SEJTKAPCSOLÓ FEHÉRJÉK EXPRESSZIÓS PROFILJA A MÉHNYAK PRAEMALIGNUS ELVÁLTOZÁSAIBAN ÉS MÉHNYAKRÁKBAN. Doktori tézisek. Dr

SEJTKAPCSOLÓ FEHÉRJÉK EXPRESSZIÓS PROFILJA A MÉHNYAK PRAEMALIGNUS ELVÁLTOZÁSAIBAN ÉS MÉHNYAKRÁKBAN

Doktori tézisek

Dr. Sobel Gábor

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémiai Program Vezetı: Dr. Mandl József, egyetemi tanár, akadémikus

Témavezetı: Dr. Kádár Anna, egyetemi tanár

Hivatalos bírálók:

Dr. Csapó Zsolt, egyetemi docens Dr. Orosz Zsolt, Ph.D,osztályvezetı fıorvos

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Somogyi Anikó, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Simon Károly, Ph.D, osztályvezetı fıorvos Dr. Sziller István, egyetemi docens Budapest 2009

1

Tartalomjegyzék:

oldalszám 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE…………………………………………………..……3 2. BEVEZETÉS…………………………………………………………………..…….5 2.1. A téma jelentısége………………………………………………….….……5 2.2. Irodalmi áttekintés……………………………………………………….….8 2.2.1. Méhnyakrák……………………………………………………….……..8 2.2.2. Tight junction………………………………………………….………..17 2.2.3. Claudin fehérje-család………………………………………….……….21 2.2.4. Occludin fehérje………………………………………………….……..24 2.2.5. Syndecan-1………………………………………………….…………..25 3. CÉLKITŐZÉSEK, KÉRDÉSFELTEVÉS…………………………………………27 4. ANYAG ÉS MÓDSZER…………………………………………………………29 4.1. Betegek és szövetminták………………………………………………….29 4.2. Immunhisztokémiai módszere…………………………………………….30 4.3. Az immunreakciók értékelése…………………….…………………..…..32 4.4. Statisztikai módszerek…………………………………………………….32 4.5. Egyéb módszerek………………………………………………………….33 5. EREDMÉNYEK……………………………………………………………….……35 5.1. Claudin expresszió a normális cervicalis laphámban……………..….……35 5.2. Claudin expresszió a CIN-ben………………………………………….….37 5.3. Claudin expresszió invazív cervicalis carcinomában………………...……42 5.4. Occludin és a syndecan-1 expresszió …………….………………………..44 5.4.1. Occludin expresszió………………………………………...……44 5.4.2. Syndecan-1 expresszió……………………………………..…….47

2

6. MEGBESZÉLÉS………………………………………………………………...….50 7. AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI, KÖVETKEZTETÉSEK…………………..61 8. ÖSSZEFOGLALÁS………………………………………………………………...65 9. IRODALOMJEGYZÉK……………………………………………………………66 10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE…………………………………………….79 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS……………………………………………………..82

3

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ABC

avidin-biotin komplex

AGCs

atípusos mirigysejtek (atypical glandular cells)

AGUS

atípusos mirigyek nem meghatározható jelentıséggel (atypical glands of undetermined significance)

AIS

adenocarcinoma in situ

AJ

adherens junctio

ASCs

atípusos laphámsejtek (atypical squamous cells)

ASCUS

atípusos laphámsejtek nem meghatározható jelentıséggel (ASC of undetermined significance)

BSA

borjú szérum albumin (bovin serum albumin)

Bves

blood vessel/epicardial substance

CAM

celluláris adhéziós molekula

CD

differenciáció marker (cluster of differentiation)

CIN

cervicalis intraepithelialis neoplasia

CIS

cervicalis in situ carcinoma

CK

citokeratin

CPE

Clostridium perfringens enterotoxin

CRB3

human homologue of Drosophila Crumbs

CT

carboxyl terminális

DAB

3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid

DlgA

Discs large A

DNS

dezoxiribonukleinsav

ECM

extracelluláris matrix

EGF

epidermalis növekedési faktor (epidermal growth factor)

EMT

epithelialis-mesenchymalis tranzíció

FIGO

Federation Internationale de Gynecologie et d’Obstetrique

FGF

fibroblaszt növekedési faktor (fibroblast growth factor)

HCV

hepatitis C vírus

H&E

hematoxilin és eozin

HGF

hepatocyta növekedési faktor (hepatocyte growth factor)

4

HPV

humán papilloma vírus

HSIL

magas fokozatú laphám intraepithelialis lézió (high grade SIL)

HSPG

heparán szulfát proteoglikán

IBD

gyulladásos bélbetegség (inflammatory bowel disease)

Ig

immunoglobulin

JAM

junkcionális adhéziós molekula (junctional adhesion molecule)

LSIL

alacsony fokozatú laphám intraepithelialis lézió (low grade SIL)

MAGI

membrane associated guanylate kinase with inverted orientation

MAGUK

membrane associated guanylate kinases

MDCK

Madin-Derby canine kidney cells

MMP

matrix metalloproteináz

MUPP1

multi-PDZ domain protein-1

Pals

protein associated with Lin-7

PBS

foszfáttal pufferelt sóoldal (phosphate buffer saline)

PCR

polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction)

PCNA

proliferációs sejtmag antigén (proliferating cell nuclear antigen)

PDZ

PSD-95, Dlg, ZO. szavakból

PSD

post-synaptic density-95

RB

retinoblastoma tumor suppressor gén

RNS

ribonukleinsav

SIL

laphám intraepithelialis lézió (squamous intraepithelial lesion)

Sy-1

syndecan-1

TER

transzepiteliális elektron rezisztencia

TGFβ

transzformáló növekedési faktor β (transforming growth factor β)

TJ

tight junction

TNFα

tumor nekrózis faktor-α

TNM

Tumor LymphNode Metastasis

VEGF

vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (vascular endothelilal growth factor)

WHO

Nemzetközi Egészségügyi Szervezet (World Health Organization)

ZO

zonula occludens

ZONAB

Y-box transcription factor ZO-1

5

2. BEVEZETÉS

2.1. A TÉMA JELENTİSÉGE A méhnyakrák a nık 2. leggyakoribb malignus daganata a világon, a fejlett országokban a 3. helyet, a fejlıdı országokban az elsı helyet foglalja el gyakoriságban (Jordan és Singer 2006, Papp és mtsai 2006, Shiohara és mtsai 2005, Tavassoli és Devilee 2003). Hazánkban az új esetek száma évente 1500 körül van, sajnálatosan a halálozás 500 körüli (Papp és mtsai 2006). A méhnyakrák gyógyítható megbetegedés, amennyiben felismerése a korai stádiumban történik (Papp 2002). A citológiai szőrıvizsgálatok bevezetése, melynek alapjait Papanicolaou vetette meg, az 1920-as évektıl kezdıdıen lehetıvé tette, hogy már a rákelıtti elváltozásokat, korábban diszpláziának, mai terminológia szerint cervicalis intraepithelialis neoplasiának (CIN), illetve a citológiai elnevezés alapján „squamous intraepithelialis lesion”–nak (SIL) nevezett eltéréseket, valamint az in situ carcinomákat (CIS) is felismerjük (Deery 2006, Ganesan és Rollason 2006, Kálmán és Pajor 2006). Jelenleg az onkocitológiai értékelés a Bethesda rendszerben (2001) történik (l.késıbb). Egyesek szerint szintén szőrımódszernek ajánlott a kolposzkópia, melynek érzékenysége és fajlagossága jelentıs a méhnyakrák felismerésében (Papp és mtsai 2006). A méhnyakrák kóroka sokáig rejtve maradt. Harald zur Hausen professzor munkássága egyértelmően bizonyította a humán papilloma vírus (HPV) nagy kockázatú típusainak kórokozó szerepét a méhnyakrákban (zur Hausen 1976a,b), melynek jelentıségét elismerve a professzor 2008-ban Nobel díjban részesült. Jelenleg általánosan elfogadottnak tekinthetjük a HPV kóroki szerepét a méhnyakrák kialakulásában és progressziójában (Murphy és mtsai 2005). A citológiai szőrıvizsgálatok eredményei nem tökéletesek. Számos adat utal arra,

hogy

laboratóriumonként

eltérı

mértékben

a

keneteket

alul-

vagy

„túldiagnosztizálják”. Több közlemény hívta fel a figyelmet arra, hogy a „hagyományos” kenetek vizsgálatával történı szőrıvizsgálatokat célszerő kiegészíteni a kórokozó ágens, a HPV típusainak meghatározásával. További kiegészítı biomarkerek

6

használhatóságát is vizsgálják, melyek mind a diagnosztikában, mind a prognózisban szerephez juthatnak (Murphy és mtsai 2005). A cervicalis carcinoma lehetséges prognosztikai tényezıi között egyes növekedési faktorok és receptoraik, angiogén faktorok, proliferációs markerek, lymphovascularis invázió stb. szerepelnek (Shiohara és mtsai 2006). Ezek között a ciklin-dependens kináz inhibitor, a p16INK4A a nagy kockázatú HPV típusokkal korrelál a preinvazív és invazív cervicalis rákokban (Bahnassy és mtsai 2007, Riethdorf és mtsai 2004). Ennek alapján felmerül a p16INK4A és HPV együttes kimutatásának lehetısége a korai cervicalis praemalignus és malignus elváltozások pontosabb diagnózisának reményében. Mindez azt tükrözi, hogy még jelenleg sem teljes a képünk a cervicalis neopláziák kialakulásáról, és a patogenezis számos kérdése sem tisztázott. Ezek megismerésétıl egyrészt várható, hogy bıvül a korai diagnosztika eszköztára, másrészt esetlegesen olyan molekulacsaládok válnak ismertté, melyek a más szervek esetében már alkalmazott célterápiát teszik lehetıvé. Az elmúlt években a sejtadhéziónak egyre nagyobb jelentıséget tulajdonítottak a tumorok kialakulásában és progressziójában (Furuse és mtsai 1999, Katoh és Katoh 2003). A sejtkapcsolatok létrejöttében a plazma membrán speciális fehérjéinek, a sejtadhéziós molekuláknak jelentıs szerepe van. A sejtadhézió létrejöttével, a kapcsolat hatására a sejtben válaszfolyamat indul el, mely legtöbbször a cytoskeleton átrendezıdésében, a kinázok aktiválódásában, a kinázok további foszforilációjában nyilvánul meg (Kovács 1999). Emellett a sejt-sejt és sejt- és extracelluláris matrix (ECM) kapcsolata döntı fontosságú a tumoros átalakulásban és a tumorok terjedésében (Rintala és mtsai 1999). Számos adat utal arra, hogy egyes transzmembrán molekulák, melyek a sejtek és extracellularis matrix közötti kapcsolatot képezik, mint például a syndecan, változnak a carcinogenesis során, beleértve a méhnyakrákot is (Nakanishi és mtsai 1999, Numa és mtsai 2002, Rintala és mtsai 1999). Újabb adatok bizonyítják, hogy a sejtfelszíni heparan sulfat proteoglikanok (HSPG) szerepet játszanak a humán papilloma vírus (HPV) fertızésben is, mivel a vírus sejtfelszíni receptoraként szolgálnak (Giroglou és mtsai 2001, Shafti-Keramat és mtsai 2003). Ezek közül a syndecan-1 az egyik olyan fontos molekula, amely a HPV receptoraként szolgálhat (Shafti-Keramat és mtsai 2003).

7

Mindezen ismeret indította vizsgálatainkat, azaz, hogy a méhnyakrákban és daganatelıtti elváltozásaiban tanulmányozzuk egyes sejtkapcsoló struktúják, elsısorban a tight junction (TJ) proteinjeinek expresszióját és ezek összefüggését a HPV receptoraként is mőködı syndecan-1-gyel.

8

2.2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.2.1. MÉHNYAKRÁK

A méhnyak szöveteibıl indul ki a kismedencei rosszindulatú nıi nemi szervi daganatok 30%-a, melyek többsége hám eredető burjánzás, 85-90%-a laphámrák, melyet a mirigyhám eredető endocervikális adenocarcinoma és az adenosquamosus carcinoma követ (Kálmán és Pajor 2006). Évente megközelítıleg 500 000 új felismert cervix carcinoma fordul elı világszerte (Papp és mtsai 2006, Tavassoli és Devilee 2003), mely geográfiai régiónként eltérést mutat (1. ábra). A méhnyakrák okozta megbetegedések száma Magyarországon 1500 körül van évente, míg az elveszített betegek száma 500 körüli (Papp és mtsai 2006). A cervix carcinoma elsısorban a 35-65 éves nıket érinti, az incidencia a legmagasabb a 40-49 év között.

1. ábra: A cervix carcinoma kor-standardizált incidenciája. Hazánk a közepesen magas elıfordulású területek közé tartozik.

9

A cervix, vagy méhnyak hámborítéka, mely a méhnyakrák kiinduló helye, hisztológiailag három típusra osztható, az „eredeti” (natív) squamosus vagy columnaris, a metaplasztikus squamosus és az u.n. atípusos epithelium (Singer és Jordan 2006). Az „eredeti” hám az intrauterin életben alakul ki és a felnıttkorban is perzisztál. Az el nem szarusodó laphám és a mirigyhám találkozási vonalát junctio squamocolumnalis–nak nevezzük. A cervix laphámborítéka 5 jól elkülöníthetı rétegre osztható (Singer és Jordan 2006), melyet a fibrózus stromától bazalmembrán határol el:

1. tábázat: A cervix laphámborítékának rétegei (Singer és Jordan 2006. alapján)

Zóna 1.

Szinonim:réteg Basalis

Leírás legalsó, egysejt sorból álló réteg, cilindrikus sejtekkel, nagyobb maggal

2.

Parabasalis

több rétegben poligonális sejtek, melyek nagyobb maggal és kifejezett intercellularis hidakkal rendelkeznek

3.

Intermedier

több rétegben elnyúltabb, laposabb, glikogén gazdag sejtek

4.

Kondenzációs

változó vastagságú (néha nem ismerhetı fel), szorosan elhelyezkedı, gyakran vakuolizál polygonalis sejtek keratohyalin szemcsékkel,

5.

