SKRIPSI
PENGUJIAN KAPASITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK POLAR, NONPOLAR, FRAKSI PROTEIN DAN NONPROTEIN KACANG KOMAK (Lablab purpureus (L.) sweet)
Oleh: OLGA YULIA F24102024
2007 DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
Olga Yulia. F24102024. Pengujian Kapasitas Antioksidan Ekstrak Polar, Nonpolar, Fraksi Protein dan Nonprotein Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Di bawah bimbingan Ir. Arif Hartoyo, MSi.
ABSTRAK Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber hayati, salah satunya adalah kacang-kacangan. Kacang-kacangan dikenal sebagai sumber protein nabati, karbohidrat kompleks, oligosakarida, mineral, fitokimia dan serat pangan yang bermanfaat bagi tubuh. Selama ini, penelitian tentang kacang-kacangan masih relatif sedikit kecuali kacang kedelai. Oleh karena itu, perlu dilakukan eksplorasi terhadap jenis kacang-kacangan yang lain, salah satunya adalah kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Berdasarkan penelitian Khodijah (2003); Purnamasari (2002); dan Suwarno (2003), kacang komak telah terbukti memiliki karakter fraksi protein dan sifat fungsional protein yang hampir sama dengan kedelai. Oleh karena itu, diduga kacang komak memiliki sifat biologis yang hampir sama juga dengan kedelai. Salah satu sifat biologis yang perlu dikaji adalah potensi antioksidan kacang komak. Hal ini diharapkan dapat meningkatkan pemanfaatan kacang komak, terutama sebagai pangan fungsional. Aspek yang akan dikaji dalam penelitian ini adalah pengukuran aktivitas antioksidan dengan uji DPPH dan uji kemampuan mereduksi, total fenol, asam fitat dan uji fitokimia. Sampel kacang komak disediakan dalam bentuk ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol dan ekstrak etil asetat. Aktivitas antioksidan dengan uji DPPH menunjukkan bahwa ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol dan ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antioksidan berturut-turut adalah 10.22, 7.10, 2.63, 1.92, dan 3.13 AEAC. Aktivitas antioksidan yang paling tinggi terdapat pada ekstrak air yaitu 10.22 AEAC. Angka ini menunjukkan bahwa ekstrak air memiliki aktivitas antioksidan 10.22 kali lebih besar daripada asam askorbat pada konsentrasi yang sama. Sedangkan uji aktivitas antioksidan dengan uji kemampuan mereduksi menunjukkan bahwa ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol, dan ekstrak etil asetat memiliki kemampuan mereduksi berturut-turut adalah 0.432, 0.272, 0.270, 0.337 dan 0.285. Sejalan dengan uji DPPH, kemampuan mereduksi yang paling tinggi terdapat pada ekstrak air yaitu sebesar 0.432. Hasil uji aktivitas antioksidan ini didukung oleh hasil pengujian kadar total fenol. Kadar total fenol ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol dan ekstrak etil asetat berturut-turut adalah 23285.64, 4585.64, 4738.21, 5304.87 dan 15722.82 ppm. Kadar total fenol yang paling tinggi terdapat pada ekstrak air (23285.64 ppm). Hasil uji aktivitas antioksidan juga didukung oleh hasil pengujian kadar asam fitat. Kadar asam fitat ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol dan ekstrak etil asetat berturut-turut adalah 2.92, 1.85, 1.96, 0.44 dan 0.08 mg/100 g ekstrak. Kadar asam fitat yang paling tinggi terdapat pada ekstrak air (2.92 mg/100 g ekstrak). Selain itu, hasil uji aktivitas antioksidan juga didukung oleh komponen fitokimia yang banyak
terdapat pada ekstrak air yaitu fenol hidrokuinon, saponin, tanin, steroid, triterpenoid dan alkaloid yang dapat bersifat sebagai antioksidan. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95%, ekstrak air pada uji DPPH, kemampuan mereduksi, total fenol dan kadar fitat memberikan hasil yang berbeda nyata dengan fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol dan ekstrak etil asetat.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Koto Tangah, Kabupaten 50 Kota, Sumatera Barat pada tanggal 14 juli 1984. Penulis adalah puteri dari pasangan Bapak Afriwandi dan Ibu Heni Zuita dan merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Penulis menempuh pendidikan di Taman Kanak-Kanak Aisyiyah Bustanul Athfal di Koto Tangah, cabang Suliki, daerah 50 Kota, Sumatera Barat pada tahun 1989-1990, pendidikan sekolah dasar di SD Negeri 02 Koto Tangah di Kecamatan Suliki Gunung Mas, Kabupaten 50 Kota pada tahun 1990-1996, pendidikan lanjutan tingkat pertama di SLTP Negeri 2 Suliki Gunung Mas di Limbanang, Kabupaten 50 kota pada tahun 1996-1999, dan pendidikan lanjutan tingkat atas di SMU Negeri 1 Suliki Gunung Mas, Lima Puluh Kota pada tahun 1999-2002. Pada tahun 2002, penulis melanjutkan pendidikan di Institut Pertanian Bogor pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor yang diterima melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Selama menempuh pendidikan di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor, penulis terlibat dalam beberapa organisasi yaitu HIMITEPA (Himpunan Mahasiswa Teknologi Pangan), dan Food Chat. Selain itu, penulis juga terlibat dalam beberapa kepanitiaan yaitu LLS (Lepas Landas Sarjana) dan Baur. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian, pada tahun 2006 penulis melakukan penelitian di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor, dengan judul “Pengujian Kapasitas Antioksidan Ekstrak Polar, Nonpolar, Fraksi Protein dan Nonprotein Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet)” di bawah bimbingan Bapak Ir. Arif Hartoyo, MSi.
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahi robbil’alamin, puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat melaksanakan dan menyelesaikan penelitian yang berjudul “Pengujian Kapasitas Antioksidan Ekstrak Polar, Nonpolar, Fraksi Protein dan Nonprotein Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Skripsi ini merupakan hasil nyata dari penelitian yang dilakukan oleh penulis. Penulisan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak, baik moral maupun material. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Keluargaku tercinta: Ama, Apa dan adikku tersayang Aufa yang selalu memberikan do’a, kasih sayang, nasehat dan motivasi tiada henti. 2. Bapak Ir. Arif Hartoyo MSi selaku dosen pembimbing yang telah membimbing penulis dalam penelitian dan penulisan. 3. Bapak Dr. Nugraha Edhi Suyatma DEA, STP atas nasehat, saran, masukan dan kesediaannya sebagai dosen penguji. 4. Bapak Dr. Sukarno atas kesediaannya sebagai dosen penguji, terima kasih atas nasehat, saran dan masukannya kepada penulis. 5. Semua teknisi dan laboran: Pak Wahid, Pak Gatot, Teh Ida, Pak Edi, Pak Rojak, Pak Sobirin, Pak Solihin, Bu Rubiah, Pak Koko, Pak Taufik, Pak Yahya; terima kasih atas saran, bantuan dan kerja samanya selama penulis melakukan penelitian. 6. Paktuo Hasbi, Maktuo Emi, Tek iyet, Pak etek Andi, Tek inel, Tek An, Abah, Tek Titin, Maktuo Iyar, Maktuo Wal, Da Depi, Bang Eja, Teh Melia; terima kasih atas kasih sayang, nasehat, saran dan bantuannya. Semoga segala kebaikannya dibalas oleh Allah SWT. 7. Wito Mariswan yang selalu memberikan do’a, kasih sayang, nasehat, saran, dukungan dan semangat kepada penulis, semoga Allah membalasnya dengan kebaikan. 8. Inda, terima kasih atas semua bantuannya selama penulis melakukan penelitian dan penulisan.
i
9. Tina yang telah membantu penulis dalam pengolahan data, terima kasih atas semua bantuannya. 10. Eva, Manginar, Christ, Mumus, Ica dan Novi; terima kasih atas persahabatan, bantuan, saran, nasehat, dukungan, semangat dan hari-hari kebersamaan selama di IPB, terima kasih telah membuat hari-hari penulis lebih bermakna. 11. Ririn, Dhenok, Sinta; terima kasih atas bantuannya. 12. Teman-teman ITP 39, terima kasih atas bantuan dan kerjasamanya selama penulis melakukan penelitian. 13. Ibu Endang dan Ibu Didah yang telah memberikan saran dan masukan kepada penulis. 14. Bapak Budi Nurtama, terima kasih atas saran dan masukannya kepada penulis. 15. Bapak-bapak pustakawan FATETA: Pak Dunung, Pak Agus, Pak Marga dan Pak Kosasih; terima kasih telah membantu penulis dalam pencarian literatur. 16. Ibu dan Bapak pustakawan di PAU dan LSI yang telah membantu dalam pencarian literatur untuk penyusunan skripsi ini. 17. Puteri 26: Ni Zia, Rahmi, Ana, Bibi, Anti, Tina, Vina, Riyah, Beti, Imel. 18. Teman-teman LA PRIEZTA: Mba Lia, Nilam, Mba Iyo, Mba Wiwin, Eri, Erda, Ayu, Betty, Maria, Christ, Yuris. 19. Pihak-pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadari dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari berbagai pihak. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat.
Bogor,
Januari 2007
Penulis
ii
PENGUJIAN KAPASITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK POLAR, NONPOLAR, FRAKSI PROTEIN DAN NONPROTEIN KACANG KOMAK (Lablab purpureus (L.) sweet)
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor
Oleh: OLGA YULIA F24102024
2007 DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN PENGUJIAN KAPASITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK POLAR, NONPOLAR, FRAKSI PROTEIN DAN NONPROTEIN KACANG KOMAK (Lablab purpureus (L.) sweet)
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor
Oleh: OLGA YULIA F24102024
Dilahirkan pada tanggal 14 Juli 1984 Di Koto Tangah, Sumatera Barat
Lulus pada tanggal: 10 Januari 2007
Menyetujui, Bogor, Januari 2007
Ir. Arif Hartoyo, MSi. Dosen Pembimbing Mengetahui,
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc Ketua Departemen ITP
DAFTAR ISI KATA PENGANTAR………………………………………………….
i
DAFTAR ISI…………………………………………………………...
iii
DAFTAR TABEL...................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR...............................................................................
vii
DAFTAR LAMPIRAN...........................................................................
viii
I. PENDAHULUAN............................................................................
1
A. LATAR BELAKANG.................................................................
1
B. TUJUAN PENELTIAN...............................................................
2
II. TINJAUAN PUSTAKA..................................................................
3
A. KACANG KOMAK....................................................................
3
B. RADIKAL BEBAS......................................................................
6
C. ANTIOKSIDAN..........................................................................
7
D. EKSTRAKSI...............................................................................
9
E. FITOKIMIA.................................................................................
10
1. Fenol.........................................................................................
11
2. Flavonoid..................................................................................
12
3. Tanin.........................................................................................
13
4. Alkaloid....................................................................................
13
5. Triterpenoid..............................................................................
13
6. Steroid......................................................................................
14
7. Saponin....................................................................................
14
F. ASAM FITAT..............................................................................
14
III. METODOLOGI PENELITIAN.......................................................
16
A. BAHAN DAN ALAT.................................................................
16
B. METODOLOGI PENELITIAN..................................................
16
a. Penyediaan Sampel..................................................................
16
1. Pembuatan Tepung Kacang Komak...................................
16
2. Pembuatan Fraksi Protein dan Nonprotein Kacang Komak...................................................................
17
3. Pembuatan Ekstrak Air.......................................................
18
4. Pembuatan Ekstrak Kloroform-Metanol.............................
18
iii
5. Pembuatan Ekstrak Etil Asetat............................................
18
b. Perhitungan Rendemen Ekstrak..............................................
18
c. Analisis....................................................................................
19
1. Analisis Kadar Air...............................................................
19
2. Analisis Kadar Protein.........................................................
19
3. Analisis Kadar Total Fenol..................................................
20
4. Analisis Fitokimia................................................................
21
a. Fenol hidrokuinon............................................................
21
b. Flavonoid.........................................................................
21
c. Tanin................................................................................
21
d. Alkaloid...........................................................................
21
e. Triterpenoid.....................................................................
22
f. Steroid.............................................................................
22
g. Saponin............................................................................
22
5. Analisis Kadar Asam Fitat..................................................
22
6. Aktivitas Antioksidan..........................................................
23
a. Uji DPPH.........................................................................
23
b. Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi.............................
24
7. Analisis Statistik.................................................................
24
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................
25
A. EKSTRAKSI KACANG KOMAK............................................
25
B. PEMBUATAN FRAKSI PROTEIN DAN NONPROTEIN.....
26
D. AKTIVITAS ANTIOKSDAN....................................................
28
1. Uji DPPH.................................................................................
28
2. Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi.....................................
30
C. UJI KIMIA..................................................................................
32
1. Total Fenol..............................................................................
32
2. Fitokimia.................................................................................
35
3. Asam Fitat...............................................................................
37
V. KESIMPULAN DAN SARAN.........................................................
40
A. KESIMPULAN............................................................................
40
B. SARAN.........................................................................................
40
iv
DAFTAR PUSTAKA.............................................................................
41
LAMPIRAN............................................................................................
49
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Visualisasi tanaman kacang komak........................................
3
Gambar 2. Visualisasi biji kacang komak................................................
4
Gambar 3. Reaksi Fenton…………………………………….................
8
Gambar 4. Reaksi Haber-Weiss...............................................................
8
Gambar 5. Reaksi peredaman radikal bebas DPPH oleh antioksidan......
9
Gambar 6. Struktur kimia komponen fenolik...........................................
11
Gambar 7. Proses pembuatan fraksi protein dan nonprotein kacang komak.........................................................................
17
Gambar 8. Aktivitas antioksidan ekstrak kacang komak (metode DPPH) .....................................................................
29
Gambar 9. Aktivitas antioksidan ekstrak kacang komak (metode uji aktivitas kemampuan mereduksi) ......................
31
Gambar 10. Kadar total fenol ekstrak kacang komak..............................
33
Gambar 11. Kadar asam fitat ekstrak kacang komak...............................
38
vii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Komposisi kimia kacang komak……………………………….
5
Tabel 2. Komposisi asam amino kacang komak.......................................
5
Tabel 3. Seri larutan standar asam tanat....................................................
20
Tabel 4. Seri larutan standar Ca-Fitat........................................................
23
Tabel 5. Rendemen ekstrak kacang komak...............................................
26
Tabel 6. Kadar air dan kadar protein fraksi protein dan nonprotein kacang komak..............................................................................
