SINTESIS ANTIGEN AFLATOKSIN M 1 -OVA ALBUMIN (Ova) SEBAGAI PEREAKSI AGAR GEL PRECIPITATION TEST (AGPT) Angriani Fusvita

Fusvita, A., Biowallacea, Vol. 2 (1) : Hal : 162-167, April, 2015

162

SINTESIS ANTIGEN AFLATOKSIN M1-OVA ALBUMIN (Ova) SEBAGAI PEREAKSI AGAR GEL PRECIPITATION TEST (AGPT)

Angriani Fusvita Akademi Analis Kesehatan Kendari Email : [email protected]

ABSTRACT Synthesis aflatoksin M1 -Ova albumin (Ova) antigen used as Agar Gel Precipitation Test (AGPT) reagent. The AFM1-Ova antigen was synthesized by reacting AFM1 standard and Ova albumin using carboxymethoxylamine hemihydrochloride (CMO) as intermediate reactions. The component of Reagent were AFM1-Ova antigen and antibody G (Ig G/serum) used for AGPT. The result of AFM1-Ova Antigen synthesis were 3,45 mg/ml. AGPT result showed bond precipitation reaction beetween specific antibody with AFM1-Ova antigen. Therefore synthesis of AFM1-Ova antigen can be used to serology reagent test as AGPT. Keywords : Aflatoxin, Ova albumin, Aspergillus flavus, Antigen

163

Sintesis Antigen Aflatoksin M1-Ova Albumin (Ova) Sebagai Pereaksi Agar Gel Precipitation Test (AGPT)

test atau ouchterlony´s double difution

PENDAHULUAN Aflatoksin

adalah

sekelompok

senyawa yang terdiri dari kumarin dan cincin

furan

rangkap

dua,

yang

mikotoksinnya terjadi secara alamiah dan diproduksi

oleh

Aspergillus,

banyak

diantaranya

adalah

dan Aspergillus nomius. A.flavus hanya menghasilkan aflatoksin B, sedangkan A.parasiticus dan A. nomius menghasilkan B

dan

G

(Lunggani,

Aflatoksin M1 (AFM1) merupakan hasil hidroksilasi metabolit aflatoksin B1 (AFB1). Ketika hewan ruminansia diberi makan dengan pakan yang mengandung AFB1, metabolit ini dapat diubah menjadi Dengan

demikian,

sering

digunakan

untuk

menganalisis antigen dan antibodi. Prinsip dari uji ini yaitu adanya ikatan antibodi spesifik dengan antigen. Antigen merupakan dua makna yang berbeda yaitu sebagai imunogen jika digunakan untuk memproduksi antibodi dan sebagai antigen penangkap antibodi dalam

teknik

immunoassai

(Maryam

2007).

AFM1

memiliki bobot

molekul

rendah (BM=328) atau disebut senyawa hapten sehingga harus dikonjugasikan

2007;Tekinsen dan Tekinsen, 2005).

AFM1.

paling

spesies

Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus

aflatoksin

yang

konsentrasi

dengan protein pembawa seperti Ova albumin (Ova) untuk dapat menangkap antibodi

dalam

uji

serologi.

Tujuan

penelitian ini adalah mensintesis antigen AFM1- Ova sebagai pereaksi Agar Gel Precipitation Test (AGPT).

AFM1 dalam susu dan hasil olahannya tergantung pada tingkat paparan dan

METODE PENELITIAN Bahan dan Alat

jumlah AFB1 yang tertelan (Pei et al., 2009).