Superficialis

elongált, ellapult sejtek, kis piknotikus maggal, széles cytoplasmával

A cervixhám fenti szabályos rétegzettségéhez (2. ábra) alapvetı a sejt-sejt kapcsolatok fenntartása, mely a különbözı sejtkapcsoló struktúrák által valósul meg (l. késıbb). Hasonlóan alapvetı a sejt-matrix kölcsönhatás, mely az adhéziós molekulákkal együtt a szöveti szerkezetet és sejtpolaritást biztosítja (Singer és Jordan 2006). A sejtek

10

pusztulásának és proliferációjának egyensúlya bonyolult szabályzással történik, mely a daganatos transzformáció során felborul. A proliferációs markerekkel (Ki-67, PCNA), a ciklin

és

ciklin-dependens

kinázok

változásának

detektálásával

a

cervicalis

carcinogenesis lépései nyomon követhetık (Singer és Jordan 2006).

Hisztopatológia: CIN • CIN 1: Enyhe dysplasia; condyloma (anogenital szemölcsök) • CIN 2: Mérsékelt dysplasia • CIN 3: Súlyos dysplasia; CIS; FIGO stage 0 Normal

CIN 1

CIN 2

CIN 3

A képek másolása engedéllyel történt Frappart, et al. Histopathology and Cytopathology of the Uterine Cervix. Digital Atlas, Lyon, France: IARC Press, 2004.

2. ábra: A cervicalis laphám rétegei normális és kóros körülmények között. A cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN) a hám fokozatosan kiterjedtebb rétegeit érinti.

A cervicalis carcinogenesis a legjobban tanulmányozott területek egyike, éppen a viszonylag könnyebb mintavételi lehetıségek miatt, illetve annak következtében, hogy a kolposzkópia segítségével a rák korai stádiumai felismerhetık. A Papanicolaoufestésen alapuló onkocitológia szőrések, melyek P0 – P5 kategóriákat különböztettek meg, számos módosításon mentek keresztük (Kálmán és Pajor 2006). A mai

11

gyakorlatban világszerte a rugalmasabb, informatívabb Bethesda-osztályozást követik (2001), mely ugyancsak számos módosuláson ment át (3. ábra). A Bethesda osztályozás új kategóriákat vezetett be, így az ASCUS-AGUS, a LSIL és HSIL (low and high squamous intraepithelial lesion) fogalmát.

A Bethesda-féle cervicalis citológiai osztályozás (2001) Squamous cells1

Glandular cells1

• Atypical squamous cells (ASCs) – ASCs of undetermined significance (ASCUS) – ASC, cannot exclude high-grade SILs (ASC-H) • Squamous intraepithelial lesions (SIL) – Low-grade SIL (LSIL): Mild dysplasia, cervical intraepithelial neoplasia 1 (CIN 1) – High-grade SIL (HSIL): Moderate and severe dysplasia, CIN 2/3, carcinoma in situ (CIS) • Squamous cell carcinoma

• Atypical glandular cells (AGCs) • AGCs, favor neoplastic • Endocervical adenocarcinoma in situ (AIS) • Adenocarcinoma

1. Solomon D, Davey D, Kurman R, et al, for the Forum Group Members and the Bethesda 2001 Workshop.

JAMA. 2002;287:2114–2119. 2. Wright TC Jr, Cox JT, Massad LS, et al, for the ASCCP-Sponsored Consensus Congress. JAMA. 2002;287:2120–2129.

3. ábra: A cervicalis citológia osztályozásában szemléletváltást jelentett a Bethesdában megfogalmazott osztályozás bevezetése 2001-ben. A nemzetközi csoport véleménye alapján összeállított kategóriák részletesebb információt adnak a méhnyak léziókról. A laphámsejtek és mirigyhámsejtek és ezek neoplasztikus elváltozásai eltérı csoportokat alkotnak.

A hisztológiai értékelés részben átfed a fenti citológiai osztályozással (4. ábra). A cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN), azaz a kizárólag a hám területére lokalizálódó transzformáció új terminológiája szemléletváltást jelentett a korábbi dysplasia fogalmával szemben. A CIN kategóriák azt jelzik, hogy a cervicalis lézióban már megindult a daganatos átalakulás, azaz a génalterációk sora, melynek

12

következtében az atípusos sejtek progressziven a cervixhám egyre kiterjedtebb területét foglalják el. Ezt tükrözi a CIN I, II és III kategória elkülönítése (4. ábra), mely a korábbi enyhe, mérsékelt és súlyos dysplasia helyére lépett. Szerzınként változó a cervicalis in situ carcinoma (CIS) megítélése (Ganesan és Rollason 2006). Egyesek különválasztják a CIN III-tól, mások azonban CIN III/CIS léziókról beszélnek, hangsúlyozva azt, hogy ezek, a cervixhám teljes szélességét érintı eláváltozások, melyek még nem törik át a bazális membránt, lényegében azonos eltérések, mind biológiai, mind klinikai értelemben. Magunk is hasonlóan értelmeztük vizsgálataink során a „kétfajta” elnevezést, azaz CIN III/CIS lézió kategóriákat alkottunk.

A cervicalis dysplasia/ intraepithelialis neoplasia hisztológiai és citológiai terminológiájának összehasonlítása Nincs teljes egyezés a hisztológiai és citológiai terminológia között között Bethesda klasszifikáció (citológia)1

CIN (WHO hisztopatológia)2

Normal

ASC

LSIL

Invaziv rák

HSIL

CIN 1 Normal Condyloma (enyhe dysplasia)

CIN 2 (mérsékelt dysplasia)

CIN 3 (súlyos Invaziv rák dysplasia /CIS)

1. Solomon D, Davey D, Kurman R, et al, for the Forum Group Members and the Bethesda 2001 Workshop. JAMA. 2002;287:2114–2119. 2. Bonnez W. In: Richman DD, Whitley RJ, Hayden FJ, eds. Washington, DC: American Society for Microbiology Press; 2002:557–596. 3. Wright TC Jr, Cox JT, Massad LS, Twiggs LB, Wilkinson EJ, for the ASCCP-Sponsored Consensus Congress. JAMA. 2002;287:2120–2129.

4. ábra: A cervicalis léziók citológiai és hisztológiai nevezéktanának összehasonlítása a Bethesda-féle és a WHO osztályozás alapján. ASC: atipikus laphámsejtek, LSIL: alacsony

fokozatú

intraepithelialis

laphám

lézió,

HSIL:

magas

intraepithelialis laphám lézió, CIN: cervicalis intraepithelialis neoplasia

13

fokozatú

A cervicalis carcinogenesis megértését nagymértékben elısegítette annak felismerése, hogy a méhnyakrák kialakulásáért a humán papillomavírus (HPV) ún. nagy kockázatú típusai felelısek. A HPV és a cervix carcinoma közötti kapcsolat felismerésében Harald zur Hausen professzornak döntı szerepe volt, mint erre a bevezetıben utaltunk. A HPV a basalis, parabasalis éretlen laphámsejteket fertızi. Az esetek jelentıs részében csak latens fertızés alakul ki, mely késıbb átmenetileg produktívvá válik, majd 6-24 hónap után spontán eliminálódhat. Produktív fertızés esetén az episzomális vírus az egyébként már nem osztódó intermedier és szuperficiális sejtekben, a gazdasejt replikálódásától függetlenül szaporodik, így nagy mennyiségben produkál fertızıképes virionokat. A jelenség szövettanilag, citológiailag a HPV citopátiás hatásaként jelenik meg, azaz acanthosis, parakeratosis, koilocytosis, sejtmag atípia, valamint többmagvúság alakul ki (Kálmán és Pajor 2006) (5. ábra).

A HPV fertızés okozta cervix-hám elváltozások spectruma1 Normal Cervix

HPV Infection / CIN* 1

CIN 2 / CIN 3 / Cervical Cancer

*CIN = cervical intraepithelial neoplasia

1. Adapted from Goodman A, Wilbur DC. N Engl J Med. 2003;349:1555–1564. Copyright © 2003 Massachusetts Medical Society. All rights reserved. Adapted with permission.

5. ábra: A HPV fertızés a hám basalis rétegének sejtjeit fertızi és a hám érésével párhuzamosan történik a vírus maturáció is. A komplett vírusrészecske a superficialis réteg sejtjeivel leválik. A HPV DNS integrációja a hámban a neopláziás átalakulás fontos szakasza, a rák kialakulásának elıfeltétele.

14

Amennyiben a vírus a gazdasejt DNS-ébe beépült, a vírus korán átíródó génjei közül az E2-es régió a DNS-győrő felnyílása során inaktiválódik. Ez az E2 által szabályozott E6 és E7 protein fokozott expresszióját vonja maga után. Az E6 fehérje a p53-mal, az E7 a retinoblastoma tumor szuppresszor gén (RB) fehérjetermékével komplexet képezve felfüggeszti azok mőködését, így felborítva a sejtciklus szabályozását, a proliferációnak kedvezve (6. ábra).

A HPV carcinogenesis mechanizmusa1–5 HPV Infectio

Virális Perzisztencia

Sejt-mediált Immunitás

Virális DNS Integratio a Gazda DNS-be

Virális Clearance

p53

Interferál a Funkciókkal

Episomalis Virális DNS a Nucleusban

Overexpression E6, E7

pRB Sejt Proliferatio Repair of 2°Mutations High-Grade Cervicalis Léziók Progressio Invazív Rákba

Típus-Specifikus Immunitás

1. Castle PE. J Low Genital Tract Dis.2004;8:224–230. 2. Frazer IH. Nature Rev Immunol. 2004;4:46–54. 3. Doorbar J. J Clin Virol. 2005;32(suppl):S7–S15. 4. Münger K, Basile JR, Duensing S, et al. Oncogene. 2001;20:7888–7898. 5. Furumoto H, Irahara M. J Med Invest. 2002;49:124–133.

6. ábra: A HPV fertızés eredménye lehet a vírus eliminációja és típus-specifikus immunitás kialakulása. A perzisztáló vírusfertızés a vírus DNS integrációját és episomalis DNS megjelenését eredményezheti a magban. A vírus E6 és E7 proteinje tumor szuppresszor fehérjékkel (p53, pRB) interferál, gátolva azok funkcióját. Mindez a sejtproliferáció fokozódását és neoplasia kialakulását okozza.

15

A cervix carcinoma morfológiailag két alapvetı formában jelenik meg. Az exophytikus növekedést mutató típus (Clark-tumor) (7. ábra) és az endophytikus növekedéső típus, mely mélyen infiltrálja a cervix állományát. Az utóbbi típusra jellemzı az ún. kulisszarák, mely során a portiohám épnek tőnhet. A szövettanilag leggyakoribb típus a laphámrák (90%), a carcinoma planocellulare, mely lehet elszarusodó (keratoides) és el nem szarusodó (non keratoides). Adenocarcinoma az esetek 8-10%-ban fordul elı. Fıleg endocervicalis sejtekre emlékeztetı morfológiájú, de elıfordul intestinalis típusú, endometrioid és világossejtes adenocarcinoma is (Tavassolo és Devilee 2003). A méhnyakrák terjedése a stroma korai inváziójával kezdıdik, majd a tumor infiltrálja a méhnyak állományát, ráterjed a hüvelyboltozatra, a hüvelyfalra, néha a méhtestre és beszőri a parametriumot. Ezt követıen ráterjed a csontos medencefalra, a kismedencében befogja az uretereket, mely hydronephrosis útján uraemiához, és következményes veseelégtelenséghez vezet. Késıi stádiumban beszőri a húgyhólyagot. A daganat viszonylag korán ad lymphogen áttétet a regionális nyirokcsomókba, míg haematogen metasztázist elırehaladottabb stádiumban képez a tüdıbe, csontokba, májba és az agyba (Kálmán és Pajor 2006, Papp 2002). A carcinoma cervicis uteri általános osztályozása a FIGO (Federation Internationale de Gynecologie et D’Obstetrique) stádiumok és a TNM kategóriák (Kálmán és Pajor 2006, Papp 2002, Rubin és Hansen, 2008) alapján történik.

16

a: CINIII

b: carcinoma

c: carcinoma

d: carcinoma

7. ábra: CIN III/CIS (a), korai invazív cervix carcinoma (b,c) és elırehaladott carcinoma (d) makroszkópos képe. (SE, II.sz. Szülészeti és Nıgyógyászati Klinikája és a II.sz Patológiai Intézete anyagából)

17

2.2.2. TIGHT JUNCTION (TJ) Az állati és emberi endothel és epithel sejtek között többféle sejtkapcsoló struktúra különböztethetı meg, némileg eltérı funkcióval (Ebnet 2008). Ezen sejtkapcsoló struktúrák az úgynevezett zonula occludens vagy „tight junction” (TJ), a zonula adherens, a desmosoma (macula adherens), a hemidesmosoma és a gap junction (réskapcsolódás). (8., 9. ábra)

8. ábra: A tigh junction (TJ), adherens junction (AJ), desmosoma elektronmikroszkópos (a,c) és fagyasztva-töréses szerkezeet (b,d). A TJ a legapicalisabban elhelyezkedı sejtkapcsoló stuiktúra. (Tsukita és mtsai Oncogene 27:6930-38., 2008 ábrája)

18

9. ábra: A tight junction és adherens junctio fehérjéinek és intracellularis kapcsolatainak sémás ábrázolása. A claudinok a ZO-1 és -2-vel, valamint az aktinnal (fehér gömbök) kapcsolódnak. A adherens junctiokat alkotó cadherin a cateninekhez, illetve az aktinhoz kapcsolódik. (Förster C., Histochem Cell Biol 130: 55-70, 2008. ábrája)

A TJ a legapicalisabban elhelyezkedı folyamatos, körkörös, övszerő struktúra az epithelialis és endothelialis sejtek apicalis és basolateralis határán (Smith és mtsai.2008). A TJ-k két csoportra oszthatók, bicellularis TJ, mely két szomszédos sejt között képzıdik és tricellularis TJ, mely a három sejt találkozásánál alakul ki (Ikenouchi és mtsai 2008). A TJ-k egyrészt sejt-sejt közötti kapcsolatot hoznak létre, másrészt lezárják, kompartmenekre osztják a sejtek közötti teret (Förster 2008).

