enzymů a systému oxidační fosforylace. Jsou složené z bílkovin, lipidů a fosfolipidů. Obsahují RNA a malé množství DNA (nositel mimojaderné dědičnosti kvasinek). V mitochondriích se syntetizují i některé mitochondriální bílkoviny, takže jsou zde přítomny též tRNA, mRNA a ribozomy. Vakuola patří k nejnápadnějším složkám cytoplazmy kvasinek. Je to většinou kulovitý útvar obklopený jednoduchou membránou, která často vysílá úzké výběžky do cytoplazmy. U mladých nebo pučících buněk jsou většinou přítomny malé vakuoly, často ve větším počtu, kdežto zralé klidové buňky obsahují jednu velkou vakuolu. U starších buněk někdy vakuola vyplňuje téměř celý prostor buňky. Izolace vakuol po lýzi protoplastů ukázala, že uvnitř vakuol jsou uloženy hydrolytické enzymy, jako proteinasy, ribonukleasa a esterasa, takže vakuoly mají zřejmě podobnou funkci jako lysozomy u vyšších organismů. Kromě toho obsahují vakuoly ještě polyfosfáty a velkou zásobu draselných iontů, aminokyselin a purinů. Dalším membránovým útvarem v cytoplazmě kvasinek je Golgiho aparát, který má tvar plochého měchýřku. Předpokládá se, že funkcí tohoto aparátu je transportovat prekurzory buněčné stěny z cytoplazmy přes cytoplazmatickou membránu. Podobně jako ostatní eukaryota obsahují kvasinky také tzv. cytoskelet, což je síť proteinových vláken, která se rozprostírá v cytoplazmě i v jádře a umožňuje vnitrobuněčný pohyb organel z jednoho místa na druhé. Kromě strukturních útvarů se v cytoplazmě kvasinek nacházejí zřetelná zrníčka rezervních látek, především volutinu a polysacharidu glykogenu. U některých rodů kvasinek se jako rezervní látka vyskytuje tuk, který ve formě velké kapky může za vhodných kultivačních podmínek dosáhnout až 60 % sušiny buňky [1, 2, 9]. 2.1.2.4. Jádro Jádro kvasinek je od cytoplazmy odděleno dvojitou jadernou membránou s velkými póry a je umístěno přibližně ve středu buňky. U nejlépe prostudované kvasinky, tj. Saccharomyces cerevisiae, bylo zjištěno 16 chromozomů v haploidním jádře, což bylo potvrzeno i sekvenací. Diploidní jádro má dvojnásobný počet chromozomů, neboť každý chromozom se v něm vyskytuje dvakrát. Délka DNA jednotlivých chromozomů se značně liší. Určitý úsek DNA chromozomu hraje důležitou roli při dělení chromozomů a jejich segregaci během dělení jádra. Tento úsek se nazývá centroméra. V koncových úsecích chromozomu, tzv. telomérách se vyskytují příčné vazby mezi oběma řetězci DNA. Kvasinkové chromozomy obsahují podobně jako chromozomy ostatních eukaryot chromatin, který se zde skládá z nukleozomálních histonů H2A, H2B, H3 a H4. V jádře druhu Saccharomyces cerevisiae se vyskytuje také nízkomolekulární DNA, která má kruhovou strukturu a je obdobou plazmidů bakterií. V jádru kvasinek je také jadérko srpkovitého tvaru, uložené těsně pod jadernou membránou. Dále je zde zřetelné pólové tělísko vřeténka. Má tvar disku a vychází z něj vlákna zvaná mikrotubuly. Mikrotubuly jsou složeny z bílkoviny tubulinu a spolu s tělískem hrají důležitou roli při dělení jádra během rozmnožování buněk [1, 2, 9].

14

Obr. č. 3: Schéma průřezu buňkou kvasinek: 1 – buněčná stěna, 2 – jizva zrodu, 3 – cytoplazmatická membrána, 4 – jádro, 5 – jaderná membrána, 6 – vakuola, 7 – endoplazmatické retikulum, 8 – mitochondrie, 9 – glykogen, 10 – polymetafosfát (volutám), 11 – lipidy, 12 – Golgiho aparát [1] 2.1.3 Rozmnožování kvasinek 2.1.3.1. Vegetativní rozmnožování Většina kvasinek se rozmnožuje pučením buněk, ale jsou i kvasinky, které se rozmnožují podobně jako bakterie jednoduchým zaškrcením, dělením např. zástupci rodu Schizosaccharomyces. Před pučením dochází ke splývání membrán endoplazmatického retikula a pak k jeho dělení, dále k opakovanému dělení vakuol a ke změně tvaru mitochondrií v dlouze protáhlé. Po počátku tvorby pupenu do něho vstupují drobné vakuoly a mitochondrie. Současně začne mitotické dělení jádra a jeho migrace k pupenu. S jádrem přecházejí do nově vytvořeného pupenu také další složky cytoplazmy. Pak se cytoplazmaticku membránou uzavře kanálek mezi mateřskou a dceřinou buňkou a v pupenu se intenzivně syntetizuje a rozšiřuje endoplazmatické retikulum. Po vytvoření buněčné stěny mezi mateřskou a dceřinou buňkou, vzrůstu velikosti pupenu a spojení drobných vakuol ve vakuolu jedinou je pučení ukončeno. Většinou se dorostlá dceřiná buňka od buňky mateřské ihned oddělí. V některých případech však buňky zůstanou spojeny i po několikátém dělení a vytvoří tzv. ,,buněčné svazky“. Celý cyklus buněčného dělení od vzniku zřetelného drobného pupenu až po oddělení dceřiné buňky trvá za optimálních růstových podmínek kolem dvou hodin. Jiné skupiny vytvářejí pravé mycelium tj. vlákno vznikající příčným dělením protáhlých buněk. Některé druhy rodu Torulopis, vytvářejí při dlouhodobé kultivaci v čistých kulturách

15

pseudomyceliu. Jeho tvorba je podmíněna nedostatkem živin a kultivačními podmínkami. Pseudomycelium je možné pozorovat na okraji kolonií, což jim dodává kořínkovitý vzhled. Jeho rozšiřováním do hloubky nebo po povrchu si kolonie obstarává novou výživu. V určitých místech pseudomycelia vznikají svazky kratších elipsoidních buněk – blastospory. Některé rody kvasinek tvoří jednobuněčné exospory na tenkých stopkách zvaných sterigmata. Zralé spory jsou z těchto stopek odmršťovány pomocí zvláštního mechanismu, a proto dostaly název balistospory [1, 2, 4, 5, 10, 11].

Obr. č. 4: Schéma pučení kvasinek: 1 – jádro, 2 – mitochondrie, 3 – vakuola, 4 – endoplazmatické retikulum, 5 – pólové tělísko vřeténka, 6 – mikrotubuly, 7 – vřeténko [1] 2.1.3.2 Pohlavní rozmnožování kvasinek Vedle vegetativního rozmnožování je u většiny kvasinek znám pohlavní způsob rozmnožování. Výsledkem pohlavního rozmnožování jsou pohlavní spory. Většina kvasinek tvoří jako pohlavní spory askospory, což jsou endospory umístěné ve vřecku neboli asku. Tyto kvasinky proto řadíme mezi Ascomycotina. Některé rody kvasinek tvoří pohlavní exospory, tj. spory umístěné vně sporotvorných buněk. Tyto rody řadíme mezi Basidiomycotina. [Praktikum z obecné mikrobiologie, Mikrobiológia I] Pohlavní rozmnožování je obecně charakterizováno spájením dvou haploidních buněk čili konjugací (nebo kopulací) a spájením jejich jader neboli karyogamií za vzniku diploidního jádra. Pak se diploidní jádro dělí meiózou, tj. redukčním dělením ve čtyři haploidní jádra, která jsou buď základem pohlavních spor nebo se dělí další mitózou a pak teprve vznikají spory. V životním cyklu kvasinek se tedy pravidelně střídá haploidní a diploidní fáze buněk. Při spájení dvou haploidních buněk u askosporogenních kvasinek dochází k okamžité karyogamii a vzniká tak diploidní buňka, která se nazývá zygota. Pokud jsou při spájení obě

16

buňky přibližně stejně velké, jedná se o tzv. izogamní spájení (např. rod Saccharomyces). Jinou možností je spájení velké buňky s malou (může být např. mateřské s dceřinnou), tzv. heterogamní spájení. Spájení mezi mateřskou a dceřinou buňkou je možné pouze u homothalických kmenů. Některé druhy kvasinek tvoří pohlavně rozlišené kmeny heterothalické kmeny. V tomto případě se spájí buňky jednoho párovacího typu s buňkami opačného párovacího typu. Např. u heterothalických kmenů Saccharomyces cerevisiae jsou párovací typy označeny a a α. Pokud je smísíme, dojde k jejich spájení a vytvoření zygot. Po vytvoření zygoty může dojít k vegetativnímu rozmnožování v diploidním stavu – přenesou-li se potom diploidní buňky do vhodných podmínek, nastane sporulace. Celá buňka se přemění v askus. U homothalických kmenů Saccharomyces cerevisiae dojde po vypučení spory ke spájení vzniklých vegetativních buněk a haploidní vegetativní fáze prakticky neexistuje [1, 2, 4, 11]. 2.1.4 Základní výživa kvasinek Růstem buněk kvasinek se rozumí zvětšování obsahu buňky (objemu, velikosti), růstem kultury zvětšování počtu buněk, teda celkové zvětšování živé hmoty kvasinek, tj. biomasy. Na růst a rozmnožování potřebují kvasinky správnou výživu. Výživu přijímají ze živného prostředí, které musí splňovat určité předpoklady. Náročnost na složení živného prostředí vyplývá už z elementárního složení biomasy [7]. Základní složky výživy kvasinek jsou: a/ voda, b/ zdroj uhlíku a dusíku, c/ prvky důležité na výstavbu živé hmoty – biogenní prvky (kyslík, vodík, uhlík, dusík, fosfor a hořčík) d/ prvky potřebné v malém množství – oligobiogenní, stopové prvky, mikroelementy e/ vitaminy a růstové látky 2.1.5 Kultivace kvasinek Kvasinky se kultivují zpravidla při teplotě 25°C až 28°C, jiné rostou lépe při teplotě 20°C nebo 37°C. Nejnižší teplota při které kvasinky mohou růst je 4 až 5°C, nejvyšší 40°C. V kapalném médiu se jejich růst projeví zákalem. Pokud při svém rozmnožování potřebují větší množství kyslíku, projeví se to slizovitou vrstvou tzv. mázdrou. Jindy se rozprostírají jako tenká blanka (kožka) na povrchu tekutiny, která se může zachytávat i na stěnách nádoby spolu se zbytky živné tekutiny. Pokud nepotřebují mnoho kyslíku, tvoří se na povrchu jen prstenec nebo ostrůvky mázdry. Ke kultivaci kvasinek a kvasinkovitých mikroorganismů používáme nejčastěji sladinu jako kapalné živné médium a sladinový agar nebo sladinovou želatinu jako tuhé živné médium. Při mikrobiologické kontrole používáme na jejich izolaci nebo přesnou identifikaci selektivní nebo selektivně-diagnostické živné média [5,7].

17

Obr. č. 5: Kultivace na tuhém sladinovém médiu a na šikmém agaru 2.1.6 Kvasinky účastnící se kvasného procesu u výroby vína Při etanolovém kvašení ovocného moštu mají prvořadý význam vinařské (vinné) kvasinky. Do moštu se dostávají z nejrůznějších druhů ovoce, z nichž největší průmyslový význam mají bobule vinné révy. Každý mošt obsahuje velmi pestrou paletu různých rodů a druhů kvasinek, z kterých je však průmyslově nejdůležitější rod Saccharomyces. Největší uplatnění mají tzv. pravé vinařské kvasinky – Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus (synonymum: Saccharomyces vini) Selekcí se získávají různé kmeny s vlastnostmi, které jsou nejvhodnější pro vlastní technologický výrobní proces a pro konečnou kvalitu vína [1, 12, 13, 14]. 2.1.6.1 Rod Saccharomyces Nejznámější a nejprozkoumanější rod kvasinek je právě rod Saccharomyces. Kvasinkové buňky tohoto rodu se vyznačují kulatým, oválným nebo i protáhlejším tvarem. Vegetativní rozmnožování se uskutečňuje multilaterálním pučením a vegetativní stádium je až na výjimky diploidní. Mezi buňkami také dochází ke konjugaci, jejímž výsledkem je tvorba spor s hladkým povrchem v počtu 1 – 4 v jednom vřecku. Vzhled a konzistence kolonií je těstovitá, krémová, světle hnědá, hladká, lesklá, ale může být i skládaná, kráterovitá, drsná, kučeravá. V kapalných médiích tvoří sediment a při okrajích prstenec, po delším čase se může vytvořit i tenká mázdra. Při pohlavním rozmnožování se střídá haplo-diplobiotický životní cyklus, kdy vegetativní buňky se mění přímo na asky. Kmeny jsou homothalické i heterothalické. Rod Saccharomyces patří mezi Ascomycetes. Velmi častou kontaminující kvasinkou je Saccharomyces pastorianus Hansen. Mezi typické zákalové kvasinky patří S. turbidans a S. validus, tyto kvasinky mohou negativně ovlivnit senzorické vlastnosti budoucího vína [5, 11, 15, 16].

18

100 µm Obr. č. 6: Nativní preparát Saccharomyces cerevisiae. Pozorováno v elektronickém mikroskopu. [16] 2.1.6.2 Rod Hanseniaspora Zahrnuje druhy s různým typem spor, spory kulaté s hladkou nebo bradavčitou stěnou, některé s ekvatoriálním lemem nebo spory kloboukovité. Buňky jsou citrónovité, oválné až protáhlé. Vytváří zpravidla dobře vyvinuté pseudomycelium. Vegetativní buňky jsou diploidní. Kulovité askospory se v zralosti z asků neuvolňují. Askospory klíčí pučením. Kvasinky rodu Hanseniaspora zkvašují sacharidy, neasimiluje nitrát [3, 11, 17]. 2.1.6.3 Rod Rhodotorula Jedná se o kvasinky rozšířené ve vzduchu, v půdě, ve sladkých i slaných vodách, ve vinařských provozech, na rostlinách i v různých orgánech živočišného těla. Vzhled a konzistence kolonií je na agaru korálovočervená, pomerančová, lososová (závisí na složení živné půdy). Okraj kolonie je ucelený, jen zřídka má primitivní pseudomycelium. Kolonie jsou hladké, lesklé, slizovité, řídké i těstovité. V kapalném prostředí se vytváří sediment a prstenec, zpravidla světlé, krémové až světle růžové barvy. Vegetativně se rozmnožuje pučením. Produkují ureázu a lipázu. Patří sem řada druhů: Rh. glutinis (syn. Rh. gracilis) vyskytující se v přírodě nejčastěji. Dalšími zástupci rodu jsou: Rh. aurantiaca, Rh. graminis, Rh. rubra. Všechny druhy rodu Rhodotorula jsou lipidotvorné, hromadí v buňkách tuk - za určitých podmínek až nadměrné množství. S tím souvisí schopnost produkovat lipasy, využívat n-alkany aj. Rh.glutinis byla modelem na zkoumání transportu látek (především pentóz) přes cytoplazmatickou membránu. Mutanty Rh.glutinis rezistentní k nystatinu se používaly na podrobnější zkoumání membránového potenciálu. Patří mezi Basidiomycetes. Produkuje ureázu a lipázu [3, 5, 16, 17].

19

100 µm

Obr. č. 7: Nativní preparát Rhodotorula glutinis. Pozorováno v elektronickém mikroskopu. [16] 2.1.6.4 Rod Pichia Tento rod obsahuje velký počet druhů (asi 40). Zástupci rodu neutralizují nitráty. Tvoří pseudomycelium. Některé druhy mohou tvořit i artrokonidie. Buňky jsou kulovité, elipsoidní, protáhlé. Sacharidy můžou, ale nemusí zkvašovat. Druhy jsou homotalické i heterotalické. Vzhled a konzistence kolonií na tuhých půdách je těstovitý, bílý, hladký a na povrchu moučný. Okraj může být cípovitý nebo kořínkovitý. Na povrchu kapalných médií se tvoří kučeravé suché kožky. Vegetativně se rozmnožuje multilaterálním pučením na zúžené bázi. Patří mezi Ascomycetes. Nejznámější druhy jsou: P. membranaefaciens a dále biotechnologicky využívané methylotrofní druhy P. methanolica a P. pastoris a druh P. stipitis, který dovede zkvašovat D-xylosu. Nejrozšířenější druhy, které způsobují vady alkoholických nápojů jsou Pichia farinosa a Pichia membranaefaciens [3, 11, 16, 17].

100 µm

Obr. č. 8: Nativní preparát Pichia fermentans . Pozorováno v elektronickém mikroskopu. [16]

20

2.1.6.5 Rod Candida Rod se vyznačuje rozmanitými tvary buněk, které multilaterálně pučí. Vytvářejí extracelulární polysacharidy, které se jódem barví na zeleno nebo purpurově. Vzhled a konzistence kolonií je krémová, polomatná, lesklá, hladká. V kapalných prostředích tento druh vytváří sediment a prstenec. Je to anamorfa bez sexuálního rozmnožování. Některé druhy tvořící pseudomycelium mohou asimilovat anozitol. Patří mezi Ascomycetes. Nejznámějším zástupcem je podmíněně patogenní kvasinka Candida albicans. C.tropicalis se zařazuje mezi patogenní kvasinky. Nejčastěji se však vyskytuje jako všeobecný komenzal v ústech, trávicím ústrojí, v plicích, ve vagíně, na pokožce lidí a zvířat. Velmi často se C.tropicalis vyskytuje v kvasném průmyslu, kde svojí houževnatostí a malou náročností na podmínky výživy vytlačuje z fermentačního procesu jiné kvasinky. Používá se na výrobu krmného droždí z netradičních substrátů. Kvasinky tohoto rodu jsou velmi rozšířeny v přírodě, hlavně na ovoci všeho druhu. Nejznámějšími zástupci jsou Candida vini (syn. Candida mycoderma), C. albicans, C. utilis, C. tropicalis, C. krusei [3, 5, 11, 16, 17].

100 µm

Obr. č. 9: Nativní preparát Candida utilis. Pozorováno v elektronickém mikroskopu.[16] 2.1.6.6 Rod Issatchenkia Vegetativně se tyto druhy rozmnožují multilaterálním pučením. Kromě kulovitých a elipsoidních buněk vytvářejí i pseudomycelium. Na povrchu kapalných prostředí vyvářejí kožky. Asky vznikají přímou přeměnou diploidních buněk bez předcházející konjugace. Druhy rodu Issatchenkia neasimilují nitráty, mohou zkvašovat sacharidy. Tuto schopnost však omezují na zkvašování monosacharidů – hexóz. Mají velmi špatnou schopnost utilizovat jakékoliv jiné zdroje uhlíku [11, 17]. 2.1.6.7 Rod Kluyveromyces Kvasinky tohoto rodu také dříve patřily do rodu Saccharomyces. Vyčleněny však byly na základě odlišných vlastností. Vegetativní buňky jsou kulovité nebo elipsoidní až cylindrické. Vyskytují se jednotlivě, v párech i v malých shlucích. Vzhled a konzistence kolonií je hnědokrémová nebo krémovošedá, povrch je hladký i bradavičnatý, slizký i matný. Vytváří se jen rudimentární pseudomycelium. V kapalných médiích vytvářejí sediment a prstenec. Na povrchu mohou vytvářet tenkou kožku. Ve vegetativní fázi růstu převládá haploidní stav. 21

Rozmnožují se pučením. Tvorbě asků předchází konjugace rovnocenných buněk nebo se diploidní buňky přímo mění na asky. V ascích jsou 1-4 ledvinovité spóry. Cukry zkvašují pouze do koncentrace cca 4 % ethanolu. Neuplatňuje se u nich hexosová represe respirace. Patří mezi Ascomycetes. Rod Kluyveromyces zahrnuje druhy dobře zkvašující laktózu. Zástupci jsou Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis [3, 16, 17].