27
Tabel 7. Hasil uji fitokimia ekstrak kacang komak...................................
35
Tabel 8. Hasil analisis fitokimia terhadap sampel produk fermentasi kedelai........................................................................
36
vi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Penentuan kurva standar DPPH ………………………………. 50 Lampiran 2. Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH ……………………............................................. 51 Lampiran 3. Nilai absorbansi uji aktivitas kemampuan mereduksi................
52
Lampiran 4. Penentuan kurva standar total fenol …………………............... 53 Lampiran 5. Pengukuran kadar total fenol sampel.......................................... 54 Lampiran 6. Penentuan kurva standar Ca-fitat................................................ 55 Lampiran 7. Pengukuran kadar asam fitat sampel........................................... 56 Lampiran 8. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran aktivitas antioksidan (metode DPPH)........................................................ 57 Lampiran 9. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran aktivitas antioksidan (metode uji aktivitas kemampuan mereduksi).......... 58 Lampiran 10. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran total fenol..... 59 Lampiran 11. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran asam fitat...... 60
viii
I. PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG Indonesia merupakan negara yang kaya sumber alam dan memiliki sumber hayati seperti kacang-kacangan dan biji-bijian yang melimpah. Namun, sebagian besar kacang-kacangan dan biji-bijian tersebut masih belum dieksplorasi. Oleh sebab itu, perlu dilakukan eksplorasi terhadap potensi sumber daya alam Indonesia, salah satunya adalah terhadap jenis kacangkacangan yaitu kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Kacang komak merupakan salah satu jenis kacang-kacangan yang memiliki potensi ekonomi yang cukup tinggi. Kacang komak dapat tumbuh di daerah tropis dan subtropis dan mudah dibudidayakan karena tanaman ini sangat toleran terhadap kekeringan. Hasil panen rata-rata biji kacang komak adalah sebesar 1.460 kg/ha (Duke, 1983). Di Asia, panen rata-rata biji kacang komak adalah sebesar 56-67 kg/ha (Kay, 1979). Skerman (1977) menyatakan bahwa di New South Wales, dalam satu hektar tanaman kacang komak dapat menghasilkan 1.500 kg protein sehingga kacang komak sangat potensial sebagai sumber protein nabati. Selain itu, kacang komak juga bermanfaat dalam menyuburkan tanah karena kandungan nitrogennya yang cukup tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pupuk hijau (Duke, 1983). Saat ini masih sedikit penelitian dilakukan pada jenis kacang-kacangan. Penelitian yang banyak dilakukan hanya pada kacang kedelai. Kacangkacangan seperti kacang kedelai mengandung komponen-komponen seperti protein, karbohidrat kompleks, oligosakarida, fitokimia, mineral dan serat pangan yang diketahui bermanfaat bagi kesehatan tubuh. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa konsumsi kedelai dapat mencegah penyakit kanker (Alekel et al., 1998; Anthony et al., 1996), menurunkan resiko osteoporosis (Arjmandi et al., 1998), berperan dalam penyakit ginjal kronis (Fico et al., 2000; Ranich et al., 2001), menurunkan kolesterol plasma (Franke et al., 1995; Ho et al., 2000), menunjukkan aktivitas antiaterosklerosis (Hillis dan Isoi, 1965; Huff et al., 1982) dan menurunkan resiko penyakit jantung koroner (Lucas et al., 2001).
1
Berdasarkan penelitian-penelitian terdahulu, kacang komak telah terbukti memiliki karakter fraksi protein dan sifat fungsional yang hampir sama dengan kedelai. Pada penelitian Khodijah (2003), hasil analisis protein globulin 7S dan 11S dari kacang komak memiliki pola elektroforesis yang hampir sama dengan kedelai. Menurut Purnamasari (2002), fraksi globulin rata-rata kedua varietas kacang komak DL-40 dan DL-58 (70.58%) mendekati fraksi globulin kacang tanah (70%) dan kacang kedelai (74%). Suwarno (2003) juga telah meneliti tentang sifat fungsional isolat protein kacang komak dan didapatkan bahwa sifat fungsional isolat protein kacang komak dan kacang kedelai memiliki banyak kesamaan. Hal ini dapat dilihat dari sifat daya serap air, daya serap minyak, dan daya emulsi isolat kacang komak dan kacang kedelai yang tidak berbeda nyata. Berdasarkan hal di atas, kemungkinan kacang komak juga mempunyai sifat biologis yang sama dengan kacang kedelai. Komponen dalam kacang kedelai seperti diketahui mempunyai manfaat bagi kesehatan tubuh diantaranya adalah sifat anti radikal bebas (antioksidan). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk membuktikan sifat anti radikal bebas pada kacang komak. Dengan dilakukannya penelitian tentang pengujian kapasitas antioksidan ekstrak polar, nonpolar, fraksi protein dan nonprotein kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet) ini diharapkan pemanfaatan kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet) secara tepat dapat diketahui, sehingga dapat meningkatkan dan memperluas pemanfaatan kacang komak. B. TUJUAN PENELITIAN Penelitian ini bertujuan untuk mencari informasi adanya kandungan antioksidan pada kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet) sehingga pemanfaatan kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet) secara tepat dapat diketahui dan dapat dikembangkan lebih luas.
2
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. KACANG KOMAK Kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet) diklasifikasikan ke dalam subkelas Dicotyledonae, ordo Leguminosae, famili Fabaceae dan genus Dolichos. Kacang komak mempunyai berbagai nama lain seperti hyacinth bean, Bonavist, Chicaros, Chink, Egyption bean, Pharao, Seem, Val, Dolichos lablab L., Dolichos purpureus L., lablab niger Medik., lablab vulgaris Savi., Dolichos albus lour., Dolichos cultratus Thunb., Dolichos lablab var hortensis, lablab leucocarpos Davi, lablab nankinicus Savi, lablab perennans DC., lablab vulgaris var niger DC (Duke, 1983). Tanaman ini merupakan tanaman asli dari Asia dan juga ditemukan di Afrika (Allan, 1981). Sebelum abad pertengahan, kacang komak sudah dibudidayakan di India, China, Jepang, Sudan dan Mesir. Kacang komak dapat tumbuh di daerah tropis dan subtropis. Suhu yang baik untuk tanaman adalah 18°-30°C. Namun, suhu yang tinggi tidak mempengaruhi perkembangannya. Tanaman ini sangat toleran terhadap kekeringan dan beradaptasi dengan baik pada lahan kering dengan curah hujan rata-rata 200-2500 mm/tahun (Duke, 1983).
Gambar 1.Visualisasi tanaman kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet)
3
Kacang komak memiliki batang yang keras, berserat dan berbulu dengan tinggi 2-3 m, dan dapat mencapai tinggi hingga 10 m. Warna bunga dari kacang komak berbeda-beda sesuai dengan jenisnya. Daun kacang komak lebar dan tebal dengan panjang 7.5-15 cm. Daun bercabang tiga (trifoliolate) pada setiap sisi tangkainya (Skerman, 1977). Deskripsi tanaman kacang komak dapat dilihat pada Gambar 1. Biji kacang komak terdapat dalam polong. Setiap polong terdapat 3-6 biji kacang komak. Polong kacang komak memiliki panjang 5-20 cm dengan lebar 1-5 cm (Kay, 1979), sedangkan panjang biji kacang komak adalah 0.6-1.3 cm (Duke, 1983). Ukuran dan warna biji beragam dari hitam, coklat, dan kekuningan (Allan, 1981). Visualisasi biji kacang komak dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Visualisasi biji kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet) Kacang komak mempunyai nilai gizi yang cukup tinggi, berupa karbohidrat, protein, serat, serta memiliki susunan asam amino yang baik. Selain itu, kacang komak juga mengandung lemak, mineral seperti abu, kalsium, fosfor, zat besi, dan vitamin seperti asam nikotinat dan vitamin C (Kay, 1979). Kacang komak dapat digunakan dalam usaha mengatasi kekurangan protein. Kandungan protein biji tua kacang komak secara normal berkisar antara 21-29 % (Kay, 1979). Komposisi kimia kacang komak dapat dilihat pada Tabel 1.
4
Tabel 1. Komposisi kimia kacang komak. Biji kering (Setiap 100 g berat basah)
Kulit (polong) (setiap 100 g yang dapat dimakan)
Daun (Setiap 100 g berat basah)
Kalori (kal)
334
30
31
Protein (g)
21.5
3.1
2.4
Lemak (g)
1.2
0.3
0.4
Karbohodrat (g)
61.4
8.2
6.1
Serat (g)
6.8
1.9
6.7
Abu (g)
3.8
0.9
1.4
Ca (mg)
98
75
120
P (mg)
345
50
57
Fe (mg)
3.9
1.2
17
Komponen
Sumber : Duke (1983) Kacang komak memiliki susunan asam amino yang mendekati pola protein kedelai, yaitu kurang mengandung asam amino yang mengandung belerang (metionin dan sistein), tetapi kaya akan asam amino lisin. Tingginya asam amino lisin pada kacang komak dapat dimanfaatkan untuk pembuatan bahan makanan campuran yang tersusun dari kacang-kacangan yang umumnya kekurangan asam amino lisin. Komposisi asam amino dari kacang komak dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Komposisi asam amino dari kacang komak Asam Amino
mg/g N
Asam Amino
mg/g N
Isoleusin
256
Tirosin
197
Leusin
436
Treonin
207
Lysin
360
Alanin
266
Metionin
36
Valin
294
Sistein
57
Arginin
393
Fenilalanin
299
Histidin
186
Asam aspartat
727
Asam glutamat
978
Glisin
240
Prolin
288
Sumber: Kay (1979)
5
Kacang komak dapat diolah menjadi berbagai jenis makanan. Biji kacang komak dapat dimasak dan dimakan sebagai sayuran atau salad. Kulit (polong) yang masih muda dan biji yang sudah kering juga dapat dikonsumsi sebagai makanan. Di Mesir, biji kacang komak digiling dan digunakan sebagai bahan pembuat kue yang disebut dengan ”tanniah” (Duke, 1983). Di Asia Tenggara, kacang komak populer sebagai sayuran polong muda atau digunakan dalam sayur kari, biji mudanya yang masih hijau dimakan setelah direbus atau disangrai, daun, pucuk, dan perbungaannya dimanfaatkan sebagai kacangkacangan, sebagai dhal yaitu kacang yang dibelah dan dihilangkan kulit bijinya (Maesen dan Somaatmaja, 1993). Sedangkan di beberapa daerah di Indonesia, seperti di Bondowoso Situbondo dan Probolinggo sering digunakan sebagai campuran dari nasi beras (Syarifudin, 2003). Kacang komak juga digunakan sebagai makanan ternak dan pupuk hijau (Duke, 1983). Selain sebagai sumber makanan, kacang komak juga dapat digunakan sebagai obat antara lain obat sakit perut dan kencing nanah (gonorrhea) (Duke, 1983). Jus dari kulit biji kacang komak digunakan sebagai obat radang telinga dan tenggorokan. Di cina, jenis kacang ini digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobatai penyakit gembur-gembur (curing dropsy), diare dan digunakan sebagai tonik (Li, 1973). B. RADIKAL BEBAS Radikal bebas merupakan atom, molekul atau senyawa-senyawa yang mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan yang bersifat sangat reaktif dan tidak stabil (Surai, 2003). Agar menjadi stabil, radikal bebas memerlukan elektron yang berasal dari pasangan elektron di sekitarnya, sehingga terjadi perpindahan elektron dari molekul donor ke molekul radikal untuk menjadikan radikal tersebut stabil (Simanjuntak et al., 2004). Akibat reaksi tersebut, molekul donor menjadi radikal baru yang tidak stabil dan selanjutnya menimbulkan reaksi berantai (Simanjuntak et al., 2004). Oleh karena itu, radikal bebas sangat berbahaya bagi makhluk hidup karena apabila reaksi ini terjadi di dalam tubuh, maka akan menimbulkan berbagai kerusakan yang menjadi penyebab berbagai penyakit.