19

Korábban a TJ elsıdleges funkcióját statikus jellegőnek gondolták, azaz feladatát csak a különbözı kompartmenek elkülönítésében látták. A TJ azonban szelektív szemipermeabilis barrier, mely a paracelluláris diffúziót szabályozza (Shen és mtsai., 2008). A sejt polaritásának biztosítása mellett (fence- vagy kerítés funkció) a TJ-k szabályozzák a diffúziót, a víz és oldatok transepithelialis áthaladását, valamint a szelektív protein transzportot (barrier vagy kapu funkció). Ezen paracellularis barrier funkció lehetıvé teszi a szükségtelen vagy toxikus molekulák kizárását és biztosítja a víz és ionok belsı homeosztázisát a szervezetben (Tsukita és mtsai 2008). Emellett a TJ-t alkotó molekulák a membránból kiinduló szignálokra is reagálnak, és a jelátvitelben is szerepet játszanak (Matter és Balda 2003, Shen és mtsai 2008). Néhány

TJ

protein

elsısorban

kapcsoló

fehérjeként

funkcionál:

így

összekapcsolja a TJ proteinjeit az aktin cytoskeletonnal, míg mások a transzmembrán junctionalis proteineket képesek egymással összekapcsolni (9. ábra). Ismét mások a TJhoz történı vesicularis szállításban vagy a jelátviteli útvonalakban szerepelnek azáltal, hogy kapcsolódnak a kinázokhoz és a Ras-hoz (Förster 2008, Gonzalez–Mariscal és mtsai 2003, 2007). A TJ morfológiai képét már a múlt században felismerték fény és elektronmikroszkóp segítségével, mint „kissing points” (8. ábra). A fagyasztva-töréses technikák jelentısen segítették a TJ részletesebb feltárását (8. ábra), azonban a molekuláris felépítésének megismerése a S. Tsukita japán kutató vezette munkacsoport nevéhez főzıdik. Az elsı TJ fehérjét 1993-ban izolálta munkatársaival, melyet a zonula occludens (a TJ szinonimája) alapján occludinnak nevezett el (Furuse és mtsai 1993). Késıbb igazolta, hogy a TJ kialakulása occludin-hiányos egerekben is megtörténik, ami további fehérjék, elsısorban a claudinok felfedezéséhez vezetett (Furuse és mtsai 1998). Számos kiváló összefoglaló közlemény ismerteti a TJ és a felépítı fehérjék jellegzetességeit (Ebnet 2008, Förster 2008, Gonzales-Mariscal és mtsai 2003, Mitic és Anderson 1998, Shen és mtsai 2008, Tsukita és Furuse 1999, Tsukita és mtsai 2008), melyek alapján több elnevezés és csoportosítás ismert. A TJ felépítésében több mint 40 különbözı fehérje vesz részt (Gonzalez-Mariscal et al 2007), melyek legfontosabb tagjait a 2. táblázatban tüntettem fel (2. Táblázat).

20

2. táblázat: A TJ-t alkotó fehérjék csoportosítása (Gonzalez-Mariscal és mtsai 2007. alapján)

Integráns membran fehérjék

Cytoplasmaticus fehérjék PDZ doménnal rendelkezık

PDZ doménnel nem rendelkezık

occludin

ZO-1, -2, -3

cingulin

claudinok (24 típus)

Pals1

symplekin

JAM-1, -2, -3, -4

MAGI-1, -2, -3

7H6

tricellulin

PAR -3, -6

Pilt

CRB3

PATJ

JEAP

MUPPI1 AF-6

A fenti táblázatban szereplı minden molekula (és számos nem felsorolt) jelentıs a TJ felépítésében, azonban a „molekuláris gerincet” a claudinok képezik (Tsukita és Furuse 2000, Tsukita és mtsai 2008). A claudinok a fenti csoport tagjaival együtt jellegzetes transzmembrán fehérjék (2. táblázat). A legújabb „tag” a tricellulin, mely a három sejt találkozásánál kialakuló TJ alkotórésze. Mindezek alapján a TJ számos kereszt-kapcsolt (cross-linked) protein komplexének tekinthetı (Shen és mtsai 2008). Ez alapozta meg a korábbi „statikus” modellt. A TJ struktúrák azonban dinamikusan szabályozottak (Shen és mtsai 2008). Újabb adatok igazolták, hogy a TJ állandóan átépül („remodellálódik”), és az egyes alkotó fehérjék eltérı dinamikus tulajdonságúak. Ez a folyamat külsı stimulus nélkül is végbemegy, azonban gyors átépülés következik be extracellularis hatásra. A proteinek állandó mozgása a TJ-ban fontosnak tőnik a különbözı hatásokra bekövetkezı gyors strukturális és funkcionális válaszokban. Az új modell azt mutatja, hogy a TJ proteinek interakcióját átmeneti és folyamatos kapcsolódás–elszakadás jellemzi (Shen és mtsai 2008)

21

A

TJ

felépülése

fokozatosan

történik,

bonyolult

protein

interakció

következtében. Elıször a „kissing point” jön létre, amit a nectinek koordinálnak, melyek késıbb az aktin citoszkeletonhoz kapcsolódnak. Ezt követi az E-cadherin kötıdés, majd a JAM, ZO-1, claudinok és occludin beépülése (Ebnet 2008).

2.2.3. CLAUDIN FEHÉRJE-CSALÁD

A claudin elnevezés a latin „claudere”, „bezár” szóból származik. Az integráns transzmembrán claudin-családnak jelenleg 24 tagja ismert emberben, azonban egyes állatokban, különösen halakban ennél lényegesen több típust ismerünk (50 körül) (Chiba és mtsai 2003, Matsuda és mtsai 2004, Katoh és Katoh 2003, Tsukita és Furuse 2001, Tsukita és mtsai 2008 ). A GenBank adatai a 24 tag között 12,5-67,7%-ig terjedı szekvencia homológiát mutattak. A claudin géncsalád phylogenetikai családfáját korábban feltérképezték (Morita és mtsai 1999) és a közelmúltban kiegészítették (Hewit és mtsai 2006). A claudin-6 és -9 között a legszorosabb a rokonság a molekuláris összetételben, amit a claudin-1 és -7 hasonlósága követ. A claudin családon belüli alcsoportok átfedı homológiája a funkció átfedésének lehetıségére is utal (Morita és mtsai 1999). A claudin gének viszonylag kicsiny, 20-27 kDA közötti molekula tömegő proteineket kódolnak. A claudin fehérjék a másik jelentıse TJ fehérjével, a lényegesen nagyobb tömegő occludinnal nem mutatnak szekvencia homológiát (Oliveira és Morgado-Díaz 2007). A claudin fehérje molekula 4 hidrofób transzmembrán domént, 2 extracellularis hurkot, valamint rövid intracitoplazmatikus N és C terminális régiót (CT) tartalmaz. A CT vég PDZ-kötı motívummal rendelkezik (Oliveira és Morgado-Díaz 2007) (10. ábra). A PDZ domén a fehérje-fehérje interakcióban jelentıs, melyen át a TJ a citoplazmatikus

fehérjékhez

kötıdik,

így

igen

fontos

ezen

szakasz

az

intracitoplazmatikus jelátvitel szempontjából. A CT vég a kinázokhoz való kötıdés és a foszforilációs hely kialakításában is szerepet játszik (Itoh és mtsai 1999).

22

10. ábra: A transzmembrán TJ fehérjék: az occludin, a claudinok és a JAM szerkezete. A két extracellularis hurok csaknem azonos nagyságú az occludinban, az elsı nagyobb a claudin családban. A transzmembrális szakasz csaknem azonos hosszúságú, az occludin intracytoplasmatikus szakasza lényegesen hosszabb (Förster C., Histochem Cell Biol 130: 55-70, 2008. ábrája)

Két sejtet legalább két különbözı claudin molekula köt össze, amelyek homo-, vagy dimereket (esetleg trimereket) képezve kapcsolódnak össze. Ezeken belül homovagy heterofil kapcsolódás lehetséges (11. ábra). Az egyes claudinok dinamikus interakciója az embriogenezis és a differenciáció során is megfigyelhetı (GonzalezMariscal és mtsai 2003). A claudinok kapcsolatban állnak a cytoskeleton aktin komponenseivel (Furuse és mtsai 1999, Tsukita és Furuse 1999) és az intracellularis jelátviteli mechanizmusokban is részt vesznek, mint ezt a TJ fehérjékkel kapcsolatban már említettük (Ivanov és mtsai 2004). Számos adat utal arra, hogy a claudinok fokozott vagy csökkent expressziója a carcinogenesisben is szerepet játszik, legalábbis kóros

23

eltérésük számos tumorban megfigyelhetı (Tsukita és mtsai 2008, részletesen l. a megbeszélés fejezetben).

A Claudinok egymáshoz kapcsolódásának lehetséges mechanizmusai Homophil adhesio

Heterophil adhesio

Homopolymer

14 51 + + + NH2 13

Heteropolymer

21-42 COOH

(Furuse et al 1999, Gonzalez-Mariscal 2003)

11. ábra: A claudinok kapcsolódásának lehetséges formái: homopolymer és heteropolymer képzıdés.

A claudinok szerv és szövet specificitást is mutatnak. A TJ-k szorossága határozza meg, hogy milyen típusú hám alakul ki, és ez összefügg azzal, hogy a claudinok milyen kombinációban és arányban vannak jelen az adott kapcsolatban (Gonzalez–Mariscal és mtsai 2003). Különösen fontossá válhat a claudinok szerepe a laphám esetében, amely ún. „rezisztens” epithelium. Ezen típusú hámban a sejtpolaritásnak, melynek a claudinok meghatározói, különösen fontos szerepük van. A daganatok kialakulásában és terjedésében mind az endothelium átjárhatósága, mind a tumorsejtek disszociációja döntı fontosságú. A daganatsejtek egyik jellemzıje, hogy elvesztik polaritásukat és specifikus funkciójukat. A claudinok alterációit számos daganatban kimutatták (Kominsky 2006, Soini 2005), beleértve a leggyakoribbakat, így az emlıdaganatot (Kominsky és mtsai 2003, Kramer és mtsai 2000., Tıkés és mtsai 2005 a, b), a colorectum (Miwa és mtsai 2000), az ovarium (Hough és mtsai 2000), a

24

nyelıcsı (Gyırffy és mtsai 2005), az epeutak tumorait (Lódi és mtsai 2006). A claudinok alterációinak szerepét a carcinogenezisben számos adat támogatja (Hewith és mtsai 2006, Hirohashi és Kanai 2003, Sawada és mtsai 2003, Tsukita és mtsai 2008). Viszonylag kevés adattal rendelkezünk egyes claudin gének mutációja és emberi megbetegedések összefüggésére vonatkozóan. Például az öröklıdı hipomagneziával kapcsolatban a claudin-14 és a claudin-16 gén mutációját írták le (Simon és mtsai 1999). A különbözı kórokozók, mint baktériumok, vírusok, allergének is célpontként használhatják a TJ-t. A claudin-3 és claudin-4, a gyakran hasmenéssel járó Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) receptora. A CPE C terminálisa kötıdhet az intestinális hámsejteken lévı claudin-3-hoz és claudin-4-hez, míg az N terminális pórusokat formál a plazmamembránban (Katahira és mtsai 1997, McClane és McDonel 1979, Morita és mtsai 1999). A claudin-4-hez kötött CPE indukálja más receptor-ligand komplex kialakulását, mely végül a sejt gyors líziséhez vezet. Azon hámsejtek, melyek nem expresszálják a claudin-3 és -4 fehérjéket, nem károsodnak a CPE hatására. Mindez felveti annak lehetıségét, hogy egyes claudinok terápiás célpontként is szolgálhatnak. A házi poratka ürülékében elıforduló cystein proteáz belégzése elhasítja az occludint, a claudin-1-et és a ZO-1-et, így megnyitja a TJ-ket a légutakban. Ezáltal allergének juthatnak be a légutakba, amelyek immunválaszt váltanak ki és asztmát okozhatnak (Sawada és mtsai 2003, Schneberger és Lynch 2004). (Egyéb kórokozókra vonatkozó részleteket l. a megbeszélésben.)

2.2.4. OCCLUDIN FEHÉRJE

Az occludin elnevezés az „occludere” (elzárni) szóból származik, ezen fehérjét identifikálták elıször a TJ proteinek sorában (Furuse és mtsai 1993). Ez a 60-65 kDa nagyságú tetraspan membránfehérje mind az epithelialis, mind az endothelialis sejtek között kialakuló TJ-ban megtalálható. Az occludin két hasonló mérető, tirozinban gazdag extracellularis hurokkal, rövid citoplazmatikus N és hosszú C terminállal rendelkezik (10. ábra) (Förster 2008, González–Mariscal és mtsai 2003). A

25

paracellularis térben lévı extracellularis hurkok összekapcsolódnak a szomszédos sejtek occludinjainak extracellularis hurkával és más molekulákkal, ezáltal sejtkapcsolat jön létre (Schneeberger és Lynch 2004). Az occludin mennyisége csökkenhet a TJ-ban anélkül, hogy ez észrevehetıen megváltoztatná a sejt morfológiáját, permeabilitását, vagy egyéb TJ proteinek szintjét. Ez arra utal, hogy az occludin szabályzása független más TJ proteinek szabályzásától. Az occludin nem alapvetı a TJ kialakulásában, azonban a claudin képezte fonatokba beépülve, a permeabilitás regulációjában szerepe van (Förster 2008). Az occludin C terminálisának utolsó 150 aminosavat tartalmazó része direkt módon kapcsolódik az F aktinhoz. Emellett még kötıdik az ZO-1, -2, és -3 molekulához is (9. ábra). A normál endometriumban és az endometrioid carcinoma elsı stádiumában például az occludin a sejtek apikális részén lokalizálódik. A daganat progressziója során viszont az occludin eltőnik a daganatos sejtekbıl és szintje párhuzamosan csökken a carcinoma progressziójával. Mindez a nyirokcsomóban kialakuló áttétekkel is összefügg (Tobioka és mtsai 2004). Az oestrogen csökkenti a TJ rezisztenciát, feltehetıen az occludin matrix-metalloproteináz-7-mediált átépülésével, a normális humán vaginaliscervicalis hámsejttenyészetekben (Gorodeski 2007). A fenti adatok arra utalnak, hogy a sejt növekedése, differenciációja során a sejtadhéziós molekulák, köztük kiemelten a TJ kialakulásában résztvevı fehérjék mennyiségileg és minıségileg is megváltoznak. Ez a jelenlegi adatok alapján, mind a daganatok kialakulásában, mind azok progressziójában döntı szerepet játszik.