100 µm

Obr. č. 10: Nativní preparát Kluyveromyces marxianus. Pozorováno v elektronickém mikroskopu. [16] 2.1.6.8 Rod Metschnikowia Rod Metschnikowia se vyznačuje multilaterálním pučením. Buňky jsou kulovité, elipsoidní, hruškovité, válečkovité i kosákovité. Pseudomycelium je jen rudimentální a velmi často se ani nevytváří. Jehlicovité askospory se vyvíjejí po 1 – 2 ve vřecku. Zatím bylo izolováno 6 druhů, které se nacházejí v půdě, ve vodním prostředí jako parazité bezobratlých živočichů a na ovoci nebo květech. Mezi vodní druhy patří M. bicuspidata, a její varianty M. zobellii a M. krissii [11, 15, 17]. 2.1.6.9 Rod Schizosaccharomyces Je to jediný rod kvasinek, který se rozmnožuje dělením jako bakterie. Buňky této kvasinky se vyznačují obdélníkovými tvary, netvoří mycelium, charakteristická je tvorba askospor. Jde tedy o kvasinky askosporogenní patřící do řádu Schizosaccharomycetales. Kolonie a nátěr jsou krémové až světle hnědé, měkké, hladké nebo slabě zvrásněné. Okraj je celistvý. V kapalném živném prostředí při teplotě 20 °C se na povrchu kapaliny vytváří po týdnu prstenec. Dříve se rozeznávaly dva druhy, Schizosaccharomyces pombe a Sch. octoporus, který se však v současné době některými badateli zařazuje do samostatného rodu Octosporomyces a druhu O. octosporus. Sch. pombe se rozmnožuje schizotomickým rozpadem na 4 – 8 dceřiných buněk. Používal se jako modelový mikroorganismus pro genetické studie. V některých afrických zemích se uplatňuje při výrobě alkoholického nápoje z prosa, zvaného africké pivo čili pombe. Pomocí této kvasinky se také mohou biologickou cestou stanovit inositol a vitaminy z komplexu B. Nalézá použití i ve vinařství k odkyselování vín, protože dovede využít přítomnou kyselinu jablečnou a vinnou. Kyselina jablečná je jedna z organických kyselin v hroznech, které zhoršují organoleptické vlastnosti vína. Sch.

22

octosporus má tlusté válečkovité nebo protáhlé buňky, v nichž se mohou tvořit vřecka s 8 askosporami [11, 15, 16, 17].

100 µm Obr. č. 11: Nativní preparát Schizosaccharomyces pombe. Pozorováno v elektronickém mikroskopu. [16] 2.1.6.10 Rod Zygosaccharomyces Vegetativní buňky se rozmnožují multilaterálním pučením a jsou kulovité, elipsoidní nebo cylindrické. Pseudomycelium se může vytvořit, ale pravé hyfy se netvoří. Vegetativní fáze je haploidní. V řadě vlastností se tyto kvasinky podobají rodu Saccharomyces, do něhož původně patřily. Mezi několika druhy je třeba uvést zejména osmofilní Zygosacch. rouxii a Zygosacch. bailii [3, 11,17]. 2.1.6.11 Rod Saccharomycodes Rod kvasinek vyznačující se silnými fermentačními schopnostmi. Rozmnožují se bipolárním pučením na tzv. široké základně, kdy pupen budoucí kvasinky je spojen s mateřskou buňkou širokým krčkem a kvasinky mohou pučet na obou koncích (pólech) buňky i ve stejné době. Po pučení se na krčku vytváří přepážka připomínající dělení buněk. Saccharomycodes vytváří velké diploidní citrónovité apikulátní nebo prodloužené buňky. Vzhled a konzistence kolonií je krémovitá a řidší, podobně jako u jiných apikulátních kvasinek. V kapalném prostředí se vytváří usazenina a prstenec. Při pohlavním rozmnožování se vytvářejí asky se 4 kulovitými sporami, které se po vyklíčení ihned spojují, proto u nich nelze hovořit o haploidní vegetativní fázi, někdy dokonce spolu kopulují ještě ve vřecku. Charakteristickým druhem je Saccharomycodes ludwigii. Buňky tohoto druhu mají kosočtverečný až kulovitý tvar a tvoří přechod mezi kvasinkami množícími se pučením a kvasinkami množícími se dělením jako u rodu Schizosaccharomyces. Vyskytuje se v silně sířených mladých vínech, na povrchu hroznů a v moštech [11, 15, 16, 17].

23

100 µm

Obr. č. 12: Nativní preparát Saccharomycodes ludwigii. Pozorováno v elektronickém mikroskopu. [16] 2.1.7 Metabolismus kvasinek – ethanolové kvašení Alkoholové kvašení, je lidmi odedávna využíváno k přípravě alkoholických nápojů. Kvašení neboli fermentace je proces, při kterém dochází k přeměně sacharidů na ethanol a oxid uhličitý. Dokazuje se jednoduše v plynovkách vývojem plynu. Přeměnou cukru na ethanol se blíže zabýval Pasteur, který v roce 1860 dokázal, že v procesu alkoholového kvašení vznikají kromě ethanolu a oxidu uhličitého ještě vedlejší produkty, a to glycerin a kyselina jantarová. Dokázal rovněž, že část cukru spotřebují ke svému růstu kvasinky. C6H12O6 → 2 CH3 – CH2OH + 2 CO2 + energie U kvasinek je pyruvát nejdříve dekarboxylován na acetaldehyd, a ten je pak za součinnosti redukovaného kofaktoru NADH a příslušného enzymu redukován na ethanol. Tím vznikají z jedné molekuly hexosy dvě molekuly ethanolu a dvě molekuly oxidu uhličitého za současného čistého zisku energie dvou molekul ATP [1, 7, 18, 19].

Obr. č. 13: Schématické znázornění tvorby ethanolu Na počátku kvašení, kdy je v prostředí ještě nedostatek acetaldehydu, je redukovaný kofaktor (NADH) dehydrogenován tím, že redukuje jiný meziprodukt glykolýzy, tj. dihydroxyaceton-3-fostát, na glycerol-3-fosfát, který pak poskytuje glycerol. Při alkoholovém kvašení se tak vytvoří asi 3 % glycerolu. Výtěžek glycerolu však můžeme zvýšit až na 25 % tím, že odstraňujeme vznikající acetaldehyd, čímž se ovšem sníží výtěžek ethanolu.

24

Při průmyslovém etanolovém kvašení vzniká kromě ethanolu a malého množství glycerolu ještě řada vedlejších produktů, které se vyskytují v poměrně nízkých koncentracích, ale mají značný technologický význam. Především jsou to vyšší jednosytné alkoholy (propanoly, butanoly a pentanoly), které se tvoří hlavně z aminokyselin odumřelých kvasinkovitých buněk a jsou v lihovarství získávány ve formě tzv. přiboudliny, jež má použití při výrobě laků. Vznikající estery, které se nepříznivě hodnotí v pivovarnictví, mají ve vinařství pozitivní význam, protože jsou součástí tzv. buketu vína. Tvoří se esterifikací organických kyselin ethanolem, přičemž zdrojem těchto kyselin je většinou vinný mošt nebo jiná surovina. Z pyruvátu vzniklého glykolýzou se při ethanolovém kvašení tvoří také malé množství fermentačních produktů, jež jsou velmi nežádoucí, především v pivovarnictví, neboť již ve velmi malých koncentracích nepříznivě ovlivňují chuť hotového výrobku. Etanolové kvašení se uplatňuje i při použití pekařského droždí, kynutí těsta je výsledkem produkce oxidu uhličitého při probíhajícím etanolovém kvašení. Během kvašení se uvolňuje velké množství tepla. Proto je velmi důležité pečlivě sledovat teplotu [1, 10, 20, 21, 22, 23].

2.2 Vinařství Vinařství je potravinářské výrobní odvětví zabývající se zpracováním vinné révy (Vitis vinifera). Technologicky navazuje na vinohradnictví, obor rostlinné zemědělské výroby, které se zabývá pěstováním stolních odrůd révy vinné, určených k přímé spotřebě a moštových odrůd révy vinné, určených k výrobě hroznových vín. Na víno se zpracuje asi 90 % hroznů, 10 % se spotřebuje jako ovoce nebo k přípravě nealkoholických nápojů. Pěstování vinné révy na našem území je podle geologických nálezů známo necelé dva tisíce let, k rozšíření vinařství v široké míře však došlo až za vlády Karla IV. Révové víno je nápoj vyrobený částečným nebo úplným zkvašením rmutu či moštu připraveného z hroznů révy vinné. Vlastnosti vína jsou výsledkem velmi jemných biochemických pochodů probíhajících již při zrání v bobulích hroznů jednotlivých odrůd révy a pokračujících nejen při kvašení moštu, ale i během jeho vývoje a zrání ve sklepech a v lahvích. Zde se mění původní odrůdové aroma v kvasný a ležácký buket, který společně s chuťovými vjemy určuje jakost vína. V současnosti je známo několik tisíc odrůd, z nichž se v praxi využívá pouze několik set [24, 25, 26, 27]. Odrůdy ušlechtilé vinné révy pěstované v našich podmínkách jsou podle praktické upotřebitelnosti zařazeny do tří jakostních tříd: I. a třída – výběrové odrůdy, např. Burgundské bílé, Ryzlink rýnský, Sauvignon, Furmint, Tramín, Muškát žlutý, Muškát Ottonel a tokajské odrůdy I. b třída – kvalitní odrůdy pěstované ve velkém rozsahu, např. Neuburské, Ryzlink vlašský, Müller-Thurgau, Sylvánské červené a zelené, Svatovavřinecké, Semillon, Frankovka, Cabernet a jejich směsi II třída – Bouviérův hrozen, Ezerjó, Malingerovo rané, Čabaňská perla, Vetlínské a omezeně Portugalské modré a jejich směsi III třída – stolní odrůdy např. Bratislavské bílé, Chrupka, Irsay Oliver, Kadarka bílá a červená a jejich směsi

25

2.2.1 Hrozny vinné révy Nejdůležitější chemickou složkou bobulí hroznů jsou cukry a organické kyseliny. Obsah cukru se pohybuje od 10 do 24 % a je závislý nejen na odrůdě, ale i na klimatických a půdních podmínkách daného ročníku a jeho zralosti. Přítomný cukr je tvořen převážně glukosou a fruktosou a to ve stejném množství. Z organických kyselin převládá v dužině hroznů kyselina vinná a dále jsou přítomny kyselina jablečná, kyselina citronová a další. Kyselina vinná je přítomna i ve formě hydrogenvinanu draselného, který je ve vodě málo rozpustný a ještě méně v ethanolu, takže při kvašení se vylučuje a usazuje se v kvasných nádobách jako vinný kámen. Dalšími chemickými složkami hroznů jsou třísloviny, tuky, dusíkaté látky, minerální látky, barviva a aromatické látky. Chemické složení a chuťové vlastnosti hroznů a zejména dužniny mají rozhodující vliv na kvalitu vyráběného vína. Z nedostatečně zralých hroznů se nemohou vyrobit kvalitní vína, protože základní složky pro tvorbu aromatických látek se dosud nevytvořily, anebo jsou v bobulích chemicky vázány. Slupka bobulí bývá různě zabarvená a na jejím povrchu je tenká vosková vrstva zabraňující odpařování vody. Barviva a aromatické látky ze slupek ovlivňují odrůdový charakter, chuť i vůni budoucího vína. Slupky zejména modrých odrůd mají vysoký obsah polyfenolů [6, 24, 26, 27, 28]. 2.2.2 Zpracování hroznů na mošt Sklizené hrozny se dopravují do zpracovatelských závodů k přejímce hroznů v různých obalech (přepravky, kádě, sudy, nákladní vozy) podle místních zvyklostí. Při skládce hroznů se zjišťuje hmotnost na poloautomatických váhách, automatických váhách, popřípadě na mostových váhách. Dále se při přejímce stanovuje průměrná cukernatost a jakost podle zdravotního stavu, odrůdy a obsahu cukru. K zjišťování cukernatosti slouží speciální moštoměry nebo refraktometr. Hrozny se obvykle sklízí i se stopkami. Vzhledem k tomu, že stopky obsahují velké množství taninu, často se okamžitě po přivezení do vinařského závodu odstraňují. Odstopkování lze provádět ručně (pouze u lepších vín) nebo strojově. K získání kvalitního čistého moštu požadované jakosti se hrozny zpracovávají různými operacemi, jako je mlýnkování, odzrňování, scezování a lisování. Všechny tyto operace se provádějí v lisovně [6, 20, 24, 26, 27, 28].

26

Obr. č. 14: Příjem hroznů do vinařského závodu Mlýnkování slouží k rozdrcení bobulí a provzdušnění drtě. Dělá se různými typy mlýnků (válcovými, bubnovými, kladívkovými, odstředivými). Nejrozšířenější jsou válcové mlýnky. Při použití některých typů odzrňovačů a lisů se mlýnkování nemusí dělat. Čím lépe se bobule rozdrtí, tím je vyšší výtěžek moštu. Mlýnek musí být seřízen tak, aby nedocházelo k porušení semen a třapin. Rozmleté hrozny s třapinami nebo i po odzrnění se nazývají rmut. Odzrňování slouží k odstranění třapin z rmutu, aby do moštu nepřecházely nežádoucí látky. Odzrňování se dělá na různých typech vystíracích či odstředivkových odzrňovačů, v nichž se v perforovaném válci zachycují třapiny, kdežto rmut jím protéká do sběrné nádrže. Odzrňování hroznů je důležité hlavně u hroznů s ještě zelenými třapinami, ze kterých přechází do moštu chlorofyl dodávající vínu trávovou chuť. Stroje, které umožňují mlýnkování a odzrňování najednou, se nazývají agrapumpy nebo fulograpy. Vína z odzrněných rmutů jsou chuťově jemnější a jakostnější. Hůře se však lisují a pomaleji se čistí, neboť obsahují méně tříslovin. Neodzrněné hrozny se lépe lisují, protože třapiny působí jako drenáž a usnadňují odtékání moštu. Pro zlepšení lisovatelnosti se přidávají pektolytické enzymové preparáty. Scezování může být samostatnou technologickou operací nebo je součástí lisovacího procesu. Slouží k oddělení nejkvalitnější části moštu, která se nazývá samotok. Provádí se ihned po předchozí operaci, aby se předešlo okysličení moštu a jeho obohacení tříslovinami vyluhujícími se z třapin. Lisování má za účel oddělení šťávy, která byla uvolněna z buněk předchozími technologickými operacemi. Používají se periodické i kontinuální lisy, hydraulické i pneumatické lisy. U periodických lisů se po naplnění násypného prostoru lisuje rmut hydraulickým nebo šroubovým tlačným zařízením. Vylisovaný mošt vytéká z lisu do nádrže. Lisuje se pozvolna s občasným přerušením, aby výtěžek moštu byl co největší. Při použití vysokovýkonných kontinuálních lisů se do moštu může dostat následkem většího tlaku více nečistot, což snižuje kvalitu vína. Rmut ze světlých hroznů pro výrobu bílého vína se lisuje ihned. Při zpracování silně aromatických světlých i při zpracování modrých hroznů a při výrobě červených vín se před lisováním rmut nakvašuje. Bílé odrůdy obvykle 1 den, červené odrůdy 4 – 14 dní podle požadovaného charakteru vyráběného vína. Nejčastěji se tento proces

27

provádí při teplotě 20 – 25°C v závislosti na zpracovávané odrůdě. Při nakvašování přecházejí barviva ze slupek a třísloviny z peciček do rmutu. U moderních výrobních linek se pracuje kontinuálně pod tlakem oxidu uhličitého. První podíl vylisovaného moštu (samotok) je nejkvalitnější, neboť obsahuje nejméně tříslovin, a proto se někdy zpracovává odděleně. Pro výrobu vybraných speciálních a zpravidla velmi drahých značek vín je dokonce podmínkou, aby víno bylo získáváno pouze kvašením samotoku. Pevné vylisované zbytky hmoty bobulí se nazývají matoliny. Ze 100 kg hroznů se získá obvykle 90 l rmutu, tj. 75 l moštu. Z celkového výtěžku moštu připadá 60 % na samotok, 26 % pochází z prvního lisování, 10 % z druhého lisování a 4 % z třetího lisování [6, 24, 26, 27]. 2.2.3 Úpravy moštu K dosažení optimální kvality moštu, zaručující hladký průběh kvašení a vysokou jakost vyrobeného vína, je třeba mošt získaný lisováním dodatečně upravovat. V praxi se provádí odkalování, provzdušňování, síření, odkyselování, okyselování a úprava cukernatosti moštu [24, 26]. Odkalování moštu slouží k oddělení hrubých kalů a nečistot, s nimiž se částečně strhávají i kontaminující mikroorganismy. Odkalují se mošty z kontinuálních lisů a mošty z mechanicky a mikrobiálně poškozených hroznů. Provzdušňování se dělá u zdravých moštů skladovaných v nepropustných tancích a nádržích. Prosycení moštu kyslíkem je nezbytným předpokladem dobré činnosti kvasinek. Síření slouží k ochraně moštů před bakteriální a plísňovou kontaminací, před oxidací a před jinými vadami. Síří se oxidem siřičitým dávkou 25 – 50 mg/l. Oxid siřičitý se také váže na acetaldehyd, který způsobuje zvětralou chuť vína a zároveň zabraňuje druhotnému kvašení v lahvích. V praxi se síří všechny mošty, aby se předešlo chorobám a vadám vína. Oxid siřičitý potlačuje činnost nežádoucích mikroorganismů, zejména bakterií a divokých kvasinek a současně příznivě ovlivňuje senzorický charakter následného vína podporou tvorby glycerolu. Odkyselování má za účel snížení kyselosti moštů s nízkým obsahem cukru. Odkyseluje se buď čistým vápencem, který váže kyselinu vinnou nebo průtokem přes vrstvu anexu, popř. míšením kyselých moštů s méně kyselými. Okyselování se provádí v letech s nízkým obsahem kyselin v moštu. Přidává se kyselina vinná v množství 1 – 2 g/l tak, aby celková kyselost byla 7 – 8 g/l. Úprava cukernatosti moštu se dělá v nepříznivých letech, kdy mošty obsahují málo cukru a příliš kyselin. Upravuje se přídavkem cukru, zahuštěným moštem. Podle ČSN je povoleno upravovat mošty, které nedosáhly 25 °ČNM, nejvýše dávkou cukru 4 kg/hl. Při úpravě cukernatosti je třeba postupovat opatrně, aby se přílišným přislazením nezměnil odrůdový charakter vína. Optimální je poměr 20 – 25 °ČNM cukru na 6 – 10 % kyselin. V příznivých vegetačních ročnících je tento poměr zachován a není třeba mošty přislazovat [6, 20, 24, 26, 27, 28].