6
Senyawa radikal yang terdapat dalam tubuh (prooksidan) dapat berasal dari luar tubuh (eksogen) atau terbentuk di dalam tubuh (endogen) dari hasil metabolisme zat gizi secara normal (Muchtadi, 2000). Secara eksogen, senyawa radikal antara lain berasal dari polutan, makanan atau minuman, radiasi, ozon dan pestisida (Supari, 1996). Sedangkan secara endogen, senyawa radikal dapat timbul melalui beberapa macam mekanisme seperti otooksidasi, aktivitas oksidasi dan sistem transpor elektron. Menurut Madhavi et al. (1996), radikal bebas diproduksi terus menerus di dalam sel di dalam sistem transpor elektron mitokondria, membran plasma, sitosol, retikulum endoplasma, dan peroksisom. Semua senyawa radikal yang terbentuk, selanjutnya manjadi inisiator pada proses peroksidasi lipid, sehingga menimbulkan kerusakan jaringan tubuh (Zakaria et al., 1996). Menurut Madhavi et al. (1996), radikal bebas dapat menimbulkan kerusakan protein pada lensa mata yang mengakibatkan terjadinya katarak. Madhavi et al. (1996) juga menyatakan bahwa radikal bebas dapat merusak membran sel terutama komponen penyusun membran berupa asam lemak tidak jenuh ganda, merusak bagian dalam pembuluh darah yang mempermudah pengendapan berbagai zat termasuk kolesterol sehingga menyebabkan aterosklerosis. Sedangkan Wang et al. (2002) menyatakan bahwa.radikal bebas dapat menyebabkan oksidasi DNA sehingga DNA termutasi dan menimbulkan kanker. Senyawa radikal juga menyebabkan terjadinya proses penuaan akibat rusaknya sel-sel jaringan tubuh serta dapat menimbulkan penyakit autoimun (Muchtadi, 2000). C. ANTIOKSIDAN Antioksidan adalah zat yang dapat melawan pengaruh bahaya dari radikal bebas atau Reactive Oxygen Species (ROS) yang terbentuk sebagai hasil dari metabolisme oksidatif yaitu hasil dari reaksi-reaksi kimia dan proses metabolik yang terjadi dalam tubuh (Goldberg, 2003). Senyawa antioksidan dapat berfungsi sebagai penangkap radikal bebas, pembentuk kompleks dengan logam-logam prooksidan dan berfungsi sebagai senyawa pereduksi (Andlauer et al., 1998). Menurut Miller et al. (2000), antioksidan dapat menangkap
7
radikal bebas sehingga menghambat mekanisme oksidatif yang merupakan penyebab penyakit-penyakit degeneratif seperti penyakit jantung, kanker, katarak, disfungsi otak dan artritis. Antioksidan dapat digolongkan menjadi antioksidan primer (Chainbreaking antioxidant) dan antioksidan sekunder (preventive antioksidant) (Gordon, 1990). Antioksidan primer dapat bereaksi dengan radikal lipid dan mengubahnya menjadi bentuk yang lebih stabil. Sebuah senyawa dapat disebut sebagai antioksidan primer apabila senyawa tersebut dapat mendonorkan atom hidrogennya dengan cepat ke radikal lipid dan radikal antioksidan yang dihasilkan lebih stabil dari radikal lipid atau dapat diubah menjadi produk lain yang lebih stabil (Gordon, 1990). Senyawa yang termasuk dalam kelompok antioksidan primer (Chain-breaking antioxidant) adalah vitamin E (tokoferol), vitamin C (asam askorbat), β-karoten, glutation dan sistein (Taher, 2003). Antioksidan sekunder berfungsi sebagai antioksidan pencegah yaitu menurunkan kecepatan inisiasi dengan berbagai mekanisme, seperti melalui pengikatan
ion-ion
logam,
penangkapan
oksigen
dan
penguraian
hidroperoksida menjadi produk-produk nonradikal (Gordon, 1990). Pada dasarnya tujuan antioksidan sekunder (preventive antioksidant) adalah mencegah terjadinya radikal yang paling berbahaya yaitu radikal hidroksil (Taher, 2003). Proses pembentukan radikal hidroksil terjadi melalui reaksi Fenton (Gambar 3) dan reaksi Haber-Weiss (Gambar 4). Fe2+ (Cu+) + H2O2
Fe3+ (Cu2+) + OH- + •OH
Gambar 3. Reaksi Fenton Fe3+ (Cu2+) + O2• -
Fe2+ (Cu+) + O2 (tahap 1)
Fe2+ (Cu+) + H2O2
Fe3+ (Cu2+) + OH- + •OH (tahap 2)
Gambar 4. Reaksi Haber-Weiss Contoh antioksidan sekunder antara lain turunan-turunan asam fosfat, asam askorbat, senyawa karoten, sterol, fosfolipid dan produk-produk reaksi maillard (Gordon, 1990). Beberapa metode pengukuran aktivitas antioksidan yang dapat digunakan antara lain metode DPPH dan metode uji aktivitas kemampuan mereduksi.
8
Metode DPPH merupakan salah satu metode aktivitas antioksidan yang sederhana dengan menggunakan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) sebagai senyawa
pendeteksi
(Miller
et
al.,
2000).
DPPH
(1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazil) adalah senyawa radikal bebas yang stabil yang dapat bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi (Simanjuntak et al., 2004). Reaksi antara DPPH dengan senyawa antioksidan dapat dilihat pada Gambar 5. Pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 517 nm (Kubo et al., 2002). Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging (aktivitas antioksidan). •
•
N-N(C6H5)2
O2 N
NH-N(C6H5)2
NO2
O2 N
NO2 + A•
+ AH NO2
NO2
Gambar 5. Reaksi peredaman radikal bebas DPPH oleh antioksidan Metode aktivitas kemampuan mereduksi digunakan untuk menentukan antioksidan total pada sampel (Kardono dan Dewi, 1998). Aktivitas antioksidan diukur sebagai kemampuan mereduksi Kalium Ferri Sianida. Pengukuran aktivitas kemampuan mereduksi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 700 nm. Absorbansi yang tinggi menunjukkan kemampuan mereduksi yang tinggi (Yang et al., 2000). D. EKSTRAKSI Ekstraksi adalah proses pemisahan komponen-komponen terlarut dari komponen yang tidak larut dari suatu campuran dengan pelarut yang sesuai (Leniger dan Beverloo, 1975). Proses ekstraksi dipengaruhi oleh lama ekstraksi, suhu dan jenis pelarut yang digunakan. Semakin lama waktu yang digunakan dan semakin tinggi suhu yang digunakan, semakin sempurna proses ekstraksi. Semakin dekat tingkat kepolaran pelarut dengan komponen yang akan diekstrak, semakin sempurna proses ekstraksi. Untuk menemukan senyawa pengekstrak yang baik diperlukan bahan pengekstrak yang memiliki
9
kepolaran yang sama dengan zat yang diekstrak. Jika komponen yang diekstrak belum diketahui tingkat kepolarannya, biasanya digunakan beberapa pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda. Sebelum memulai ekstraksi, dilakukan persiapan bahan baku yang mencakup pengeringan bahan sampai kadar air tertentu dan penggilingan bahan untuk mempermudah proses ekstraksi (Purseglove et al., 1981). Selain itu, tingkat kemudahan ekstraksi bahan kering masih ditentukan oleh ukuran partikel bahan. Bahan yang akan diekstrak sebaiknya berukuran seragam untuk mempermudah kontak antar bahan dengan pelarut (Purseglove et al., 1981). Metode ekstraksi yang dilakukan tergantung pada beberapa faktor antara lain tujuan ekstraksi, skala ekstraksi, sifat komponen yang akan diekstrak, dan sifat pelarut yang akan digunakan (Hougton dan Raman, 1998). Beberapa metode umum ekstraksi yang biasa dilakukan adalah ekstraksi dengan pelarut, distilasi, Supercritical Fluid Extraction (SFE), pengepresan mekanik, dan sublimasi. Diantara metode-metode tersebut, metode yang banyak dilakukan adalah distilasi dan ekstraksi menggunakan pelarut (Hougton dan Raman, 1998). Prinsip ekstraksi menggunakan pelarut adalah bahan yang akan diekstrak kontak langsung dengan pelarut selama selang waktu tertentu dan komponen yang akan diekstrak akan terlarut dalam pelarut. E. FITOKIMIA Senyawa-senyawa yang dihasilkan dari sintesis tanaman kebanyakan merupakan senyawa aktif yang memiliki fungsi fisiologis bagi tubuh (Lin, 1994). Senyawa tersebut dinamakan senyawa fitokimia. Senyawa fitokimia potensial mencegah berbagai penyakit seperti penyakit degeneratif dan kardiovaskuler (Lin, 1994). Menurut Bidlack dan Wang (2000), beberapa senyawa fitokimia dapat mencegah kanker. Senyawa yang termasuk senyawa fitokimia antara lain senyawa fenol, flavonoid, tanin, alkaloid, steroid dan triterpenoid (Harborne, 1987). Menurut Meskin et al. (2002), asam fitat dan saponin termasuk senyawa fitokimia nonfenol yang banyak terdapat pada kacang-kacangan.
10
1. Fenol Senyawa fenol meliputi berbagai senyawa yang berasal dari tumbuhan yang memiliki ciri yang sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua gugus hidroksil (Harborne, 1987) (Gambar 6). Senyawa fenol diantaranya adalah senyawa fenol sederhana seperti monofenol dengan satu cincin benzen (3-etilfenol, 3,4-dimetilfenol) yang banyak ditemukan pada kacang-kacangan, grup asam hidroksi sinamat (asam
ferulat
dan
kafeat),
flavonoid
dan
glikosidanya
(katekin,
proantosianin, antosianidin, dan flavonol) dan tanin yang merupakan senyawa fenol yang kompleks dengan berat molekul yang tinggi (Johnson, 2001). Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya berikatan dengan gula sebagai glikosida (Harborne, 1987). OH Gambar 6. Struktur kimia komponen fenolik Senyawa fenol pada kacang-kacangan terdiri dari senyawa fenol sederhana dan kompleks. Kacang-kacangan mengandung campuran beberapa senyawa fenol yang dapat berfungsi sinergis dengan komponen lain dan berfungsi sebagai antioksidan dan pencegahan berbagai penyakit (Meskin et al., 2002). Menurut Mukhopadhiay (2000), polifenol memiliki kemampuan untuk berikatan dengan metobolit lain seperti protein, lemak dan karbohidrat membentuk senyawa kompleks yang stabil sehingga menghambat mutagenesis dan karsinogenesis. Polifenol memiliki sifat antioksidatif dan antitumor (Mukhopadhiay, 2000). Menurut Bidlack dan Wang (2000), polifenol dapat digunakan sebagai pencegah penyakit kardiovaskuler dan kanker. Shahidi dan Wanasundara (1992) di dalam Bidlack dan Wang (2000) menyatakan bahwa senyawa fenol terbukti sebagai sumber antioksidan yang efektif, penangkap radikal bebas dan pengkelat ion-ion logam. Aktivitas antioksidan dari senyawa fenol berhubungan dengan struktur senyawa fenol (Meskin et al., 2002). Keberadaan grup hidroksil
11
atau metoksi pada posisi orto atau para dari turunan asam benzoat, penilpropanoid atau flavonoid (isoflavon) diketahui dapat meningkatkan aktivitas antioksidan dari senyawa fenol (Meskin et al., 2002). Sementara keberadaan dua grup hidroksil pada posisi orto atau para dapat menghasilkan struktur quinoid yang stabil, dan grup metoksi pada posisi orto atau para adalah elektron donor yang efektif dalam menstabilkan radikal bebas yang terbentuk, sehingga meningkatkan aktivitas dari senyawa fenol. Penilpropanoid merupakan antioksidan yang lebih efektif dibandingkan dengan senyawa fenol lainnya. 2. Flavonoid Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol (Harborne, 1987). Jenis utama flavonoid yang terdapat dalam tanaman antara
lain
dihidrokalkon,
kalkon,
flavan,
katekin
(flavan-3-ol),
leukoantosianidin (flavan-3,4-diol), flavanon, flavanonol (dihidroflavonol), flavon, flavonol, garam flavilium, antosianidin dan auron. Berdasarkan struktur, flavonoid dapat diklasifikasikan menjadi flavonoid (1,3diarilpropan), isoflavonoid (1,2-diarilpropan) dan neoflavonoid (1,1diarilpropan). Senyawa-senyawa isoflavonoid dan neoflavonoid hanya ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan, terutama suku leguminosa (kacang-kacangan). Pada kacang kedelai, semua flavonoid yang ditemukan adalah isoflavon (Pratt dan Hudson, 1990). Flavonoid sangat efektif digunakan sebagai antioksidan (Johnson, 2001). Senyawa flavonoid dapat mencegah penyakit kardiovaskuler dengan menurunkan oksidasi Low Density Protein (LDL) (Johnson, 2001). Senyawa isoflavon (genistein dan daidzein) pada kacang kedelai bermanfaat dalam mencegah oksidasi dari partikel lipid dan menurunkan resiko terjadinya aterosklerosis (Anderson et al., 1999). Choi et al. (1991) menyatakan bahwa flavonoid dapat menurunkan hiperlipidemia pada manusia. Pada kasus penyakit jantung, penghambatan oksidasi LDL dapat mencegah pembentukan sel-sel busa dan mencegah perkembangan kerusakan lipid (Meskin et al., 2002).
12
3. Tanin Tanin merupakan salah satu senyawa fenol kompleks yang terdapat pada kacang-kacangan (Meskin et al., 2002). Tanin terkondensasi dihasilkan melalui polimerisasi flavonoid dan banyak terdapat pada tanaman kayu yaitu pada lapisan biji. Tanin dapat bersifat sebagai antioksidan karena kemampuannya dalam menstabilkan fraksi lipid dan keaktifannya dalam penghambatan lipoksigenase (Zeuthen dan Sørensen, 2003). 4. Alkaloid Senyawa alkaloid umumnya mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne, 1987). Berdasarkan cincin heterosiklik nitrogen, alkaloid dapat diklasifikasikan antara lain pirolidin, piperidin, isokuinolin, indol, kuinolin. Senyawa alkaloid memiliki aktifitas fisiologis sehingga banyak digunakan dalam bidang pengobatan. Kuinin, morfin dan striknin adalah contoh alkaloid yang memiliki pengaruh fisiologis dan psikologis. Alkaloid pirolizidin diketahui memiliki aktivitas antikanker (Mukhopadhyay, 2000). 5. Triterpenoid Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik, yaitu skualena (Harborne, 1987). Senyawa ini berstruktur siklik yang nisbi rumit, kebanyakan berupa alkohol, aldehida atau asam karboksilat. Senyawa triterpenoid yang terdapat pada tumbuhan tingkat tinggi adalah fitosterol yang terdiri dari sitosterol (β-sitosterol), stigmasterol dan kampesterol. Pada kacang-kacangan seperti kacang kedelai terdapat senyawa triterpenoid yaitu sitosterol dan stigmasterol (Goldberg, 2003). Senyawa terpenoid dapat digunakan untuk pengobatan dan terapi (Goldberg, 2003).
13
6. Steroid Steroid merupakan golongan dari senyawa triterpenoid (Harborne, 1987). Senyawa steroid dapat diklasifikasikan menjadi steroid dengan atom karbon tidak lebih dari 21 (steroid sederhana) dan steroid dengan atom karbon lebih dari 21 seperti sterol, sapogenin, alkaloid steroid, glikosida jantung dan vitamin D (Hogiono dan Dangi, 1994). Menurut Hogiono dan Dangi (1994), steroid alami berasal dari berbagai transformasi kimia dua triterpen yaitu lanosterol dan sikloartenol. Pada umumnya, steroid tumbuhan berasal dari sikloartenol. Senyawa steroid dapat digunakan sebagai bahan dasar untuk pembuatan obat (Hogiono dan Dangi, 1994). 7. Saponin Saponin merupakan senyawa aktif permukaan yang dihasilkan dari grup steroid atau triterpen yang berikatan dengan gula (Meskin et al., 2002). Saponin bersifat seperti sabun dan dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa (Harborne, 1987). Senyawa saponin dapat ditemukan pada kacang-kacangan seperti pada kacang kedelai (Meskin et al., 2002). Senyawa ini memiliki pengaruh biologis yang menguntungkan yaitu bersifat sebagai hipokolesterolemik dan antikarsinogen serta dapat meningkatkan sistem imun (Rao dan Koratkar, 1997 di dalam Meskin et al., 2002). F. ASAM FITAT Asam fitat adalah suatu mio-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 heksakis (dihidrogen fosfat), dan merupakan sumber utama unsur fosfor dalam kacang-kacangan (Koswara, 1992). Menurut Salunke et al. (1985), pada kacang-kacangan 60-80 % fosfor terdapat dalam bentuk asam fitat. Asam fitat yang terdapat pada oilseeds adalah sekitar 1-6% (Harland dan Obertas, 1977 di dalam Meskin et al., 2002). Kandungan fitat terdapat dalam biji kedelai sebesar 1.4 % (Meskin et al., 2002). Koswara (1992) menyatakan kandungan fitat dalam biji kedelai terdistribusi merata dalam semua bagian biji.