2.2.5. SYNDECAN-1

A sejtfelszíni heparan sulfat proteoglikanok (HSPG) szerepet játszanak a humán papilloma vírus (HPV) fertızésben, mivel a vírus sejtfelszíni receptoraként szolgálnak (Giroglou és mtsai 2001, Shafti-Keramat és mtsai 2003). Ezek közül a syndecan-1 (Sy-1) az egyik olyan fontos transzmembrán molekula, amely a HPV receptoraként szolgálhat (Sahafti-Keramat és mtsai 2003).

26

A Sy-1 különbözı ECM komponensekhez, így a fibrillaris kollagénhez, a fibronektinhez, a thrombospondinhoz és a tenascinhoz kötıdik, más HSPG komponenssel, mint a bFGF-ral együtt (Inki és mtsai 1994, Sebestyén és mtsai 1997, 2000). Az embryogenesis során a Sy-1 fontos reguláló szerepet tölt be a sejtdifferenciációban és az epithelialis-mesenchymalis interakcióban (Inki és mtsai 1994). Az érett szövetekben a Sy-1 elsısorban a hámszövetben található, különösen a laphámban, valamint kisebb mértékben a fibroblasztok és endothel sejtek is expresszálják és szerepet játszik a mikrokörnyezet reakcióinak alakításában (Numa és mtsai 2002). A Sy-1 szerepet játszik egyes növekedési faktorok megkötésében, a cytoskeleton organizációjában, így befolyásolja a sejtmorfológiát (Rintala és mtsai 1999, Numa és mtsai 2002). A Sy-1 expresszió kóros a malignus transzformáció során és elváltozásai jellemzik a diszplasztikus és neoplasztikus sejteket (Inki és mtsai 1994). A Sy-1 a normális cervicalis epitheliumban is detektálható, kivéve a basalis sejtréteget. A Sy-1 mennyisége szignifikánsan csökken a carcinoma inváziója során (Inki és mtsai 1994, Nakanishi és mtsai 1999, Rintala és mtsai 1999, Shinyo és mtsai 2005). Számos adat igazolta, hogy a Sy-1 extracellularis domain-jének a leválása a sejtfelszínrıl, mely ezt követıen az ECM-ban kimutatható, kedvezıtlen prognosztikai faktor számos tumorban (Gumbiner 1996, Wiksten és mtsai 2001).

27

3. CÉLKITŐZÉSEK, KÉRDÉSFELTEVÉS Az irodalom adatai alapján bizonyítottnak tekinthetı, hogy a TJ fehérjék expressziója változik a carcinogenesis és a daganatok progressziója során. A fenti adatok felvázolták a TJ statikus-dinamikus modelljét, az alkotó fehérjék kapcsolatát. Számos esetben bebizonyosodott in vivo és in vitro rendszerekben, hogy a külsı hatásokra a TJ szerkezete és funkciója megváltozik, mely az alkotó fehérjék expressziója megváltozásának függvénye. A cervix hámszerkezete, mint kifejezetten polarizált, „rezisztens” hám, fokozottan érzékeny a sejtkapcsolatokban beálló eltérésekre, mely a neoplasia során megfigyelhetı, azonban ennek molekuláris alapjai nem tisztázottak. Ezen ismeretekre és irodalmi adatokra alapoztuk hipotézisünket, mely a következı: A TJ egyes protein összetevıi már a carcinogenesis korai szakaszában változnak,

eltérnek

a

normális

sejtkapcsoló

struktúrák

összetételétıl.

Feltételezésünk szerint a cervix praemalignus elváltozásaiban már észlelhetık a TJ-t

alkotó

egyes

fehérjék,

elsısorban

a

”gerincet”

képezı

claudinok

expressziójának eltérése és ez dinamikusan alakul a praemalignus-malignus progresszió folyamán. Feltételezzük, hogy a CIN I-III, CIS szakaszokban, majd a daganat inváziójával a TJ fehérjék eltérı expressziós rajzolata alakul ki, mely jellemzi az egyes szakaszokat, az elváltozás elırehaladott voltát.

A fenti hipotézis igazolására a következı kérdések megválaszolását tőztük ki célul, melyre nem találtunk adatot az irodalomban: 1. Mennyire jellemzı a cervicalis laphám claudin mintázata normális, nem daganatos állapotban? Milyen claudin típusok jellemzik a cervicalis hámot? 2. Változik-e az egyes claudinok expressziója a praemalignus CIN I-III stádiumokban?

28

3. Milyen mértékben változnak az egyes claudin típusok és ezek közül melyek jellemzik legkifejezettebben a cervix korai és elırehaladott daganatos elváltozásait? Van-e a hámot és daganatos elváltozásait jellemzı „claudin-rajzolat”? 4. Van-e különbség az in situ carcinoma (CIS), a CIN I-II és az invazív rák claudin mintázatában és az egyes claudin típusok expressziójában? 5. Az occludin expresszió változik-e a cervicalis carcinogenesis során és lokalizációja, valamint változásának iránya korrelál-e a claudinokkal? 6. Van-e összefüggés a HPV receptor, transzmembrán heparán szulfát proteoglikán, a syndecan-1 expresszió, az occludin és a claudinok között a cervicalis carcinogenesis korai, elsısorban praemalignus szakaszaiban? 7. A cervicalis carcinognesis során észlelt TJ protein eltérések felhasználhatók-e a daganatelıtti és daganatos elváltozások diagnosztikájában?

29

4. ANYAG ÉS MÓDSZER 4.1.

Betegek és szövetminták

A cervixbıl származó szövetmintákat a Semmelweis Egyetem II.sz. Szülészeti és Nıgyógyászati Klinikájának betegeibıl diagnosztikus vagy kuratív célból eltávolított, és a II.sz. Pathologiai Intézetben feldolgozott mintákból válogattuk. A vizsgálatokhoz rendelkeztünk a Regionális Etikai Bizottság engedélyével (172/2003.). A minták fixálása a SE II.sz. Patológiai Intézete biopsziás laboratóriumi protokollja szerint rutin módon 10%-os pufferolt formalinban történt 24 órán át, majd paraffinba történt a beágyazás. A diagnózis megállapítása haematoxilin-eosin (H&E) festett metszeteken történt. A vizsgálatokhoz a leletek alapján kiemelt metszeteket ismételten áttekintettük, a megfelelı, a kérdéses elváltozást tartalmazó blokk kiválasztására. Összességében 105 biopszia és uterus exstirpáció során eltávolított cervicalis mintát dolgoztunk fel. A szöveteket a korábbi citológiai indikáció alapján eltávolított portio konizátumok képezték. A biopsziás minták diagnózisa a következı volt; normális cervix (n=20), cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN) Grade I (n=10), CIN II (n=17), CIN III (n=10), carcinoma in situ (CIS) (n=15), valamint invazív laphámrák (T1 és T2, n=33). A 20 normális szöveti szerkezető portio minta egyéb, a cervixet nem érintı okból eltávolított uterusból származott (3. táblázat). 3. táblázat: A vizsgált portio minták hisztológiai diagnózisa

Hisztológiai diagnózis

A minták száma (n= 105)

Normális cervicalis laphám

20

CIN I

10

CIN II

17

CIN III

10

CIS

15

Invazív laphámrák (T1, T2)

33

30

4.2. Immunhisztokémiai módszerek A 3-4 mikrométer vastagságú metszeteket deparaffináltuk (2x10’ xilol, 2x5’ etanol), majd az endogén peroxidáz aktivitást 3%-os hidrogén-peroxid elıkezeléssel gátoltuk 20 percig. A metszeteket mikrohullámú sütıben citrát alapú feltáró oldattal kezeltük (Target Retrieval Solution, DakoS1699, DAKO, Glostrup, Dánia, pH6) 30 percen át. A TJ ellenes primer antitestek mindegyikét a Zymed (Zymed Inc., San Francisco, CA USA), a humán anti-Syndecan-1 egér monoclonális antitestet

a

Serotec Ltd (Oxford, UK) cégtıl szereztük be (4. táblázat).

4. táblázat: Elsıdleges claudin, occludin és Sy-1 ellenes antitestek

Antitest

Klonalitás

Gyártó cég

Higítás

Claudin-1

Polyclonalis (nyúl)

Zymed Inc.SanFrancis.

1:80, 1:100

CA, USA Claudin-2

Monoclonalis (egér)

Zymed Inc.

1::80, 1:100

Claudin-3

Polyclonalis (nyúl)

Zymed Inc.

1:80, 1:100

Claudin-4

Monoclonalis (egér)

Zymed Inc.

1:80, 1:100

Claudin-7

Polyclonalis (nyúl)

Zymed Inc.

1:80, 1:100

Occludin

Polyclonalis (nyúl)

Zymed Inc.

1:300

Syndecan-1

Monoclonalis (egér)

Serotec LtD, Oxford, 1:100 UK

A reakciókat kézileg processzáltuk, majd beállítás után a Syndecan-1, a claudin1, -2, -3, -4 és -7 ellenes antitesteket a Ventana ES automata immunfestıvel processzáltuk (Ventana Medical System Inc., Tucson, AZ, USA), az occludin reakciókat kizárólag manuálisan végeztük. A szekunder antitestek biotinizált anti-egér, illetve anti-nyúl nyúl savók voltak (Ventana, Zymed), 1:100-as hígításban, 1 órán át, szobahın alkalmazva. Ezt az avidinbiotin-peroxidáz (ABC, DAKO) követte. Kromogénként 3,3’-diaminobenzidin (DAB) szolgált (Ventana). Automata alkalmazása esetén a Ventana iVIEW kit DAB detection

31

Kit a következıket tartalmazta a cég által megadott adatok alapján: inhibitor (3% H2O2), PAB 10%-os BSA-ban higítva, biotinizált Ig, SA-HRP (fehérje stabilizáló), DAB (0,2%), H2O2 (0,04%), hematoxylin, „bluing reagens” (cat# 760-091). Az immunhisztokémiai reakció menetét az 5. sz. táblázat foglalja össze. 5. táblázat: Az immunhisztokémiai rekció menete

Folyamat

Anyag, cég

idıtartam

Paraffinos metszet, 3-4 µm Xilol

2x10’

Alkohol

2x5’

Mosás

Deszt.víz, PBS

3x10’

Endogén peroxidáz blokkolás

3% H2O2

20’

Mosás

PBS

3x10’

Antigén feltárás

DAKO-elıhívó oldat

30’ mikrohullám

Mosás

PBS

3x10’

Deparaffinálás

Éjszakán át, 4°C

Primer antitest Mosás

PBS

3x10’

Szekunder antitest

Biotinizált IgG

60’, szobahı

Mosás

PBS

3x10’

Vizualizálás

(1)Avidin-biotin-perioxidáz technika,

EnvisionTM

(DAKO)

DAB (Ventana) (manualis),

(2) iView DAB Detection Kit, Ventana (automata) Mosás

Deszt.víz

Öblítés, 3x10’

Festés,

Haematoxilin

1’ 5-10’

„kékítés” Dehidrálás, Fedés

Alkohol (70%, 95%, abs)

3x10’

Xilol

2x10’

32

A nem specifikus reakció kimutatására negatív kontrollokat használtuk: az elsıdleges antitestet nem-immun nyúl illetve egér szérummal (Zymed) helyettesítettük a primer antitestnek megfelelı hígításban, valamint PBS-sel. Pozitív kontrollként a claudin-1 kimutatása esetén bırt, a claudin-2, -3, -4-hez colon és endometrium nyálkahártyát,

a

claudin-7-hez

emlıszövetet

használtunk.

Az

endometrium

immunreaktivitását különbözı fixálókat használva és a claudin mRNS expresszióval is összevetve, korábbi munkánkban határoztuk meg (Páska és mtsai 2004).

4.3.

Az

Az immunreakciók értékelése

immunreakciókat

két

egymástól

független

vizsgáló

értékelte.

Az

immunreakció lokalizációját a normális többrétegő el nem szarusodó laphám sejtrétegeiben elemeztük; így a basalis, parabasalis, intermedier és felszínes rétegben és meghatároztuk az immunreakcióval pozitív reakciót mutató sejtek számát.

A CIN

léziókban, valamint a carcinomákban a diszplasztikus, valamint a tumorsejtek között határoztuk meg a pozitívan reagáló sejtek számát. Az immunhisztokémiai reakciót szemikvantitativ módon analizáltuk: 10 random szelektált, hám illetve tumorkomponenst tartalmazó területet választottunk ki metszetenként, 20x-os objektív nagyítással, látóterenként 100 sejtet számolva. A normális hám esetében csak a laphámréteget, CIN és daganatok elemzése során ugyancsak kizárólag a laphám eredető tumorsejteket értékeltük. A mintában esetlegesen jelenlévı mirigykomponenseket, a syndecan reakciók esetében a kötıszöveti réteget nem analizáltuk.

33

A pozitívan reagáló sejtek számát százalékban adtuk meg, majd a további értékeléshez pontrendszerbe illesztettük a következı módon; 5 pont = a laphám/tumorsejtek 80-100%-a, 4 pont = a laphám/tumorsejtek 60-80%-a, 3 pont = a laphám/tumorsejtek 40-60%-a, 2 pont = a laphám/tumorsejtek 20-40%-a, 1 pont = a laphám/tumorsejtek 5-20%-a, 0 pont = a laphám/tumor >5% festıdött

4.4. Statisztikai módszerek

A statisztikai számolást a MANN-Withney U teszttel végeztük, amely során az immunhisztokémiai pontértékeket hasonlítottuk össze a különbözı csoportokban. Az értékeket szignifikánsnak tekintettük p>0,05-nél. A korrelációs koefficienst a Spearmann rank módszerrel elemeztük.