28

2.2.4 Kvašení moštu Dříve se využívalo především spontánní kvašení způsobené kvasinkami ulpěnými na povrchu hroznů. Dnes se používá čisté neboli řízené kvašení. Kvašení začíná buď samovolně (spontánně) činností kvasinek obsažených již v moštu, anebo se mošt zakvašuje čistou kulturou vyšlechtěných kvasinek. Ty zajišťují rychlé rozkvašení moštu, dokonalejší prokvašení cukru obsaženého moštu a také čistější kvašení, neboť rychlejší tvorba ethanolu zabraňuje rozmnožování nežádoucích mikroorganismů. Kvašení probíhá ve vertikálních či horizontálních tancích a má tři fáze: 1/ Začátek kvašení - je charakteristický pozvolným rozmnožováním kvasinek a pomalým začátkem prokvašování cukrů moštu a trvá 2 – 3 dny. 2/ Bouřlivé kvašení - nastává třetí až čtvrtý den a projevuje se vývinem tepla, zvýšením teploty až nad 25°C a uvolňováním oxidu uhličitého, který strhává i aromatické a těkavé buketní látky. V této fázi kvašení se musí regulovat teplota v rozmezí 15 – 18°C a u chladnomilných kmenů kvasinek v rozmezí 10 – 12°C. Bouřlivé kvašení trvá několik dnů až týdnů. Kvašení při nižších teplotách trvá déle, ale vyrobená vína jsou kvalitnější. 3/ Dokvašování - je poslední fáze kvašení, která nastává po poklesu obsahu cukru na 2 – 5 g/l a trvá 1 – 2 měsíce, někdy i půl roku. Činnost kvasinek se postupně omezuje, až zcela ustane. Po ukončení kvašení a zastavení vývinu oxidu uhličitého začnou kvasinky sedimentovat na dno tanku a usazují se i kaly. V období od ukončení alkoholového kvašení do stáčení vína z kvasničných kalů probíhá tvorba révového vína. Probíhají při ní různé biologické a fyzikálně-chemické procesy – biologické odbourávání kyselin. Tyto biochemické procesy jsou doprovázeny vylučováním vinného kamene ve formě vinanu vápenatého a hydrogenvinanu draselného a procesy samočištění vína při nichž se srážejí a sedimentují shluky molekul opačného náboje organického i anorganického charakteru. Víno se pozvolna samovolně čistí. Čištění vína lze urychlit čiřením [6, 24, 26, 27]. Biologické odbourávání kyselin je proces, při němž se působením bakterií, především mléčného kvašení, mění kvalitativní i kvantitativní poměry nižších organických kyselin ve víně. Chuťově méně příznivé kyseliny jablečná, citrónová a další se přeměňují na kyselinu mléčnou a další produkty, které poskytují vínu jemnější chuť a zlepšují jeho stabilitu. Dokvašené víno se odděluje od sedimentu kalů a kvasinek stáčením do čistých zasířených kvasných tanků. Při prvním stáčení se víno obvykle provzdušní a nastane další vysrážení kalů, především tříslobílkovinných. Proto se po 6 – 8 týdnech víno stáčí znovu. Víno po ukončení kvašení se nazývá mladé víno [24, 26, 28]. 2.2.5 Ošetřování a školení vína Ošetřování a školení vína vytváří jeho konečné organoleptické vlastnosti a celkový charakter. Po kvašení se víno ukládá do zasířených ležáckých tanků nebo cisteren. Ležácké nádoby se dolévají vínem, aby byly stále plné, a tím se zamezilo přístupu vzduchu a kontaminaci. Dolévá se vínem stejné odrůdy a třídy jakosti. Víno ležením v tancích zraje. Při

29

stálé a nízké teplotě v ležáckém sklepě dochází k vytváření buketu a k harmonickému vyrovnání senzorických vlastností – vůně a chuť se zaokrouhlují. Školení vína se provádí před plněním do lahví a zahrnuje čiření, stabilizaci, pasteraci a filtraci [24, 26]. K čiření vína, pokud neproběhne v dostatečné míře samovolně, se používá srážecích prostředků, které se ve víně srážejí přítomnými nebo přidanými tříslovinami, dále hexakyanoželeznatan draselný, který sráží těžké kovy za vzniku sraženiny berlínské modři, čímž se z vína strhávají i jemné koloidní látky. Ke stabilizaci vína se používají adsorpční prostředky, na které se koloidní složky vína adsorbují. Víno lze stabilizovat též chladem, neboť silné podchlazení vína pod 0 °C snižuje rozpustnost hydrogenvinanu draselného, který vypadává z vína ve formě krystalků. Pasterace vína se provádí krátkodobým ohřevem na 60 – 70 °C v deskových průtokových výměnících tepla a následným rychlým ochlazením. K filtraci vína se používají nejčastěji deskové nebo naplavovací křemelinové filtry, obdobně jako v pivovarství, a v moderních vinařských provozech se zavádí „cross-flow“ filtrace a membránové filtrace. Místo filtrů lze použít též vysokoobrátkové kalové odstředivky. Po skončení školení, kdy víno je optimálně vyzrálé a je ukončen proces tvorby aroma a chuti vína, což většinou trvá nejdéle rok, se provádí závěrečné úpravy hotového vína a poté se víno plní do lahví či jiných expedičních obalů. Závěrečné úpravy hotového vína zahrnují scelování vína, úpravu koncentrace zbytkového cukru, ethanolu a kyselin, odkyselování či okyselování, barvení či odbarvování, alkoholizování a osvěžování vína [6, 24, 26].

Obr. č. 15: Zrání vína 30

2.2.6 Odrůda Sauvignon Tato odrůda pravděpodobně pochází z francouzského regionu Bordeaux nebo z vinařských oblastí na Loiře. Nové genetické poznatky ukazují na to, že asi vznikl ze samovolného křížení mezi odrůdami Chenin blanc a Tramín. Francouzský název je Sauvignon blanc nebo Sauvignon jaune a je nutné ho dobře odlišovat od méněcenné odrůdy s velkým hroznem Sauvignon vert neboli Sauvignonasse. Sauvignon vyžaduje velmi dobré svahové polohy s chudšími, nejlépe štěrkovitými půdami. Na úrodných půdách roste příliš bujně. Vyšší půdní a vzdušná vlhkost ovlivňuje příznivě vznik aromatických látek. Sauvignon patří k nejkvalitnějším vínům severních vinařských oblastí. V závislosti na ročníku, stanovišti, době sběru a na technologii tvorby vína se vyvíjejí různé typy vína této odrůdy. U zahraničních Sauvignonů se většinou setkáváme s víny plnými, často i s minerální příchutí, hlavně z půd křemičitých (francouzská oblast Sancerre) nebo s víny tělnatějšími z půd hlinitých či s filigránskou stavbou a bohatou hrou vůní z půd vápenitých. Z velkých sklizní a horších ročníků mohou být vína Sauvignonu lehká a tvrdá. Intenzita aromatických látek, kterou vnímáme v mladých vínech současně se svěžestí mladého vína, je pro mnohé milovníky Sauvignonu velmi svůdná. V plné síle se objevuje hlavně u Sauvignonů z Nového Zélandu, kde její vývoj podporuje vysoká vzdušná vlhkost a velký počet slunečných dní při nižší průměrné teplotě. V méně příznivých ročnících, v severnějších oblastech a při vyšší vlhkosti vznikají travnaté, kopřivové či paprikové tóny ve vůni i chuti. Při vyšším slunečním svitu a lepší vyzrálosti hroznů se začínají objevovat ovocné tóny. Zráním Sauvignonu v lahvi se většinou ony mladistvé tóny ztrácejí a ve víně se rozvíjí hlavně lahvová zralost. Spolu s ní narůstá i vyšší barevný tón vína a jeho plnost [29, 30, 31]. U nás je to kvalitní víno žlutozelené barvy, s výraznou vůní i chutí s tóny po broskvích, černém rybízu, po kopřivách, podle půdních podmínek a ročníku. Sauvignon z jižních a zámořských zemí je extraktivním vínem s intenzivní vůní lišící se od vůně našich Sauvignonů. Specifický charakter se vyskytuje u vín vyrobených z hroznů napadených plísní Botrytis cinerea. Vysokou kvalitu s jemnými tóny vanilky a tříslovin získávají tato vína prokvašením v dubových sudech. Ve střední Francii je to jedna z hlavních bílých moštových odrůd [27].

31

Obr. č. 16: Odrůda Sauvignon 2.2.7 Škodlivé kvasinky v kvasném průmyslu Základním mikrobiologickým požadavkem v kvasném průmyslu je zavádění výhradně čistých kultur, tzv. produkčních kvasinek do všech technologických výrobních procesů. Všechny ostatní kvasinky vyhodnocujeme při mikrobiologických kontrolách v kvasném průmyslu jako kvasinky škodlivé – divoké. Jejich škodlivost spočívá především v enzymové činnosti. Svými enzymy nepříznivě ovlivňují technologickou jakost surovin, kvasných substrátů, fyziologickou činnost čistých kultur kvasinek, kvasný proces a kromě čistého lihu i finální výrobky. Z hlediska technické praktické mikrobiologie, rozdělujeme tyto škodlivé kvasinky na: a/ křísotvorné – které v tekutých substrátech (sladině) tvoří křís neboli mázdru b/ zákalotvorné – které v tekutých substrátech tvoří zákaly c/ sedimentující – které tvoří sedlinu K jejich bližší identifikaci používáme kritéria morfologická (velikost, tvar buněk, způsob pučení, tvorba pseudomycelia, spor) a kritéria biochemická (způsob zkvašování a prokvašování cukrů, popřípadě jiných uhlíkatých zdrojů, tvorba kyselin) [5]. 2.2.8 Integrovaná produkce hroznů a vína Integrovaná produkce (IP) představuje způsob zemědělského hospodaření, jehož základním cílem je zajištění trvale udržitelného rozvoje ve smyslu § 6 zákona č.17/1992 Sb. v aktuálním znění o životním prostředí, tedy rozvoje, který umožňuje zachovávat přirozené funkce agroekosystému a ostatních ekosystémů, jež jsou zemědělskou produkcí přímo či nepřímo ovlivňovány. Integrovaná produkce usiluje o dosažení optimálních výnosů vyšší kvality cestou, která nezatěžuje životní prostředí. Na bázi celistvého způsobu myšlení se IP orientuje komplexně na agroekosystém; je zaměřena na zemědělský podnik jako celek. Základem je udržení, resp. 32

zlepšení půdní úrodnosti a mnohotvárného životního prostředí. Přednostně se využívají a podporují přirozené regulační mechanismy. K ochraně životního prostředí s ohledem na hospodárnost a společenské požadavky se vyžaduje smysluplný soulad mezi biologickými, technickými a chemickými opatřeními. Dalším základním požadavkem je důsledný systémový přístup k celé technologii pěstování a zpracování révy, jehož cílem je optimalizace ekonomických a ekologických hledisek produkce. Veškeré technologické postupy, které registrovaní členové svazu používají ve svých vinicích, musí odpovídat přesně stanoveným mezinárodním kritériím Svazu IP. Tyto kritéria jsou v České republice vydávána přibližně ve dvouletých cyklech pod názvem „Směrnice svazu integrované produkce hroznů a vína“ a jsou v sídle Svazu volně dostupná. Směrnice IP hroznů a vína jsou zpracovány s přihlédnutím k požadavkům na systémy IP révy vinné, jež pro švýcarské vinohradnictví zpracovali Basler a Murisier (1990) a jež jsou dnes podkladem k mezinárodně kladeným požadavkům na systémy IP révy vinné, které jsou zpracovány v rámci organizace IOBC. Tyto směrnice stanovují limitující a doporučená kritéria pro jednotlivé technologie pěstění. Při jejich dodržování bude finální produkt (stolní hrozen, víno) deklarován jako produkt z IP a označen ochrannou známkou [32]. 2.2.8.1 Seznam zakázaných účinných látek pro rok 2009 Mezi zakázané účinné látky, které nesmí být obsaženy v přípravcích na ochranu rostlin používaných v IP révy vinné, patří následující látky (dle nařízení vlády č. 79, § 8 odst. 5): alpha-cypermethrin, bifenthrin, carbofuran, cypermethrin, deltamethrin, dichlobenil, dimethoate, diquat dibromide, fenazaquin, fenithrothion, fenpyroximate, chlorpyrifos-methyl, chlorpyrifos, chlorothalonil, lambda-cyhalothrin, paraquat, pirimiphos-methyl, propyzamide, pyrethriny (= směs přírodních pyrethroidů), terbuthylazine, triazamate, zeta-cypermethrin. 2.2.8.2 Seznam přípravků na ochranu rostlin, které lze používat v rámci opatření integrované produkce pěstování ovoce a révy vinné (dle nařízení vlády č. 242/2007, podle § 14a odst. 4 písm. a) a odst. 5 písm. a) a e)) Příklady jednotlivých povolených přípravků na ochranu rostlin jsou uvedeny v tabulce č. 1 Tab. č. 1: Příklady jednotlivých povolených přípravků na ochranu rostlin [32] ACROBAT MZ ( dimethomorph + mancozeb ) Fungicidy EUPAREN MULTI ( tolylfluanid ) QUADRIS ( azoxystrobin ) KOCIDE 2000 (hydroxid Cu++) CASCADE 5 EC ( flufenoxuron ) Insekticidy a akaricidy INTEGRO (methoxyfenozide) OLEOEKOL ( chlorpyrifos + olej řepkový + methylester ) SULKA ( polysulfidická síra ) AMINEX PUR ( MCPA ) Herbicidy BASTA 15 ( glufosinate-NH4 GLYFOGAN 480 SL ( glyphosate ) TOUCHDOWN ( glyphosate - trimesium )

33

2.3 Polymerasová řetězová reakce (PCR) Zvedení polymerázové řetězové reakce (PCR) v roce 1985 Kary B. Mullisem, znamenalo pro molekulární biologii stejný přínos jako objev restrikčních endonukleáz nebo zavedení sekvencování DNA. Polymerasová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) je enzymová metoda sloužící k rychlé syntéze velkého množství definovaného úseku DNA in vitro, pro nějž jsou k dispozici oligonukleotidové primery komplementární k 3´ a 5´ koncovým sekvencím úseku, jenž má být amplifikován. Tato metoda, která znamenala revoluci v metodice molekulární biologie, poskytuje až 106 násobné pomnožení během 2 – 3 hodin. Metoda má také význam pro diagnostiku patogenních mikroorganismů a detekci genetických poruch. Jednotlivé kroky amplifikace zahrnují: [8, 18, 33, 34, 35] 1/ denaturaci templátu 2/ připojení primerů 3/ syntéza vlákna DNA Opakování těchto kroků vede k syntéze segmentu s konci definovanými primery, které jsou inkorporovány do nově vznikajících molekul. Fragmenty této délky tvoří hlavní produkt reakce, ale kromě toho vznikají i delší fragmenty DNA. Jejich podíl se však v průběhu reakce snižuje. Při prvním reakčním cyklu vznikají delší fragmenty než odpovídá vzdálenosti vymezené zvolenými primery. Ve druhém cyklu poskytují tyto nově vzniklé molekuly již fragmenty DNA požadované délky, jejichž podíl exponenciálně roste v následujících cyklech reakce. Delší molekuly budou produkovány i nadále, ale jejich množství bude stoupat pouze lineární rychlostí. Doba zdvojení odpovídá jednomu cyklu denaturace templátu, připojení a extenze primeru [33]. Vzhledem k vysoké citlivosti detekce je možné PCR použít pro zjištění přítomnosti velmi malého množství nukleové kyseliny ve vzorku (teoreticky by měla stačit jediná molekula DNA nebo ve zvláštních případech RNA). Základem úspěšné reakce je použití neporušeného úseku DNA, který má být amplifikován (pomnožen). Velmi důležitým předpokladem pro úspěšnou reakci je navržení vhodných primerů tak, aby byla zajištěna specifita reakce. Jak návrh oligonukleotidových primerů tak programování reakčních kroků vychází z obecné znalosti struktury DNA a ze znalosti sekvence, k níž jsou příslušné oligonukleotidy komplementární. Je tedy nutné zdůraznit, že pro PCR je nutno znát sekvence alespoň hraničních úseků fragmentu, který má být amplifikován [33, 34]. Pro PCR jsou nutné: [33] 1/ 2 oligonukleotidové primery (každý cca 20 nukleotidů) komplementární k 3´- koncovým sekvencím obou komplementárních řetězců úseku, jenž má být amplifikován. 2/ cílová DNA, která slouží jako templát pro reakci. Jedná se o úsek izolované dvojřetězcové DNA, která zahrnuje sekvenci vymezenou oběma primery 3/ termostabilní DNA polymerasa, stálá i při teplotě 95°C. 4/ směs všech čtyř deoxyribonukleotidů 5/ vhodný pufr obsahující Mg2+ ionty

34

Tab. č. 2: Struktura stavebních kamenů DNA [37]

Adenin

6-aminopurin

Cytosin

4-aminopyrimidin-2-ol

Thymin

5-methylpyrimidin-2,4-diol

Uracil

pyrimidin-2,4-dion

2.3.1 Princip a průběh reakce Princip PCR je založen na replikaci nukleových kyselin, která je základním molekulárním procesem všech živých organizmů. Podstatou PCR je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5´→ 3´ prostřednictvím DNA-polymerázy. DNA, která má být reprodukována je zahřáta tak, aby došlo k oddělení dvou řetězců templátu. Jsou přidány dva primery, které jsou komplementární ke koncovým sekvencím oblasti, jež má být amplifikována. Při ochlazení na vhodnou teplotu tyto primery nasednou na komplementární úseky templátu. Je přidána termostabilní DNA polymerasa a směs deoxynukleotidů (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), které slouží jako stavební kameny pro syntézu nových řetězců DNA podle templátu. Směs je inkubována při teplotě vhodné pro syntézu po dobu nutnou pro dokončení celého úseku. Cyklus je opakován. Nově vzniklá vlákna slouží rovněž jako templáty pro syntézu dalších vláken. Řetězová reakce poskytuje exponenciální amplifikaci originální DNA, kde počet cyklů (n) určuje kolik kopií (2n) je syntetizováno [34, 35, 36, 38, 39]. Vlastní průběh PCR zahrnuje periodické opakování tří cyklů představujících denaturaci templátu, připojení primerů a syntézu vlákna DNA. Denaturace templátu – tohoto efektu je dosaženo zvýšením teploty vzorku na 95 °C. DNA je denaturována zpravidla 1 – 5 min. Je důležité, aby došlo ke kompletní denaturaci (oddělení) obou vláken. Jinak by totiž mohlo dojít k velmi rychlé renaturaci celé molekuly, což by zabránilo interakci s primery. 35

Připojení primerů (annealing) – tímto druhým stupněm je vlastně denaturace, při níž je reakční směs ochlazena na zvolenou teplotu, která se (dle teploty charakterizující stabilitu duplexu DNA-primer) pohybuje kolem 55 °C. Teplota vhodná pro tuto reakci závisí na délce oligonukleotidu a na zastoupení A-T a G-C párů (tři vodíkové můstky fixující G-C zvyšují stabilitu a tím i denaturační teplotu). Lze ji zpravidla vyčíst přímo z údajů výrobce primerů. Syntéza vlákna DNA – jedná se o extensi připojených primerů DNA polymerasou. V této fázi jsou tedy připojovány jednotlivé deoxynukleotidy ve směru 5´→ 3´. Teplota je v případě použití Taq polymerasy při tomto kroku zvýšena na 75 °C, což je teplotní optimum tohoto enzymu. Výtěžek je závislý na vhodných reakčních podmínkách, které je často třeba optimalizovat. Jedná se zejména o koncentraci Mg2+ iontů a teplotu annealingu. Kromě molekuly DNA, jejíž úsek má být kopírován, jsou v mikrozkumavce přítomné i ostatní složky reakční směsi [33, 34].