14
Asam fitat dapat membentuk kompleks dengan protein dan pati sehingga disebut sebagai senyawa antinutrisi (Meskin et al., 2002). Asam fitat juga dapat mengikat senyawa-senyawa mineral seperti seng, kalsium, magnesium dan besi (Koswara, 1992). Asam fitat dapat mengkelat ion logam (ion besi) penyebab oksidasi. Karena kemampuannya dalam mengkelat ion besi, asam fitat berpotensi menghambat pembentukan radikal hidroksil yang disebabkan oleh ion besi (Meskin et al., 2002). Rickard dan Thompson (1997) di dalam Meskin et al. (2002) menyatakan bahwa asam fitat bersifat sebagai antikanker di dalam usus besar dan di dalam kelenjer susu pada hewan percobaan, serta memiliki sifat hipokolesterolemik. Selain itu, asam fitat juga berpotensi dalam mencegah penyakit kardiovaskuler (Meskin et al., 2002).
15
III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT Bahan baku yang digunakan adalah kacang komak. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis kimia adalah etil asetat, kloroform, metanol, HCl, NaOH 2N, etanol 95 %, air bebas ion, aquades, reagen Folin-Ciocalteau 50 % (v/v), Na2CO3 5 % (b/v), asam tanat, buffer fosfat (0.2M, pH 6.60), K3Fe(CN)6 1 %, larutan trikhloroasetat (TCA) 10 %, larutan FeCl3, buffer asetat 100 mM (pH 5.50), DPPH 3 mM, asam askorbat, K2SO4, HgO, H2SO4, H3BO3, indikator merah metil dan metilen blue, NaOH-Na2S2O3, H2SO4 2N, iodin, kalium iodida, HgCl2, asam asetat glasial, Pb-asetat jenuh, etanol 70 %, HNO3 0.5M, Amonium tiosianat, Ca-fitat 0.2 mM dan amil alkohol. Peralatan yang digunakan untuk pembuatan tepung kacang komak adalah oven, wileymill dan ayakan. Peralatan untuk ekstraksi diantaranya adalah shaker, magnetic stirrer, penyaring vakum, dan rotavapor. Peralatan untuk analisis adalah tabung reaksi, sudip, pipet tetes, pipet mohr, vorteks, spektrofotometer, labu takar, inkubator, sentrifuse, pHmeter, water bath, gelas piala, pHmeter, termometer, labu Kjeldahl, alat destilasi lengkap, buret, erlenmeyer, aluminium foil, mikropipet, tips, neraca kasar dan neraca analitik. B. METODOLOGI PENELITIAN a. Penyediaan Sampel 1. Pembuatan Tepung Kacang Komak Kacang komak disortir dahulu, kemudian dicuci sampai bersih sebelum direndam dalam larutan alkali (NaOH 2N) selama tiga jam untuk mengurangi aktivitas tripsin inhibitor dan tanin, serta menghilangkan aktivitas hemaglutinin. Kacang yang telah direndam lalu ditiriskan dan dicuci dengan air untuk menghilangkan sisa larutan alkali. Pengeringan dilakukan dengan oven pada suhu 50ºC sampai kering. Hasil pengeringan kemudian digiling dengan wileymill. Tepung kacang diayak dengan saringan ukuran 60 mesh. Tepung kacang hasil ayakan disimpan dalam tempat tertutup, sebelum digunakan pada tahap selanjutnya.
16
2. Pembuatan Fraksi Protein dan Nonprotein Kacang Komak Pembuatan fraksi protein dan nonprotein kacang komak dapat dilihat pada Gambar 7 (Suwarno, 2003): 100 gram tepung kacang komak
ditambah 1 liter aquades (1:10) bersuhu 60ºC
diaduk dengan magnetic stirrer
diatur pH 8.5 – 8.7 dengan NaOH 2N
diekstrak 60ºC selama 30 menit disentrifuse 2000 rpm selama 15 menit Æ endapan (fraksi nonprotein)
diatur pH supernatan menjadi 4.5 dengan HCl 2 N disentrifuse 2000 rpm selama 15 menit Æ supernatan (fraksi nonprotein)
ditambah endapan dengan air 200ml (dicuci)
disentrifuse
dikeringkan
digiling
fraksi protein Gambar 7. Proses pembuatan fraksi protein dan nonprotein kacang komak
17
3. Pembuatan Ekstrak Air Sejumlah tepung kacang komak direndam dengan akuades dan diekstrak selama 4 jam sambil diaduk dengan magnetic stirrer. Campuran kemudian disaring atau disentrifuse. Ekstrak yang diperoleh dikeringbekukan menggunakan freeze dryer. 4. Pembuatan Ekstrak Kloroform-metanol (Monago dan Alumanah, 2005) Sejumlah tepung kacang komak direndam dengan pelarut kloroform-metanol dengan perbandingan 2:1 dan diekstrak selama 18 jam pada alat shaker. Campuran disaring dan filtrat diekstrak ulang dengan air dengan volume yang sama. Ekstrak yang diperoleh dihilangkan residu pelarutnya menggunakan rotavapor lalu dikeringkan dengan oven vakum. 5. Pembuatan Ekstrak Etil Asetat Sejumlah tepung kacang komak direndam dalam pelarut etil asetat dan diekstrak semalam pada alat shaker. Campuran disaring dengan penyaring vakum dan ekstrak yang diperoleh dihilangkan residu pelarutnya menggunakan vacuum evaporator. b. Perhitungan Rendemen Ekstrak Rendemen menunjukkan jumlah ekstrak kacang komak yang diperoleh dari setiap gram sampel tepung kacang komak yang diekstrak (%w/w). Perhitungan rendemen adalah sebagai berikut: % rendemen =
berat ekstrak x 100 % berat tepung yang diekstrak
18
c. Analisis 1. Analisis Kadar Air Metode Oven (AOAC, 1995) Mula-mula cawan kosong dikeringkan dengan oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Sebanyak 4 – 5 gram contoh dimasukkan dalam cawan yang telah ditimbang dan selanjutnya dikeringkan dalam oven bersuhu 1000C – 105 0C selama 6 jam. Cawan yang telah berisi contoh tersebut dipindahkan ke desikator, didinginkan, dan ditimbang. Pengeringan dilakukan kembali sampai diperoleh berat konstan. Kadar air dihitung berdasarkan kehilangan berat yaitu selisih berat awal dengan berat akhir. Penetapan kadar air berdasarkan perhitungan: Kadar air (% bb) = ( a – b ) x 100% a (% bk) = ( a – b ) x 100% b Keterangan : a = berat bahan awal b = berat bahan akhir bb = berat basah bk = berat kering 2. Analisis Kadar Protein Metode Kjeldhal (AOAC, 1995) Sampel sebanyak 0.2 gram ditimbang dan dipindahkan ke labu kjeldahl, ditambahkan 1.9 gram K2SO4, 40 mg HgO dan 2.0 ml H2SO4 pekat. Campuran didestruksi di ruang asam selama + 1.5 jam sampai cairan menjadi bening. Setelah dingin, campuran ditambahkan akuades secara perlahan. Isi labu kjeldhal dipindahkan ke dalam alat destilasi dan dibilas beberapa kali dengan aquades. Erlenmeyer yang berisi larutan 5 ml H3BO3 3 % dan 3 tetes indikator merah metil dan metilen blue dipasang di bawah kondensor (ujung tabung kondensor harus terendam dalam H3BO3). Larutan NaOH-Na2S2O3 sebanyak 8-10 ml ditambahkan ke dalam alat destilasi. Destilasi dilakukan sampai tertampung + 50 ml
19
destilat dalam erlenmeyer. Destilat yang tertampung kemudian dititrasi dengan HCl 0.02N sampai terjadi perubahan warna. Hal yang sama dilakukan terhadap blanko. Perhitungan kadar protein adalah sebagai berikut: %N
= (ml HCl-ml blanko) x N HCl x 14.007 x100 mg sampel
% protein = % N x faktor konversi Faktor konversi = 6.25 3. Analisis Kadar Total Fenol dengan Metode Chandler dan Dodds yang Dimodifikasi (Shetty et al., 1995 di dalam Radianti, 2005) Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bersih dan ditambahkan 1 ml etanol 95 % dan 5 ml air bebas ion. Selanjutnya ditambahkan pada masing-masing sampel 0.5 ml reagen Folin-Ciocalteu 50 % (v/v) lalu diencerkan dengan air bebas ion. Setelah 5 menit, 1 ml Na2CO3 5 % (w/v) ditambahkan dan diencerkan kembali dengan air bebas ion (jika terlalu pekat). Setelah itu divorteks dan disimpan pada ruangan gelap selama 60 menit. Sampel dihomogenisasi (divorteks) kembali, dan absorbansinya diukur pada 725 nm. Sebagai standar digunakan asam tanat. Pembuatan standar asam tanat yaitu dengan cara membuat larutan induk 200 ppm. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan total fenol sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Seri larutan standar dipersiapkan seperti tabel di bawah ini: Tabel 3. Seri larutan standar asam tanat Konsentrasi 0 25 50 (ppm) Larutan induk 0 0.125 0.25 (ml) Etanol 95 % 1 0.875 0.75 (ml)
75
100
125
0.375
0.500
0.625
0.625
0.500
0.375
20
4. Analisis Fitokimia ( Houghton dan Raman, 1998, Dep Kes RI, 2000, di dalam Azima, 2004) a. Fenol hidrokuinon (Pereaksi FeCl3) Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram dilarutkan dalam 1 ml etanol 70 %. Ekstrak sampel diambil 0.5 ml
kemudian
ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5 %. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Senyawa fenol kemungkinan terdapat dalam tanaman dalam bentuk bebas atau dalam bentuk glikosidik. b. Flavonoid Ekstrak kacang komak sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian larutan ditambahkan beberapa tetes Pb-asetat jenuh. Terbentuknya larutan berwarna merah atau jingga tua menunjukkan reaksi positif. Warna jingga tua menunjukkan adanya senyawa kalkon dan warna merah menunjukkan adanya senyawa auron. c. Tanin (Pereaksi FeCl3) Ekstrak kacang komak sebanyak 50 mg ditambahkan air dan dididihkan selama beberapa menit, kemudian ditambahkan beberapa tetes FeCl3 1 %. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin. d. Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N. Kemudian diuji dengan pereaksi alkaloid yaitu pereaksi Meyer dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner.
21
Pereaksi Wagner, dibuat dengan cara: dipipet 1.25 ml akuades ditambahkan 0.31 gram iodin dan 0.25 gram kalium iodida. Kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 25 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Meyer, dibuat dengan cara: 0.136 gram HgCl2 ditambahkan 0.05 gram kalium iodida. Kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 10 ml dalam labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. e. Triterpenoid (Uji Liebermann-Burchard) Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram ditambahkan 0.2 ml asam asetat glasial, kemudian ditambahkan 3 tetes asam sulfat pekat. Apabila sampel mengandung terpenoid maka reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah dan berubah ke biru. f. Steroid (Uji Liebermann-Burchard) Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram dilarutkan dalam 0.5 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian ke dalam larutan ditambahkan 0.125 ml asam asetat glasial dan 0.038 ml asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali, kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif. g. Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2N, menunjukkan adanya saponin. 5. Analisis Kadar Asam Fitat (Davies dan Reid, 1979 di dalam Muchtadi, 1989) Sebanyak 0.4 gram sampel disuspensikan dalam 20 ml larutan HNO3 0.5 M, diaduk dengan magnetic stirrer selama tiga jam, kemudian
22
disaring untuk mendapatkan filtratnya. Sebanyak 0.5 ml filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi kering, ditambahkan 0.9 ml HNO3 0.5 M dan 1 ml FeCl3 (dalam tabung reaksi bertutup), divorteks dan direndam dalam penangas air mendidih selama 20 menit, lalu didinginkan.
Campuran
dipindahkan
ke
tabung
sentrifuse
dan
ditambahkan 5 ml amil alkohol lalu divorteks. Sebanyak 0.1 ml amonium tiosianat ditambahkan ke dalam campuran (15 menit sebelum pengukuran absorbansi). Campuran kemudian divorteks dan disentrifuse 1500 rpm selama 2 menit. Lapisan amil alkohol diukur absorbansinya pada panjang gelombang 465 nm (15 menit setelah penambahan amonium tiosianat). Sebagai standar digunakan Ca-fitat. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan fitat sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Seri larutan standar dipersiapkan seperti pada Tabel 4. Tabel 4. Seri larutan standar Ca-fitat Konsentrasi 0 0.04 0.08 (mM) Larutan induk 0 1 2 (ml) HNO3 0.5 M 5 4 3 (ml)
0.12
0.166
0.20
3
4
5
2
1
0
6. Aktivitas Antioksidan a. Uji DPPH (Kubo et al., 2002 di dalam Radianti, 2005) Buffer asetat 100 mM 1 ml (pH 5.50), 1.87 ml metanol dan 0.1 ml radikal bebas DPPH 3 mM dalam metanol dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung reaksi tersebut dan diinkubasi 25ºC selama 20 menit. Absorbansi yang dihasilkan dibaca pada 517 nm. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging (aktivitas antioksidan). Untuk pembuatan kurva standar digunakan asam askorbat, sehingga satuannya dinyatakan dalam AEAC (Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity).
23
b. Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi dengan Metode Baku (Oyaizu, 1986 di dalam Kardono dan Dewi, 1998) Ekstrak (10-1000 µg) dalam 1 ml air suling dicampur dengan dapar fosfat (2.5 ml, 0.2M, pH 6.60 dan kalium ferri sianida (K3Fe(CN)6) (2.5 ml, 1 %) dan campuran diinkubasi pada suhu 50ºC selama 20 menit. Sebanyak 2.5 ml larutan trikholoasetat (TCA) 10 % ditambahkan pada campuran, kemudian disentifuse pada 3000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas dari larutan (2.5 ml) ditambahkan dengan air suling (2.5 ml) dan larutan FeCl3 (0.5 ml, 0.1%) dan serapan diukur pada panjang gelombang 700 nm. Peningkatan absorbansi menunjukkan kekuatan mereduksi yang tinggi. 7. Analisis Statistik Analisis statistik yang dilakukan pada penelitian ini adalah analisis statistik dengan program SPSS. Metode yang dipakai adalah metode ANOVA Oneway dengan dua kali ulangan dan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada selang kepercayaan 95%.