4.5. Egyéb módszerek

A claudinokat a vizsgálataink kezdetén (2000-ben) csupán két éve ismerték. Expressziójuk vizsgálatára ezért különbözı szövetmintákat győjtöttük, elsısorban nıgyógyászati anyagokat, amelyeket a tovább tanulmányainkban pozitív kontrollként használtuk. Különbözı fixálási és beágyazási technikákat alkalmaztunk és a kereskedelmi forgalomban elérhetı antitesteket alkalmazva standardizáltuk a különbözı claudin immunreakciókat és kiválasztottuk azon szöveteket, melyek a saját vizsgálataink és az irodalmi adatok alapján megfelelı kontrollként szolgálhatnak az egyes claudin típusok detektálására. Ezen kísérletek során állítottuk be a késıbbi vizsgálatainkban (nem képezi az értekezés tárgyát) fontos szerepet játszó mRNS expresszió vizsgálatát. Ezen elızetes vizsgálatok során magam a munkafázis egyes stádiumaiban vettem

részt;

így

anyaggyőjtés,

különbözı

34

fixálási

technikák

hatása

az

immunhisztokémiai reakciókra, az egyes claudinok detektálása, ezek egymással való összehasonlítása, RNS izolálás. Ezen vizsgálat képezte azonban az alapját a már önállónak tekinthetı munkámnak. A módszertannal kapcsolatos közleményben, mint jeleztem, munkatársként vettem részt (Páska és mtsai 2004). Mivel az ezen cikkben ismertetett molekuláris patológiai vizsgálatokkal kapcsolatos munka a továbbiakban nem kerül a disszertáció során elemzésre, és értékelésre, bár alapját képezte a jelen munkának technikai felkészülésem szempontjából, az értekezésemben a Páska és mtsai (2004) cikkben részletesen ismertetett metodikai részletekre nem térek ki.

35

5. EREDMÉNYEK 5.1. Claudin expresszió a normális cervicalis laphámban Az egyes claudinok eloszlása a normális cervicalis laphámban igen jellegzetesnek mutatkozott. A claudin-1 antitest erısen reagált a parabasalis és intermedier réteg sejtjeivel, elsısorban a sejtmembránt festette linearisan, körkörös jelleggel, ezáltal a kapcsolódó sejtek által képzett laphámnak „lépesmézszerő” képet adott gyakran a metszetekben. A felszínesebb réteg felé haladva csökkent a festıdés intenzitása és a legfelsıbb, szuperficiális rétegben a reakció nem volt detektálható, hasonlóan a basalis sejtréteghez, melyben ugyancsak nem tudtuk a claudin-1-t kimutatni (12.a ábra). A claudin-2, az elıbbivel ellentétesen a basalis sejtrétegben mutatott intenzív reakciót. A claudin-1-el szemben azonban granularis reakció mutatkozott, mely részben a membranok mentén, másrészt azonban intracytoplasmaticusan is detektálható volt. Lényegesen gyengébb volt a reakció a parabasalis sejtrétegben, és csak elszórtan, egyegy kicsiny pont formájában volt festıdés látható a hám felszíne felé haladva (12.b ábra). A claudin-3 minden rétegben negatívnak bizonyult (12.c ábra). A claudin-4 és a claudin-7 festıdés megjelenésében nagymértékben hasonlított a claudin-1-hez, azaz membranózus reakciót mutatott, „lépesmézszerő” képet nyújtva. A basalis sejtréteg negatívnak bizonyult, a szuprabasalis és az intermedier réteg alsó fele viszont pozitív volt. A claudin-7 intenzívebben reagált, mint a claudin-4. A szuperficiális rétegben reakció nem volt megfigyelhetı (12.d.,e ábra).

36

Claudin 1

Claudin 4

Claudin 2

Claudin 3

Claudin 7

H&E

12. ábra: Claudinok lokalizációja normális cervicalis laphámban. a: claudin-1, b: claudin-2, c: claudin-3, d claudin-4, e: claudin-7, f: H&E festés. A claudin1, -4, -7 membranózus pericellularis festıdést mutat a parabasalis és intermedier rétegben. A claudin-2 (b) granularis reakciót ad, elsısorban a basalis rétegre lokalizálódik. A nyilak a pozitív (barna) reakciót mutatják. 400 x

37

5.2. Claudin expresszió a cervicalis intraepithelialis neoplasiában (CIN I/II, CIN III/CIS) A claudin-1 expresszió szignifikáns növekedése volt megfigyelhetı a CIN léziókban. A reakció jellege, azaz a membranózus lineáris reakció, hasonló volt a normális hámban megfigyelthez, azonban a reakció intenzitása fokozott volt. A CIN lézió erısen pozitív területe élesen elkülönült az egyébként negatívan festıdı cervicalis glandularis mirigyek hámsejtjeitıl (13.a,b ábra). Ugyancsak éles határ volt megfigyelhetı az ép és kóros hám határán. A claudin-1 expresszió változott a progresszió elırehaladásával. Míg a CIN I/IIben a sejtek kb. 60-70%-a reagált, a CIN III-ban és a CIS-ben gyakorlatilag minden hámsejt erısen pozitívan festıdött (13.b ábra). A hám alsó rétege már a korai léziókban (CIN I) is intenzíven festıdött, szemben a normális hám claudin-1 negatív basalis rétegével. A CIN I/II és CIN III/CIS léziók claudin-1 expressziója szignifikánsan különbözött a normális hámtól. A CIN I/II és CIN III/CIS ugyancsak szignifikáns különbséget mutatott, az utóbbi sejtjei nagyobb arányban reagáltak (6. táblázat, 14.a ábra). Statisztikailag elemezve, a claudin-1 szignifikánsan magasabb volt a CIN I/II-ben, (átlag.4.00 +/-0) és CIN III/CIS-ben (átlag 4,88 +/-0,33), összehasonlítva a normális epitheliummal (átlag 2,05 +/- 0,22), P<0,0001, ( 6. táblázat, 14. a ábra).

A claudin-2 expressziója, mely a normális hámban csupán a basalis rétegben volt megfigyelhetı, ugyancsak kiterjedtebb volt a CIN különbözı fokozataiban. Az általánosságban jellemzı granularis reakció nem változott, bár az intenzitás kissé csökkent, ugyanakkor a hám felsıbb rétegeire is kiterjedt (13.c ábra). A CIN I/II, illetve CIN III/CIS léziókban szignifikánsan magasabb volt a claudin-2 expresszió, mint a normális hámban. A CIN I/II és CIN III/CIS között azonban a különbség nem volt szignifikáns (6. táblázat, 14.b ábra).

38

A claudin-3 nem volt detektálható a CIN léziókban (13.d ábra), hasonló módon a normális portio laphámhoz.

A claudin-4 expresszió intenzitása fokozatosan növekedett a felszíni réteg felé, a reakció membranózus jellege nem változott (13.e ábra). A CIN I/II és a CIN III/CIS léziókban szignifikánsan magasabb volt a claudin-4 expresszió a normális hámhoz képest. A CIN I/II, illetve CIN III/CIS között is szignifikáns különbség volt, nevezetesen a claudin-4 csökkent a progresszióval a CIN I/II-tıl a CIN III/CIS felé (6. táblázat, 14.c ábra).

A claudin-7 hasonló képet nyújtott mind lokalizációban, mint a reakció megjelenésében, a claudin-1-hez. A jellegzetes membranózus reakció megfigyelhetı volt, és a basalis rétegére is kiterjedt a praemalignus léziókban (13.f ábra). A pozitívan reagáló sejtek száma növekedett a CIN I/II, illetve CIN III/CIS felé haladva, és szignifikáns különbség volt a normális hámmal összehasonlítva. Ugyancsak szignifikáns különbség volt a CIN I/II és CIN III/CIS között, azaz a CIN III/CIS-ben magasabb volt a claudin expresszió, mint a CIN I/II-ben (6. táblázat, 14.d ábra).

Összefoglalva

tehát

a

claudin

expresszió

mértéke

változott,

már a

carcinogenesis korainak tekinthetı szakaszaiban, a CIN I/II -ben is. Ez legkifejezettebb a claudin-1 és -7 esetében volt, melyek expressziója jelentısen növekedett a folyamat súlyosbodásával. A progresszió elırehaladásával mindkét claudin expressziója növekedett és a maximumot a CIN III/CIS elváltozásokban érte el. A claudin-2 és -4 szignifikáns emelkedése is megfigyelhetı volt a CIN I/II fokozatban, azonban ez a CIN III/CIS- ben csökkent, bár még mindig magasabb volt, mint a normális hámban. A jellegzetes lokalizáció, és festési reakció, azaz a membranózus reakció a claudin-1, -4, 7-ben és a granularis jelleg a claudin-2-ben nem változott.

39

13. ábra: A claudinok expressziója CIN III/CIS-ben. A claudin-1 intenzív pozitív reakciót ad és a diszplasztikus hám teljes vastagságára kiterjed, élesen elkülönül a nem érintett, normális hámtól (a, b, nyíl). A szomszédos cervicalis mirigyek nem festıdnek. A claudin-2 granuláris reakciója ugyancsak jelentısen kiterjedt, a hám csaknem minden sejtjében detektálható, azonban gyengébb intenzitással. A claudin-3 negatív (d). A claudin-4 kiterjedt, azonban elsısorban a hám felsıbb rétegei reagálnak (e). A claudin-7 a hám teljes szélesességében intenzív reakciót ad (f). a:100 x, b-e: 400 x

40

6. táblázat: A claudinok szemikvantitatív értékelésének eredményei.

Normal - CIN I/II Normal - CIN III/CIS Normal - Inv T1 + T2 CIN I/II - CIN III/CIS CIN I/II - Inv T1 + T2 CIN III/CIS - Inv T1 + T2

Cl 1 2,05-4,0 p<0,0001 2,05-4,88 p<0,0001 2,05-4,0 p<0,0001 4,0-4,88 p<0,0001 4,0-4,0 ns 4,88-4,0 p<0,0001

Cl 2 Cl 4 Cl 7 1,05-3,00 1,2-3,0 1,61-3,0 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 1,05-2,92 1,2-2,24 1,61-3,8 p<0,0001 p=0,001 p<0,0001 1,05-2,03 1,2-1,7 1,61-3,47 p<0,0001 ns p<0,0001 3,0-3,8 3,01-2,92 3,0-2,24 ns p=0,0019 p=0,0016 3,01-2,03 3,0-1,7 3,0-3,47 p<0,0001 p<0,0001 p=0,0121 2,92-2,03 2,24-1,7 3,8-3,47 p=0,0006 ns ns

CIN: cervicalis intraepithelialis neoplasia, inv: invazív carcinoma T1, T2, Cl: claudin, ns: nem szignifikáns

41

Claudin 1

Claudin 2

7.5

4

Score

Score

3 5.0

2

2.5 1

a)

0.0

Normal

CIN 1+2 CIN 3+CIS

b)

T1+T2

0

Normal

Claudin 4 5 4

Score

Score

3

2

1

0

T1+T2

Claudin 7

4

c)

CIN 1+2 CIN 3+CIS

3 2 1

Normal

CIN 1+2 CIN 3+CIS

d)

T1+T2

0

Normal

CIN 1+2 CIN 3+CIS

T1+T2

14. ábra: A claudin-1, -2, -4 és -7 szemikvantitatív értékelésének összehasonlító ábrázolása. A claudinok expressziója növekszik a CIN, CIS elváltozásokban, a maximumot a claudin-1 és -7 esetében a CIN III/CIS léziókban éri el. Az invazív carcinomákban csökken az expresszió, azonban a normális értéket meghaladja.

42

5.3. Claudin expresszió az invazív cervicalis carcinomában A 33 vizsgált daganat mintában 10 T1a1, 5 T1a2, 8 T1b1, 5 T1b2 és 5 T2 invazív laphámrákot vizsgáltunk. Hisztológiailag a tumorok közül 18 elszarusodó és 15 nem elszarusodó carcinoma volt. A normális cervicalis laphámban detektált claudinok (claudin-1, -2, -4, -7) mindegyike fokozottabban expresszálódott invazív carcinomában, mint a normális hámban (14., 15. a, b, d, e ábra). Ezek közül a claudin-1, -2 és -7 esetében a különbség szignifikáns volt (6. táblázat, 14.a, b, d ábra). A claudin-4 esetében a csökkenés a CIN I/II-vel összevetve szignifikáns, de a CIN III/CIS-hez képest nem bizonyult szignifikánsnak (6. táblázat). A claudin-3 a carcinomában sem expresszálódott, hasonlóan a normális cervixhámhoz és a CIN/CIS léziókhoz (15.c ábra). A festıdés morfológiai megjelenése és a lokalizáció nem változott (15. ábra) A claudin-1, -2, -4 és -7 expresszió heterogénnek bizonyult az egyes carcinomák különbözı területein. Rendszerint intenzív rajzolat volt megfigyelhetı a pozitívan reagáló sejtekben (15.a, b, 16a ábra), különösen a claudin-1 esetében, amely egyes esetekben még a limfatikus invázió során sem változott (16.c ábra). Más területeken azonban a tumorsejteknek csak kisebb csoportjai expresszálták a claudin-1-et vagy más claudint, míg egyes sejtek negatívak voltak (16.b ábra). A fokális expresszió minden esetben megfigyelhetı volt és nem volt különbség sem a T kategória, sem a hisztológiai típus (keratinizáló vagy nem keratinizáló) között.

43

15. ábra: A claudinok expressziója inhomogén az invazív carcinomákban. Egyes tumorokban a claudin-1 erıs reakciója még az invázió során is megtartott (a). A claudin-2 reakciója gócossá vált (b). A claudin-3 negatív (c). A claudin-4 reakciója csökken, fıleg az inváziót mutató területeken (d). A claudin-7 az ábrán látható intraepithelialis lézióban még igen intenzív, azonban az inváziót mutató sejtekben jelentısen csökkent (e, nyíl). H&E (f). a: 100 x, betét: 400x, b-d: 400 x

44

16. ábra: A claudin-1 egyes invazív tumorokban igen intenziv rajzolatot ad (a), másokban csak egyes sejtek expresszálják a fehérjét (b). Néha az erıs expresszió a limfogén invázió területén is megmarad (c). 400 x

5.4. Occludin és a syndecan-1 expresszió A fenti mintákból 50 esetet analizáltunk immunhisztokémiai módszerrel az occludin és a HSPG syndecan-1 kimutatására. A mintá között 10 normális cervicalis epithelium, 10 CIN I, 10 CIN II és 10 CIN III lézió, valamint 10 in situ carcinoma került feldolgozásra.

5.4.1. Occludin expresszió

A claudin-2-vel összehasonlítva (17.a ábra), az occludin igen erıs linearis membranózus reakciót mutatott a normális hám basalis rétegében, míg a felsıbb rétegek negatívnak bizonyultak (17.c ábra). A reakció intenzitása csökkent a CIN léziókban,

45

azonban

kiterjedtebbnek

bizonyult,

fokális jellegővé

vált: pozitívan

reagáló

sejtcsoportok váltakoztak negatív fókuszokkal (17.d, 18.a,b ábra). A claudin-2 reakció a hám teljes szélességére kiterjedt CIN III-ban (17.b ábra).