Obr. č. 17: Schématická znázornění jednotlivých kroků PCR Výsledným produktem PCR jsou amplikony – úseky DNA definované délky o velikosti obvykle desítky až tisíce bp, analogické restrikčním fragmentům, jejichž přítomnost se v reakční směsi prokazuje stanovením jejich velikosti elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu nebo kvantitativním měřením množství produktu v reálném čase [35].

36

2.3.2 Požadavky kladné na primery Přesnost a úspěšnost PCR při amplifikaci určitého genu nebo části sekvence genomové DNA je závislá na pečlivém návrhu obou primerů, při němž je třeba přihlížet k celkové sekvenci studovaného genomu. Pro genom o velikosti 3 miliardy bp je teoreticky postačující sekvence primeru o délce 16 nukleotidů. Sekvence o této délce by měla být v genomu uvedené velikosti jedinečná a měla by se proto vázat specificky jen k jedinému místu. Ve většině reakcí je vhodná sekvence a koncentrace primerů parametrem rozhodujícím o úspěšném výsledku. Existuje celá řada počítačových programů sestavených pro návrh vhodných primerů. Pro návrh vhodných primerů platí několik zásad. Je třeba však zdůraznit, že nejsou universální, ale pouze orientační [8, 33, 34, 35, 36, 40]. -

-

zpravidla obsahují 18 – 24 nukleotidů neobsahují sekundární strukturu (nejsou v nich inverzně opakované sekvence) mají vyvážený poměr G/C a A/T párů nejsou vzájemně komplementární (netvoří vzájemně dimery) mají přijatelnou teplotu tání, která dovoluje jejich připojení k templátu (cca 55°C – 65 °C) – vyšší teplota zpravidla představuje vyšší specifiku, oba primery by měly mít podobnou teplotu tání jejich optimální koncentrace v reakci je zpravidla 0,1 – 0,6 µM, vyšší koncentrace mohou vést ke vzniku nespecifických produktů na 5´- konec je možné přidat nekomplementární báze (např. pro zavedení restrikčního místa)

2.3.3 Termostabilní DNA polymerasy PCR využívá termostabilní DNA polymerasu pro opakovanou syntézu obou vláken. Podmínka teplotní stability enzymu je dána tím, že jedním krokem opakovaných cyklů je denaturace DNA tj. oddělení komplementárních vláken templátu za vysoké teploty (cca95°C). Pokud by byla DNA polymerasa při tomto kroku inaktivována (což je případ všech běžných enzymů), bylo by nutno je při každém cyklu po denaturaci přidat. V principu by byl tento postup možný, metoda by se však stala natolik nákladnou, že by byla nepoužitelná. Použití termostabilní DNA polymerasy (Taq DNA polymerasa) z termofilní bakterie Thermus aquaticus zajišťuje dostatečnou aktivitu enzymu po celou dobu amplifikace. Taq DNA polymerasa má teplotní optimum při 75 °C a poločas inaktivace při 95 °C je přibližně 40 min. Jedná se o enzym, který má pouze 5´→ 3´polymerasovou aktivitu a postrádá 3´→ 5´ exonukleasovou aktivitu což znamená, že tento enzym není schopen opravovat chyby vzniklé při replikaci. Je-li použita k amplifikaci sekvence dlouhá 200 párů bází, tato DNA polymerasa, jejíž frekvence inkorporace chyb odpovídá cca 2 x 10-4 chyb/bázi, bude při 106 amplifikaci cca 56 % amplifikačních produktů obsahovat jednu nebo více nesprávně inkorporovaných bází. Kromě Taq DNA polymerasy jsou používány také Pwo a Pfu DNA polymerasy (zdroj – Pyrococcus woesei a Pyrococcus furiosus). Tyto enzymy mají kromě polymerasové aktivity také 3´→ 5´ exonukleasovou aktivitu, umožňující opravu chybně inkorporovaných deoxynukleotidů. Produkty těchto enzymů jsou syntetizovány s desetinásobně vyšší přesností ve srovnání s Taq polymerasou.

37

Tth DNA polymerasa je enzym izolovaný z bakterie Thermus thermophilus, který má stejné teplotní optimum jako Taq DNA polymerasa. Předností tohoto enzymu je jeho schopnost působit i jako reversní transkriptasa. Kombinace reversní transkripce a amplifikace jejího produktu se zkráceně nazývá RT-PCR. Tato metoda slouží k detekci, kvantifikaci, klonování a analýze genové exprese na úrovni RNA [33, 34, 36, 39].

Obr. č. 18: Taq polymerasa [41] 2.3.4 Hořečnaté ionty Kromě Taq DNA polymerázy a primerů obsahuje reakční směs jako kofaktor hořečnaté ionty Mg2+, které tvoří rozpustný komplex s jednotlivými 2´-deoxyribonukleosidy-5´trifosfáty (dNTP) rozpoznávaný DNA-polymerásou. Jelikož ionty Mg2+ interagují nejen s dNTP, ale i s primery, templátovou DNA, EDTA a dalšími chelatačními činidly je třeba ve většině případů stanovit pro každou aplikaci optimální koncentraci iontů Mg2+ empiricky. Příliš vysoká koncentrace některé ze složek reakce může vést k chybám a vzniku nespecifických produktů [35, 36]. 2.3.5 Termocyklér Termocyklér je programovatelný termostat, který musí být schopen přechodu mezi jednotlivými teplotami. Postupným opakováním tohoto procesu se exponenciálně (2n, n = počet cyklů) vytváří až miliarda kopií vybraného úseku cílové molekuly [33, 34, 35].

38

Obr. č. 19 : Termocyklér

2.4 Princip elektromigračních metod Elektromigračními či elektroforetickými metodami nazýváme soubor technik, které využívají k separaci pohyb nabitých částic v elektrickém poli. Elektroforéza jako separační technika byla prvně použita Tiseliem, který na jejím základě už v roce 1937 rozdělil směs bílkovin. Později za tento objev obdržel Nobelovu cenu. [34] Jestliže jsou látky nesoucí náboj rozpuštěny v elektrolytu a umístěny v elektrickém poli, začnou se pohybovat konstantní rychlostí úměrnou velikosti jejich nábojů, anionty k anodě a kationty ke katodě. Rychlost, kterou se ion v elektrickém poli pohybuje, může být vyjádřena vztahem: v = µ eE v = rychlost iontu µe = elektroforetická pohyblivost E = intenzita elektrického pole Částice jsou při průchodu okolním prostředím vystaveny odporu sil vnitřního tření. Jejich mobilita je tedy výsledkem rovnováhy mezi silou, působící na ionty v elektrickém poli a silou vnitřního tření [34]. µe =FE /FF FE = qE FF = -6πηrv FE = síla elektrického pole FF = síla vnitřního tření q = náboj iontu η = viskozita roztoku r = poloměr iontu v = rychlost iontu 39

Z výše uvedeného vztahu vyplývá, že síla vnitřního tření se mění s viskozitou prostředí. Proto se změnou teploty dojde ke změně této síly a tudíž i ke změně rychlosti pohybu částice. V průběhu elektroforézy dojde k ustavení rovnováhy, která je definována rovnováhou mezi silou elektrického pole a silou vnitřního tření [34]. qE = 6πηrv Mobilitu je pak možno definovat pomocí fyzikálních parametrů následovně: µe = q/6πηrv Z této rovnice je jasné, že malé částice s velkým nábojem mají velkou mobilitu (pohyblivost), zatímco velké částice s malým nábojem mají mobilitu malou. Efektivní mobilita, tj. mobilita, kterou skutečně při elektroforéze naměříme, bývá obvykle nižší než teoretická elektroforetická mobilita a je závislá na pH a použitém pufru. Úspěch separace látek ze směsi lze předpokládat jen tehdy, budou-li mít separované látky dostatečně odlišné efektivní elektroforetické pohyblivosti (mobility) [34]. 2.4.1 Elektroforéza Jak už bylo zmíněno v předchozí kapitole, spočívá elektroforéza v migraci elektricky nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Toto elektrické pole se vytváří vkládáním konstantního stejnosměrného napětí mezi elektrody. V zónové elektroforéze je prostředí mezi elektrodami tvořeno základním elektrolytem, který zajišťuje dostatečnou elektrickou vodivost v celém systému. Kationty migrují k zápornému pólu, anionty ke kladnému pólu a neutrální molekuly či částice se nepohybují. Vlivem odlišné rychlosti migrace složek vzorku se v průběhu separace vytvářejí oddělené zóny jednotlivých složek. Velikost nabitých částic vzorku může být různá, od jednoduchých iontů až po makromolekuly. Zařízení se skládá z elektroforetické vany s anodou, katodou a pufrem, vlastního držáku gelu, ve kterém bude probíhat separace, a externího zdroje stejnosměrného napětí. Gelový přípravek se nalije do vaničky (agarózová ELFO) nebo mezi skla (polyakrylamidová ELFO) a nechá se zatuhnout. Jamky (starty) pro umístění vzorků se tvoří pomocí tzv. hřebenů s definovanou šířkou, které se vsunou do gelu před zatuhnutím. DNA migruje směrem k anodě (+ pólu). Rychlost pohybu studované DNA závisí jednak na jejích vlastnostech (molekulová hmotnost – velikost, elektrický náboj, prostorové uspořádání), na vlastnostech nosiče (gelu), prostředí (pufru) a na přivedeném napětí. Obecně platí, že molekuly větší velikosti a složitější prostorové struktury procházejí gelem pomaleji, tj. zůstávají blíže místu nanesení vzorku (startu). Pro separaci molekul o určité velikosti je třeba volit správnou koncentraci gelu [42, 43].

40

Obr. č. 20: Elektroforetická vana a zdroj napětí 2.4.1.1 Agarózová elektroforéza Jako prostředí pro dělení slouží gel z agarózy (polysacharid izolovaný z mořských řas). Připravuje se rozvařením práškové agarózy v elektroforetickém pufru, tuhne za pokojové teploty. Gely se většinou sestavují jako horizontální (separace na vodorovné ploše). Koncentrace agarózy určuje velikost pórů a tím propustnost pro DNA určité velikosti. Homogenita a rozlišovací schopnost je nižší než u PAGE, ale špičkové vysoce kvalitní agarózy se vlastnostem polyakrylamidu přibližují. Velmi snadná příprava gelů však tuto nevýhodu vyváží [42]. 2.4.2 Detekce PCR produktu K identifikaci, separaci a purifikaci fragmentů DNA získaných pomocí PCR se používá elektroforéza v agarosovém či polyakrylamidovém gelu. Fragmenty DNA jsou děleny v elektrickém poli v závislosti na jejich velikosti. Touto metodou může být detekován až 1 ng DNA. Rozdělené fragmenty DNA lze izolovat přímo z gelu a použít pro další práce. Volbou typu a koncentrace gelu lze zajistit vhodné podmínky pro dělení fragmentů v různých rozmezích molekulových hmotností. Jelikož separované molekuly nejsou pouhým okem viditelné, je třeba po dokončení elektroforézy tyto fragmenty identifikovat. Molekuly DNA lze snadno zviditelnit interakcí molekuly s interkalačním barvivem ethidium bromidem. Barvivo se vmezeřuje mezi sousední páry bází, vytváří komplex s DNA a po osvětlení UV světlem následně fialově fluoreskuje. Výsledkem jsou potom patrné proužky, jejichž intenzita je úměrná koncentraci DNA.

41

2.5 Restrikční analýza Jedná se o soubor technik, využívající zvláštní vlastnosti restrikčních endonukleáz (restriktáz). Tyto bakteriální enzymy se vážou na specifické rozpoznávací sekvence dsDNA, dlouhé zpravidla 4 – 6 bp, přičemž oba řetězce štěpí buď uvnitř, nebo poblíž této sekvence. Rozpoznávací sekvence mohou být buď unikátní (např. u enzymu EcoRI), nebo neurčité (např. HindII), kdy jeden nebo více nukleotidů v sekvenci je libovolných. Místo štěpení DNA se označuje jako restrikční místo. Tatáž sekvence je ve vlastní DNA methylovýma, což restriktásám brání v degradaci vlastní DNA. Systém je tedy určen k degradaci cizorodé DNA, která dotyčné cílové sekvence nemá chráněny. Počet restrikčních míst na zkoumané DNA je závislý na její velikosti, na její sekvenci a také na délce rozpoznávací sekvence. Kratší sekvence se totiž budou vyskytovat častěji než sekvence delší. U mnoha endonukleáz jsou restrikční místa na komplementárních řetězcích DNA vzájemně posunuty, což umožňuje jejich snadné spojení s jinými fragmenty pomocí ligázy. Příklady jednotlivých restriktáz a jejich cílových míst pro štěpení je uvedeno v tabulce č. 3. Činností restriktáz je DNA rozštěpena na několik fragmentů o různé délce, které lze od sebe elektroforeticky oddělit. Délka jednotlivých fragmentů je zjišťována jejich porovnáváním s hmotnostními standardy, které jsou umístěny na tomtéž gelu. Fragmenty DNA jsou na gelu detekovány autoradiografií nebo fluorescenčními barvivy [38, 44, 45, 46, 47]. Tab. č. 3: Příklady restrikčních endonukleáz a jejich cílových míst pro štěpení Název enzymu

Producent enzymu

AluI

Arthrobacter luteus

HaeIII

Haemophilus aegypticus

HhaI

Haemophilus haemolyticus

HpaII

Haemophilus parainfluenzae

HinfI

Haemophilus influenzae

MseI

Micrococcus species

TaqαI

Thermus aquaticus

Rozpoznávací místo na sekvenci DNA 5´…AG↓CT…3´ 3´…TC↑GA…5´ 5´…GG↓CC…3´ 3´…CC↑GG…5´ 5´…GCG↓C…3´ 3´…C↑GCG…5´ 5´…C↓CGG…3´ 3´…GGC↑C…5´ 5´…G↓ATC…3´ 3´…CTA↑G…5´ 5´…T↓TAA…3´ 3´…AAT↑T…5´ 5´…T↓CGA…3´ 3´…AGC↑T…5´

2.6 Identifikace kvasinkových kmenů – Metoda PCR – RFLP Při analýze genomu lze využít rozdílů v restrikčních mapách jedinců téhož druhu. Tyto rozdíly, podmíněné různou délkou a počtem resrikčních fragmentů vytvořených štěpením genomové DNA (nebo její části) určitou restrikční endonukleázou, se označují jako polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP). Jejich podstatou jsou buď mutace, které 42

vedou k vytvoření nebo ztrátě rozpoznávacích míst pro restrikční endonukleázy, nebo vznikají jako důsledek přítomnosti různého počtu repetitivních sekvencí, delecí, inzercí nebo přestaveb ve specifických oblastech chromozómu. Rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů u různých jedinců lze snadno detekovat gelovou elektroforézou. PCR-RFLP je modifikace standardní PCR používaná pro typizaci cílové sekvence, obvykle určitého genu, obsahujícího sekvenční polymorfizmus. V závislosti na volbě primerů může být provedena analýza jakéhokoliv genu. Tato sekvence o délce až 5 kb se amplifikuje za přísných podmínek pomocí primerů připojujících se ke koncovým konzervovaným oblastem. Výsledkem amplifikace jsou produkty PCR o stejné délce, které se detekují elektroforeticky. Amplifikované produkty jsou štěpeny restrikční endonukleázou a poté opět analyzovány elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. Vzorky jsou typizovány restrikčními spektry fragmentů amplifikované DNA [8, 35, 38, 40, 48, 49].

43

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Chemikálie • Sladina (pivovar Brno) • Sterilní a deionizovaná voda • Komerční sada Ultra CleanTM Microbial DNA Isolation Kit (Elizabeth Pharmacon spol.s.r.o., ČR) • Agaróza pro elektroforézu DNA (SERVA, Německo) • Ethylendiaminetetraacetic acid (EDTA), (Sigma-aldrich, Německo) • Tris (SERVA, Německo) • H3BO3 (Mach-chemikálie s.r.o., Ostrava) • NaOH (Lach-Ner s.r.o., Neratovice) • CH3COONa ((Lachema - Brno, Lach-Ner s.r.o., Neratovice) • HCl (Lach-Ner s.r.o., Neratovice) • Na2CO3 (Lachema – Brno, Lach-Ner s.r.o., Neratovice) • Ethidium bromid (Serva Bitech, Německo) • Taq DNA polymerasa (KapaBiosystems, Boston, USA) • 10× Taq pufr pro PCR mix (Invitek, Německo) • Primery ITS1, ITS4 (Invitek, Německo) • dNTP mix (Invitek, Německo) • Nanášecí pufr Loading buffer (Fermentas, Litva) • Délkový standard 20 bp a 100 bp (Elizabeth Pharmacon s.r.o., ČR) • Restrikční endonukleasy – TaqαΙ, HinfI, AluI, MseI, HaeIII, HhaI, HpaII (BioLabs – New England, Fermentas - Litva) • Ethanol (Lach-Ner s.r.o., Neratovice) • Parafínový olej (Penta, Praha) • Kvasniční extrakt (Himedia, Indie) • močovina • KH2PO4 • Fenolová červeň (Lachema, Brno)

3.2 Přístroje a pomůcky • Minicentrifuga National LABNET C – 1200 (Biotech s.r.o., ČR) • Centrifuga eppendorf 5417 R (Eppendorf AG, Německo) • Vortex LABNET VX 100 (Biotech s.r.o., ČR) • Vortex-Genie 2, MO Bio (Biotech s.r.o., ČR) • Mikropipety Biohit (Biotech s.r.o., ČR) • Termostat IP 100-U LTE SCIENTIFIC, (Velká Británie) • Termocyklér PTC-100TM, (MJ Research, Inc, USA) • PCR box- AURA MINI (Bioair instruments, Itálie) • Mikrovlnná trouba ETA 1195 (ČR) • Analytické váhy (A&D, Instruments LTD, Japonsko) • Elektroforetická vana (Owl separation systeme, model - B2, (Biotech s.r.o., ČR) • Zdroj napětí – SAVANT PS 250 (Biotech s.r.o., ČR)

44

• Zdroj napětí – Major Science MP 500P (Biotech s.r.o., ČR) • Předvážky EK-600 H (A&D, Instruments LTD, Japonsko) • Transluminátor (Ultra Lum. INC, USA) • Třepačka (Heidolph, Německo) • Spektrofotometr DU 7400 (Beckman, USA) • NanoPhotometerTM UV/Vis (Implen GmbH, Mnichov, Německo) • Turbidimetr Ultrospec 10 (Amersham Biosciences, Švédsko) • Sterilní box pro mikrobiologickou práci - AURA MINI (Bioair instruments, Itálie) • Lednice a mražák k uchování vzorků DNA • Parafilm (American Nacional CanTM, USA) • Exsikátor • Mikroskop • Software – LUCIA Net (Copyright 2001-2004 Laboratory Imaging) • Software - Scion Image (Biotech s.r.o., ČR) • Software – BioNumerics (Applied Maths) • Laboratorní sklo • Mikrozkumavky Eppendorf • Plastové Petriho misky • Bakteriologické kličky • Buničitá vata • Stojan na zkumavky • Kahan

3.3 Suroviny Dodavatelem bylo soukromé vinařství Holánek, sídlící v obci Ivaň v mikulovské vinařské podoblasti. Surovinou, ze které se následně izolovaly čisté kultury kvasinek byly bobule a listy vinné révy, půda z vinice a vinný mošt. V rámci této diplomové práce byly zpracovány pouze kvasinky izolované z bobulí a vinného moštu vína Sauvignon. Odběr byl proveden z integrované vinice dne 10.9.2009 a to při 25 °C. Typové kvasinky poskytla Sbírka kvasinek CCY, která sídlí na Chemickém ústavu SAV Bratislava.