24
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. EKSTRAKSI KACANG KOMAK Ekstraksi adalah proses pemisahan komponen-komponen terlarut dari komponen yang tidak larut dari suatu campuran dengan pelarut yang sesuai. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah air, etil asetat dan kloroform-metanol yang memiliki tingkat polaritas yang berbeda-beda. Hal ini bertujuan agar semua komponen yang terdapat pada bahan dapat terwakili. Air merupakan pelarut yang bersifat polar. Ekstraksi dengan pelarut air diharapkan dapat membawa komponen-komponen polar yang terdapat pada tepung kacang komak. Etil asetat adalah pelarut yang bersifat semipolar. Pemilihan etil asetat sebagai pelarut didasarkan pada asumsi bahwa etil asetat mampu menggabungkan gugus polar dan nonpolar sehingga komponen pada tepung kacang komak yang bersifat polar dan nonpolar dapat terekstrak. Pelarut kloroform-metanol digunakan pada penelitian ini dengan perbandingan 2:1. Kloroform merupakan pelarut yang bersifat nonpolar sehingga cenderung melarutkan komponen yang bersifat nonpolar. Sedangkan metanol adalah pelarut yang relatif bersifat polar yang cenderung melarutkan komponen yang bersifat polar. Penggabungan pelarut kloroform-metanol dengan perbandingan 2:1 dimaksudkan agar komponen nonpolar lebih banyak terekstrak daripada komponen polar. Sebelum dilakukan ekstraksi, kacang komak dikeringkan terlebih dahulu. Pengeringan harus dilakukan dalam keadaan terkontrol untuk mencegah terjadinya perubahan kimia yang terlalu banyak (Harborne, 1987). Pada penelitian ini, kacang komak dikeringkan dengan oven pada suhu 50°C. Tujuan pengeringan pada suhu rendah adalah untuk mencegah kerusakan yang terjadi akibat perubahan kimia. Selain itu, keberadaan air dalam jumlah tinggi akan mempengaruhi polaritas pelarut (pengekstrak). Setelah dikeringkan, sampel yang akan diekstrak digiling dengan willeymill sampai mencapai ukuran 60 mesh. Proses penggilingan akan menghasilkan partikel yang jauh lebih kecil sehingga pelarut dapat lebih mudah kontak dengan bahan dan berdifusi lebih banyak ke dalam partikel
25
sehingga proses ekstraksi berlangsung lebih baik. Partikel sampel yang halus akan memperluas daya pelarutan sehingga pelarutan komponen pada sampel dapat lebih merata. Pada tahap akhir ekstraksi dilakukan pemisahan pelarut. Untuk pelarut air dilakukan pemisahan dengan freeze drier. Sedangkan kloroform-metanol dan etil asetat diuapkan dengan rotary vacuum evaporator pada suhu 40°C. Penggunaan suhu penguapan yang relatif rendah diharapkan dapat mencegah kerusakan komponen kimiawi bahan. Tabel 5. Rendemen ekstrak kacang komak Sampel Rendemen (%) Ekstrak air
18.70
Ekstrak etil asetat
8.1
Ekstrak kloroform-metanol
2.2
Masing-masing ekstrak dihitung rendemen berdasarkan bobot/bobot. Nilai rendemen ekstrak yang paling tinggi adalah rendemen ekstrak air yaitu sebesar 18.70 % (w/w). Sedangkan ekstrak etil asetat dan ekstrak kloroformmetanol memiliki rendemen sebesar 8.1 % dan 2.2 %. Besarnya nilai rendemen ekstrak air menunjukkan bahwa komponen polar yang terdapat pada kacang komak relatif lebih banyak. Menurut Winarno (1995), air mampu melarutkan komponen bahan pangan seperti garam, vitamin yang larut air, mineral dan senyawa-senyawa citarasa seperti yang terkandung dalam teh dan kopi. Komponen lain yang ikut terekstrak pada pelarut air adalah protein, peptida dan senyawa fenol. Senyawa fenol memiliki cincin aromatik yang mengandung satu atau dua gugus hidroksil sehingga mudah larut dalam pelarut polar seperti air. Data rendemen ekstrak kacang komak menggunakan pelarut air, etil asetat dan kloroform-metanol dapat dilihat pada Tabel 5. B. PEMBUATAN FRAKSI PROTEIN DAN FRAKSI NONPROTEIN Fraksi protein dan nonprotein dibuat berdasarkan metode pembuatan isolat protein kacang kedelai (Suwarno, 2003). Protein tepung kacang komak diekstrak dengan menggunakan air bersuhu 60°C selama 30 menit dengan
26
perbandingan 1:10 dan diatur pH alkali sekitar 8.5 – 8.7 dengan tujuan untuk melarutkan protein. Menurut Cheftel et al. (1985), pemilihan suasana basa sebagai pH selama ekstraksi berdasarkan pada kenyataan bahwa sebagian besar asam amino akan bermuatan negatif pada pH di atas titik isoelektriknya, muatan yang sejenis cenderung untuk tolak menolak, hal ini menyebabkan minimumnya interaksi antara residu-residu asam amino yang berarti kelarutan protein akan meningkat. Setelah diekstrak dan diatur pH menjadi 8.5-8.7, protein yang terlarut dipisahkan dari komponen non protein yang tidak larut dengan cara sentrifuse pada 2000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang berupa protein terlarut diendapkan menggunakan HCl 2N pada pH 4.5, yang diperkirakan merupakan titik isoelektriknya. Menurut Thanh & Shibasaki (1976) di dalam Suwarno (2003), pada titik isoelektriknya muatan total masing-masing asam amino dalam protein sama dengan nol, artinya terjadinya keseimbangan antara gugus bermuatan positif dengan gugus bermuatan negatif. Interaksi elektrostatik antara asam amino akan maksimum karena muatan yang tidak sejenis cenderung untuk tarik menarik, fenomena ini dapat diamati dengan terjadinya penggumpalan protein. Protein yang menggumpal kemudian dipisahkan/diendapkan dengan sentrifuse 2000 rpm selama 15 menit. Setelah itu, protein dicuci dan dikeringkan menggunakan freeze-drier. Tabel 6. Kadar air dan kadar protein fraksi protein dan nonprotein kacang komak Kadar air rata-rata Kadar Protein rata-rata (%) (%) Sampel Berat basah Berat kering Berat basah Berat kering Fraksi protein 8.43 9.27 70.91 77.44 kacang komak 76.45 324.66 3.07 13.06 Fraksi nonprotein kacang komak Dari penelitian ini, didapatkan kadar fraksi protein kacang komak ratarata sebesar 77.44% (b.k). Dari metode pembuatan fraksi protein dihasilkan fraksi nonprotein. Fraksi nonprotein merupakan bahan yang tidak larut (insoluble solid material) dan diperkirakan sebanyak 15 % protein dari bahan awal masih ada dalam sisa padatan ini (Suwarno, 2003). Untuk mengetahui
27
kadar protein dalam padatan sisa, dilakukan analisis protein menggunakan metode kjeldahl. Hasil kadar protein pada fraksi nonprotein kacang komak yaitu 3.07% (b.b) dan 13.06% (b.k). Kadar air dan kadar protein fraksi protein dan fraksi nonprotein kacang komak dapat dilihat pada Tabel 6. Fraksi protein memiliki rendemen sebesar 6.70 %. Sedangkan fraksi nonprotein memiliki rendemen sepuluh kali lebih besar dari fraksi protein yaitu sebesar 70.62 %. Komponen yang paling banyak terdapat dalam fraksi nonprotein ini adalah karbohidrat. Menurut Duke (1983), kacang komak memiliki kandungan karbohidrat sebesar 61.4 %. Komponen lain yang terdapat pada fraksi nonprotein ini adalah serat, abu dan lemak. Komposisi kimia kacang komak dapat dilihat pada Tabel 1. C. AKTIVITAS ANTIOKSIDAN 1. Uji DPPH Uji DPPH merupakan salah satu metode uji pengukuran aktivitas antioksidan di dalam bahan pangan. Uji DPPH memiliki beberapa kelebihan antara lain uji ini tidak spesifik untuk keterangan komponen antioksidan, tetapi digunakan untuk pengukuran kapasitas antioksidan total pada bahan pangan. Pengukuran total kapasitas antioksidan akan membantu untuk memahami sifat-sifat fungsional bahan pangan. Kelebihan uji DPPH yang lain adalah metode uji pengukuran kapasitas antioksidan yang dilakukan sederhana, cepat dan murah. Berdasarkan alasan tersebut, maka pada penelitian ini digunakan uji DPPH untuk pengukuran aktivitas antioksidan pada ekstrak kacang komak. DPPH (1.1-diphenyl-2-pycryl hydrazil) merupakan senyawa radikal bebas stabil. DPPH digunakan secara luas untuk menguji kemampuan senyawa untuk bereaksi sebagai penghambat radikal atau donor hidrogen. DPPH akan bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi (DPPH-H) (Gambar 5). DPPH tereduksi tidak memiliki absorpsi maksimum pada kisaran panjang gelombang sinar tampak, sedangkan DPPH itu sendiri berwarna ungu. Oleh karena itu, semakin kuat suatu senyawa dapat mendonorkan atom hidrogen
28
maka semakin tinggi kapasitas antioksidan dan dapat dilihat dari semakin pudar warna ungu yang dihasilkan. Uji DPPH pada penelitian ini menggunakan standar asam askorbat 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mM. Dengan demikian, satuan pengukuran dinyatakan sebagai AEAC (Ascorbic Acid Equivalent Antioksidant Capacity). Kurva standar asam askorbat dapat dilihat pada Lampiran 1. Berdasarkan hasil pengukuran (Gambar 8), aktivitas antioksidan ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol, dan ekstrak etil asetat berturut-turut adalah 10.22, 7.10, 2.63, 1.92, dan 3.13 AEAC. Aktivitas antioksidan yang paling tinggi terdapat pada ekstrak air yaitu sebesar 10.22 AEAC. Sedangkan aktivitas antioksidan yang paling rendah terdapat pada ekstrak kloroform-metanol yaitu sebesar 1.92 AEAC. Angka ini menunjukkan bahwa ekstrak air memiliki aktivitas antioksidan 10.22 kali lebih besar daripada asam askorbat pada konsentrasi yang sama, dan ekstrak kloroform-metanol memiliki aktivitas antioksidan 1.92 kali lebih besar daripada asam askorbat pada konsentrasi yang sama.
EA= Ekstrak Air; FP= Fraksi Protein; FNP= Fraksi Nonprotein; EKM= Ekstrak Kloroform-Metanol; EEA= Ekstrak Etil Asetat Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada grafik menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%) Gambar 8. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kacang Komak (Metode DPPH)
29
Tingginya aktivitas antioksidan ekstrak air menunjukkan pada ekstrak air banyak terdapat senyawa yang bersifat sebagai antioksidan. Hal ini didukung oleh kadar total fenol dan asam fitat yang tinggi pada ekstrak air serta komponen fitokimia yang banyak terdapat pada ekstrak air seperti fenol hidrokuinon, saponin, tanin, steroid, triterpenoid dan alkaloid yang dapat bersifat sebagai antioksidan. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan sampel dengan metode DPPH dapat dilihat pada Lampiran 2. Selanjutnya data hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis ragam (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada selang kepercayaan 95%. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dapat dilihat pada Lampiran 8. Data hasil pengolahan analisis ragam menunjukkan bahwa nilai signifikansi sampel adalah 0.000 sedangkan nilai signifikansi level adalah 0.05. Nilai signifikansi sampel yang lebih kecil daripada nilai signifikansi level menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95%, sampel ekstrak kacang komak yang diujikan berbeda nyata. Data hasil pengolahan dengan uji lanjut Duncan (Lampiran 8) menunjukkan bahwa kelima sampel terbagi dalam tiga subset. Sampel 1 (ekstrak air) berbeda nyata dengan sampel 2 (fraksi protein). Sampel 3 (fraksi nonprotein) tidak berbeda nyata dengan sampel 4 (ekstrak kloroformmetanol) dan tidak berbeda nyata dengan sampel 5 (ekstrak etil asetat). Ketiga sampel ini berbeda nyata dengan sampel 1 (ekstrak air) dan berbeda nyata dengan sampel 2 (fraksi protein). 2. Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi Uji aktivitas kemampuan mereduksi merupakan salah satu uji untuk pengukuran kapasitas antioksidan total pada bahan pangan. Uji ini memiliki ketelitian yang lebih tinggi dari uji DPPH karena lebih stabil dibandingkan dengan DPPH. Senyawa yang direduksi untuk melihat aktivitas antioksidan adalah Kalium Feri Sianida (K3Fe(CN)6). Aktivitas kemampuan mereduksi
30
dilihat dengan cara mengukur absorbansi sampel. Besarnya nilai absorbansi menunjukkan besarnya kemampuan mereduksi pada sampel. Berdasarkan hasil pengukuran (Gambar 9), uji aktivitas antioksidan dengan uji kemampuan mereduksi menunjukkan bahwa ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol, dan ekstrak etil asetat memiliki absorbansi berturut-turut adalah 0.432, 0.272, 0.270, 0.337 dan 0.285. Absorbansi yang paling tinggi terdapat pada ekstrak air yaitu sebesar 0.432. Nilai ini menunjukkan bahwa ekstrak air memiliki kemampuan mereduksi yang paling tinggi yaitu sebesar 0.432. Hal ini sejalan dengan uji DPPH, serta didukung oleh kadar total fenol dan asam fitat yang tinggi pada ekstrak air dan komponen fitokimia yang banyak terdapat pada ekstrak air seperti fenol hidrokuinon, saponin, tanin, steroid, triterpenoid dan alkaloid yang dapat bersifat sebagai antioksidan. Hasil pengukuran selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3.