AFB1

hepatokarsinogen

dikenal

paling

Bahan

sebagai

kuat

pada

yang

digunakan

dalam

penelitian ini adalah standar AFM1 dari

mamalia (Virdis et al., 2008). Meskipun

Aspergillus

flavus

yang

dikonjugasi

toksisitas AFM1 kurang dari senyawa

dengan Ova albumin sebagai antigen dan

induknya AFB1, akan tetapi senyawa ini

antibodi G (Ig G) kelinci . Bahan kimia lain

dikenal juga bersifat hepatotoksik dan

yang

karsinogenik (Lee et al., 2009).

carboxymethoxylamine hemihydrochloride

digunakan

adalah

diperlukan

(CMO), larutan refluks (piridin, methanol

pengujian

dan air suling), asam asetat glasial,

serologi. Gholib (2005) menyatakan salah

kloroform, carbodiimide (EDC), Phospate

satu

Buffer

Sintesis sebagai

uji

AFM1-Ova

pereaksi

serologi

dalam

adalah

dengan

Saline

(PBS)

N-

EDC

dan

menggunakan Agar Gel Precipitation Test

hydroxysuccinimide

(AGPT). Agar Gel Precipitation Test lebih

larutan NHS. Alat-alat yang digunakan

dikenal sebagai double immunodifution

dalam


penelitian

(NHS).

dan

ini

meliputi

164


khoromatografi

lapis

tipis

(TLC),

sinar UV pada panjang gelombang 365

Evaporator, kaca preparat, cawan petri,

nm. Hasil reaksi AFM1-CMO

diambil

Hot plate, pengaduk magnet (magnetic

dengan dikeruk silika gel dari TLC plate

stirrer, sentrifuge dan spektrofotometer.

dan dilarutkan ulang dengan kloroform,

Antigen yang disintesis dari AFM1-

kemudian disentrifuge selama 5 menit

Ova dan Antibodi G (Ig G) digunakan

untuk menghilangkan residu silika gel.

sebagai

AFM1-CMO dikering anginkan

pereaksi

untuk

Agar

Gel

Precipitation Test (AGPT). Pengujian ini dilakukan

dengan

berdasarkan

teknik

presipitasi (pengendapan) antigen oleh

tahap sintesis dengan Ova.

b. Sintesis AFM1-Ova AFM1-CMO

antibodi yang sesuai (spesifik).

disintesis

mengkonjugasikan

a. Persiapan aflatoksin M1- CMO

untuk

menambahkan

dengan

Ova larutan

dan

carbodiimide

oleh

(EDC) dan N-hydroxysuccinimide (NHS).

Wang et al. (2011) yang telah dimodifikasi

EDC disiapkan (1,0 mg EDC dalam 0,01

dengan

ml DMF) dan larutan NHS (0.8 mg dari

Metode

yang

digunakan

mempersiapkan

memungkinkan

konjugasi

AFM1-CMO pembawa

NHS

di

0.01

ml

DMF)

setelah

itu

protein atau enzim. Percobaan dimulai

ditambahkan ke aflatoksin M1-CMO (0,5

dengan

0,5

mg

menambahkan

aflatoksin

M1

mg aflatoksin M1-CMO dalam 0,13 ml

1,5

mg

DMF). Hasil reaksi disimpan di suhu 300C

carboxymethoxylamine hemihydrochloride

selama

(CMO), yang dilarutkan dalam 6 ml larutan

magnetik stirer secara terus menerus.

refluks (1,0 ml piridin,

4,0 ml methanol

Dari campuran tersebut berisi 150 µl. Ova

dan 1,0 ml air suling) dalam labu ukur.

(1.5 mg Ova dalam 1,0 ml 0,1 M NaHCO3,

Setelah

pH

itu

reaksi

campuran

direflux

2

8,3)

jam

dengan

yang

telah

disiapkan

dengan lembut selama 2,5 jam secara

ditambahkan

terus-menerus dengan magnetik stirer,

tersebut, dan disimpan pada suhu 30oC.

labu ukur dibungkus dalam aluminium foil

Setelah reaksi, campuran dalam botol di

dan disimpan pada suhu 30oC semalam.

