SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST PCR. Vannay Ádám st Department of Pediatrics;

SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST

PCR

Vannay Ádám 2011 1st Department of Pediatrics; [email protected]


Definíció

A PCR során a DNS/cDNS egy relatív kis darabkáját sokszorozzuk meg.

1st Department of Pediatrics; [email protected]


Miért, illetve mire jó a PCR? • Egyszerű • Nagyon érzékeny • Olcsó • Klónozás • Genotipizálás (szekvenálás, RFLP, allélspecifikus PCR)

• mRNS expresszió meghatározása (real time RT-PCR) 1st Department of Pediatrics; [email protected]


Mi történik a PCR során 0.

1.

2.



Kiindulási minta: DNS; mRNS/cDNS FR: A gének két végén elhelyezkedő, RNS-re át nem íródó DNS szakasz. Ez a DNS régió tartalmazza a gének promoterét. UTR: az mRNS fehérjére át nem íródó szakasza. DNS

mRNS/cDNS Fehérje 1st Department of Pediatrics; [email protected]


DNS, Plazmid, RNS izolálás Tiszta felület: DNS, RNS, Pazmid mentes, DNáz, RNáz - mentes felület és eszközök. • Kesztyű, maszk, sapka, köpeny • γ - és UV-besugárzás és rekombináns hő-instabil dupla szálú DNS specifikus DNase • 43944 DNase AWAY® Decontamination Reagent for DNA - Sigma-Aldrich • RNaseZap® RNase Decontamination Solution - Ambion



DNS, Plazmid, RNS izolálás



Reverz Transzkripció Puffer (5X)

- 4 µl

dNTP (10mM)

- 1 µl

DTT (0,1M)

- 2 µl

42 °C, 50 min

Oligo dT (0,5 µg/ µl) - 1 µl RNA 1 µg

- 10 µl

RNase inh (40 U/ml) - 1 µl H2O

- 20 µl-ig 1st Department of Pediatrics; [email protected]


Hagyományos PCR

• •

• • •

Alacsony szenzitivitás Kis dinamikus tartomány Kis feloldóképesség Nem automatizálható Toxikus nyersanyagok (ethidium bromid)



Hagyományos PCR

• Puffer (10x) - 5µl • dNTP mix (2,5 mM) - 5µl • MgCl2 - (25mM )- 5µl • Enzim - 0,5 µl • S primer (10pmol/µl) - 1µl • AS Primer (10pmol/µl) - 1µl • DNS - 1µl • H2O - 50 µl-ig

Beállítandó ≈ 20-35 ciklus 95°C 95°C 5 min 15 sec 50°C 15 sec

72°C 95°C 30 sec 7 min 4°C



Taq Polimeráz



Hagyományos PCR

Kiértékelés 1) Futtatás, emésztés, szekvenálás 2) Denzitometrálás



Real Time PCR Real-time PCR során a reakció során keletkező fluoreszcenciát detektáljuk. A PCR termékek detektálhatóvá válásának ciklusa arányos a kiindulási mintában lévő templát DNS mennyiségével.



Real Time PCR

• Nincs post PCR procedura, komputerizált kiértékelés • Nagyon gyors (25 min) • Nagy dinamikus tartomány • Sokkal érzékenyebb (1000 x kevesebb RNS-ből) • Reprodukálhatóbb • Real time monitorizálás • Melting analízis



Real Time PCR

• Enzim mix • S primer • AS Primer • DNS • H2O

- 10 µl - 1 µl - 1µl - 1µl - 20 µl-ig

95°C 95°C 5 min 5 sec

95°C

50°C 5 sec

72°C 10 sec

10 sec 45°C 10 sec

4°C



Real Time PCR

Enzimek: extenzió 60 vagy 72°C, 5’exonuclease vagy Sybr green



Real Time PCR

Jelölések Hydrolízis próba (TaqMan) Hibridizációs próba (FRET)

DNS kötő festékek (Sybr Green)



Real Time PCR Hidrolízis próba: A próba egy riporter és egy quencher a riporter fluorescenciáját elnyelő fluorochrommal konjugált. Az amplifikáció során Taq polimeráz hidrolizálja a próbát. Ez azt eredményezi, hogy a próba riporter és quencher fluorochromja szeparálódik egymástól és a fluoreszcens jel detektálhatóvá válik. 1st Department of Pediatrics; [email protected]


Real Time PCR Hibridizációs próba (FRET) Az egyik próba a 3’ végén egy donor a másik az 5’ végén egy akceptor fluorochrommal jelölt. Amikor a fluorochromok elég közel kerülnek egymáshoz (1-5 nukleotid) a donor fluorochrom által emittált fény excitálja az akceptort ami aztán fluorescens fényt emittál. 1st Department of Pediatrics; [email protected]


Real Time PCR

SYBR Green A fluoreszcencia mértéke abnormálisan megnő ha a festék dupla szálú DNShez köt.