17. ábra: A claudin-2 (a,b) és occludin (c,d) a normális cervicalis laphámban a basalis sejtrétegben detektálható (a,c). A CIN III/CIS léziókban mindkét fehérje expressziója kiterjedt a hám teljes rétegére. Az occludin reakció fokális jellegő (d), mérsékeltebb kiterjedéső, mint a claudin-2 reakció (b). 200 x, betét 400 x

46

18. ábra: Occludin expresszió CIN II-ben (a). A kiterjedt basalis sejt réteg intenzíven reagál, az intermedier rétegben is megjelenik a reakció, de kisebb intenzitással. A CINIII/CIS-ben (b) az occludin változó intenzitású az egyes sejtekben, fokális, intenzitása csökkent. 200x, 400x

47

5.4.2. Syndecan-1 expresszió

A syndecan-1 a normális cervicalis epitheliumban intenzív folytonos sejtfelszíni membrán festıdést mutatott. A reakció nem volt jelen a basalis és a superficiális rétegben, a parabasalis és az intermedier réteg sejtjei viszont igen intenzíven reagáltak. (19.a ábra). A CIN I/II, és CIN III/CIS léziókban a syndecan-1 a normális hámhoz hasonló intenzív reakciót mutatott (19.b ábra). A reakció membranózus jellege hasonló volt a normális epitheliumban észleltekhez, azonban sokkal kiterjedtebbnek bizonyult, ugyanis a diszplasztikus epithelium felsıbb rétegei is pozitívan reagáltak. Kisebb-nagyobb negatív gócok azonban elıfordultak, elsısorban az elırehaladottabb CIS léziókban (19.b ábra). A reakció lokalizációja és jellege hasonló volt a claudin-1 reakcióhoz mind a normális cervicalis hámban (19.c ábra), mind a CIN III/CIS-ben (19.d ábra). A syndecan-1 reakció jellege ugyancsak hasonló volt a claudin-4 és -7 reakciókhoz, bár a claudinok intenzitása a syndecan-1-hez viszonyítva halványabb a CIN/CIS elváltozásokban.

48

19.

ábra: A syndecan-1 (a,b) és claudin-1 (c,d) expressziója normális

hámban (a,c) és CIN III-ban (b,d). A normális hámban a két fehérje hasonló membranózus festıdést mutat, a parabasalis és intermedier rétegben lokalizálódik és nem érinti a basalis réteget. A CIN léziókban mindkét fehérje kiterjedten expresszálódik a kóros sejtek felszínén. 200 x, betét 400x

49

Összefoglalva az occludinok, a syndecan-1 és a claudinok expressziójának összehasonlítását, a következıket állapíthatjuk meg: -

A normális cervicalis laphámban az occludin és a claudin-2

hasonló lokalizációt mutat a basalis rétegben, míg a syndecan-1 és claudin-1, 4 és -7 hasonlóan lokalizálódik a parabasalis és intermedier rétegben. -

Az occludin reakció intenzitása csökkent a CIN/CIS léziókban,

azonban kiterjedt a hám felsı rétegeire is, hasonlóan a claudinokhoz, azonban a reakció fokális jellegő és csökkent kiterjedéső. Az occludin lokalizációja tehát CIN/CIS léziókban nem egyezett a claudin-2 expressziójával, mely minden rétegben megfigyelhetı volt CIN III/CIS esetekben. -

A syndecan-1 expresszió, mely a normális hámban hasonló volt a

claudin-1, -4 és -7 reakcióval, a CIN léziókban nem volt azokkal párhuzamos. A claudinok expressziója a CIN/CIS léziókban progresszíven nıtt, a teljes hámrétegre kiterjedt, míg a Syndecan-1 expresszió csökkent a CIN progressziójával. -

Mindezen vizsgálatok arra utalnak, hogy az egyes TJ proteinek és

a syndecan-1 nem változnak párhuzamosan a cervix carcinogenesis során. Az occludin expresszió intenzitása csökken, hasonlóan a syndecan-1 változásához a CIN/CIS elváltozásokban, ellentétben a claudinok progresszíven növekvı expressziójával a carcinogenesis során.

50

6. MEGBESZÉLÉS

Eredményeink egyértelmően igazolták, hogy a méhnyak praemalignus és malignus elváltozásaiban a TJ fehérjék jelentıs elváltozást mutatnak. A TJ fehérjék szerepét a sejtadhézióban a bevezetésben összefoglaltuk. Egyre nagyobb számban jelennek meg kiváló összefoglalások a TJ fehérjék alterációiról, összefüggésérıl az emberi megbetegedésekkel és igen intezív a kutatás ezen a területen (Ebnet 2008, Förster 2008, Gonzalez-Mariscal és mtsai 2003, 2007, Martin és mtsai 2008, Oliveira és Morgado-Diaz 2007, Sawada és mtsai 2003, Shen és mtsai 2008, Tsukita és mtsai 2008). A TJ fehérjék barrier funkciójának a károsodása számos nem daganatos és fıleg daganatos emberi megbetegedésben megfigyelhetı (Förster 2008, Hewitt és mtsai 2006, Morin 2005, Soini 2005, Swissshelm és mtsai 2005,). Munkánk kezdetén, 2000-ben, a claudin család csupán két éve volt ismert és igen kevés adattal rendelkeztünk az egyes típusok expressziójáról a normális és kóros emberi szövetekben. A kezdeti adatok egyértelmően igazolták, hogy a claudinok kifejezett, jellegzetes szerv- és szövet specificitást mutatnak (Förster 2008, Rahner és mtsai 2001,). Az eltelt idıben a TJ fehérjék vizsgálata és jelentıségének felismerése robbanásszerő

volt.

Különösen

elıtérbe

került

tanulmányozásuk,

miután

bebizonyosodott, hogy a claudin-3 és -4 a Clostridium perfringens enterotoxinjának (CPE) receptora, és így citolízist okozhat a claudin-4-t expresszáló sejtekben. Ennek alapján a CPE potenciális tumor ellenes szerként való alkalmazása is felmerülhet (Fujita és mtsai 2000, Michl és mtsai 2003 Kominsky 2006, Smedley és mtsai 2007, Van Itallie és Anderson, 2004). Az epithelialis carcinogenesis összefügg a normális szöveti szerkezet felbomlásával, a sejt-sejt és sejt-ECM kapcsolatok elvesztésével, mely lehetıvé teszi a malignus sejtek migrációját, elszakadását a microkörnyezetbıl (Lioni és mtsai 2007). A sejtkapcsolatok változnak, többnyire csökkennek a daganatos progresszió során, mely fokozhatja a tumorsejt disszeminációt, a progressziót, új sejtkapcsolatok létrehozását és metasztázis kialakulását. Az utóbbi összefügghet a TJ fehérjék expressziójának csökkenésével (Smith és mtsai 2008, Tsukita és mtsai 2008). A TJ „gerincének” tartott claudin család változásai különösen jelentısek a funkció

51

megbomlásában, mely morfológiailag a sejt polaritásának megváltozásával jár (Smith és mtsai 2008). A claudin-1, -7 számos daganatban, legalábbis az invazív szakaszban, csökken (Lioni és mtsai 2007, Oliveira és Morgado-Diaz 2007, Tsukita és mtsai 2008). Számos adat bizonyítja azonban, elsısorban az újabb irodalomban, hogy egyes claudinok expressziója növekedhet is a különbözı daganatokban, a tumor típusától függıen (Kominsky 2006, Gonzalez-Mariscal és mtsai 2007, Tsukita és mtsai 2008). Fokozottan expresszálódhat például a claudin-4 az emlırák egyes típusaiban (Kominsky és mtsai 2003, Tıkés és mtsai 2005), pancreas carcinomában (Borka és mtsai 2007, Michl és mtsai 2001, 2003), prostata carcinomában (Landers és mtsai 2008), ovarium carcinomában (Agarwal és mtsai 2005, Rangel és mtsai 2003), cholangiocarcinomában (Lódi és mtsai 2006, Németh és mtsai 2009, Nishino és mtsai 2008). A claudin-18 expresszió emelkedett intestinalis típusú gyomorrákban (Sanada és mtsai 2006). A claudin-1 expressziója növekedett colorectalis carcinomában, sıt a claudin-1 magi lokalizációja is észlelhetı ezen tumorok metasztázisában (Dhawan et és mtsai 2005, Smith és mtsai 2008). A claudin-1 gén manipulásával az epithelialis-mesenchymalis átalakulás (EMT) fenotípiás strukturális és funkcionális változásait észlelték colon sejtvonalakban (Hewitt és mtsai 2000). A claudin-1 fokozott expressziója primer colorectalis carcinoma sejtekben (SW480) nem fokozta a sejtproliferációt, de növelte az ECM-on át történı inváziót (Smith és mtsai 2008). Felmerülhet, hogy az általunk észlelt claudin-1 expresszió fokozódása a praemalignus cervicalis neoplasiában, ugyancsak hasonló mechanizmust, azaz az ECM-on történı átjutást szolgálja az inváziót megelızı szakaszban. A metasztatikus colorectalis carcinoma sejtvonalban, mely fokozottan expresszálta a claudin-1-t, csökkent az apoptosis és a leválás az edény faláról. Ugyanezt a szerzık in vivo xenograft modellben is igazolták (Smith és mtsai 2008). Mindez azt igazolja, hogy a claudin-1 fontos szerepet tölt be a daganatsejtek proliferációjának szabályozásában. Az irodalom fényében azonban nem szabad elfelejteni, hogy a claudinok és egyéb TJ molekulák dinamikusan változnak a carcinogenesis során és az egyes szakaszokban eltérı funkciót tölthetnek be. Ugyancsak szem elıtt kell tartani, hogy a TJ proteinek erısen sejt- szövet- és szervspecifikusak. A colorectalis carcinomára vonatkozó megfigyeléseket nem lehet feltétlenül vonatkoztatni a cervicalis carcinogenesisre.

52

A claudinok növekedési faktorok (EGF, TGFβ) hatására is reagálnak (Martin és mtsai 2009, Singh and Harris 2004), továbbá aktiválják a promatrix metalloproteináz-2t (MMP-2), mely jelentıs a daganatok inváziójában és a metasztázis képzésben (Miyamori és mtsai 2001). A különbözı sejtadhéziós molekulák és jelátviteli útvonalak, elsısorban az Ecadherin és a Wingless Wnt jelátviteli út, jelentıs szerepet játszik a β-cateninen keresztül a többlépcsıs carcinogenesisben (Sawada és mtsai 2003, Hirohashi és Kanai 2003, Tobioka és mtsai 2004, Lioni és mtsai 2007). A TJ multiprotein komplex azontúl, hogy részt vesz a sejtadhézióban, intracitoplazmatikus plakk proteinje a cytoskeleton proteinekhez kapcsolódik, és részt vesz a jelátvitelben (Gonzalez-Mariscal és mtsai 2003, Ivanov és mtsai 2004). A fokozott claudin-1 expresszió megnövekedett Wnt jelátvitel aktivitással jár, míg a claudin-1 expresszió gátlása ezt megakadályozza (Miwa és mtsai 2000, Smith és mtsai 2008). Ebnet (2008) szerint a TJ nagyszámú és funkcionálisan eltérı proteinek közvetítette bejövı és kimenı szignálok fókuszában van és az összetétele dinamikusan változik. Számos, a TJ-ban identifikált protein a sejt más kompartmenjében is megtalálható, beleértve a magot és „aktívan” utazik ezen kompartmenek és a TJ között (Matter és Balda 2007). Ezen hálózat organizációját olyan proteinek szabályozzák, melyek multiplex protein interakciós doménnel, mint a PDZ domének, rendelkeznek. A ZO-1-nek, mely közvetlenül kapcsolódik a claudinokhoz és az occludinhoz a PDZ doménen át, szerepe van a proliferáció regulációjában (Balda és Matter, 2009). A ZO-1 gátolja a sejtproliferációt a ZONAB citoplazmatikus szekvesztrálásával, mely a sejtciklus regulátor CDK-4-gyel (ciklin dependens kináz-4) interakcióban van és a kontrollálja az egyes sejtciklus regulátorokat, mint a ciklin D1-t és a PCNA-t (Balda és Matter 2009). Összefoglalva azt mondhatjuk, hogy a TJ proteinek, melyek szerteágazó hálózatot alkotva kapcsolódnak a jelátviteli utakhoz, így a sejtproliferáció, differenciáció és génexpresszió szabályozásában is résztvesznek. Általánosságban a TJ elnyomja azon jelátviteli utakat, melyek a sejtproliferációt stimulálják, kedvezve a differenciációnak (Balda és Matter 2009). A daganatos proliferációban azonban a fiziológiás szabályozás alterált, melynek pontos mechanizmusát és funkcionális jelentıségét csak most kezdjük felismerni. Vizsgálatainkban a claudin-1 mutatta a leginkább jellegzetes eltérést a CIN/CIS léziókban, expressziója jelentısen növekedett. Ugyancsak emelkedett volt a claudin-1

53

expresszió az invazív rákban, a normális hámhoz viszonyítva. Azonban csökkenést mutatott a CIN/CIS léziókkal összevetve. A claudin-1 szerepét tanulmányozva az epithelialis-mesenchymalis tranzicióban (EMT) és metasztázisban azt figyelték meg, hogy a claudin-1 és a Smad4 expressziója inverz korrelációt mutat. Ennek alapján felvetették, hogy a Smad4 szerepet játszik a claudin-1 regulációjában (Smith és mtsai 2008). Hasonló következtetésre jutottak más szerzık is, azaz a stabil Smad4 expresszió in vitro és in vivo csökkent xenográft tumorigenitással járt (Muller és mtsai 2002). Oralis laphámrákban a claudin-1 fokozott expressziója megnövekedett invázióval és aggresszív hisztológiai képpel függött össze (Dos Reis és mtsai 2008), és fokozta az oralis laphámsejtek invazíós készségét (Oku és mtsai 2006). A cervicalis carcinogenesisben nem egyértelmő a claudin-1 expresszió emelkedésének magyarázata. A claudin expresszió, mint tumor prognosztikai faktor szerepe is ismert. A claudin-1 a papillaris veserákok többségében expresszálódik, a világossejtes típusban azonban ritkábban. Az utóbbi csoportban a claudin-1 pozitivitás rövidebb túléléssel járt és independens prognosztikai indikátornak bizonyult (Fritzsche és mtsai 2008). A claudin-1 fokozott expressziója növelte a melanoma sejtek motilitását (Leotlela és mtsai 2007). Egyes szerzık szerint a claudin-1 expresszió elvesztése korrelál a hepatocellularis carcinoma malignitásával (Higash és mtsai 2007), csökkenése az emlırák rekurrenciájával (Morohashi és mtsai 2007) és tüdıcarcinomában is fontos regulátornak tekinthetı (Chao és mtsa 2009, Moldvay és mtsai 2007). Egyesek a claudin-1-t invázió/metastasis szuppresszornak tartják, legalábbis tüdırákban (Chao és mtsai