EA= Ekstrak Air; FP= Fraksi Protein; FNP= Fraksi Nonprotein; EKM= Ekstrak Kloroform-Metanol; EEA= Ekstrak Etil Asetat Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada grafik menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%) Gambar 9. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kacang Komak (Metode Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi) Kemampuan mereduksi ekstrak kacang komak lebih kecil bila dibandingkan kemampuan mereduksi Mucuna pruriens (velvet beans). Hal ini dapat dilihat dari besarnya konsentrasi yang diperlukan pada ekstrak
31
kacang komak untuk pengujian kemampuan mereduksi. Menurut Rajeshwar et al. (2005), kemampuan mereduksi Mucuna pruriens (velvet beans) meningkat dengan meningkatnya jumlah sampel. Pada konsentrasi 0.125 mg/ml, Mucuna pruriens (velvet beans) memiliki absorbansi sebesar 0.485. Sedangkan ekstrak air kacang komak yang memiliki absorbansi yang paling tinggi yaitu sebesar 0.432 membutuhkan konsentrasi sebesar 5 mg/ml ekstrak kacang komak. Data hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode uji aktivitas kemampuan mereduksi selanjutnya dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis ragam dan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada selang kepercayaan 95%. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode uji aktivitas kemampuan mereduksi dapat dilihat pada Lampiran 9. Data hasil pengolahan analisis ragam menunjukkan bahwa nilai signifikansi sampel adalah 0.000 sedangkan nilai signifikansi level adalah 0.05. Nilai signifikansi sampel yang lebih kecil daripada nilai signifikansi level menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95%, sampel ekstrak kacang komak yang diujikan berbeda nyata. Data hasil pengolahan dengan uji lanjut Duncan (Lampiran 9) menunjukkan bahwa kelima sampel terbagi dalam empat subset. Sampel 1 (ekstrak air) berbeda nyata dengan sampel 4 (ekstrak kloroform-metanol), berbeda nyata dengan sampel 5 (ekstrak etil asetat) serta berbeda nyata dengan sampel 2 (fraksi protein) dan sampel 3 (fraksi nonprotein). Sampel 2 (fraksi protein) tidak berbeda nyata dengan sampel 3 (fraksi nonprotein). D. UJI KIMIA 1. Total Fenol Pengujian aktivitas total fenol merupakan dasar dilakukan pengujian aktivitas antioksidan, karena diketahui bahwa senyawa fenolik berperan dalam
mencegah
terjadinya
peristiwa
oksidasi.
Pengukuran
total
antioksidan bahan pangan asal tanaman dapat dilakukan dengan mengukur kadar total fenolik menggunakan reagen Folin-ciocalteau. Hal ini karena
32
sebagian besar antioksidan dalam bahan asal tanaman merupakan senyawa polifenol. Menurut Shahidi dan Marian (1995), pengujian total fenol bertujuan untuk menentukan total senyawa fenolik yang terkandung di dalam sampel, sehingga diduga bila kandungan senyawa fenolik di dalam sampel tinggi maka aktivitas antioksidannya akan tinggi. Analisis ini menggunakan kurva standar yang dipersiapkan dengan menggunakan asam tanat di dalam 95 % etanol. Kurva standar menggunakan asam tanat dengan konsentrasi 0, 25, 50, 75 dan 100 ppm. Dari hasil pengujian diperoleh persamaan kurva standar adalah sebagai berikut: Y = 0.0078x – 0.0057 dengan R2 = 0.9997. Kurva standar asam tanat pada analisis total fenol dapat dilihat pada Lampiran 4. Berdasarkan hasil pengukuran, kadar total fenol ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol, dan ekstrak etil asetat berturut-turut adalah 23285.64, 4585.64, 4738.21, 5304.87, dan 15722.82 ppm (Gambar 10). Hasil pengukuran total fenol selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 5.
EA= Ekstrak Air; FP= Fraksi Protein; FNP= Fraksi Nonprotein; EKM= Ekstrak Kloroform-Metanol; EEA= Ekstrak Etil Asetat Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada grafik menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%) Gambar 10. Kadar Total Fenol Ekstrak Kacang Komak Dari hasil pengukuran, ekstrak air memiliki total fenol yang paling tinggi yaitu sebesar 23285.64 ppm. Jenis pelarut sangat berpengaruh
33
terhadap kadar total fenol. Pelarut yang sesuai untuk mengekstrak total fenol adalah pelarut yang bersifat polar seperti air. Menurut Harborne (1987), senyawa fenol cenderung larut dalam pelarut air karena umumnya berikatan dengan gula sebagai glikosida. Ekstrak air kacang komak memiliki kadar total fenol yang tinggi. Kadar total fenol ekstrak air kacang komak (23285.64 ppm) lebih besar bila dibandingkan dengan kadar total fenol ekstrak air dan ekstrak etanol dari kacang kedelai. Hasil penelitian McCuoa et al. (2004) menunjukkan bahwa ekstrak air dari kacang kedelai mengandung 11330 ppm dan ekstrak etanol dari kacang kedelai mengandung 5840 ppm. Kadar total fenol kacang komak (23285.64 ppm) juga lebih tinggi dibandingkan dengan kadar total fenol biji kering kacang hijau. Hasil penelitian Anggraeni (2003) menunjukkan bahwa biji kering kacang hijau varietas No. 129, Gelatik, Merak, Merpati dan Betet berturut-turut adalah 230, 210, 164, 177 dan 179 ppm. Sedangkan Bila dibandingkan dengan Mucuna pruriens (velvet beans), kadar total fenol ekstrak kacang komak (23285.64 ppm) lebih rendah. Rajeshwar et al. (2005) menemukan bahwa kadar total fenol yang terdapat pada Mucuna pruriens (velvet beans) adalah sebesar 32000 ppm. Ekstrak air dari kacang komak diduga memiliki antioksidan yang tinggi, karena mengandung total fenol yang tinggi. Hal ini sejalan dengan uji aktivitas antioksidan metode DPPH dan uji kemampuan mereduksi serta didukung oleh kadar asam fitat yang tinggi pada ekstrak air dan komponen fitokimia yang banyak terdapat pada ekstrak air seperti fenol hidrokuinon, saponin, tanin, steroid, triterpenoid dan alkaloid yang dapat bersifat sebagai antioksidan. Menurut Meskin et al. (2002), kacang-kacangan mengandung campuran beberapa senyawa fenol yang dapat berfungsi sebagai antioksidan dan pencegahan berbagai penyakit. Data hasil pengukuran total fenol dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis ragam dan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada selang kepercayaan 95 %. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran total fenol dapat dilihat pada Lampiran 10.
34
Hasil analisis ragam data hasil pengukuran total fenol (Lampiran 10) menunjukkan bahwa jenis ekstrak berpengaruh nyata terhadap nilai total fenol ekstrak kacang komak pada selang kepercayaan 95 %. Uji lanjut Duncan (Lampiran 10) menunjukkan bahwa sampel 1 (ekstrak air) berbeda nyata dengan sampel 5 (ekstrak etil asetat). Sampel 2 (fraksi protein), sampel 3 (fraksi nonprotein) dan sampel 4 (ekstrak kloroform-metanol) tidak berbeda nyata. Ketiga sampel ini berbeda nyata dengan sampel 1 (ekstrak air) dan berbeda nyata dengan sampel 5 (ekstrak etil asetat). 2. Fitokimia Analisis fitokimia adalah salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu tanaman. Senyawa-senyawa yang diperiksa keberadaannya adalah alkaloid, steroid, flavonoid, saponin, fenolik hidrokuinon, triterpenoid dan senyawa tanin. Hasil uji fitokimia ekstrak kacang komak dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7. Hasil uji fitokimia ekstrak kacang komak Sampel
Alkaloid
Steroid
Flavonoid
Saponin
Fenol hidrokuinon +++ +
Triterpenoid
Tanin
Ekstrak Air + ++++ ++ +++++ + Fraksi ++ +++ protein Fraksi +++ + ++ ++ non protein +++++ ++++ Ekstrak kloroformmetanol (2:1) Ekstrak etil + + asetat Ket:(+++++):tinggi, (++++):cukup, (+++):sedang, (++): rendah, (+): sangat rendah, (-):tidak ada
Dari hasil uji fitokimia yang diperoleh, ekstrak air dari kacang komak diduga memiliki antioksidan yang paling tinggi karena mengandung komponen-komponen fitokimia yang paling banyak yang dapat bersifat sebagai antioksidan yaitu alkaloid, saponin, fenol hidrokuinon, tanin, steroid dan triterpenid. Bila dibandingkan dengan hasil penelitian analisis fitokimia Sofian (2005) terhadap sampel produk fermentasi kedelai, ekstrak air kacang komak memiliki komponen fitokimia yang hampir sama dengan
35
sampel produk fermentasi kedelai yaitu mengandung alkaloid, saponin, fenol hidrokuinon dan triterpenoid. Sofian (2005) menyatakan bahwa sampel produk fermentasi kedelai mengandung komponen fitokimia yaitu flavonoid, saponin, senyawa fenolik, alkaloid dan triterpenoid. Hasil penelitian Sofian (2005) tentang analisis fitokimia sampel produk fermentasi kedelai dapat dilihat pada tabel 8. Tabel 8. Hasil analisis fitokimia terhadap sampel produk fermentasi kedelai Analisis fitokimia Hasil Alkaloid
+
Saponin
+
Flavonoid
+
Senyawa fenolik
+
Terpenoid
+
Steroid
-
Tanin
-
Sumber: Sofian (2005) Senyawa fitokimia yang bersifat sebagai antioksidan pada ekstrak kacang komak umumnya bersifat lebih polar. Hal ini ditunjukkan oleh banyaknya senyawa fitokimia yang terdapat pada ekstrak air. Alkaloid umumnya larut dalam pelarut lipofil tetapi dalam bentuk garamnya larut dalam pelarut hidrofil. Menurut Satria (2005), alkaloid dalam tanaman umumnya terdapat dalam bentuk garam, sehingga uji alkaloid memberikan hasil positif pada ekstrak air kacang komak yang merupakan pelarut hidrofil. Streoid dan triterpenoid memberikan hasil positif pada semua ekstrak kacang komak yang diuji. Hal ini disebabkan jenis steroid dan triterpenoid memiliki struktur yang berbeda-beda, sehingga sifat kepolaran juga berbeda. Saponin dan glikosida jantung merupakan contoh jenis triterpenoid yang bersifat polar, dan fitosterol merupakan jenis triterpenoid yang bersifat nonpolar. Oleh karena itu, uji steroid dan triterpenoid
36
memberikan hasil uji positif pada ekstrak air, ekstrak etil asetat, ekstrak kloroform-metanol, fraksi protein dan fraksi nonprotein. Flavonoid memberikan hasil negatif pada semua ekstrak kacang komak yang diuji. Keadaan ini diduga disebabkan oleh sedikitnya senyawa flavonoid yang terdapat pada ekstrak kacang komak. 3. Asam Fitat Asam fitat adalah salah satu zat antinutrisi yang dapat bersifat sebagai antioksidan. Hal ini berhubungan dengan kemampuan asam fitat dalam mengkelat ion logam penyebab oksidasi. Asam fitat dapat mengkelat ion besi sehingga pembentukan radikal hidroksil yang disebabkan oleh ion besi dapat dicegah (Meskin et al., 2002). Pembentukan radikal hidroksil oleh ion besi dapat dilihat pada reaksi Fenton pada Gambar 3 dan reaksi HaberWeiss pada Gambar 4. Penetapan kadar asam fitat yang dilakukan didasarkan pada metode yang dikemukakan oleh Davies dan Reid (1979) di dalam Muchtadi (1989). Sebagai standar digunakan Ca-fitat 0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.20 mM. Dari hasil pengujian diperoleh persamaan kurva standar adalah sebagai berikut: Y = 0.83x – 0.0017 dengan R2 = 0.9931. Kurva standar Ca-fitat pada analisis asam fitat dapat dilihat pada Lampiran 6. Berdasarkan hasil pengukuran (Gambar 11), kadar asam fitat ekstrak air, fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol, dan ekstrak etil asetat berturut-turut adalah 2.92, 1.85, 1.96, 0.44 dan 0.08 mg/100 g ekstrak. Hasil pengukuran asam fitat selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 7. Dari hasil pengukuran, ekstrak air memiliki kadar asam fitat yang paling tinggi yaitu sebesar 2.92 mg/100 g ekstrak. Sedangkan kadar asam fitat yang paling rendah terdapat pada ekstrak etil asetat yaitu sebesar 0.08 mg/100 g ekstrak. Kadar fitat ekstrak kacang komak yang ditemukan pada penelitian ini lebih kecil bila dibandingkan dengan jenis kacang yang lain seperti kacang jogo, kacang tunggak dan kacang kedelai. Penelitian Koswara (1989) menemukan bahwa kacang jogo mentah mengandung kadar fitat 0.85 %,
37
dan kacang tunggak mentah mengandung fitat 0.38 %. Sedangkan Sudarmadji dan Markakis (1977) menemukan kadar fitat kacang kedelai mentah sebesar 1.4 %.
EA= Ekstrak Air; FP= Fraksi Protein; FNP= Fraksi Nonprotein; EKM= Ekstrak Kloroform-Metanol; EEA= Ekstrak Etil Asetat Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada grafik menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%) Gambar 11. Kadar Asam Fitat Ekstrak Kacang Komak Selanjutnya data hasil pengukuran asam fitat dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis ragam dan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada selang kepercayaan 95%. Hasil pengolahan statistik data hasil pengukuran asam fitat dapat dilihat pada Lampiran 11. Data hasil pengolahan analisis ragam menunjukkan bahwa nilai signifikansi sampel adalah 0.000 sedangkan nilai signifikansi level adalah 0.05. Nilai signifikansi sampel yang lebih kecil daripada nilai signifikansi level menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95%, sampel ekstrak kacang komak yang diujikan berbeda nyata. Data hasil pengolahan dengan uji lanjut Duncan (Lampiran 11) menunjukkan bahwa kelima sampel terbagi dalam empat subset. Sampel 2 (fraksi protein) tidak berbeda nyata dengan sampel 3 (fraksi nonprotein). Kedua sampel ini berbeda nyata dengan sampel 1 (ekstrak air) dan berbeda
38
nyata dengan sampel 4 (ekstrak kloroform-metanol) serta berbeda nyata dengan sampel 5 (ekstrak etil asetat).