Real Time PCR Előnyők hátrányok: TaqMan - FRET - Sybr Green TaqMan/FRET – könnyű beállítani Sybr Green – nehezebb beállítani

FRET/ Sybr Green – melting analízis TaqMan – nincs melting analízis



Real Time PCR Kiértékelés 1) Ellenőrzés futtatás, emésztés, szekvenálás 2) Melting analízis 3) Ct meghatározás



Kiértékelés Melting: ne hidd el! A

Fluoreszcencia

Fluoreszcencia

B

Hőmérséklet (°C)

Hőmérséklet (°C)



Kiértékelés

ciklus (db)

DCT = target – referencia = 4

ciklus (db)

DCT = target – referencia = 2

Különbség =DCT- DCT= DDCT DDCT=4-2=2 A különbség 22, azaz 4x-es 1st Department of Pediatrics; [email protected]


Egyéb Belső kontroll Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Beta-actin MHC I Cyclophilin mRNAs for ribosomal proteins (ribosomal protein, large, P0) 28S or 18S rRNA

Negatív kontroll (nyersanyagok tisztasága) Pozitív (technikai) kontroll (természetes/mesterséges) 1st Department of Pediatrics; [email protected]


Primer tervezés Primer Length: 18-22 bp. This length is long enough for adequate specificity and short enough for primers to bind easily to the template at the annealing temperature. Primer Melting Temperature (Tm): primers with melting temperatures in the range of 52-58 °C generally produce the best results.

Primer annealing temperature (Ta): primer melting temperature is the estimate of the DNA-DNA hybrid stability and critical in determining the annealing temperature. Too high Ta will produce insufficient primer-template hybridization resulting in low PCR product yield. Too low Ta may possibly lead to non-specific products caused by a high number of base pair mismatches. Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm(product) – 14.9 http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html



Primer tervezés Szoftverek segítik:

DNA star: http://www.dnastar.com/

Primer 3 plus: http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

LightCycler Probe Design2:



Primer tervezés

DNS

mRNS



Primer tervezés

aSMA tgctccagctatgtgtgaagaggaagacagcacagccctggtgtgcgacaatggctctgggctctgtaaggccggcttcgctggtgatgatgctcccagggctgttttcc catccatcgtgggacgtcccagacatcagggagtaatggttggaatgggccaaaaagacagctatgtgggggatgaagcccagagcaagagagggatcctgacgct

bActin tgctccagctatggatgacgatatcgctgcgctggtcgtcgacaacggctccggcatgtgcaaagccggcttcgcgggcgacgatgctccccgggctgtattcccctcca tcgtgggccgccctaggcaccagggtgtgatggtgggaatgggtcagaaggactcctatgtgggtgacgaggcccagagcaagagaggtatcctgaccctgaagtacc

gActin tgctccagctatggaagaagaaatcgccgcactcgtcattgacaatggctccggcatgtgcaaagccggctttgctggcgacgacgcccccagggccgtgttcccttcca tcgtagggcgcccccgacaccagggcgtcatggtgggcatgggccagaaagactcatacgtgggtgacgaggcccagagcaagaggggtatcctgaccctgaagta



Primer tervezés E1-E5

E8

E1-E5

E6a

E1-E5

E7

E1-E5

E6a

E7

E1-E5

E6a

E6b?

VEGF120

E8

VEGF144

E8

VEGF164

VEGF188

E8

E7

E8

VEGF205




E8

E1-E5

E6a

E1-E5

E7

E1-E5

E6a

E7

E1-E5

E6a

E6b?

VEGF120

E8

VEGF144

E8

VEGF164

VEGF188

E8

E7

E8

VEGF205




E8

E1-E5

E6a

E1-E5

E7

E1-E5

E6a

E7

E1-E5

E6a

E6b?

VEGF120

E8

VEGF144

E8

VEGF164

VEGF188

E8

E7

E8

VEGF205

VEGFK/120/188/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza

E5

E8

E 6a

E7

E 6b

VEGFK/144/164/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza

E 6a

E8

E5

E7

E 6b



Összegzés A PCR egy igen szenzitív módszer egy gén expressziójának vagy mutációjának vizsgálatára. Sarokpontok: A primer tervezésnél fontos, hogy pontosan tudjuk, hogy mit is akarunk detektálni. Helyes enzimválasztás. Körültekintő értékelés.


SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST PCR. Vannay Ádám st Department of Pediatrics;

Recommend Documents