dialisis

Menggunakan Evaporator untuk

fosfat

reaksi

bertetes-tetes

pengadukan

ke

botol

dengan larutan 0,01 M buffer mengandung

0,15

NaCl

M

campuran sampai hasil akhir 1 ml, dari

[phosphate buffered saline (PBS) pH 7,5]

sisa

selama 72 jam dengan dua kali pertukaran

campuran 1 ml tersebut dan

aflatoksin M1 standar diamati dengan TLC

buffer.

plate.

dikumpulkan untuk di diamati dengan TLC

TLC

Plate

dilarutkan

dalam

Setelah

dan

dialisis,

kloroform : metanol (9: 1) ditambah 1,5%

plate

asam asetat glasial, dan diamati di bawah

Precipitation Test (AGPT)


dilanjutkan

campuran

Agar

Gel

165


c. Agar Gel Precipitation Test (AGPT) Uji ini dilakukan untuk antigen AFM1-Ova.

Agar

gel

dibuat

dengan

melarutkan agarose 0,4 % dan 1,2 g PEG 6000, 0,1 % Na azide dalam 25 ml PBS pH 7,4 dan 25 ml air suling pH 7,4. Larutan ini dipanaskan sampai larut dan warna larutan menjadi bening. Kemudian larutan dipipet sebanyak 3,75 ml, dicetak pada gelas obyek dan ditunggu sampai memadat. Kemudian dibuat sumur-sumur

cukup banyak untuk digunakan pada imunisasi mencit (sebagai imunogen) dan sebagai antigen penangkap untuk AGPT . Tabel 1. Hasil pengukuran spektrofotometer standar Ova dan antigen AFM1-Ova Absorbansi (280 nm) 0 0,109 0,239 0,384 0,598 1,05

Bahan yang dipakai Blanko (PBS 0,01 M) Ova (0,25 mg/ml) Ova (0,5 mg/ml) Ova (1 mg/ml) Ova (2 mg/ml) AFM1-Ova (mg/ml)

dengan puncher diameter 2-3 mm, satu sumur di tengah dimasukkan 25 µl antigen AFM1-Ova dan 6 sumur dimasukkan 25 µl antibodi G (IgG/serum). Gelas obyek diletakkan di atas kertas yang basah agar terjaga kelembabannya. Reaksi dibaca setelah 24 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya pita presipitasi di antara sumur antigen dan serum.

HASIL DAN PEMBAHASAN Sintesis AFM1 – Ova Konjugat AFMl-CMO yang diamati dengan kromatografi lapis tipis memiliki Rf =

0,9.

Hasil

konjugasi

pengukuran

AFM1-Ova

Ova

pada

0,25, 0,5, 1,0 dan 2,0 ng/mL dan diukur dengan menggunakan spektrofotometer. pengukuran

antigen AFM1-Ova

menggunakan

larutan standar Ova dengan konsentrasi 0,

Hasil

Gambar 1 Kurva standar Ova dalam

absorbansi

dan

penghitungan Ova terpapar pada Gambar 1 dan Tabel 1. Dengan menggunakan persamaan linier regresi y = ax + b dari kurva larutan standar Ova, maka diperoleh konsentrasi Ova dalam antigen AFMl-Ova

Agar Gel Precipitation Test (AGPT) Pada AFM1-Ova

percobaan yang

ini,

antigen

diperoleh

dengan

mereaksikan

AFM1

dan

menghasilkan

senyawa

yang

Ova dapat

bereaksi positif dengan antobodi yang terlihat pada Gambar 2. Reaksi positif tersebut ditandai dengan terbentuknya garis presipitasi diantara satu sumur yang

sebesar 3,45 mg/mL (Tabel 1). Jumlah ini Fusvita, A., Biowallacea, Vol. 2 (1) : Hal : 162-167, April, 2015

166


berisi Antigen AFM1-Ova dan antibodi G

chromatography (HPLC) atau enzyme-

(Ig G/serum). Hal ini menunjukkan adanya

linked immunosorbent assay (ELISA).

homologi antara antigen dan antibodi yang dicerminkan oleh adanya garis presipitasi.