3.4 Příprava kultur pro izolaci 3.4.1 Odběry vzorků bobulí a moštu Odběr vzorků bobulí byl proveden sterilně do předem připravených vysterilizovaných sklenic s víčkem. Nůž byl mezi jednotlivými odběry dezinfikován ethanolem. Bobule se odebraly ze dvou míst vinice, z kraje vinice a ze středu vinice. Vzorky moštu byly odebírány 52 dnů v různých technologických fázích výroby vína. Odběry byly prováděny do předem vysterilizovaných zavařovacích sklenic a ještě ten den zpracovány nebo byly uchovány v lednici a do 24hod. zpracovány. Jednotlivé dny odběrů jsou uvedeny v tabulce č. 4.

45

Tab. č. 4: Pořadí jednotlivých odběrů Číslo odběru Datum odběru 1 22.9.2010 2 23.9.2010 3 25.9.2010 4 29.9.2010 5 30.9.2010 6 2.10.2010 7 5.10.2010 8 7.10.2010 9 9.10.2010 10 12.10.2010 11 22.10.2010 12 2.11.2010 13 12.11.2010

Kvašení 1.den 2. den 4. den 8. den 9. den 11. den 14. den 16. den 18. den 21. den 31. den 42. den 52. den

3.4.2 Příprava živných půd Pro izolaci čisté kultury kvasinek byly ze sladiny připraveny tekuté půdy v Erlenmayerových baňkách a tuhé půdy na Petriho miskách. Pro uchování vyizolované čisté kultury se připravily šikmé agary do zkumavek. 3.4.2.1 Příprava sladinových ploten a tekutých živných médií Jako kultivační médium byl použit sladinový extrakt z pivovaru Starobrno, který byl připraven následujícím způsobem. Do odměrného válce o objemu 500 ml bylo nalito 200 ml sladiny. Roztok byl zředěn vodou na cukernatost 7 °ČSN, uhličitanem sodným bylo upraveno pH na 6,8. K takto připravenému roztoku nalitému do Erlenmayerových baněk byl přidán agar (2 % hm.). Vzniklá směs byla promíchána a vysterilizována v tlakovém hrnci (20 minut). Po vychladnutí na 60 °C bylo přidáno antibiotikum (250 µg/l) proti nežádoucímu růstu bakterií a kyselina propionová (0,25 ml/l) proti růstu plísní. Kultivační médium bylo následně nalito do Petriho misek. Tekutá živná půda byla připravena analogicky jenom s tím rozdílem, že do ní nebyl přidán agar. 3.4.2.2 Příprava šikmých agarů Do zkumavek byla nalita rozvařená sladina do ¼ objemu, zkumavky byly zazátkovány a vysterilizovány v tlakovém hrnci po dobu 20 minut. Po vytáhnutí z hrnce se nechaly ztuhnout v šikmé poloze při laboratorní teplotě. 3.4.3 Izolace kvasinek z bobulí Ve sterilním boxu bylo do Erlenmayerových baněk s 200 ml tekuté živné půdy přidáno 20 bobulí z každého vzorku hroznového vína. Kultivace probíhala 10 dní při laboratorní teplotě. Po 10 dnech byla kultivace ukončena a z baňky bylo přeneseno 0,3 ml sedimentu na připravenou Petriho misku se sladinovou půdou, antibiotikem a kyselinou propionovou. Takto připravené kultury byly kultivovány v termostatu 3-5 dní při teplotě 26 °C. Získané kultury byly přečištěny Kochovou zřeďovací metodou.

46

3.4.4 Izolace kvasinek z moštu Ve sterilním boxu byly odebrané vzorky po promíchání přefiltrovány přes bakteriologické filtry. Filtry byly sterilní pinzetou přeneseny na Petriho misky se sladinou. Takto připravené misky byly kultivovány v termostatu při 26 °C po dobu 5-7 dny. Získané kultury byly přečištěny několikrát Kochovou zřeďovací metodou. 3.4.5 Kochova zřeďovací metoda Tato metoda byla použita k získání čistých kultur kvasinek z kultur směsných, které byly získány kultivací v termostatu. Ve sterilním boxu byly nachystány 3 zkumavky – do prvních dvou zkumavek bylo napipetováno 10 ml sterilní vody a do poslední zkumavky pouze 9 ml. Z Petriho misky se směsnou kulturou byla odebrána 2 očka pomocí bakteriologické kličky a přenesena do první zkumavky s 10 ml sterilní vody. Obsah zkumavky byl promíchán na vortexu a poté bylo z této zkumavky odebráno mikropipetou 50 µl a přeneseno do další zkumavky s 10 ml sterilní vody. Obsah zkumavky byl opět důkladně promíchán. Z této suspenze byl odebrán 1 ml do třetí zkumavky s 9 ml vody. Po promíchání bylo ze zkumavky odebráno mikropipetou 50 µl suspenze, přeneseno na Petriho misku se sladinou a pomocí bakteriologické kličky rozetřeno křížovým roztěrem. V termostatu byly misky inkubovány 23 dny při 26 °C. Po kultivaci v termostatu byly jednotlivé kolonie přeočkovány na novou Petriho misku tak, že byly rozetřeny po celé ploše a opět vloženy do termostatu na 2-3 dny při 26 °C. Tento postup byl opakován několikrát, dokud nebyly získány čisté kultury kvasinek za současného kontrolování pomocí mikroskopu. Získané čisté kultury byly přeočkovány na šikmé agary, přelity sterilním parafínem a ponechány v chladničce při 7 °C.

Obr. č. 21: Ukázka křížového roztěru

3.5 Izolace DNA Izolace kvasinkové DNA byla provedena za použití komerčního setu UltraCleanTMMicrobial DNA Isolation Kit. Do rozbíjecí zkumavky bylo pipetováno 300 µl rozbíjecího pufru (MicroBead Solution), ve kterém byla následně rozsuspendována dvě očka kvasinkové kultury. Obsah zkumavky se krátce zvortexuje. Ke směsi bylo přidáno 50 µl roztoku MD1, mikrozkumavky byly vloženy v horizontální poloze do adaptéru vortexu a při maximální rychlosti byly 10 minut vortexovány. Poté byly centrifugovány 1 minutu při 47

10000×g. Supernatant byl odebrán a přenesen do čisté mikrozkumavky. K roztoku bylo přidáno 100 µl MD2, směs byla zvortexována a inkubována 5 minut při 4 °C. Po opětovné centrifugaci (1 minutu při 10000×g) byl supernatant přenesen do čisté mikrozkumavky. K roztoku bylo přidáno 900 µl MD3 a směs byla zvortexována. Přibližně 700 µl takto vzniklého roztoku bylo přeneseno do mikrozkumavky na kolonku a centrifugováno (1 minutu při 10000×g). Přefiltrovaný roztok byl odstraněn, na tutéž kolonku byl přenesen zbytek roztoku a kolonka s roztokem byla opět centrifugována (1 minutu při 10000×g). Přefiltrovaný roztok byl odstraněn. Do kolonky bylo přidáno 300 µl roztoku MD4 a centrifugováno 1 minutu při 10000×g. Kolonka byla opatrně přenesena do čisté mikrozkumavky. Do středu bílé membrány uvnitř kolonky bylo napipetováno 50 µl roztoku MD5 a následně centrifugováno (1 minutu při 10000×g). Kolonka byla odstraněna a roztok DNA v mikrozkumavce byl připraven pro další aplikace. Takto vyizolovaná DNA byla uchována při –20 °C.

3.6 Příprava chemikálií a roztoků 3.6.1 Příprava 10×TBE pufru Nejprve byl připraven 0,5 M roztok EDTA o pH 8. 9,36 g EDTA bylo převedeno do 50 ml odměrné baňky, pH bylo upraveno 0,5% roztokem NaOH. Z takto připraveného roztoku bylo odebráno 40 ml a přeneseno do 1000 ml odměrné baňky. K tomuto roztoku bylo přidáno 108 g Tris a 55 g H3BO3 rozpuštěné v destilované vodě. Po rozpuštění byla odměrná baňka doplněna destilovanou vodou po rysku. Tímto postupem se získal tzv. zásobní roztok. 3.6.2 Příprava 1×TBE pufru Ze zásobního roztoku bylo do 1000 ml odměrné baňky odlito 100 ml a doplněno po rysku destilovanou vodou. 1×TBE pufr byl použit k přípravě gelů. 3.6.3 Příprava 1×TBE pufru s ethidium bromidem K připravenému roztoku 1×TBE pufru v 1000 ml odměrné baňce bylo přidáno 100 µl ethidium bromidu. 1×TBE pufr s EtBr byl použit jako vodivostní pufr při elektroforetické detekci DNA fragmentů. 3.6.4 Příprava EtBr 10 mg ethidium bromidu bylo naváženo do mikrozkumavky eppendorf a rozpuštěno v 1 ml destilované vody. Vznikl tak roztok o koncentraci 10 mg/ml. Ethidium bromid byl použit pro vizualizaci fragmentů DNA na gelu. Při práci s EtBr je nutné dodržovat bezpečnostní předpisy, protože se jedná o silný mutagen, který proniká do organismu. 3.6.5 Příprava 3 M octanového pufru 2,46 g CH3COONa bylo rozpuštěno v destilované vodě, pomocí koncentrované HCl bylo upraveno pH na 5,5. Roztok byl kvantitativně převeden do 10 ml odměrné baňky a doplněn destilovanou vodou po rysku. Připravený roztok byl uchováván při 4 °C. 3.6.6 Příprava 80% ethanolu 80% ethanol byl používán k přečištění PCR produktu a byl připraven následujícím postupem. 1,6 ml 96% ethanolu bylo smícháno s 0,32 ml destilované vody. Roztok byl skladován při –20 °C. K přečištění byl používán i 96% ethanol, který byl pouze odlit ze zásobní lahve do 2 ml mikrozkumavek a před použitím byl chlazen na –20 °C. 48

3.7 Příprava délkových standardů 100 bp a 20 bp 3.7.1 100 bp Délkový standard 100 bp byl připraven smícháním 10,9 µl sterilní vody, 2,5 µl nanášecího pufu a 1,6 µl roztoku 100 bp. Z takto připraveného roztoku bylo nanášeno na gel 1 µl. 3.7.2 20 bp Délkový standard 20 bp byl připraven tak, že bylo smícháno 4,25 µl sterilní vody, 1 µl nanášecího pufru a 0,75 µl roztoku 20 bp. Na gel byl nanášen v množství 6 µl.

3.8 Příprava 2% agarózového gelu Do Erlenmayerovy baňky bylo naváženo 6 g agarózy a zalito 300 ml 1×TBE pufru. Směs byla dokonale rozvařena v mikrovlnné troubě, až se agaróza úplně rozpustila. Poté se nechala vychladnout na teplotu 60 °C. Podle velikosti elektroforetické vany byla agaróza odměřena odměrným válcem, bylo přidáno fluorescenční barvivo ethidium bromid (podle objemu agarózy), vše důkladně promícháno a nalito do vany, která byla předem vyvážena. Do nalitého gelu byly vloženy hřebeny, které po ztuhnutí gelu vytvoří jamky na nanášení jednotlivých vzorků. Takto připravený gel byl ponechán 30 minut při pokojové teplotě a poté ještě 30 minut v chladničce do úplného ztuhnutí. 3.9 Příprava reakční směsi pro PCR Reakční směs pro PCR (tzv. mastermix) byla připravována ve stanoveném pořadí, pro každý vzorek DNA v množství 150 µl. Složení mastermixu a pořadí jednotlivých komponent reakce pro jeden vzorek: 1/ sterilní voda.…………………..126,9 µl 2/ pufr……………………………….15 µl 146,4 µl 3/ dNTP mix………………………..1,5 µl 4/ primer ITS1………………….......1,5 µl 5/ primer ITS4………………….......1,5 µl + 3 µl templátové DNA + 0,6 µl termostabilní DNA polymerázy. Podle stanoveného pořadí byly nejprve smíchány složky 1 až 5 a jejich množství bylo vynásobeno počtem vzorků. Směs byla promíchána na vortexu a rozpipetována do jednotlivých popsaných mikrozkumavek. Poté byla do každé zkumavky přidána templátová DNA a nakonec Taq-polymeráza. Každá mikrozkumavka byla pečlivě promíchána na vortexu a vložena do termocykléru. Příprava mastermixu byla prováděna ve sterilním boxu a jednotlivé složky byly po celou dobu přípravy uchovávány v chladícím stojanu, aby nedošlo k jejich znehodnocení. Negativní kontrola se připravuje stejným způsobem, ale místo templátové DNA se k reakční směsi přidají 3 µl sterilní vody. 3.9.1 Průběh reakce PCR v termocykléru PCR probíhá v periodicky se opakujících třech cyklech – denaturaci templátové DNA, připojení primerů a syntéze vlákna DNA. V prvním kroku se zvýší teplota v termocykléru na 94 °C a dojde k rozpletení dvoušroubovice DNA. Tento krok trvá 1-5 minut. V druhém kroku, který se nazývá annealing, dochází k připojení primerů při teplotě 55 °C. Tato teplota je dána výrobci primerů a je závislá na délce oligonukleotidů a zastoupení jednotlivých párů. Ve třetí, 49

syntetické fázi, dochází ke zvýšení teploty na 72 °C a připojování jednotlivých deoxynukleotidů pomocí Taq-polymerázy (jedná se o extenzi připojených primerů). Časový a teplotní profil reakce PCR znázorňuje tabulka č. 5. Tab. č. 5: Jednotlivé kroky průběhu reakce PCR

Denaturace templátové DNA Annealing (připojení primerů) Elongace (syntéza vlákna DNA)

T (°C) 94 94 48 72

t (min.) 4 1 0,5 1

72

10

3.9.2 Detekce PCR produktu pomocí elektroforézy Do elektroforetické vany s připraveným 2 % agarózovým gelem byl nalit pracovní roztok TBE s ethidium bromidem. Poté byly postupně do jamek nanášeny vzorky v množství 5 µl. Nejprve byly na parafilm naneseny 1 µl kapky vzorkového pufru (Loading buffer), k němu bylo napipetováno 5 µl amplifikované DNA, promícháno opakovaným nasáváním pomocí mikropipety a z této směsi odebráno 5 µl a vneseno do jamky. Tímto způsobem byly na gel naneseny všechny vzorky amplifikované DNA. Délkový standard byl nenesen do první jamky a za negativní kontrolu, která následovala po posledním vzorku. Poté byla vana připojena ke zdroji napětí. Podle počtu analyzovaných vzorků byly použity různé velikosti van. Množství použitého gelu, EtBr, velikost napětí a časový profil jednotlivých elektroforetických van uvádí tabulka č. 6. Tab. č. 6: Množství použitého gelu, EtBr, velikost napětí a časový profil jednotlivých elektroforetických van Délka gelu 14 cm 11 cm 8,5 cm

Množství gelu 70 ml 50 ml 30 ml

Množství EtBr 7 µl 5 µl 3 µl

Napětí zdroje 65 V 55 V 45 V

Čas 160 min 140 min 170 min

Po skončení byl gel vložen do transluminátoru, kde byl výsledek detekován pomocí UV záření, obraz vyfocen v programu Scion Image a uložen. 3.10 Přečištění PCR produktu Před restrikční analýzou bylo potřeba PCR produkt přečistit, aby došlo k odstranění inhibujících látek. PCR produkt byl přečištěn následujícím způsobem. 20 µl amplifikované DNA bylo smícháno s 2 µl octanového pufru. Směs byla zvortexována a ke směsi bylo přidáno 60 µl 96% ethanolu vychlazeného na teplotu – 20 °C. Následovala centrifugace po dobu 30 min. při 4 °C a 15 000 otáčkách. Supernatant byl dekantován, do mikrozkumavky bylo přidáno 60 µl 80% ethanolu, obsah byl zvortexován a opět při stejných podmínkách centrifugován. Po centrifugaci byl supernatant opět dekatován a mikrozkumavky s přečištěnou DNA byly vysušeny v exsikátoru (15 minut). Takto přečištěná DNA se uchovává v mrazáku při -20 °C.

50

3.11 Restrikční analýza Pro každý vzorek byla připravena směs o tomto složení a množství: 1) sterilní destilovaná voda ……….13 µl 2) pufr pro danou restriktázu ……..1,5 µl 3) enzym ………………………… 0,5 µl Směs pro restrikční analýzu byla připravována podle pokynů výrobce a za sterilních podmínek v pracovním boxu. Nejprve bylo vypočítáno množství směsi podle počtu vzorků, které měli být analyzovány. Poté byla směs rozpipetována do jednotlivých mikrozkumavek s přečištěným PCR produktem, mikrozkumavky byly promíchány na vortexu a vloženy do termocykléru. Program termocykléru a tedy i doba trvání restrikční analýzy byl nastaven podle pokynů výrobců jednotlivých enzymů. U všech použitých enzymů – HinfI, HaeIII, AluI, TaqαI a MseI – byla nastavena inkubační teplota na 37 °C a doba trvání 16 hodin. Po skončení inkubační doby následoval inaktivační krok. Teplota inaktivace byla pro jednotlivé používané restrikční endonulkeázy rozdílná. Inaktivace probíhala při teplotě 65 nebo 80 °C po dobu 20 minut. Po uplynutí této doby byly restrikční fragmenty detekovány elektroforézou na 2% gelu. Detekce restrikčních fragmentů probíhala stejným způsobem jako detekce PCR fragmentů, která byla popsána v kapitole 3.9.2. Místo negativní kontroly byla na gel vynášena pozitivní kontrola. Jako pozitivní kontrola byly na gel naneseny PCR produkty o délce shodující se s délkou amplikonu, který byl použitý pro restrikční analýzu. Po skončení elektroforézy byly vytvořené fragmenty DNA detekovány pomocí UV záření v transluminátoru a obraz byl vyfocen v programu Scion Image, aby mohl být později vyhodnocen. 3.12 Alkoholová tolerance Byla pozorována schopnost jednotlivých druhů kvasinek přežívat a množit se v rozdílných koncentracích ethanolu. Do 100 ml Erlenmayerových baněk bylo odměřeno 50 ml sladiny. Baňky byly zazátkovány a vysterilizovány. Po sterilizaci byl přidán ethanol v takovém množství, aby výsledná koncentrace byla 1, 4, 8, 12 a 16 % alkoholu. Byla připravena kvasinková suspenze vybraných zástupců jednotlivých rodů analyzovaných kvasinek. Ve zkumavce s 10 ml destilované vody byly rozsuspendovány bakteriologickou kličkou 2 očka kultury. Suspenze byla zvortexována a z takto vzniklé suspenze byl odebírán do každé baňky 1 ml. Jedna baňka byla ponechána pouze s čistou sladinou a sloužila jako blank. Vzorky byly turbidimetricky proměřovány každý den po dobu 10 dnů sledováním zákalu suspenze.