2009). Újabb adatok a claudin-1 és p63 gén kapcsolatára utalnak, a gén

hiányában szenvedı egerekben végzett vizsgálatok alapján. Ez felvetette, hogy a claudin-1 fontos p63 célgén és a normális bırben jelentıs a barrier funkció fenntartásában (Lopardo és mtsai 2008). A claudin-16 (paracellin-1) csökkent expresszióját észlelték emlırákban, mely összefüggött a tumor aggresszivitásával és magasabb mortalitással (Martin és mtsai.2009). A gyomor carcinoma progressziója során a claudin-2 pozitivitása fokozódott (Song és mtsai 2008). Vizsgálataink kezdetén nem találtunk adatot a claudinok és egyéb TJ molekulák expressziójára vonatkozóan az emberi CIN léziókban és a cervicalis laphámrákban. Ezzel szemben, számos adattal rendelkeztünk a citokeratinok expressziójának változására, valamint az Ep-CAM (Litvinov és mtsai 1996) és számos más adhéziós

54

molekula, mint a cadherin és cateninek (de Boer és mtsai 1999, Vessey és mtsai 1995) eltéréseire a CIN léziókban, és invazív laphám carcinomában. A syndecan-1 expressziójának változása ugyancsak ismert volt és fordított összefüggést észleltek az invazív cervicalis carcinoma fokozatával (Numa és mtsai 2002, Rintala és mtsai 1999). A citokeratinok expressziós rajzolata jellemzi a cervicalis carcinomát, és hasznosnak bizonyult a daganat szubtípusainak, fokozatának megállapításában (Carrilho és mtsai 2004). A vizsgálatainkban észlelt claudin expresszió változás a méhnyak praemalignus elváltozásaiban igen jellegzetesnek bizonyult. Legkifejezettebb markernek a claudin-1 és -7, ez a két, phylogenetikailag egymáshoz közelálló fehérje mutatkozott, bár a claudin-2 és -4 emelkedése is észlelhetı volt. A claudin-1 és -7 pozitív reakció élesen elkülönítette a diszplasztikus sejteket a normális cervicalis laphámsejtektıl. A CIN léziók

elırehaladásával

egyre

nagyobb

arányban

érintett

sejtek

elvesztették

polaritásukat, kiterjedtebb réteget foglaltak el a diszplasztikus cervixhámban és fokozottan expresszálták a fenti claudinokat. A claudin-expresszáló sejtek a CIN III/CIS léziókban a hám teljes vastagságára kiterjedtek. A claudin-1-re vonatkozó fenti irodalmi adatok tükrében, a TJ szabályzás igen bonyolult a daganatokban és a TJ-t alkotó fehérjék összetételében bekövetkezı gyors, dinamikus változás a sejtkapcsoló struktúra remodellálását eredményezi. Mindez a sejt polaritásának megváltozásához vezet, mely a diszplasztikus sejtekben jól megfigyelhetı. Adataink azt bizonyítják, hogy ez a „remodellálás” már a daganatos transzformáció kezdeti szakaszában kialakul és maximumát az invázió elıtti szakaszban éri el. Közleményünket követıen jelent meg Lee és mtsai (2005) közleménye, mely a claudin-1 és -7 expressziójával foglalkozik a cervicalis neoplasia progressziója során. Saját megfigyelésünkkel ellentétben, fenti szerzık nem észleltek claudin-1 és -7 expressziót a normális cervix hámban. Ez a megfigyeléssel ellentétben egyéb el nem szarusodó laphámok esetében, így a normális nyelıcsı (Gyırffy és mtsai., 2005), a nyelv (Bello és mtsai., 2008) és orális laphámban (Dos Reis és mtsai., 2008) az általunk a cervix laphámban megfigyelthez hasonló claudin rajzolat látható a suprabasalis és intermedier rétegben, egyértelmő claudin-1 és -7 expresszióval. Lee és mtsai (2005) viszont a saját megfigyelésünkhöz hasonlóan a claudin-1 és -7 expresszió növekedését észlelték a LSIL és HSIL-ben, valamint in situ carcinomában, ami lényegében

55

megegyezett a vizsglataink eredményével. Egyéb claudinok expresszióját nem vizsgálták. Vizsgálatainkban megállapítottuk a claudin-1 és -7 expressziójának növekedését a CIN III/CIS szakaszban is, sıt maximumot, a hámréteg teljes vastagságát érintı expressziót ezen léziókban detektáltunk. Ezt az eltérést jelenleg nem tudjuk egyértelmően magyarázni, bár megfigyelések megerısítették észlelésünket más szervek praemalignus elváltozásaiban, egyéb claudinokra (claudin-3,-4) vonatkozóan. Így Gyırffy és mtsai (2005) Barrett oesophagusban a claudin-2 emelkedését detektálták. A colon praemalignus gyulladásos megbetegedéseiben ugyancsak észlelhetı a claudin-1 és -2 expressziójának növekedése. Ez a szerzık szerint annak a jele, hogy a hám már az IBD-asszociált neoplasia korai szakaszában van (Weber és mtsai 2008).

Figyelembe

véve, hogy a TJ molekulái és maga a komplex nem csupán statikus struktúra, hanem a sejt jelátviteli rendszerének, így a külsı hatásokat közvetítı részének is integráns komponense, számos lehetıség merül fel a claudin expresszió növekedésének magyarázatára a praemalignus elváltozásokban. Lehetséges, hogy a claudin-1 fokozott expressziója, a melanoma sejtekhez hasonlóan, fokozott motilitást jelent (Leotlela és mtsai 2007), mely elısegíti a tumorsejtek migrációját és az invázió megindulását. A claudin-1 az újabb adatok szerint viszont metasztázis szuppresszorként is szerepelhet (Chao és mtsai 2009.), mely a praemalignus állapotban, reverz hatásként csökkentheti a sejt migrációt és inváziót. A claudin-1 csökkenése az invázió megindulásával azonban a gátló hatás alól való felszabadulást is kifejezheti. Furuse és mtsai (2001) a claudin-2 fokozott expressziója során MDCK sejtekben igazolták, hogy a megnövekedett expresszió csökkentette a TJ „szorosságát”. A claudin expresszió fokozódása azonban nem feltétlenül csak a sejtkapcsoló funkcióval, hanem egyéb, még nem tisztázott jelátviteli mechanizmusokal is kapcsolatos lehet, amire számos újabb adat utal, melyek egy részét korábban említettük (Chao és mtsai 2009, González-Mariscal és mtsai 2007, Hewit és mtsai 2006, Kondo és mtsai 2008, Lioni és mtsai 2007, Lopardo és mtsai 2008, Oku és mtsai 2006, Shen és mtsai 2008, Smith és mtsai 2008, Tsukita és mtsai 2008) Számos adat bizonyítja, hogy a fokozott claudin-1 expresszió modulálja számos molekula, így az occludin, ZO-1, TGFα, PGD, TNFα stb funkcióját (Kondo és mtsai

56

2008). Chao és mtsai (2009) adatai azt mutatják, hogy a claudin-1 fokozott expressziója TJ-szerő fonatokat alkot a sejtmembránon és az epithelialis sejtek multicellularis aggregátumát hozza létre, egyidejőleg a motilitás és invazivitás csökkenésével. Lehetséges azonban, figyelembe véve a claudin család 24 tagját emberben, hogy a carcinogenesis egyes szakaszaiban a különbözı claudin típusok regulációja és expressziójának változása egymástól eltérı. Erre utalnak a legújabb dinamikus modell megalkotásához vezetı vizsgálatok (Shen és mtsai 2008). A változás funkcionális következményei, azaz a permeabilitás és elektromos rezisztencia változásának jelentısége még messzemenıen nem tisztázott. A paracellularis influx is változhat a carcinogenesis során, mint azt colon carcinoma sejtekben kimutatták (Soler és mtsai 1999). A megnövekedett permeabilitás lehetıvé teszi számos, eddig a sejt más kompartmentjére ható növekedési faktor hatásának

érvényesülését.

sejttenyészetet

rákkeltı

Kísérletes anyaggal

adatok

utalnak

(forbolészter)

arra,

kezelve,

hogy a

epithelialis

transzepitelialis

paracellularis permeabilitás nı és a sejtek daganatosan transzformálódnak (Soler és mtsai 1999), mely a TJ permeabilitás és carcinogenesis összefüggésére utal. Más adatok igazolják, hogy a humán colorectalis daganatok és a dimetil hidrazinnal indukált colon tumorok TJ-jai kevésbé szorosak, mint a normális vastagbél hámsejtjeinek kapcsolatai. Ez azt a lehetıséget veti fel, hogy a colon epithelium sejtek TJ-jának megnövekedett permeabilitása összefügg a colon daganatok kialakulásával (Soler és mtsai 1999). Az IBD-asszociált TJ alterációk és ezek további észlelése korai colon carcinomában, ugyancsak erısítik az összefüggést a TJ változás és a carcinogenesis között (Weber és mtsai 2008). Egyes adatok szerint az oncogen mutáció növelheti a TJ áteresztıképességét. A RAS mutáció számos TJ molekula expresszióját befolyásolhatja (Mullin és mtsai 2004). A claudin-2-t csökkentnek találták a RAS-t fokozottan expresszáló sejtekben, míg a claudin -1, -4, -7 expressziója növekedett (Mullin és mtsai 2004). A RAF-1 onkogén, az occludin és a ZO-1 foszforilációjának szabályzásával csökkenti a TJ funkcióképességét úgy, hogy a claudin-1 foszforilációjára nem hat. Az occludin és ZO-1 csökkenése a glanduláris epithelium sejtjeinek fenotípiás eltérését eredményezi emberi vastagbélben (Sawada és mtsai 2003). Mindez azt igazolja, hogy az egyes TJ fehérjék változása a különbözı patológiás elváltozásokban egymással összefügg, azonban egymástól

57

eltérıen is regulálódhat. Vizsgálatainkban a claudinok és occludin expressziójának fokozódása egyaránt megfigyelhetı volt CIN-ben. A claudin-1 és -7 expressziója viszont a legmagasabbnak a CIN III/CIS-ben bizonyult, míg a claudin-2, -4 csökkent a CIN I/II-léziókhoz viszonyítva. Mindez azt igazolja, hogy az egyes TJ proteinek változása nem teljesen párhuzamos a cervicalis carcinogenesisben. Az invazív rákban viszont az összes vizsgált TJ protein csökkenése bekövetkezik a CINIII/CIS léziókhoz viszonyítva, bár eltérı mértékben, hasonlóan a syndecan-1-hez. A claudin expresszió viszont az invazív cervixrákban magasabb, mint a normális epitheliumban. Számos kórokozó, így a Rota vírus, a Helicobacter pylori toxinja növelheti az intestinalis sejtek közti paracellularis tér permeabilitását (Sawada és mtsai 2003). Másrészrıl viszont a paracellularis tér kiterjedése fokozhatja egyes kórokozók, elsısorban vírusok, sejtfelszínhez való kötıdését és így valószínőleg a sejtbe való bejutását is. A claudin-1-rıl igazolták, hogy a hepatitis C vírus (HCV) egyik koreceptora (Evans és mtsai 2007), újabban a claudin-6 és -9 koreceptor szerepét is bizonyították (Meertens és mtsai 2008). A syndecan-1 szerepe, mint HPV receptor ismert (Giroglou és mtsai 2001, Shafti-Keramat és mtsai 2003), valamint az is, hogy a CIN léziókban fokozódik, majd az invázióval csökken az expressziója, mint azt magunk is észleltük. Összevetve a sy-1 és a claudin-1, -7 expressziót, míg a lokalizáció a normális cervixhámban megegyezett, a CIN I-II-ben mind növekedett, a CIN III/CISben a fenti két claudin jelentısen nıtt, a sy-1 expressziója csökkent. A claudinok expressziójának növekedése a carcinogenesis korai szakaszában felveti annak a lehetıségét, hogy ez elısegíti közvetve, a paracellularis tér kiterjesztésével, vagy közvetlenül, esetleges viralis koreceptorként a HPV fertızés terjedését. Ugyancsak felmerülhet, hogy egyéb vírusok, melyek a cervicalis carcinogenezisben kofaktorként szerepelnek, így elsısorban a 2. típusú herpes vírus, a TJ protein expresszió módosításával, így a TJ szerkezetések megváltoztatása és a paracellularis tér kiterjesztése révén, elısegíthetik a kórokozó HPV fertızés létrejöttét és progresszióját. Ezen utóbbi lehetıségek még nem tekinthetık bizonyítottnak, további vizsgálatok igazolhatják a felvázolt lehetıséget. A TJ fehérjék expressziója változhat a tumor progressziójával, a korai, kezdeti szakasztól az elırehaladott stádiumokig, és ez a változás prognosztikus értékő lehet, melyet saját vizsgálataink, azaz a vizsgált claudinok és occludin expressziójának

58

változása a cervicalis carcinogenezis különbözı szakaszaiban is támogat. Bello és mtsai (2008) a claudin-1, -4, -5, -7 és occludin expresszióját a nyelv laphámrák prognózisával hozták összefüggésbe. A tüdı adenocarcinoma esetében a claudin-1 korrelál a daganat klinikai kimenetelével (Chao és mtsai., 2009). A claudin-1 expresszió összefügg a colorectalis carcinoma metasztatikus viselkedésével (Dhawan és mtsai 2005). A claudin-1 prognosztikus markernek tekinthetı a vesecarcinomában szenvedı betegek túlélése szempontjából (Fritzsche és mtsai 2008). A claudin -1 csökkenése összefügg a hepatocellularis carcinoma malignitásával (Higashi és mtsai., 2007). Kominsky és mtsai (2003) a claudin-7 expresszió csökkenését összefüggésben találták a ductalis emlırák invazivitásával. A claudin-16 fokozott expressziója esetében viszont az emberi emlırák aggresszivitásának csökkenésérıl számoltak be (Martin és mtsai 2008). Az egyes tumorok elkülönítésében, az altípusok differenciálásában is jelentıs lehet a TJ mintázat ismerete. Moldvay és mtsai (2007) elkülönítették a claudin expresszió alapján a tüdırákok egyes típusait. Borka és mtsai (2007) a pancreas exocrin és endocrin daganatainak jellegzetes képét ismertette, mely differencál diagnosztikus értékő. A claudin-4 magas expressziója elkülöníti az intrahepatikus cholangiocellularis carcinomát a hepatocellularis carcinomától (Lódi és mtsai., 2006). Magunk igazoltuk, hogy a claudin-1 alapján elkülöníthetı az endometrialis carcinoma két formája (Sobel és mtsai., 2006). A jobb prognózisú endometrioid carcinomát alacsony claudin-1 és magas claudin-2 protein expresszió, a rosszabb prognózisú sero-papillaris formát a magas claudin-1 és alacsony claudin-2 expresszió jellemezte.