UCAPAN TERIMAH KASIH

Angi et al., 2009 menyatakan pada uji presipitasi, pengikatan antara antigen dan

Terima

kasih

kepada

antibodi memerlukan struktur yang cocok

Penelitian Veteriner bogor Jawa Barat dan

antara keduanya. Ketika suatu antibodi

kepada

yang berdifusi ke agar memiliki kecocokan

Kendari sebagai institusi asal Peneliti

atau homolog dengan antigen maka akan

yang

terlihat garis presipitasi.

sehingga penelitian dapat berjalan dengan

Akademi

telah

Analis

Balai

Besar

Kesehatan

memberikan

dukungan

baik.

DAFTAR PUSTAKA

Gambar 2. 1Reaksi positif dari uji AGPT (a) antigen AFM1-Ova (b) antibodi G (IgG/serum) (p) 2 garis presipitasi Reaksi negatif uji AGPT (a) antigen AFM1-Ova (b) PBS

KESIMPULAN 1. Hasil

sintesis

AFM1-Ova

diperoleh

sebanyak 3,45 mg/ml 2. Hasil

AGPT

menunjukkan

adanya

reaksi pembentukan pita presipitasi ikatan antibodi spesifik dengan antigen AFM1-Ova.

SARAN Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan membandingkan pengujian yang bersifat

Angi, A.H., Wibawan, I.W.T., Murtini, S. 2009. Kemampuan netralisasi antibodi spesifik Avian Influenza H5 terhadap beberapa virus H5N1 Isolat lapang. Forum pascasarjana. 32 (1): 55-66. Gholib, D. 2005. Pengembangan teknik serologi untuk pemeriksaan Aspergillosis ayam. JITV. 10 (2): 143-149. Lee, J. E., Kwak, B. M., Ahn, J. H., & Jeon, T. H. 2009. Occurrence of aflatoxin M1 in raw milk in South Korea using an immunoaffinity column and liquid chromatography. J Food Control. 20: 136–138. Lunggani AT. 2007. Kemampuan Bakteri Asam Laktat Dalam Menghambat Pertumbuhan dan Produksi Aflatoksin B2 Aspergilllus flavus BIOMA ISSN: 1410-8801. 9 (2): 45 – 51. Maryam, R. 2007. Produksi antibodi monoklonal menggunakan konjugat fumonisin B1Ovaalbumin sebagai antigen untuk deteksi fumonisin secara imunoasai. Bogor: Indonesia: IPB, Dr.Disertasi.

kuantitatif seperti High performance liquid



Pei, S.C. Zhang, Y.Y. Eremin, S.G. Lee, W.J. 2009. Detection of aflatoxin M1 in milk products from China by ELISA using monoclonal antibodies. J Food Control. 20 :1080–1085. Tekinsen, K.K. dan Tekinsen, O.C. 2005.Aflatoxin M1 in white pickle and van otlu (herb) cheeses consumed in southeastern in Turkey. Food Control.7:565– 568. Virdis, S. Corgiolu, G. Scarano, C. Pilo, A.L. De Santis E.P L. 2008. Occurrence of aflatoxin M1, in tank bulk goat milk and ripened goat cheese. J Food Control. 19: 44–49. Wang, J.J. Liu, B.H. Hsu, Y.T. Yu, F.Y, 2011. Sensitive Competitive Direct Enzyme-Linked Immunosorbent Assay And Gold Nanoparticle Immunochromatographic Strip For Detection Aflatoksin M1 In Milk. J Food Control. 22:64-969.


167

SINTESIS ANTIGEN AFLATOKSIN M 1 -OVA ALBUMIN (Ova) SEBAGAI PEREAKSI AGAR GEL PRECIPITATION TEST (AGPT) Angriani Fusvita

Recommend Documents