51

4. VÝSLEDKY A DISKUZE V této diplomové práci byly zpracovány bobule a mošt bílého vína odrůdy Sauvignon pěstovaného v integrované vinici soukromého vinařství Holánek z mikulovské vinařské podoblasti. Dále bylo analyzováno 12 typových vzorků kvasinek získaných ze sbírky CCY na Chemickém ústavu SAV Bratislava. Identifikace a taxonomické zařazení analyzovaných vzorků bylo prováděno porovnáním elektroforeogramů s typovými kvasinkami zpracovanými již v předchozích diplomových pracích.

4.1 Izolace kvasinkové DNA Z jednotlivých odběrů vzorků byla pomocí Kochovy zřeďovací metody vyizolována čistá kultura kvasinek. Abychom měli jistotu, že se opravdu jedná o čistou kulturu bylo ředění a následný křížový roztěr proveden 6x a sledovali se nejen makroskopické znaky kolonií, ale i mikroskopické snímky. DNA kvasinek byla vyizolována komerční sadou UltraCleanTMMicrobial DNA Isolation Kit. Pomocí sady bylo získáno 50 µl mikrobiální DNA, která byla použita k dalším analýzám.

4.2 Amplifikace kvasinkové DNA využitím metody PCR Požadovaný úsek vyizolované kvasinkové DNA byl naamplifikován použitím primerů ITS1-ITS4 polymerázovou řetězovou reakcí. Sekvence těchto primerů je uvedena v Tab. č. 7. Získané PCR produkty byly detekovány na 2% agarosovém gelu a porovnány s délkovým standardem. Pro kontrolu byla na gel aplikována negativní kontrola, která místo DNA obsahovala sterilní vodu. Negativní kontrola se podrobuje amplifikaci pomocí PCR pro ověření čistoty použitých PCR komponent. Aby došlo k dostatečnému rozdělení délkového standardu a následnému kvalitnímu odečtení jednotlivých délek amplikonů vzorků, je třeba dobře optimalizovat podmínky elektroforézy. Velikost PCR produktu byla z elktroforeogramu určena pomocí programu BioNumerics. Tab. č. 7: Sekvence použitých primerů ITS1 a ITS4 [38] ITS1 ITS4

5´- TCCGTAGGTGAACC GCGG-3´ 5´- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´

4.2.1 PCR vzorků Amplifikací DNA jednotlivých analyzovaných kvasinek byly získány fragmenty délky 390 bp, 450 bp, 500 bp, 570 bp, 590 bp, 650bp, 750 bp a 880 bp. Amplifikace s použitím primerů ITS1 a ITS4 byla úspěšná pro všechny vzorky. Pro elektroforeogram byl použit délkový standard 100 bp a NK v popisu gelu označuje negativní kontrolu. Elektroforeogram PCR produktů vzorků je na Obr. č. 22. Tabulka č. 8 udává velikosti amplikonů jednotlivých vzorků po PCR.

52

100 91 109 110 46 56 150 41 170 179 153 27 157 158 74 NK 100

100 73 75 2

3

5

8 10 11 14 16 17 18 19 21 25 137 139 169 100

Obr. č. 22: Elektroforeogram PCR produktu vzorků v 2% agarózovém gelu amplifikovaných primery ITS1 a ITS4 Tab. č. 8: Velikosti amplikonů jednotlivých vzorků po PCR Pracovní označení vzorku 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 73 74

Délka amplikonu (bp) 390 390 390 450 450 450 450 500 570 590 590 650 650 650 750 750

Pracovní označení vzorku 75 2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

Délka amplikonu (bp) 750 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880

53

4.2.2 PCR typových kvasinek Amplifikací DNA jednotlivých typových kvasinek byly získány fragmenty délky 500 bp, 550bp, 650 bp, 660 bp, 800 bp a 880 bp. Kvasinky rodu Saccharomyces poskytují jednotnou délku amplikonů a to 880 bp. Délky jednotlivých fragmentů typových kvasinek jsou uvedeny v tabulce č. 9. Elektroforeogramy PCR produktů typových kvasinek jsou uvedeny na Obr. č. 23. 100 S96 S97 S98 S99 S100 S101 S102 S103 nk 100

100 S104 S105 S106 S107 100

Obr. č. 23: Elektroforeogramy PCR produktů typových kvasinek dělených v 2% agarózovém gelu amplifikovaných primery ITS1 a ITS4 Elektroforéza vlevo probíhala 2 hodiny a 35 minut při napětí 55V. Elektroforéza vpravo probíhala pouze hodinu při napětí 55V. Z obrázku je patrné, že na elektroforeogramu vlevo došlo k lepšímu rozdělení délkového standardů a proto lze i přesněji odečíst jednotlivé délky amplikonů po PCR. Pro zjištění délky fragmentů, které jsou na obrázku vpravo bylo nutné elektroforézu ještě zopakovat. Pro vyhodnocení elektroforeogramů byl použit program BioNumerics. Tab. č. 9: Velikosti amplikonů jednotlivých typových kvasinek po PCR Pracovní označení vzorků s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

54

CCY

Druh

Délka amplikonu (bp)

29-9-17 62-7-1 17-18-1 41-11-2 19-6-15 39-27-1 21-6-7 21-6-6 48-80 48-79 21-53-2 21-22-10

Issatchenkia orientalis (Candida crusei) Cystofilobasidium bisporidii – typový Cystofilobasidium infirmo-miniatum Pichia fluxuum Sporobolomyces roseus Issatchenkia occidentalis Saccharomyces pastorianus – typový Saccharomyces pastorianus Saccharomyces uvarum Saccharomyces uvarum Saccharomyces paradoxus Torulaspora delbrueckii

550 650 660 500 650 550 880 880 880 880 880 800

4.3 Analýza použitím metody PCR-RFLP Vzorky DNA, které byly naamplifikovány metodou PCR pomocí primerů ITS1 a ITS4 byly následně přečištěny (přesráženy ethanolem) a v dalším experimentu štěpeny restrikčními endonukleázami HaeIII, HinfI, TaqαI, MseI a AluI. Tabulka s ukázkou cílových míst pro štěpení jednotlivých endonukleáz je uvedena v kapitole 2.5, tabulka č. 3. Identifikace analyzovaných vzorků byla provedena na základě porovnání délek restrikčních fragmentů pro jednotlivé restrikční enzymy s typovými kvasinkami. Vyhodnocování délek fragmentů bylo provedeno pomocí programu BioNumerics. Výsledky jednotlivých experimentů jsou popsány v následujících kapitolách. 4.3.1 Restrikční analýza s endonukleázou HaeIII Jako jedna z endonukleáz byla použita HaeIII, která rozpoznává a štěpí místo 5´…GG↓CC…3´ DNA. Pro elektroforeogram byl použit délkový standard 100 bp a 20 bp. Jako pozitivní kontrola byly vybrány PCR produkty vzorků kvasinek, které zastupují jednotlivou skupinu vzorků, jež byly po PCR naštěpeny na stejně dlouhé fragmenty. Délky fragmentů po štěpení tímto enzymem jsou uvedeny v tabulce č. 10. Elektroforeogarmy štěpení PCR produktů tímto enzymem jsou uvedeny na obr. č. 24 a č. 25. 100 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 100 20 153/ 109/ 170 150 27

100 2

3

5

8 10 14 16 17 18 19 21 169 137 139 11 100 20 5

Obr. č. 24: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků enzymem HaeIII v 2% agarózovém gelu.

55

100 73 74 75 100 20 74

Obr. č. 25: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků 73-75 enzymem HaeIII v 2% agarózovém gelu. Z elektroforeogramu (Obr. č. 24 a č. 25) je patrné, že vzorky 25, 27, 170, 179, 153, 157, 158, 73, 74 a 75 se tímto enzymem neštěpily, protože neobsahují štěpné místo pro tuto endonukleázu. Ostatní vzorky obsahují cílovou sekvenci a tudíž je tento enzym rozštěpil na více fragmentů. Jako pozitivní kontrola byly použity PCR produkty vzorků 153, 150, 109, 27, 170, 5 a 74. U vzorků 2, 3, 5, 8, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 137, 139 a 169 lze s jistotou říct, že se jedná o rod Saccharomyces, avšak druhově tyto kvasinky nelze zařadit. U vzorků 73, 74 a 75 lze také s jistotou říci, že se jedná o kvasinky rodu Hanseniaspora, protože tato kvasinka nebyla enzymem HaeIII naštěpena a délka fragmentu po PCR byla 750 bp. K určení těchto rodů byly použity typové kvasinky a výsledky restrikčních analýz z minulých let. Tab. č. 10: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou HaeIII Pracovní označení vzorků 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 73 74 56

Délka amplikonu (bp) 390 390 390 450 450 450 450 500 570 590 590 650 650 650 750 750

Délka restrikčních fragmentů 295+110 295+110 295+110 330+100+70 330+100+70 330+100+70 330+100+70 n n n n n n n n n

Pracovní označení vzorků 75 2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

Délka amplikonu (bp) 750 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880

Délka restrikčních fragmentů n 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 510+320+240+140 510+320+240+140 320+240+180+140

Štěpení typových kvasinek enzymem HaeIII je na obrázku č. 26. Velikosti fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou HaeIII jsou uvedeny v tabulce č. 11. 100 s104 s105 s106 s107100 20 s104 s107 100 s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 100 20

Obr.č. 26: Elektroforeogramy štěpení PCR produktů typových kvasinek enzymem HaeIII v 2% agarózovém gelu. Tab. č. 11: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou HaeIII. Pracovní označení vzorků s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

Délka amplikonu (bp) 550 650 660 500 650 550 880 880 880 880 880 800

Délka restrikčních fragmentů 400+100 420+220 450+90+70 n n 400+100 320+240+180+140 320+240+180+140 500+240+150 500+240+150 320+240+180+140 n

Z elektroforeogramů je patrné, že DNA typových kvasinek Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces uvarum a Saccharomyces paradoxus byla enzymem HaeIII naštěpena odlišně. U Saccharomyces pastorianus (s102 a s103) a Saccharomyces paradoxus (s106) došlo k naštěpení na čtyři fragmenty délky 320+240+180+140 bp u Saccharomyces uvarum (s104 a s105) byly detekovány tři fragmenty dlouhé 500+240+150 bp. DNA kvasinek Pichia fluxuum, Torulaspora delbrueckii a Sporobolomyces roseus nebyla tímto enzymem naštěpena. DNA kvasinek Issatchenkia orientalis (s96) a Issatchenkia occidentalis (s101) byla naštěpena totožně na dva fragmenty délky 400+100 bp. Zatímco rodově stejné kvasinky 57

Cystofilobasidium bisporidii (s97) a Cystofilobasidium infirmo-miniatum (s98) byly štěpeny odlišně. 4.3.2 Restrikční analýza s endonukleázou HinfI Enzym HinfI byl zvolen jako další restrikční endonukleáza. Rozpoznává a štěpí sekvenci 5´…G↓ATC…3´. Pro elektroforeogram byl použit délkový standard 100 bp a 20 bp. Fragmenty získané štěpením tímto enzymem jsou uvedeny v tabulce č. 12. Elektroforeogramy štěpení PCR produktů tímto enzymem jsou uvedeny na obr. č. 27 a č. 28. 100 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 100 20 153/ 109/ 170 150 27

100 2

3

5

8 10 14 16

17 18 19 21 169 137 139 11 100 20

5

Obr. č. 27: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků enzymem HinfI v 2% agarózovém gelu. 100 73 74 75 100 20 74

Obr.č. 28: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků 73-75 enzymem HinfI v 2% agarózovém gelu. 58

Z elektroforeogramu (Obr. č. 27 a č. 28) je patrné, že po stěpení tímto enzymem byl u vzorku 25 detegován pouze fragment o délce 240 bp. Jelikož fragment po PCR dosahoval délky 500 bp, je možné, že došlo k naštěpení na dva totožné fragmenty. Ostatní vzorky byly tímto enzymem rozštěpeny na více fragmentů. Vzorky 2, 3, 5, 8, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 137, 139 a 169 patřící do rodu Saccharomyces byly všechny naštěpeny na dva fragmenty délky 380+140 bp. Vzorky 73, 74 a 75 patřící do rodu Hanseniaspora byly naštěpeny na tři fragmenty délky 350+190+160 bp a porovnáním s typovými kvasinkami je možné je zařadit druhově jako Hanseniaspora uvarum. Tab. č. 12: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou HinfI Pracovní označení vzorků 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 73 74

Délka amplikonu (bp) 390 390 390 450 450 450 450 500 570 590 590 650 650 650 750 750

Délka restrikčních fragmentů 205+190 205+190 205+190 260+115+105 260+115+105 260+115+105 260+115+105 240+240 300+180 310+145+105 310+145+105 280+125+105 280+125+105 280+125+105 350+190+160 350+190+160

Pracovní označení vzorků 75 2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

Délka amplikonu (bp) 750 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880

Délka restrikčních fragmentů 350+190+160 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140

Štěpení typových kvasinek enzymem HinfI je na obrázku č. 29. Velikosti fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou HinfI jsou uvedeny v tabulce č. 13.

59

100 s104 s105 s106 s107 100 20 s105 s107 100 s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 100 20

Obr. č. 29: Elektroforeogramy štěpení PCR produktů typových kvasinek enzymem HinfI v 2% agarózovém gelu. Tab. č.13: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou HinfI. Pracovní označení vzorků s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

Délka amplikonu (bp) 550 650 660 500 650 550 880 880 880 880 880 800

Délka restrikčních fragmentů 240+170+150 360+220+70 290+210+190 240+240 220+130+100+50 240+170+150 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 420+380

Z elektroforeogramů je patrné, že rod Saccharomyces byl touto endonukleázou naštěpen totožně na dva fragmenty délky 380+140 bp. DNA kvasinky Issatchenkia orientalis (s96) a stejně tak Issatchenkia occidentalis (s101) byla naštěpena na tři fragmenty dlouhé 240+170+150 bp. Cystofilobasidium bisporidii (s97) a Cystofilobasidium infirmo-miniatum (s98) byly naštěpeny odlišně. U Pichia fluxuum byl detegován pouze fragment o délce 240 bp. Jelikož fragment po PCR dosahoval délky 500 bp, je možné, že došlo k naštěpení na dva totožné fragmenty. DNA kvasinky Sporobolomyces roseus (s100) byla naštěpena na čtyři fragmenty dlouhé 220+130+100+50 bp. A u kvasinky Torulaspora delbrueckii (s107) byly detegovány dva fragmenty délky 420+380 bp. 4.3.3 Restrikční analýza s endonukleázou TaqαI Endonukleáza TaqαI, která byla použita ke štěpení PCR produktů, štěpí DNA v místě 5´…T↓CGA…3´. Pro elektroforeogram byl použit délkový standard 100 bp a 20 bp.

60

Fragmenty získané štěpením tímto enzymem jsou uvedeny v tabulce č. 14. Elektroforeogramy štěpení PCR produktů tímto enzymem jsou uvedeny na obr. č. 30 a č. 31.

100 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 100 20 153/ 109/ 170 150 27

100 2

3

5

8 10 14 16 17 18 19 21 169 137 139 11 100 20 5

Obr. č. 30: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků enzymem TaqαI v 2% agarózovém gelu.

100 73

74 75 100 20 74

74

Obr. č. 31: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků 73-75 enzymem TaqαI v 2% agarózovém gelu.

61

Z elektroforeogramu (Obr. č. 30 a č. 31) je patrné, že tímto enzymem byly naštěpeny všechny vzorky na více fragmentů a tudíž všechny vzorky kvasinek obsahovaly cílové místo pro štěpení touto endonukleázou. Vzorky 2, 3, 5, 8, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 137, 139 a 169 patřící do rodu Saccharomyces byly naštěpeny totožně na čtyři fragmenty délky 290+265+145+105 bp. Vzorky 91, 109 a 110 byly naštěpeny na dva fragmenty 280+150 bp. Porovnáním s analýzou typových kvasinek je možné konstatovat, že se jedná o rod Metschnikowia. Vzorky 46, 56, 150 a 41 byly naštěpeny na tři fragmenty délky 220+180+85. Touto restrikční endonukleázou byla stejně naštěpena i typová kvasinka Pichia membranifaciens, která má s analyzovanými vzorky i shodnou délku fragmentu naamplifikovaného po PCR. Tab. č. 14: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou TaqαI. Pracovní označení vzorků 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 73 74

Délka amplikonu (bp) 390 390 390 450 450 450 450 500 570 590 590 650 650 650 750 750

Délka restrikčních fragmentů 280+150 280+150 280+150 220+180+85 220+180+85 220+180+85 220+180+85 300+115 320+150 330+205 330+205 350+240 350+240 350+240 400+170+130 400+170+130

Pracovní označení vzorků 75 2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

Délka amplikonu (bp) 750 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880

Délka restrikčních fragmentů 400+170+130 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105

Štěpení typových kvasinek enzymem TaqαI je na obrázku č. 32. Velikosti fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou TaqαI jsou uvedeny v tabulce č. 15.

62

100 s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 100 20

100 s104 s105 s106 s107 100 20 s104 s107

Obr. č. 32: Elektroforeogramy štěpení PCR produktů typových kvasinek enzymem TaqαI v 2% agarózovém gelu. Tab. č. 15: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou TaqαI. Pracovní označení vzorků s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

Délka amplikonu (bp) 550 650 660 500 650 550 880 880 880 880 880 800

Délka restrikčních fragmentů 250+120+70 240+190+70 230+200+90+70 270+190+80 250+120+80 300+280+140+100+60 300+280+140+100+60 300+280+140+100+60 300+280+140+100+60 300+280+140+100+60 400+370+40

Po elektroforetické detekci PCR produktu naštěpeného endonukleázou TaqαI u typových kvasinek Saccharomyces uvarum a Saccharomyces paradoxus byly získány totožné fragmenty délky 300+280+140+100+60 bp shodně jako u všech ostatních druhů rodu Saccharomyces. Proto není možné přesně určit druhové zastoupení ani v analyzovaných vzorcích. Touto endonukleázou bylo možno sledovat rozdílné štěpení kvasinky Cystofilobasidium v rámci jednoho rodu. DNA kvasinky Cystofilobasidium bisporidii (s97) byla touto endonukleázou naštěpena na tři fragmenty dlouhé 240+190+70 bp a Cystofilobasidium infirmo-miniatum (s98) byla rozštěpena na čtyři fragmenty dlouhé 230+200+90+70 bp. DNA kvasinky Issatchenkia orientalis (s96) a stejně tak Issatchenkia occidentalis (s101) byla naštěpena totožně na tři fragmenty dlouhé 250+120+70 bp. U kvasinky Pichia fluxuum (s99) byly detegovány tři fragmenty délky 270+190+80 bp. DNA u kvasinky Torulaspora delbrueckii (s107) byla naštěpena na tři fragmenty dlouhé 400+370+40 bp.