39
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. KESIMPULAN Berdasarkan hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dan uji aktivitas kemampuan mereduksi, ekstrak air memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi. Pada uji DPPH, aktivitas antioksidan ekstrak air memiliki nilai sebesar 10.22 AEAC. Angka ini menunjukkan bahwa ekstrak air memiliki aktivitas antioksidan 10.22 kali lebih besar daripada asam askorbat pada konsentrasi yang sama. Pada uji aktivitas kemampuan mereduksi, ekstrak air memiliki kemampuan mereduksi sebesar 0.432. Tingginya aktivitas antioksidan ekstrak air menunjukkan pada ekstrak air banyak terdapat senyawa yang bersifat sebagai antioksidan. Hal ini didukung oleh kadar total fenol yang tinggi pada ekstrak air dan komponen fitokimia yang banyak terdapat pada ekstrak air seperti fenol hidrokuinon, saponin, tanin, steroid, triterpenoid dan alkaloid yang dapat bersifat sebagai antioksidan. Flavonoid, senyawa yang umum terdapat dalam kacangkacangan, tidak terdeteksi keberadaannya pada semua bahan yang diuji. Keadaan ini diduga disebabkan oleh sedikitnya senyawa flavonoid yang terdapat pada ekstrak kacang komak. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95%, ekstrak air pada uji DPPH, kemampuan mereduksi, total fenol dan kadar fitat memberikan hasil yang berbeda nyata dengan fraksi protein, fraksi nonprotein, ekstrak kloroform-metanol dan ekstrak etil asetat. B. SARAN •
Perlu dilakukan metode uji aktivitas antioksidan yang lain seperti metode rancimat, metode FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) dan metode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) untuk mendukung hasil penelitian aktivitas antioksidan pada ekstrak kacang komak.
•
Perlu dilakukan analisis fitokimia dengan metode lain seperti metode HPLC (High Performance Liquid Chromatograph), sehingga dapat diketahui jumlah kuantitatif senyawa fitokimia.
40
DAFTAR PUSTAKA
Allen, O. N. and E. K. Allen. 1981. The Legumes; A sources Book of Characteristic, Uses, and Nodulation. The University of Wisconsin Press, USA. Alekel, L., C. M. Hasler, S. Juma, B. W. Drum, S. C. Kukreja. 1998. Role of Soy Protein with Normal or Reduced Isoflavon Content in Revensing Bone Loss Induced by Ovarian Hormone Deficiency in Rats. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Anderson, J. W., B. M. Smith and C. S. Washnock. 1999. Cardiovaskuler and Renal Benefits of Dry Bean and Soybean Intake. American Journal of Clinical Nutrition, Vol. 70, No. 3, 464S-474S. Andlauer, W. and P. Furst. 1998. Antioxidative Power of Phytochemicals With Special Reference to Cereals. in: Rajeshwar, Y., G. P. S. Kumar, M. Gupta, U. K. Mazumder. 2005. Studies on in Vitro Antioxidant Activities of Methanol Extract of Mucuna pruriens (Fabaceae) Seeds. European Bulletin of Drug Research, Vol 13, N° 1. Anggraeni. 2003. Pengaruh Penggunaan Polisakarida Sebagai Elisator Untuk Produksi Antioksidan Selama Germinasi Biji Kacang Hijau. Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Anthony, M. S., T. B. Clarkson, C. L. Hughes, T. M. Morgan, G. L. Burke. 1996. Soybean Isoflavones Improve Cardiovaskular Risk Factors Without Affecting The Reproductive System of Peripubertal Rhesus Monkeys. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. AOAC. 1995. Official Methods of Analysis of The Association of Official Analytical Chemistry. AOAC Int., Washington D. C. Arjmandi, B. H., M. J. Getlinger, N. V. Goyal, L. Alekel, C. M. Hasler, S. Juma, M. L. Drum, B. W. Hollis, S. C. Kukreja. 1998. Role of Soy Protein with Normal or Reduced Isoflavon Content in Revensing Bone Loss Induced by Ovarian Hormone Deficiency in Rats. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741.
41
Bidlack, W. R. and W. Wang. 2000. Designing Functional Foods to Enhance Health. in: Bidlack, W. R., S. T. Omaye, M. S. Meskin, D. K. W. Topham. Phytochemicals as Bioactive Agents. Technomic Publishing Co., Inc, Lancaster, Basel. Cheftel, J. C., J. L. Cuq and D. Lorient. 1985. Amino Acid, Peptide and Protein. in: O. R. Fennema (ed). Food Chemistry. Marcell Dekker Inc., New York. Choi, J. S., T. Yokozaiva and H. Owa. 1991. Antihyperlipedemic Effect of Flavonoid From Prunes deividiana. in: Meskin, M. S., W. R. Bidlack, A. J. Davies, S. T. Omaye. 2002. Phytochemicals in Nutrition and Health. CRC Press, London-New York. Davies, N. T. and H. Reid. 1979. Brit. Di dalam: Muchtadi, D. 1989. Evaluasi Nilai Gizi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi PAU Pangan dan Gizi, IPB, Bogor. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Di dalam: Azima, F. 2004. Aktivitas Antioksidan dan Anti-Agregasi Platelet Ekstrak Cassia Vera (Cinnamomum burmanni Nees ex Blume) serta Potensinya dalam Pencegahan Aterosklerosis pada Kelinci. Disertasi. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Duke, J. A. 1983. Handbook of Legumes of World Economic Importance. Plenum Press, New York. Fico, G., A. Braca, A. R. Bilia, F. Tome, I. Morelli. 2000. Flavonol Glycosides From The Flowers of Aconitum paniculatum. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Franke, A. A., L. J. Custer, C. M. Cerna, K, Narala. 1995. Rapid HPLC Analysis of Dietary Phytoestrogens From Legumes and From Human Urine. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Goldberg, G. 2003. Plants: Diet and Health. I Owa State Press, Blackwell Publishing Company, 2121 State Avenue, Ames, USA. Gordon, M. H. 1990. The Mechanism of Antioksidants Action in Vitro. In: Hudson, B.J.F. (ed). Food Antioksidants. Elsevier Applied Science. LondonNew York. Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia. Penerbit Insitut Teknologi Bandung, Bandung.
42
Harland, B. F. and Obertas, D. 1977. A Modified Methode for Phytate Analysis Using An Ion Exchange Procedure-Application to Textured Vegetable Protein. in: Meskin, M. S., W. R. Bidlack, A. J. Davies, S. T. Omaye. 2002. Phytochemicals in Nutrition and Health. CRC Press, London-New York. Hillis, W. E. and K. Isoi. 1965. Variation in The Chemical Composition of Eucalyptus sideroxylon. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Ho, S. C., J. L. Woo, S. S. F. Leung, A. L. K. Sham, T. H. Lam, E. D. Janus. 2000. Intake of Soy Products is Associated with Better Plasma Lipid Proriles in The Hong Kong Chinese Population. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Hogiono dan Dangi. 1994. Peningkatan Nilai Tambah Tanaman Hortikultura yang Berpotensi Sebagai Bahan Dasar Sintesis Obat-Obatan Steroid. Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Airlangga, Surabaya. Houghton, P. J. and A. Raman. 1998. Laboratory Handbook for the Fractination of Natural Extract. Chapman and Hall, London. Huff, M. W., D. C. K. Roberts and K. K. Carroll. 1982. Long-term Effects of Semipurified Diets Containing Casein or Soy Protein Isolate on Atherosclerosis and Plasma Lipoprotein in Rabbits. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Johnson, I. T. 2001. Antioxidants and Antitumour Properties. in: Pokorny, J., N. Yanishlieva, M. Gordon. CRC Press, Cambridge England. Kardono, L. B. S. dan Dewi, R. T. 1998. Evaluasi Kandungan Antioksidan dan Senyawa Fenolik Dalam Rempah-Rempah Endemik Indonesia. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Pangan dan Gizi, Yogyakarta. ISBN:97995554-0-X. Kay, E. K. 1979. Food Legumes. Tropical Products Institute, London. Khodijah, S. 2003. Pola Elektroforesis Protein Globulin 7S dan 11S dari Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Koswara, S. 1992. Teknologi Pengolahan Kedelai. Pustaka Sinar Harapan, Jakarta.
43
Kubo, I., N. Masuoka, P. Xiao., H. Haraguchi. 2002. Antioxidant Activity of Dodecyl Gallate. Di dalam: Radianti, M. A. 2005. Studi Tentang Pembuatan Minuman Fungsional Tomat-Kayu Manis. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Leniger, H. H. and W. A Beverloo. 1975. Food Process Engineering. D. Reidel Publ. Co. Boston. Li, S. C. 1973. Chines Medical Herbs. Di dalam: Syarifudin, R. A. 2003. Mempelajari Sifat-Sifat Deformasi Protein Globulin 7S dan 11S dari Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Lin, S and Robert. 1994. Phytochemicals and Antioxidants. in: Golberg, I. Functional Foods. Chapman & Hall, London. Lucas, E. A., D. A. Khalil, B. P. Baggy, B. H. Arjmandi. 2001. Ethanol-Extracted Soy Protein Isolate Does Not Modulate Serum Cholesterol in Golden Syrian Hamster: A model of Postmenopausal Hypercholesterolemia. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Madhavi, D. L., S. S. Deshpande and D. K. Salunkhe. 1996. Food Antioxidants; Technological, Toxicological, and Health Persectives. Marcel Dekker, Inc., New York. Matthews, R. H. 1989. Legumes: Chemistry, Technology, and Human Nutrition. Marcel Dekker, Inc, New York and Basel. McCuea, P, A. Horiib and K. Shettyb. 2004. Mobilization of Phenolic Antioxidants From Defatted Soybean Powders by Lentinus edodes During Solid-State Bioprocessing1 is Associated with Enhanced Production of Laccase. Innovative Food Science and Emerging Technologies 5, 385-392. Meskin, M. S., W. R. Bidlack, A. J. Davies, S. T. Omaye. 2002. Phytochemicals in Nutrition and Health. CRC Press, London-New York. Miller, H. E., F. Rigelholf, L. Marquart, A. Prakash, M. Kanter. 2000. Antioxidant Content of Whole Grain Breakfast Cereals, Fruits and Vegetables. Journal of The American College of Nutrition. Vol. 19. No. 3. 312S-319S. Monago, C. C. and E. O. Alumanah. 2005. Antidiabetic Effect of ChloroformMethanol Extract of Abrus precatorius Linn Seed in Alloxan Diabetic Rabbit. J. Appl. Sci. Environ. Mgt. Vol. 9 (1) 85-88.
44
Muchtadi, D. 2000. Sayur-sayuran Sumber Serat dan Antioksidan: Mencegah Penyakit Degeneratif. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Mukhopadhyay, M. 2000. Natural Ekstracts Using Supercritical Carbon Dioxide. CRC Press, London-New York. Oyaizu, M. 1986. Studies on Product of Browning Reaction Prepared From Glucose Amine. Di dalam: Kardono, L. B. S. dan Dewi, R. T. 1998. Evaluasi Kandungan Antioksidan dan Senyawa Fenolik Dalam RempahRempah Endemik Indonesia. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Pangan dan Gizi, Yogyakarta. ISBN:979-95554-0-X. Pratt, D. E. and B. J. F. Hudson. 1990. Natural Antioxidants Not Exploited Commercially. in: Hudson, B. J. F. Elsevier Applied Science, London-New York. Purnamasari, V. 2002. Fraksinasi dan Karakterisasi Protein Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet) dan Kacang Benguk (Mucuna pruriens (L.) DC.). Tesis. Program Studi Ilmu Pangan, Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Purseglove, J. W., E. G. Brown, C. L. Green, S. R. J. Robins. 1981. Spices Vol. 1. Longman Inc., New York. Radianti, M. A. 2005. Studi Tentang Pembuatan Minuman Fungsional TomatKayu Manis. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Rajeshwar, Y., G. P. S. Kumar, M. Gupta, U. K. Mazumder. 2005. Studies on in Vitro Antioxidant Activities of Methanol Extract of Mucuna pruriens (Fabaceae) Seeds. European Bulletin of Drug Research. Vol. 13, No 1. Ranich, T., S. J. Bhathena and M. T. Velasquez. 2001. Protective Effects of Dietary Phytoestrogen in Chronic Renal Disease. in: Lee, C. H., J. Z. Xu, S. Y. V. Yeung, Y. Huang, Z. Y. Chen. 2004. Relative Antioxidant Activity of Soybean Isoflavones and Their Glycosides. Food Chemistry 90, 735-741. Rao, A. V. and R. Koratkar. 1997. Anticarcinogenic Effects of Saponin and Phytosterols, in Antinutrients and Phytochemicals in Food. in: Meskin, M. S., W. R. Bidlack, A. J. Davies, S. T. Omaye. 2002. Phytochemicals in Nutrition and Health. CRC Press, London-New York. Rickard, S. E. and Thompson, L. U. 1997. Interactions and Biological Effects of Phytic Acid, in Antinutrients and Phytochemical in Food. in: Meskin, M. S., W. R. Bidlack, A. J. Davies, S. T. Omaye. 2002. Phytochemicals in Nutrition and Health. CRC Press, London-New York.
45
Salunke, D. K., S. S. Kadam and J. K. Chafan. 1985. Postharvest Biotechnology of Food Legumes. CRC Press, Boca Raton, Florida. Satria, E. 2005. Potensi Antioksidan dari Daging Buah Muda dan Daging Buah Tua Mahkota Dewa. Skripsi. Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Shahidi, F. and N. Marian. 1995. Food Phenolics, Sources Chemistry Effects Applications Technomic Publ., Lancaster, Basel. Shahidi, F. and P. K. J. Wanasundara. 1992. Phenolik Antioxidants. in: Bidlack, W. R., W. Wang. 2000. Designing Functional Foods to Enhance Health. Technomic Publishing Co., Inc, Lancaster, Basel. Shetty, K., O. F. Curtis, R. E. Levin, R. Witkowsky, W. Ang. 1995. Prevention of Vitrification Associated with in Vitro Shoot Culture of Oregano (Origanum vulgare) by Pseudomonas spp. Di dalam: Radianti, M. A. 2005. Studi Tentang Pembuatan Minuman Fungsional Tomat-Kayu Manis. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Simanjuntak, P., T. Parwati, L. E. Lenny, S. Tamat, R. Murwani. 2004. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Benalu Teh, Scurrula oortiana (Korth) Danser (Loranthaceae). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia ISSN 1693-1831, Vol. 2 No. 1. Skerman, P. J. 1977. Tropical Forage Legumes. Food and Agriculture Organization of The United Nations, Rome, Italy. Sofian, A. 2005. Potensi Produk Fermentasi Kacang Kedelai Sebagai Pengendali Kadar Kolesterol Darah. Skripsi. Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Sudarmadji, S and P. Markakis. 1977. The Phytate & Phytase of Soybean Tempeh. J. Sci. Food Agric. 28 :381. Supari, F. 1996. Radikal Bebas dan Patofisiologi Beberapa Penyakit. Prosiding Seminar Senyawa Radikal dan Sistem Pangan: Reaksi Biomolekuler, Dampak Terhadap Kesehatan dan Penangkalan. Kerjasama Pusat Studi Pangan dan Gizi-IPB dengan Kedutaan Besar Prancis, Bogor. Surai, P. F. 2003. Natural Antioxidant in Avian Nutrition and Reproduction. Bookcraft, Bath, England.