63

4.3.4 Restrikční analýza s endonukleázou MseI Enzym MseI štěpí DNA v místě 5´…T↓TAA…3´. Pro elektroforeogram byl použit délkový standard 100 bp a 20 bp. Fragmenty získané štěpením tímto enzymem jsou uvedeny v tabulce č. 16. Elektroforeogramy štěpení PCR produktů tímto enzymem jsou uvedeny na obr. č. 33 a č. 34. 100 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 100 20 153/ 109/ 170 150 27

100 2

3

5

8 10 14 16 17 18 19 21 169 137 139 11 100 20 5

Obr. č. 33: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků enzymem MseI v 2% agarózovém gelu. 100 73 74 75 100 20 74

74

Obr. č. 34: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků 73-75 enzymem MseI v 2% agarózovém gelu.

64

Vzorky 2, 3, 5, 8, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 137, 139 a 169 patřící do rodu Saccharomyces byly naštěpeny na pět totožných fragmentů délky 230+200+130+110+100 bp. Vzorky 153, 157 a 158 se naamplifikovaly po PCR na fragment dlouhý 650 bp a po restrikční analýze enzymem MseI se rozštěpily na tři fragmenty délky 430+85+65, stejně jako typová kvasinka rodu Rhodotorula. Lze tedy i naše izolázy zařadit do tohotu rodu. Tab. č. 16: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou MseI. Pracovní označení vzorků 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 73 74

Délka amplikonu (bp) 390 390 390 450 450 450 450 500 570 590 590 650 650 650 750 750

Délka restrikčních fragmentů 290+170 290+170 290+170 360+60+30 360+60+30 360+60+30 360+60+30 220+125+75 380+100 240+150+100 240+150+100 430+85+65 430+85+65 430+85+65 260+125 260+125

Pracovní označení vzorků 75 2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

Délka amplikonu (bp) 750 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880

Délka restrikčních fragmentů 260+125 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100

Štěpení typových kvasinek enzymem MseI je na obrázku č. 35. Velikosti fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou MseI jsou uvedeny v tabulce č. 17. 100 s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 100 20

100 s104 s105 s106 s107 100 20 s104 s107

Obr. č. 35: Elektroforeogramy štěpení PCR produktů typových kvasinek enzymem MseI v 2% agarózovém gelu. 65

Tab. č. 17: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou MseI. Pracovní označení vzorků s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

Délka amplikonu (bp) 550 650 660 500 650 550 880 880 880 880 880 800

Délka restrikčních fragmentů 500+20 200+160+120 270+100 200+120+90+60 420+50 500+20 210+180+120+100+80+50+20 210+180+120+100+80+50+20 210+180+120+100+80+50+20 210+180+120+100+80+50+20 210+180+120+100+80+50+20 210+140+120

Z elektroforeogramů je patrné, že typové kvasinky rodu Saccharomyces byly touto endonukleázou rozštěpeny na totožné fragmenty délky 210+180+120+100+80+50+20 bp. DNA kvasinky Issatchenkia orientalis (s96) a stejně tak Issatchenkia occidentalis (s101) byla naštěpena totožně na dva fragmenty dlouhé 500+20 bp. DNA u kvasinky Pichia fluxuum (s99) byla naštěpena na čtyři fragmenty dlouhé 200+120+90+60 bp. DNA kvasinky Cystofilobasidium bisporidii (s97) byla touto endonukleázou naštěpena na tři fragmenty dlouhé 200+160+120 bp a u Cystofilobasidium infirmo-miniatum (s98) byly detegovány dva fragmenty dlouhé 270+100 bp. U kvasinky Torulaspora delbrueckii (s107) byly detegovány tři fragmenty dlouhé 210+140+120 bp. DNA kvasinky Sporobolomyces roseus (s100) byla naštěpena na tři fragmenty dlouhé 210+140+120 bp. 4.3.5 Restrikční analýza s endonukleázou AluI Jako poslední restrikční endonukleáza byl zvolen enzym AluI, který štěpí DNA v místě 5´…AG↓CT…3´. Pro elektroforeogram byl použit délkový standard 100 bp a 20 bp. Fragmenty získané štěpením tímto enzymem jsou uvedeny v tabulce č. 18. Elektroforeogarmy štěpení PCR produktů tímto enzymem jsou uvedeny na obr. č. 36 a č.37.

66

100 91 109 110 46 56 150 41 25 100 20 109 150

100 2

3

5

8 10 14 16 100 20 5

100 27 170 179 153 157 158 100 20 27 170 153 100 17 18 19 21 169 137 139 11 100 20 21

Obr. č. 36: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků enzymem AluI v 2% agarózovém gelu. 100 73 74 75 100 20 74

74

Obr. č. 37: Elektroforeogram štěpení PCR produktů vzorků 73-75 enzymem AluI v 2% agarózovém gelu. Vzorky 2, 3, 5, 8, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 137, 139 a 169 patřící do rodu Saccharomyces byly naštěpeny na dva fragmenty délky 800+80 bp. Vzorky 153, 157 a 158 byly štěpeny shodně jako typová kvasinka Rhodotorula glutinis. Stejně tak vzorky 91, 109 a 110 lze podle typových kvasinek zařadit druhově jako Metschnikowia pulcherrima. Vzorek 25 byl po porovnání s typovými kvasinkami zařazen do rodu Candida. Vzorek 27 byl po porovnání s typovými kvasinkami zařazen druhově jako Cryptococcus laurentii. Vzorky 170 a 179 se nepodařilo druhově zařadit. Důvodem bylo to, že žádná z typových kvasinek neprokazovala po štěpení restrikčními endonukleázami stejnou délku fragmentů jako naše analyzované vzorky.

67

Tab. č. 18: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou AluI. Pracovní označení vzorků 91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 73 74

Délka amplikonu (bp) 390 390 390 450 450 450 450 500 570 590 590 650 650 650 750 750

Délka restrikčních fragmentů n n n 405+65 405+65 405+65 405+65 405+65 n 370+190 370+190 370+115+90 370+115+90 370+115+90 560+190 560+190

Pracovní označení vzorků 75 2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

Délka amplikonu (bp) 750 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880

Délka restrikčních fragmentů 560+190 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80

Štěpení typových kvasinek enzymem AluI je na obrázku č. 38. Velikosti fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou AluI jsou uvedeny v tabulce č. 19. 100 s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 100 20

100 s104 s105 s106 s107 100

20 s105 s107

Obr. č. 38: Elektroforeogramy štěpení PCR produktů typových kvasinek enzymem AluI v 2% agarózovém gelu.

68

Tab. č. 19: Souhrnná tabulka velikostí fragmentů typových kvasinek získaných štěpením PCR produktu restrikční endonukleázou AluI. Pracovní označení vzorků s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

Délka amplikonu (bp) 550 650 660 500 650 550 880 880 880 880 880 800

Délka restrikčních fragmentů 380+150 450+220+50 450+220+50 n 430+200 380+150 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 600+110

Z elektroforeogramu a z tabulky výše je patrné, že enzymem AluI nebyla štěpena pouze jedna typová kvasinka a to Pichia fluxuum (s99). Ostatní typové kvasinky obsahují cílové místo, pro tento enzym a došlo k rozštěpení na více fragmentů. Kvasinky rodu Saccharomyses byly neštěpeny totožně na dva fragmenty dlouhé 800+80 bp. DNA kvasinky Issatchenkia orientalis (s96) a Issatchenkia occidentalis (s101) byla naštěpena totožně na dva fragmenty dlouhé 380+150 bp. Stejně tak u kvasinky Cystofilobasidium bisporidii (s97) a Cystofilobasidium infirmo-miniatum (s98) byly detegovány tři totožné fragmenty dlouhé 450+220+50 bp. U kvasinky Sporobolomyces roseus (s100) byly detegovány dva fragmenty dlouhé 430+200 bp. DNA u kvasinky Torulaspora delbrueckii (s107) byla naštěpena na dva fragmenty dlouhé 600+110 bp.

69

4.4 Taxonomické zařazení identifikovaných kvasinek Porovnáním délek a počtu restrikčních fragmentů typových kvasinek, vzniklých po štěpetí různými restrikčními endonukleázami, byly taxonomicky zařazeny izolované kvasinky z vinného moštu a bobulí vína Sauvignon pěstovaného v integrované vinici soukromého vinařství Holánek. K taxonomickému zařazení byly použity typové kvasinky a výsledky restrikčních analýz z minulých let. V rámci této diplomové práce bylo zpracováno restrikční analýzou dalších dvanáct typových kvasinek. Vzorky 91, 109 a 110 byly zařazeny druhově jako Metschnikowia pulcherima. Vzorky 46, 56, 150 a 41 byly zařazeny také druhově jako Pichia membranifaciens. Vzorek 25 byl zařazen rodově jako Candida sp. Vzorek 27 byl zařazen druhově jako Cryptococcus laurentii. Vzorky 170 a 179 se nepodařilo zařadit. Vzorky 153, 157 a 158 byly zařazeny druhově jako Rhodotorula glutinis. Vzorky 73, 74 a 75 byly zařazeny také druhově jako Hanseniaspora uvarum. Vzorky 2, 3, 5, 8, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 137, 139 a 169 byly zařazeny jako rod Saccharomyces sp., všechny kvasinky tohoto rodu poskytovaly po restrikčních analýzách stejné délky fragmentů. Nelze však s jistotou říci, že se ve všech případech jedná o kvasinku Saccharomyces cerevisiae. Důvodem druhového nezařazení je shodnost štěpení různých druhů typových kvasinek rodu Saccharomyces u všech pěti použitých restrikčních endonukleáz. Přehled taxonomického zařazení analyzovaných vzorků je uveden v tabulce č. 20. Tab. č. 20: Přehled taxonomického zařazení analyzovaných vzorků Pracovní označení vzorků

Místo izolace vzorku

91 109 110 46 56 150 41 25 170 179 153 157 158 73 74 75

70

Taxonomické zařazení

Bobule

Metschnikowia pulcherrima

Mošt

Pichia membranifaciens

Mošt

Candida sp.

Bobule

Nezařazeno

Mošt

Rhodotorula glutinis

Bobule

Hanseniaspora uvarum

Pracovní označení vzorků

Místo izolace vzorku

Taxonomické zařazení

27

Bobule

Cryptococcus laurentii

2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

Mošt

Saccharomyces sp.

4.5 Dendrogram identifikovaných kvasinek izolovaných z vína Na základě výsledků získaných štěpením amplifikované DNA jednotlivými restrikčními endonukleázami byl pomocí programu BioNumerics sestaven dendrogram, které ukazuje genetickou podobnost jednotlivých vyizolovaných kvasinek. Jako kritérium podobnosti byly zvoleny Pearsonovy koeficienty podobnosti. Z dendrogramu je patrné, že došlo k rozdělení vyizolovaných kvasinek do osmi skupin podle jejich genetické podobnosti.

Obr. 39: Dendrogram genetické podobnosti kvasinek izolovaných z vína a bobulí, sestavený na základě výsledků RFLP – pro enzymy AluI, HaeIII, HinfI , MseI, a TaqαI.

71

4.6 Alkoholová tolerance Alkoholovou tolerancí byla pozorována schopnost jednotlivých druhů kvasinek přežívat a množit se v odlišných koncentracích ethanolu. Vzorky 110, 56, 25, 27, 179, 153, 74 a 2 byly vybrány jako zástupci kvasinek, kteří zastupují jednotlivou skupinu vzorků, jež byly po PCR naštěpeny na stejně dlouhé fragmenty. Zároveň i z dendrogramu genetické podobnosti kvasinek vyizolovaných z vína je patrné, že jsme získaly osm odlišných druhů. Byly připraveny Erlenmayerovy baňky se sladinou, do kterých byla přidána kvasinková suspenze v množství 1 ml. Tím bylo zajištěno, že v každé Erlenmayerově baňce bylo na počátku experimentu stejné množství kvasinkové kultury. Dále bylo přidáno vypočítané množství ethanolu, aby výsledná koncentrace v baňce byla 1, 4, 8, 12 a 16 obj. %. ethanolu. Turbidimetricky byl každý den pozorován nárůst buněk. Experiment byl proměřován deset dnů. Výsledky naměřených hodnot absorbance pro jednotlivé vzorky jsou uvedeny v příloze č. 4. Grafy znázorňující růstové křivky jednotlivých vzorků jsou uvedeny na obrázcích č. 4047. Kvasinky, které byly nalezeny, patří většinou do divokých tzv. apikulátních kvasinek. Činnost apikulátních kvasinek je důležitá pro tvorbu aroma ve víně, ušlechtilé kvasinky jako je Saccharomyces jsou důležité pro tvorbu ethanolu ve víně. Vzorek 110 byl taxonomicky zařazen jako Metschnikowia pulcherrima. Tato kvasinka byla izolována z bobulí a jak je patrné z grafu množí se pouze do maximální koncentrace ethanolu 4% obj. největší nárůst je zaznamenán první dva dny kultivace. Vzorek 56 byl zařazen jako Pichia membranifaciens. Tato kvasinka byla izolována v prvních fázích kvašení vinného moštu a to zhruba do 6. odběru. V grafu je možné sledovat její pozvolný nárůst i 8% koncentraci ethanolu. Vzorek 25 byl zařazen pouze rodově, a to jako Candida sp. Tato kvasinka byla izolována z moštu v prvním odběru. Největší nárůst byl zaznamenán první dva dny, a to pouze do koncentrace 4% obj. ethanolu, poté se již koncentrace téměř neměnila. Vzorek 27 byl zařazen jako Cryptococcus laurentii. Tato kvasinka byla izolována z bobulí a v grafu můžeme sledovat její pozvolný nárůst po celou dobu kultivace, ale pouze do koncentrace 4% obj. Vzorek 179 nebyl do žádného rodu zařazen. Tato kvasinka byla izolována z bobulí a v grafu je patrno, že 72 hodin trvala lag fáze a teprve potom zaznamenala mírný nárůst, ale zase jenom do maximální koncentrace 4% obj. ethanolu. Vzorek 153 byl taxonomicky zařazen jako Rhodotorula glutinis. Tato kvasinka byla izolována v prvních fázích kvašení vinného moštu. Z grafu je patrné, že se tato kvasinka musela na podmínky nejdříve adaptovat a po 120 hodinách došlo k viditelnému nárůstu, který se však už do konce experimentu zásadně nenavyšoval. Tato kvasinka zase prokazuje svou životaschopnost pouze do koncentrace ethanolu 4 % obj. Vzorek 74 byl druhově zařazen jako Hanseniaspora uvarum. Tato kvasinka byla izolována z bobulí a v grafu je patrno, že se množí pouze v maximální 4% koncentraci ethanolu. Největší nárůst zaznamenala první den kultivace, poté již nebyl nárůst tak velký. Vzorek 2 byl zařazen pouze rodově jako Saccharomyces sp. Z grafů je patrně, že největší alkoholovou toleranci měl právě rod Saccharomyces sp. Tato kvasinka se nacházela ve všech odběrech vinného moštu. Z grafu je patrné, že přežívá i v 12% koncentraci ethanolu.

72

0,35

Absorbance

0,3 1%

0,25

4%

0,2

8%

0,15

12%

0,1

16%

0,05 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 40: Alkoholová tolerance vzorku 110

0,35

Absorbance

0,3 1%

0,25

4%

0,2

8%

0,15

12%

0,1

16%

0,05 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 41: Alkoholová tolerance vzorku 56

0,35

Absorbance

0,3 1%

0,25

4%

0,2

8%

0,15

12%

0,1

16%

0,05 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 42: Alkoholová tolerance vzorku 25 73

0,35

Absorbance

0,3 1%

0,25

4%

0,2

8%

0,15

12%

0,1

16%

0,05 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 43: Alkoholová tolerance vzorku 27

0,35

Absorbance

0,3 1%

0,25

4%

0,2

8%

0,15

12%

0,1

16%

0,05 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 44: Alkoholová tolerance vzorku 179

0,35

Absorbance

0,3 1%

0,25

4%

0,2

8%

0,15

12%

0,1

16%

0,05 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 45: Alkoholová tolerance vzorku 153 74

0,35

Absorbance

0,3 1%

0,25

4%

0,2

8%

0,15

12%

0,1

16%

0,05 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 46: Alkoholová tolerance vzorku 74

0,6

Absorbance

0,5 1% 0,4

4%

0,3

8%

0,2

12% 16%

0,1 0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

čas (hod.)

Obr. č. 47: Alkoholová tolerance vzorku 2

75

5. ZÁVĚR Náplní této diplomové práce bylo identifikovat kvasinky izolované z moštu a bobulí odrůdy vína Sauvignon za použití molekulárně biologických metod. Získané vzorky kvasinek byly kultivovány za optimálních podmínek pro jejich růst a následně přečištěny Kochovou zřeďovací metodou. Přečištěním byla získána čistá kultura, z které byla následně vyizolována DNA pomocí komerční izolační sady UltraCleanTMMicrobial DNA Isolation Kit. Vyizolovaná DNA byla podrobena polymerázové řetězové reakcí (PCR), jenž slouží k amplifikaci specifické oblasti v DNA za použití primerů ITS1 a ITS4. K taxonomickému zařazení různých druhů kvasinek byla použita metoda PCR-RFLP. Použitelnost metody závisí na vhodné volbě primerů pro PCR a také volbě restrikčních endonukleas. PCR-RFLP je modifikace standardní PCR používaná pro typizaci cílové sekvence určitého genu, obsahujícího sekvenční polymorfismus. Před provedením restrikční analýzy byl PCR produkt přečištěn a následně podroben restrikčnímu štěpení za použití restrikčních endonuklaes HinfI, MseI, HaeIII, TaqαI a AluI. Získané fragmenty byly porovnávány podle retenčních vzdáleností s fragmenty získanými po restrikčním štěpení typových kvasinek, u nichž bylo známo taxonomické zařazení. Pro taxonomické zařazení vyizolovaných vzorků kvasinek byly použity typové sbírkové kvasinky CCY, nacházející se na Chemickém ústavu SAV, Bratislava. Kvasinky, které byly nalezeny, patří většinou do divokých tzv. apikulátních kvasinek. Činnost apikulátních kvasinek je důležitá pro tvorbu aroma ve víně, ušlechtilé kvasinky jako je Saccharomyces jsou důležité pro tvorbu ethanolu ve víně. Rod Saccharomyces má také daleko větší alkoholovou toleranci, než všechny ostatní identifikované kvasinky, což bylo dokázáni i experimentálně. Z toho také vyplývá, že apikulátní kvasinky se uplatňují na začátku kvasného procesu, kdy je ještě koncentrace ethanolu ve víně nízká, zatímco kvasinky Saccharomyces sp. se vyskytovaly i v pozdějších odběrech vinného moštu. Na bobulích byly zjištěny kvasinky Metschnikowia pulcherrima, Hanseniaspora uvarum a Cryptococcus laurentii. Ve vinném moštu potom byly identifikovány kvasinky Pichia membranifaciens, Candida sp., Rhodotorula glutinis a Sacharomyces sp.

76

6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1] ŠILHÁNKOVÁ, L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. oprav. a dopl. vyd. Praha: Academia, 2002. 363 s. ISBN 80-200-1024-6. [2] HUDECOVÁ, D., MAJTÁN, V.: Mikrobiológia I. Bratislava: Vydavatelství STU, 2002. 189 s. ISBN 80-227-1663-4. [3] JANDEROVÁ, B., BENDOVÁ, O.: Úvod do biologie kvasinek. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1999. 108 s. ISBN 80-7184-990-1 [4] VRANÁ, D.: Kvasinky ve výzkumu a praxi. 1. vyd. Praha : Academia, 1986. 376 s. ISBN 21-023-86. [5] VESELÁ, M.: Praktikum z obecné mikrobiologie. 3. vyd. Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2004. 100 s. ISBN 80-214-2567-9. [6] LOSKOTOVÁ, M.: Využití kvasinkovitých mikroorganismů v moderních biotechnologiích [online]. Přírodovědecká fakulta MU. Brno 2005. [cit. 2010-04-08], http://www.sci.muni.cz/mikrob/kvasbiotech/spustit.html [7] KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, A.: Kvasinky a kvasinkovité mikroorganizmy. 1. vyd. Bratislava : Alfa, 1982. 488 s. ISBN 63-154-82. [8] BOEKHOUT, T., ROBERT, V.: Yeasts in food. Cambridge England: Woodhead Publishing Ltd, 2003. 487 p. ISBN 1 855573 706 X. [9] WALKER, GRAEME M.: Yeast : Physiology and Biotechnology. 1st edition. Chichester : John Wiley&Sons, 1998. 350 s. ISBN 0-471-96446-8. [10] ALBERTS, B. a kol.: Základy buněčné biologie: Úvod do molekulární biologie buňky. 2.vyd. Ústí nad Labem: Espero Publishing, s.r.o., 1998. 630 s. ISBN 80-902906-0-4. [11] FUGELSANG, K. C., EDWARDS Ch. G: Wine Microbiology: Practical Applications and Procedures. 2nd ed. New York: Springer, 2007. 395 s. ISBN 0-387-33341-x. [12] CAPECE, A., SALZANO, G., ROMANO, P.: Molecular typing techniques as a tool to differentiate non-Saccharomyces wine species. International Journal of Food Microbiology. 2003, vol. 84, pp. 33 – 39. [13] JEUNE, CH., ERNY, C., DEMUYTER, C., LOLLIER, M.: Evolution of the population Saccharomyces cerevisiae from grape to wine in a spontaneous fermentation. Food Microbiology. 2006, vol. 23, pp. 709 – 716. [14] LOUREIRO, V., MALFEITO-FERREIRA, M.: Spoilage yeasts in the wine industry. International Journal of Food Microbiology 2003, vol. 86, pp. 23– 50. [15] KLABAN, V.: Ilustrovaný mikrobiologický slovník. 1. vyd. Praha: Galén, 2005. 654 s. ISBN 80-7262-341-9.

77

[16] CHUMCHALOVÁ, J., NĚMEC, M., TVRZOVÁ, L., PÁČOVÁ, Z., SAVICKÁ, D., KUBÁTOVÁ, A., PATÁKOVÁ, P.: Miniatlas mikroorganismů [online]. [cit. 2010-04-09], http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/mikr.htm [17] KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, A.: Taxonómia kvasinek a kvasinkovitých mikroorganizmov. Bratislava: vydavateľstvo ALFA, 1990. 704 s. ISBN 80-05-00644-6. [18] KLOUDA, P.: Základy biochemie. 1. vyd. Ostrava: Nakladatelství Pavel Klouda, 2000. 155 s. ISBN 80-86369-00-5. [19] FARKAŠ, J.: Technologie a biochemie vína. 2. vyd. Bratislava: Státní nakladatelství technické literatury ALFA, 1980. 872 s. [20] CALLEC, C.: Velká encyklopedie vína. 2. vyd. Dobřejovice: Rebo Production cz, spol. s.r.o. 2003. 527 s. ISBN 80-7234-311-4 [21] FLEET, G.H.: Wine: Microbiology and Biotechnology. 2nd ed. New York: CRC Press, 1993. 510 p. ISBN 0-415-27850-3. [22] FLEET, G.: Microorganisms in food ecosystems. International Journal of Food Microbiology. 1999, vol. 50, pp. 101 – 117. [23] Vodrážka, Zdeněk. Biochemie. 2. opr. vyd. Praha: Academia, 1999. ISBN 80-200-06001. [24] KADLEC, P. a kol.: Technologie potravin II. 1. vyd. Praha: Vysoká škola chemickotechnologická, 2002. 236 s. ISBN 80-7080-510-2 [25] PELIKÁN, M., DUDÁŠ, F., MÍŠA, D.: Technologie kvasného průmyslu. Brno : Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 1996.129 s. ISBN 80-7157-240-3. [26] Čepička, J. a kol.: Obecná potravinářská technologie. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 1995. 246 s. ISBN 80-7080-239-1. [27] KUTTELVAŠER, Z.: Abeceda vína. 2. vydání. Praha: Radix, spol. s r. o., 2003. 280 s., 16 s. příloh. ISBN 80-86031-43-8. [28] DRDÁK, M., a kol.: Základy potravinárskych technológií. 1. vyd. Bratislava : Malé Centrum, 1996. 511 s. ISBN 80-967064-1-1. [29] Znovín Znojmo, a.s. se sídlem v Šatově. [online]. 2005, 28. dubna 2010 [cit. 2010-0429]. Dostupný z WWW: http://www.znovin.cz/article.asp?nArticleID=276&nDepartmentID=247&nLanguageID=1 [30] KRAUS, V., a kol.: Réva a víno v Čechách a na Moravě. [online]. 2005, [cit. 2010-0429] Dostupný z WWW: http://www.wineofczechrepublic.cz/ukaz_odrudu.php?id=6&lang=cz [31] CALLEC, C.: Encyklopedie vína. Dobřejovice: Rebo Production cz, spol. s.r.o. 2000. 320 s. ISBN 80-7234-480-3

78

[32] Svaz integrované produkce hroznů a vína, [online]. 2006, 13. dubna 2010 [cit. 2010-0429]. Dostupný z www: http://siphv.artemon.cz:8080/vino-ip/ [33] RUML, T., RUMLOVÁ, M., PAČES, V.: Genové inženýrství. 1.vyd. Praha: VŠCHT, 2002. 270 s. ISBN 80-7080-499-8. [34] KRÁLOVÁ, B. a kol.: Bioanalytické metody. 3. přepracované vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická, 2001. 254 s. ISBN 80-7080-449-1. [35] ŠMARDA, J. a kol.: Metody molekulární biologie. 1.vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2005. 188s. ISBN 80-210-3841-1. [36] BEZOUŠKA, K., a kol. Molekulární biologie a genetika VIII. J. Jonák. 1. vyd. Praha : SEDISTRA, 1998. 264 s. ISBN 80-902588-0-8. [37] VŠCHT. [online]. [cit. 2010-04-29]. Dostupný z WWW: http://vydavatelstvi.vscht.cz/echo/organika/trivialni-sk-heterocykly.html [38] HERAZ-VAZQUEZ, F. J.; MINGORANCE-CAZORLA, L.; CLEMENTE-JIMENEZ, J. M.; RODRIGUEZ-VICO, F.: Identification of yeast species from orange fruit and juice by RFLP and sequence analysis of the 5·8S rRNA gene and the two internal transcribed spacers. FEMS Yeast Research. 2003, vol. 3, pp. 3 – 9. [39] COCOLIN, L., BISSON, F.L., MILLS, A.: Direct profiling of the yeast dynamics in wine fermentations. FEMS Microbiology Letters. 2000, vol. 189, pp. 81-87. [40] SHUANG-SHI LI, CHAO CHENG, ZHENG LI, JING-YU CHEN, BIN YAN, BEIZHONG HAN, MALCOM REEVES: Yeast species associated with wine grapes in China. International Journal of Food Mikrobiology. 2010, vol. 138, pp. 85–90 [41] The Chemistry Encyclopedia [online]. 2005, 1. dubna 2007 [cit. 2010-04-29]. Dostupný z WWW: http://www.chemistrydaily.com/chemistry/Thermus_aquaticus [42] KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z.: Molekulární genetika zvířat : Metody detekce polymorfizmů DNA genů. 1. vyd. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2002. 168 s. ISBN 80-7157-616-6. [43] KLOUDA, P.: Moderní analytické metody. 2.vyd. Ostrava: Nakladatelství Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80-86369-07-2. [44] ZIMA, J. a kol: Genetické metody v zoologii. 1.vyd. Praha: Karolinum, 2004. 239 s. ISBN 80-246-0795-6. [45] ŠTÍPEK, S.: Stručná biochemie: Uchování a exprese genetické informace. Praha: MEDPRINT, 1997. 92 s. ISBN 80-902036-2-0. [46] ŠIPICKÝ, M., ŠUBÍK, J.: Genetika kvasinek. 1. vyd. Bratislava : Veda, 1992. 312 s. ISBN 80-224-0396-2.

79

[47] SENSES-ERGUL, S., ÁGOSTON, R., BELÁK, Á., DEÁK, T.: Characterization of some yeasts isolated from foods by traditional and molecular tests. Journal of Food Mikrobiology, 2006. vol. 108, pp 120-124. [48] ZOTT, K., CLAISSE, O., LUCAS, P., COULON, J., LONVAUD-FUNEL, A., MASNEUF-POMAREDE, I.: Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR. Food Microbiology. 2010, pp. 1-9 [49] ESTEVE-ZARZOSO, B., BELLOCH, C., URUBURU, F., QUEROL, A.: Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal of Systematic Bacteriology. 1999, vol. 49, pp 329-337

80

7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ DNA RNA tRNA mRNA PCR RFLP ATP NADH pH S. Rh. P. C. M. Sch. dsDNA G C A T dNTP dATP dCTP dGTP dTTP EDTA ITS bp Taq DNA polymeráza TBE CCY UV °ČSN EtBr IP V NK n IOBC

deoxyribonukleová kyselina riboxynukleová kyselina transferová ribonukleová kyselina messenger ribonukleová kyselina polymerázová řetězová reakce polymorfismus délky restrikčních fragmentů adenosintrifosfát nukleosidpolyfosfát záporný logaritmus H3O+ Saccharomyces Rhodotorula Pichia Candida Metschmikowia Schizosaccharomyces dvouřetězcová DNA guanin cytosin adenin thiamin deoxynukleotidtrifosfát deoxyadenosintrifosfát deoxycytosintrifosfát deoxyguanintrifosfát deoxythimintrifosfát ethylendiamin tetraoctová kyselina vnitřní přepisová oblast (z angl. internal trascribed spacer) počet páru bazí termostabilní DNA polymeráza tris-borátový pufr Zbierka kultúr kvasinek, Chemický ústav AV SR, Bratislava ultrafialové záření český normalizovaný moštoměr ehidium bromid integrovaná produkce jednotka napětí negativní kontrola neštěpí Mezinárodní organizace pro biologickou a integrovanou ochranu proti rostlinným a živočišným škůdcům

81

8. SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1: Seznam typových kvasinek. Příloha 2: Délky fragmentů DNA po restrikční analýze pro typové kvasinky. Příloha 3: Délky fragmentů získaných na základě analýzy RFLP u vzorků kvasinek izolovaných z vína. Příloha 4: Alkoholová tolerance vybraných druhů kvasinek, naměřené výsledky absorbance

82

9. PŘÍLOHY Příloha 1: Seznam typových kvasinek. Tab.1: Seznam typových kvasinek Pracovní označení vzorků s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

CCY

Druh

29-9-17 62-7-1 17-18-1 41-11-2 19-6-15 39-27-1 21-6-7 21-6-6 48-80 48-79 21-53-2 21-22-10

Issatchenkia orientalis (Candida crusei) Cystofilobasidium bisporidii – typový Cystofilobasidium infirmo-miniatum Pichia fluxuum Sporobolomyces roseus Issatchenkia occidentalis Saccharomyces pastorianus – typový Saccharomyces pastorianus Saccharomyces uvarum Saccharomyces uvarum Saccharomyces paradoxus Torulospora delbrueckii

83

84

Číslo izolátu s96 s97 s98 s99 s100 s101 s102 s103 s104 s105 s106 s107

550 650 660 500 650 550 880 880 880 880 880 800

PCR

HinfI

TaqαI

AluI

MseI

400+100 240+170+150 250+120+70 380+140 500+20 420+220 360+220+70 240+190+70 450+220+50 200+160+120 450+90+70 290+210+190 230+200+90+70 450+220+50 270+100 n 240+240 270+190+80 n 220+120+90+60 n 220+130+100+50 430+200 420+50 400+100 240+170+150 250+120+80 380+150 500+20 320+240+180+140 380+140 300+280+140+100+60 800+80 210+180+120+100+80+50+20 320+240+180+140 380+140 300+280+140+100+60 800+80 210+180+120+100+80+50+20 500+240+150 380+140 300+280+140+100+60 800+80 210+180+120+100+80+50+20 500+240+150 380+140 300+280+140+100+60 800+80 210+180+120+100+80+50+20 320+240+180+140 380+140 300+280+140+100+60 800+80 210+180+120+100+80+50+20 n 420+380 400+370+40 600+110 210+140+120

HaeIII

Tab.2: Délky fragmentů DNA po restrikční analýze pro typové kvasinky.

Příloha 2: Délky fragmentů DNA po restrikční analýze pro typové kvasinky.

PCR

390 390 390 450 450 450 450 500 570 590 590 650 650 650 750 750 750

Číslo izolátu

91 109 110 46 56 150 41 25 27 170 179 153 157 158 73 74 75

295+110 295+110 295+110 330+100+70 330+100+70 330+100+70 330+100+70 n n n n n n n n n n

HaeIII 205+190 205+190 205+190 260+115+105 260+115+105 260+115+105 260+115+105 240+240 300+180 310+145+105 310+145+105 280+125+105 280+125+105 280+125+105 350+195+160 350+195+160 350+195+160

HinfI 280+150 280+150 280+150 220+180+85 220+180+85 220+180+85 220+180+85 300+115 320+150 330+205 330+205 350+240 350+240 350+240 400+170+130 400+170+130 400+170+130

TaqαI n n n 405+65 405+65 405+65 405+65 405+65 n 370+190 370+190 370+115+90 370+115+90 370+115+90 560+190 560+190 560+190

AluI

Tab.3: Délky fragmentů získaných na základě analýzy RFLP u vzorků kvasinek izolovaných z vína

Příloha 3: Délky fragmentů získaných na základě analýzy RFLP u vzorků kvasinek izolovaných z vína.

290+170 290+170 290+170 360+60+30 360+60+30 360+60+30 360+60+30 220+125+75 380+100 240+150+100 240+150+100 430+85+65 430+85+65 430+85+65 260+125 260+125 260+125

MseI

85

86

Číslo izolátu 2 3 5 8 10 11 14 16 17 18 19 21 137 139 169

HaeIII

320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 320+240+180+140 510+320+240+140 510+320+240+140 320+240+180+140

PCR

880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880 880

380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140 380+140

HinfI 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105 290+265+145+105

TaqαI

MseI 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100 230+200+130+110+100

AluI 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80 800+80

Tab.3: Pokračování: Délky fragmentů získaných na základě analýzy RFLP u vzorků kvasinek izolovaných z vína

Příloha 4: Alkoholová tolerance vybraných druhů kvasinek, naměřené výsledky absorbance Tab. č. 4: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 110 Číslo vzorku

110

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,005 0,007 0,005 0,002 0,004

0,094 0,053 0,006 0,002 0,004

0,159 0,138 0,006 0,002 0,004

0,177 0,150 0,006 0,002 0,004

0,180 0,162 0,006 0,002 0,004

0,186 0,171 0,006 0,002 0,004

0,192 0,174 0,007 0,002 0,004

0,201 0,174 0,007 0,002 0,004

0,210 0,195 0,007 0,002 0,004

0,219 0,201 0,007 0,002 0,004

Tab. č. 5: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 56 Číslo vzorku

56

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,002 0,004 0,003 0,001 0,008

0,091 0,079 0,021 0,001 0,008

0,153 0,126 0,033 0,001 0,008

0,186 0,144 0,081 0,001 0,008

0,204 0,156 0,093 0,001 0,008

0,228 0,159 0,108 0,001 0,008

0,234 0,174 0,123 0,001 0,008

0,255 0,183 0,132 0,001 0,008

0,297 0,195 0,144 0,001 0,008

0,300 0,219 0,156 0,001 0,008

Tab. č. 6: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 25 Číslo vzorku

25

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,001 0,003 0,003 0,002 0,002

0,094 0,044 0,003 0,002 0,002

0,126 0,123 0,003 0,002 0,002

0,126 0,126 0,003 0,002 0,002

0,132 0,138 0,003 0,002 0,002

0,138 0,138 0,003 0,002 0,002

0,138 0,138 0,003 0,002 0,002

0,144 0,138 0,003 0,002 0,002

0,150 0,138 0,003 0,002 0,002

0,156 0,144 0,003 0,002 0,002

Tab. č. 7: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 27 Číslo vzorku

27

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,002 0,001 0,001 0,002 0,004

0,022 0,006 0,001 0,002 0,004

0,052 0,020 0,001 0,002 0,004

0,073 0,037 0,001 0,002 0,004

0,096 0,060 0,001 0,002 0,004

0,126 0,080 0,001 0,002 0,004

0,147 0,092 0,001 0,002 0,004

0,150 0,099 0,001 0,002 0,004

0,159 0,117 0,001 0,002 0,004

0,162 0,123 0,001 0,002 0,004 87

Tab. č. 8: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 179 Číslo vzorku

179

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,004 0,003 0,001 0,003 0,001

0,007 0,006 0,002 0,003 0,001

0,008 0,006 0,002 0,003 0,001

0,026 0,006 0,002 0,003 0,001

0,080 0,044 0,002 0,003 0,001

0,094 0,058 0,002 0,003 0,001

0,095 0,060 0,002 0,003 0,001

0,098 0,062 0,002 0,003 0,001

0,101 0,066 0,002 0,003 0,001

0,101 0,064 0,002 0,003 0,001

Tab. č. 9: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 153 Číslo vzorku

153

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,002 0,003 0,003 0,001 0,001

0,011 0,005 0,003 0,001 0,001

0,014 0,005 0,003 0,001 0,001

0,016 0,005 0,003 0,001 0,001

0,016 0,005 0,003 0,001 0,001

0,016 0,008 0,003 0,001 0,001

0,061 0,051 0,003 0,001 0,001

0,074 0,057 0,003 0,001 0,001

0,078 0,059 0,003 0,001 0,001

0,078 0,059 0,003 0,001 0,001

Tab. č. 10: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 74 Číslo vzorku

74

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,003 0,002 0,004 0,003 0,002

0,069 0,075 0,004 0,003 0,002

0,096 0,084 0,004 0,003 0,002

0,102 0,096 0,004 0,003 0,002

0,108 0,102 0,004 0,003 0,002

0,108 0,102 0,004 0,003 0,002

0,114 0,096 0,004 0,003 0,002

0,12 0,102 0,004 0,003 0,002

0,126 0,108 0,004 0,003 0,002

0,126 0,120 0,004 0,003 0,002

Tab. č. 11: Naměřené hodnoty absorbance kvasinky 2 Číslo vzorku

2

88

obj. %c EtOH 1 4 8 12 16

0 hod.

24 hod.

48 hod.

72 hod.

96 hod.

120 hod.

144 hod.

168 hod.

192 hod.

216 hod.

0,004 0,003 0,002 0,002 0,003

0,354 0,270 0,051 0,002 0,003

0,504 0,480 0,279 0,018 0,003

0,504 0,492 0,336 0,097 0,003

0,504 0,504 0,396 0,132 0,003

0,492 0,516 0,408 0,162 0,003

0,504 0,516 0,420 0,276 0,003

0,504 0,528 0,420 0,294 0,003

0,504 0,528 0,420 0,324 0,003

0,504 0,540 0,432 0,354 0,003