46
Suwarno, M. 2003. Potensi Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet) Sebagai Bahan Baku Isolat Protein. Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Syafe’i, S. 1985. Pembuatan Isolat Protein dari Dedak Bebas Lemak (Defatted Rice Bran) dan Penetapan Komposisi Asam Aminonya. Departemen Perindustrian, Pusat Pembinaan Latihan Keterampilan dan Kejuruan Industri, Sekolah Analisis Kimia Menengah Atas, Ujung Pandang. Syarifudin, R. A. 2003. Mempelajari Sifat-Sifat Deformasi Protein Globulin 7S dan 11S dari Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Taher, A. 2003. Peran Fitoestrogen Kedelai Sebagai Antioksidan dalam Penanggulangan Aterosklerosis. Tesis. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Tangendjaja. B. 1979. Studies on The Dephosphorylation of Phytic Acid in Rice Bran. Di dalam: Rahmawati, A. 2005. Kadar Fitat Fraksi Dedak Padi dan Efektivitas Asam Asetat Sebagai Pelarut Dalam Ekstraksi Fitat. Skripsi. Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Thanh, U. H. and Shibasaki. 1976. Major Protein of Soybean Seeds, A Straight Forward Fractination and Their Characterization. Di dalam: Suwarno, M. 2003. Potensi Kacang Komak (Lablab purpureus (L.) sweet) Sebagai Bahan Baku Isolat Protein. Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Tombilangi, A. K. 2004. Khasiat Ekstrak Daun Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) Terhadap Kadar Lipid Peroksida Darah Kelinci yang Hiperlipidemia. Skripsi. Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Wang, S. Y., Y. H. Kuo, H. N. Chang, P. L. Kang, H. S. Tsay, K. F. Lin, N. S. Yang, L. F. Shyur. 2002. Profiling and Characterization Antioxidant Activities in Anoectochilus formosanus Hayata. J. Agric. Food Chem. 50. 1859-1865. Winarno, F. G. 1995. Kimia Pangan dan Gizi. Penerbit PT. Gramedia, Jakarta. Yang, J. H., J. L. Mau, P. T. Ko, L. C. Huang. 2000. Antioxidant Properties of Fermented Soybean Broth. Food Chemistry 71. 249-254.
47
Zakaria, F., S. Abidin, Madanijah, Sanjaya. 1996. Kadar Malonaldehida dan Zat Gizi Antioksidan Plasma pada Populasi Remaja Rentan Pencermaran Makanan. Bul. Teknol. dan Ind Pangan. 7 (3) : 11-17 Vol. VII, No 3. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Zeuthen, P. and L. B. Sørensen. 2003. Food Preservation Techniques. CRC Press, Cambridge England.
48
LAMPIRAN
Lampiran 1. Penentuan Kurva Standar DPPH Konsentrasi asam askorbat (mM) 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
Nilai Absorbansi (Ulangan 1) 0.938 0.808 0.705 0.609 0.508 0.391
Nilai Absorbansi (Ulangan 2) 0.908 0.797 0.714 0.620 0.514 0.372
Nilai Absorbansi (Rata-rata) 0.923 0.803 0.709 0.615 0.511 0.382
Delta Absorbansi 0.000 0.121 0.214 0.309 0.412 0.542
Delta Absorbansi
Kurva Absorbansi Standar Asam Askorbat 0.6
0.5415
y = 0.2101x + 0.0034 R2 = 0.9971
0.4
0.412 0.3085
0.2135
0.2 0.1205
0
0
0
0.5 1 1.5 2 2.5 Konsentrasi Asam Askorbat (mM)
3
50
Lampiran 2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH
1 2 0.817 0.819 0.847 0.851
Δ absorbansi Konsentrasi (abs. blanko- antioksidan abs sampel) (mM) 1 2 1 2 0.106 0.104 0.49 0.48 0.076 0.072 0.35 0.33
Konsentrasi antioksidan (AEAC) 1 2 10.32 10.12 7.30 6.90
0.882 0.905
0.041 0.018 0.18
0.07
3.78
1.47
2.63c
0.897 0.904
0.026 0.019 0.11
0.07
2.27
1.57
1.92c
0.889 0.888
0.034 0.035 0.15
0.15
3.08
3.18
3.13c
Nilai Absorbansi
Jenis Ekstrak Ekstrak air Fraksi protein Fraksi non protein Ekstrak kloroformmetanol Ekstrak etil asetat Keterangan:
Rata-rata (AEAC) 10.22a 7.10b
Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%) Absorbansi blanko = 0.923 Contoh Perhitungan: Ekstrak air (ulangan 1) 0.49 mM = 0.49 mmol x 1 L x 3 ml x 1 mol x 176.13 g x 1000 mg L 1000 ml 1000 mmol mol 1g = 0.26 mg = 0.26 mg 25 mg ekstrak
0.26 mg x 100000 mg ekstrak = 10.32 mg 25 mg ekstrak 100 g ekstrak 100 gr ekstrak Rata-rata (AEAC) = (Konsentrasi antioksidan 1 (AEAC) + Konsentrasi antioksidan 2 (AEAC)) / 2 = (10.32 +10.12) / 2 = 10.22 Ket: 25 mg @ sampel dilarutkan dlm 5 ml @ pelarut 3 ml = besarnya volume yang diukur absorbansinya
51
Lampiran 3. Nilai Absorbansi Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi Sampel
Nilai Absorbansi 1 2 0.430 0.433 0.267 0.276 0.271 0.269
Absorbansi Rata-rata 0.432a 0.272d 0.270d
Ekstrak air Fraksi protein Fraksi non protein 0.340 0.334 0.337b Ekstrak kloroformmetanol 0.289 0.280 0.285c Ekstrak etil asetat Keterangan: Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%)
52
Lampiran 4. Penentuan Kurva Standar Total Fenol Konsentrasi Asam Tanat (ppm) 0 25 50 75 100
Nilai Absorbansi (Ulangan 1) 0.033
0.208 0.404 0.613 0.804
Nilai Absorbansi (Ulangan 2) 0.033 0.218 0.430 0.613 0.807
Nilai Absorbansi (Rata-rata) 0.033 0.213 0.417 0.613 0.806
Delta Absorbansi 0.000 0.180 0.384 0.580 0.773
Delta Absorbansi
Kurva Absorbansi Standar Asam Tanat 1 y = 0.0078x - 0.0057 R2 = 0.9997
0.8 0.6 0.4
0.7725 0.58
0.384
0.2
0.18
0
0 0
25
50
75
100
125
Konsentrasi Asam Tanat (ppm )
53
Lampiran 5. Pengukuran Kadar Total Fenol Sampel Jenis Ekstrak
Δ absorbansi (abs. sampel -abs blanko) 1 2 1 2 0.565 0.558 0.532 0.525 Nilai Absorbansi
Total Fenol (ppm)
Total Fenol (mg/kg ekstrak)
1 2 1 2 68.94 68.04 23438.21 23133.08 Ekstrak air Fraksi 0.125 0.140 0.092 0.107 12.53 14.45 4258.72 4912.56 protein 0.133 0.139 0.100 0.106 13.55 14.32 4607.44 4868.97 Fraksi non protein 0.156 0.142 0.123 0.109 16.50 14.71 5610.00 4999.74 Ekstrak kloroform -metanol Ekstrak 0.398 0.378 0.365 0.345 47.53 44.96 16158.72 15286.92 etil asetat Keterangan: Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%) Absorbansi blanko= 0.033 Contoh Perhitungan: Ekstrak air (ulangan 1) 68.94 ppm = 68.94 mg x 1 L x 8.5 ml = 0.59 mg = 0.59 mg L 1000 ml 25 mg ekstrak 0.59 mg x 1000000 mg ekstrak = 23438.21 mg = 23438.21 ppm 25 mg ekstrak 1 kg ekstrak kg ekstrak Rata-rata total fenol (mg/kg ekstrak) = (total fenol 1(mg/kg ekstrak) + total fenol 2 (mg/kg ekstrak)) / 2 = (23438.21 +23133.08) / 2 = 23285.64 mg / kg ekstrak = 23285.64 ppm Ket: 25 mg @ sampel dilarutkan dlm 5 ml @ pelarut 8.5 ml = besarnya volume yang diukur absorbansinya
54
Rata-rata (mg/kg ekstrak) 23285.64a 4585.64c 4738.21c 5304.87c 15722.82b
Lampiran 6. Penentuan Kurva Standar Ca-fitat Nilai Absorbansi (Ulangan 1) 0.216 0.197 0.150 0.113 0.080 0.056
Konsentrasi Ca-fitat (mM) 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20
Nilai Absorbansi (Ulangan 2) 0.216 0.184 0.152 0.114 0.078 0.060
Nilai Absorbansi (Rata-rata) 0.216 0.191 0.151 0.114 0.079 0.058
Delta Absorbansi 0.000 0.026 0.065 0.103 0.137 0.158
Delta Absorbansi
Kurva Absorbansi Standar Ca-fitat 0.2 y = 0.83x - 0.0017 R2 = 0.9931
0.15
0.2, 0.158 0.16, 0.137 0.12, 0.1025
0.1
0.08, 0.065
0.05
0.04, 0.0255
0
0, 0
0
0.05 0.1 0.15 0.2 Konsentrasi Ca-fitat (mM)
0.25
55
Lampiran 7. Pengukuran Kadar Asam Fitat Sampel Jenis Ekstrak
Δ absorbansi Kadar Fitat Konsentrasi (abs. blanko(mg/100 g fitat (mM) abs sampel) ekstrak) 1 2 1 2 1 2 1 2 0.033 0.032 0.183 0.184 0.22 0.22 2.91 2.93 Nilai Absorbansi
Rata-rata (mg/100 g ekstrak)
2.92a Ekstrak air Fraksi 0.100 0.101 0.116 0.115 0.14 0.14 1.86 1.84 1.85b protein 0.097 0.090 0.119 0.126 0.15 0.15 1.90 2.01 1.96b Fraksi non protein 0.197 0.183 0.019 0.033 0.02 0.04 0.33 0.55 0.44c Ekstrak kloroform -metanol Ekstrak 0.212 0.213 0.004 0.003 0.01 0.01 0.09 0.07 0.08d etil asetat Keterangan: Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom menunjukkan nilai tidak berbeda nyata (uji Duncan α = 5%) Absorbansi blanko= 0.216 Contoh Perhitungan: Ekstrak air (ulangan 1) 0.22 mM = 0.22 mmol x 1 L x 7.5 ml x 1 mol x 698.1 g x 1000 mg L 1000 ml 1000 mmol mol 1g = 1.17 mg = 1.17 mg 400 mg ekstrak 1.17 mg x 100000 mg ekstrak = 2.91 mg 400 mg ekstrak 100 g ekstrak 100 gr ekstrak Rata-rata fitat (mg/100 g ekstrak) = (fitat 1(mg/100 g ekstrak) + fitat 2 (mg/100 g ekstrak)) / 2 = (2.91 +2.93) / 2 = 2.92 mg / 100 g ekstrak Ket: 400 mg @ sampel dilarutkan dlm 20 ml larutan HNO3 7.5 ml = besarnya volume yang diukur absorbansinya
56
Lampiran 8. Hasil Pengolahan Statistik Data Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan (Metode DPPH) ONEWAY ANOVA Nilai DPPH Sum Of Squares Between 100.565 Groups Within 3.018 Groups Total 103.583
Df 4
Mean Square 25.141
5
.604
F
Sig.
41.651
.000
9
POST HOC TESTS HOMOGENEOUS SUBSETS Nilai DPPH DUNCAN Jenis Ekstrak
N
Subset For Alpha = .05
1 2 3 4 2 1.9200 3 2 2.6250 5 2 3.1300 2 2 7.1000 1 2 10.2200 Sig. .190 1.000 1.000 Means For Groups In Homogeneous Subsets Are Displayed. A Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
57
Lampiran 9. Hasil Pengolahan Statistik Data Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan (Metode Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi) ONEWAY ANOVA Nilai Uji Kemampuan Mereduksi Mean Sum Of Df Square Squares Between .038 4 .009 Groups Within .000 5 .000 Groups Total .038 9
F
Sig.
446.154
.000
POST HOC TESTS HOMOGENEOUS SUBSETS Nilai Uji Kemampuan Mereduksi DUNCAN Jenis Ekstrak
N
Subset For Alpha = .05
1 2 3 4 3 2 .2700 2 2 .2715 5 2 .2845 4 2 .3370 1 2 .4315 Sig. .757 1.000 1.000 1.000 Means For Groups In Homogeneous Subsets Are Displayed. A Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
58
Lampiran 10. Hasil Pengolahan Statistik Data Hasil Pengukuran Total Fenol ONEWAY ANOVA Nilai Total Fenol Sum Of Squares Between 571318485.393 Groups Within 860730.755 Groups Total 572179216.148
Df 4
Mean Square F 142829621.34 829.700 8
5
Sig. .000
172146.151
9
POST HOC TESTS HOMOGENEOUS SUBSETS Nilai Total Fenol DUNCAN N
Subset For Alpha = .05
Jenis 1 2 3 Ekstrak 2 2 4585.6400 3 2 4738.2050 4 2 5304.8700 5 2 15722.8200 1 2 23285.6450 Sig. .153 1.000 1.000 Means For Groups In Homogeneous Subsets Are Displayed. A Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
59
Lampiran 11. Hasil Pengolahan Statistik Data Hasil Pengukuran Asam Fitat ONEWAY ANOVA Kadar Asam Fitat Sum Of Squares Between 10.946 Groups Within .031 Groups Total 10.977
Df
Mean Square
F
Sig.
4
2.736
443.511
.000
5
.006
9
POST HOC TESTS HOMOGENEOUS SUBSETS Kadar Asam Fitat DUNCAN Subset For Alpha = .05 Jenis N Ekstrak 1 2 3 4 5 2 .0800 4 2 .4400 2 2 1.8500 3 2 1.9550 1 2 2.9200 SIG. 1.000 1.000 .239 1.000 Means For Groups In Homogeneous Subsets Are Displayed. A Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
60