Számos egyéb claudin

expressziója változik a különbözı tumorokban, mely diagnosztikus értékő is lehet (Soini 2005). A claudinok, kiemelten a claudin -1 és -7 csökkenése a carcinomákban gyakori jelenség, mint erre utaltunk. Az a tény, hogy az egyes daganatokban az egyes claudinok fokozott vagy csökkent expressziója nem azonos, sıt azonos tumor esetében a tumor stádiumától, az invázió fokától függıen is változik, a rendszer igen dinamikus, ugyanakkor az egyes szervekre-, szövetekre és az ezekbıl kiinduló daganatokra messzemenıen jellemzı TJ szerkezettel és dinamikával magyarázható. Saját vizsgálatainkban a claudin-1 expresszió kifejezett növekedését észleltük a CIN/CIS léziókban a normális hámhoz viszonyítva, majd szignifikáns csökkenést az

59

invazív (T1, T2) rákokban, összevetve a CIN III/CIS léziókkal. A carcinomák egyes területein

azonban

kifejezett

heterogenitás

volt

megfigyelhetı.

A

claudin-1

expressziójának a növekedése a CIN/CIS léziókban felveti, hogy a tight junction permeabilitása csökken, bár aberráns szubcelluláris lokalizáció és a tight junction remodellálása ugyancsak diszfunkcióhoz vezethet. A tight junction remodellálás, mely az egyes protein összetevık aránya expressziójának a megváltozásában is megnyilvánul, a dedifferenciáció során is elıfordul, amely szerepet játszhat a sejtpolaritás érett funkciójának és a sejtkapcsolatok elvesztésében, és a rák progressziójában. Felvetıdik, hogy a claudin-1 fokozott expressziója a CIN/CIS léziókban esetleges adaptációs válasz a prezervált barrier funkcióra. Hasonló változások voltak megfigyelhetık, mint a claudin-1-ben a claudin-7-re vonatkozóan más tumorokban is. Egyes közlemények a claudin-7 deregulálását írták le emlırákokban a normális emlıszövethez képest, bár nem volt szignifikáns különbség megfigyelhetı az I, II és III-as fokozatú tumorokban (Kominsky és mtsai, 2003). Inverz korrelációt találtak a claudin-7 expresszió és a hepatocyta növekedési faktor között emlırákokban, ami arra utal, hogy a claudin-7 csökkenése a sejt-sejt kapcsolatok elvesztésével, a promoter szekvencia hipermetilációjával is összefügghet, amely a silencing expresszió fı mechanizmusa (Kominsky és mtsai 2003). Ezen megfigyelések, melyeket az emlırák sejtvonalakon tettek, természetesen nem feltétlenül alkalmazhatók a méhnyakrákra. Fej- nyakrákokban c-DNS mikroarray analízissel a claudin-7 deregulálását találták, a normál hámhoz képest (Al Moustafa és mtsai 2002). Szerzık feltételezték, hogy a claudin-7 szerepet játszik a sejtkohézió elvesztésében a tumor progresszió és disszemináció során. Hasonló jelentısége csökkenésének

cervicalis

invazív

carcinomában,

a

lehet a claudin-7

CIN/CIS

elváltozásokkal

összehasonlítva. A claudin-2 általában erısen expresszálódik az ún. „lyukas”, „áteresztı” hámokban, mint a vese proximális tubulusok (Gonzáles-Mariscal és mtsai., 2003). Érdekes módon a normális cervicalis hám bazális rétegéhez képest a CIN/CIS elvátozásokban expresszió növekedést tudtunk kimutatni, és szignifikáns csökkenést invazív karcinómában. A claudin-2 expressziójának növekedése a praemalignus elváltozásokban

felveti,

hogy

a

tumoros

megváltozott.

60

hám

áteresztıképessége

jelentısen

A claudin-3 és -4 a Clostridium perfingens enterotoxinjaként funkcionál, specifikus sejt lízist eredményezve, melynek terápiás konzekvenciája is lehet, mint erre korábban utaltunk (Michl és mtsai 2003). Kimutatták, hogy ovarium carcinomában a tumorsejtekben a claudin-3 és -4 fokozottan expresszálódott (Hough és mtsai 2000). Tanulmányunkban a claudin-3 negatív volt mind a normális cervicalis hámban, mind a kórosban. Ezzel ellentétben a claudin-4 expresszió emelkedett volt CIN/CIS-ben, míg csökkenést észleltünk ínvazív daganatokban. In vitro vizsgálatokban a claudin-4 fokozott expressziót mutató tumorsejtek kisebb invazivitást mutattak, míg in vivo, csökkent a hasnyálmirigy daganatok tüdı metasztázisainak a száma. Michl és mtsai (2003) tanulmánya értelmében, a hasnyálmirigy daganatokban a claudin-4 inhibitorként hat, mely a sejtek invazivitását és metasztázis képzését befolyásolja. A vizsgálatunkban tapasztalt claudin-4 szignifkáns növekedés CIN/CIS-ben, és a csökkenés invazív carcinomában, alátámasztja azt az elméletet, hogy a claudin-4 csökkenése kapcsolatban lehet a tumor invazivitásával, azonban nem azonos elıjellel. A cervicalis carcinogenesis invazív szakaszában ugyanis csökkent a claudin-4 expressziója. Fenti adatok és saját megfigyeléseink azt erısítik, hogy a méhnyak laphám eredető tumorait az egyes, ismert adhéziós molekulák, mint az Ep-CAM (Litvinov és mtsai., 1996, Winter és mtsai., 2003) mellett a TJ fehérjék, elsısorban a claudinok expressziója illetve azok változása igen jól jellemezi. Az általunk leírt claudin mintázat jellemzi a normális cervicalis laphámot, melyhez hasonló eltérést azóta számos egyéb laphámban is igazoltak az irodalomban. A claudinok karakterisztikus eltérései, nevezetesen, több claudin expressziójának emelkedése észlelhetı a cervix praemalignus elváltozásaiban. Az invázió elindulásával azonban ezen claudinok és az occludin expressziója csökken, melynek szerepe lehet a sejtmotilitás és a tumorsejtek invazív tulajdonságának növekedésében. A leírt TJ expressziós változások nagymértékben jellemzik a cervicalis carcinogenesis kezdeti, invázió elıtti szakaszait és diagnosztikus markerként is felhasználhatók a normális hámtól való elkülönítésben.

61

7. AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI, KÖVETKEZTETÉSEK

7.1. A normális human cervicalis laphám claudin rajzolata és occludin expressziója jellegzetes és állandó. A világon elıször vizsgáltuk több TJ molekula expresszióját normális emberi cervicalis hámban. Megállapítottuk, hogy az egyes TJ molekulák eltérı módon expresszálódnak a hám különbözı rétegeiben: a claudin-1, -4 és -7 a suprabasalis és intermedier rétegben, a claudin-2 és occludin a basalis sejtrétegben detektálható. A claudin-2 kivételével, mely granularis reakciót ad, a többi vizsgált molekula membranózus, lépesmézszerő rajzolatot mutat immunhisztokémiai módszerrel. A claudin-3 nincs jelen a laphámban. A jellegzetes claudin eloszlás jól jellemzi a laphám egyes sejtrétegeit, mutatja a normális hám polaritását és a rétegek sejtjei nem mutattak lényeges eltérést a vizsgált mintákban.

7.2. A cervix praemalignus elváltozásaiban (CIN I-III) és in situ carcinomájában (CIS) megváltozik a claudinok expressziója a normális hámhoz viszonyítva, a vizsgált claudinok expressziója jelentısen növekszik. Vizsgálataink elıször bizonyították, hogy a cervicalis laphám praemalignus lézióiban az egyes claudinok mennyisége nem csökken, hanem változó mértékben fokozódik. Elıször igazoltuk - a várttal ellentétben - a claudin-1, -2, -4, és -7 expresszió szignifikánsan növekedését (p<0,0001) a CIN I/II elváltozásokban, sıt a claudin-1 és 7 a CIN III/CIS léziókban is szignifikánsan magasabbnak bizonyult a normális hámhoz viszonyítva (p<0,0001). A claudin morfológiai megjelenése, azaz membranózus vagy granularis jellege nem változott a normális hámhoz viszonyítva a daganatos progresszió során. A claudint expresszáló sejtek intenzív reakciója élesen elhatárolta a dysplasiaanaplasia jeleit mutató sejteket a környezı, morfológiailag épnek tekinthetı sejtrétegtıl.

7.3. A cervix invazív laphám carcinomájában csökkent a claudinok expressziója a CIN/CIS elváltozásokhozhoz viszonyítva, azonban a csökkent expresszió a T1+T2 stádiumban még mindig meghaladta a normális cervicalis laphámban mért értékeket.

62

A claudin-4 kivételével a normális hámhoz viszonyított claudin expresszió emelkedés magasan szignifikáns volt (p<0,0001). A CIN I-II és invazív carcinomát összehasonlítva, a claudin-2, -4, -7 jelentısen csökkent (p<0,0001), a claudin-1 változatlan

expressziót

mutatott.

A

CIN

III/CIS

és

invazív

carcinomát

összehasonlítva a legkifejezettebb csökkenést a claudin-1-ben észleltük (p<0,0001), ezt követte a claudin-2 (p<0,0006), azonban a claudin-4 és -7 eltérése nem volt szignifikáns, bár a tendencia megfigyelhetı volt.

7.4. Az occludin a normális hámban a basalis sejtrétegben volt jelen, a CIN/CIS léziókban fokozódott az expressziója a normális hámhoz viszonyítva. Az occludin expressziója a normális hámban megegyezett a claudin-2 lokalizációjával, mindkét protein a basalis sejtekben volt megfigyelhetı. A pozitív sejtek számának növekedése CIN-ben mindkét TJ protein esetében megfigyelhetı volt, azonban az occludin festés intenzitása jelentısen csökkent CIN-ben és fokális jellegő volt CIS-ben.

7.5. A Syndecan-1 reakció a normális cervicalis hámban intenzív membranózus festıdést mutatott a parabasalis és intermedier rétegekben. A Syndecan-1 reakció intenzitása nem változott a CIN I-II léziókban és kiterjedt a hám felsıbb rétegeire. A reakció intenzitása azonban csökkent és gócossá vált a CISben. A Syndecan-1 reakció hasonló lokalizációt mutatott a claudin-1, -4, és -7-hez a normális hámban. A reakció kiterjedése, azaz a pozitívan reagáló sejtek számának növekedése ugyancsak megfigyelhetı volt, a fenti claudinokhoz hasonlóan.

7.6. Összefoglalóan megállapítható, hogy az összes, a normális cervicalis laphámban is jelenlévı vizsgált claudin, occludin és a syndecan-1 expresszió jelentısen növekedett a praemalignus cervicalis és a CIS-elváltozásokban a normális hámhoz viszonyítva. A fenti proteinek expressziója viszont jelentısen csökkent az invazív carcinomában a CIN- léziókhoz viszonyítva, bár meghaladta a normális hámban mért értékeket.

63

KÖVETKEZTETÉSEK Elsıként igazoltuk, hogy a cervicalis carcinogenesis folyamatában számos TJ protein expressziója jelentısen megváltozik. A várttal ellentétben a praemalignus elváltozásokban fokozódott az egyes claudinok expressziója. Ezen megfigyelés arra utal, hogy a TJ módosulása, mely ismert a carcinogenesis során, nem feltétlenül az egyes TJ-t alkotó proteinek elvesztésével jár, ellenkezıleg, átmenetileg fokozott expresszió mutatható ki, legalábbis a korábbi szakaszokban. Számos adat igazolta vizsgálataink elkezdését követıen az irodalomban, hogy ez más szervek laphám eredető praemalignus elváltozásaiban is hasonlóan történik. A nagyobb mennyiségben kimutatható TJ protein jelenléte, mely a praemalignus léziókban észlelhetı, nem feltétlenül jelenti azonban a TJ funkció „erısödését”, azaz a sejtkapcsolatok szorosabbá válását, hanem ellenkezıleg, a barrier és permeabilitási funkció károsodását jelezheti, mely kedvezhet a daganatsejtek disszociációjának, a sejtkapcsolatok lazulásának és a növekedési faktorok hatásának fokozott érvényesülését teszi lehetıvé. A vizsgált claudinok expressziójának jelentıs növekedése a daganatelıtti elváltozásokban a sejtkapcsolatok alakulását új megvilágításba helyezi. A fenti eltérések arra utalnak, hogy a sejtkapcsolatok TJ-fehérjék által történı szabályozása a protein összetevık igen bonyolult kölcsönhatásának az eredménye, mely nem feltétlenül követi az elvárt mennyiségi „csökkenés” lehetıségét. A TJ bonyolultan felépített molekuláris szerkezetében az egyedi összetevık arányának megváltozása funkcionális zavart eredményezhet. A leírt TJ fehérjék expressziójának a fokozódása, elsısorban a claudin-1 és -7 esetében, a „rezisztens” típusú laphám praemalignus szakaszait jellemzı elváltozás. Mindez azt a reményt nyújthatja, hogy a fokozott claudin expresszió

kiegészítı

markerként

jelezheti

a

korai

eltéréseket

a

cervicalis

carcinogenesisben. Diagnosztikus felhasználása mind az immunhisztokémiai, mind az immuncitokémiai vizsgálatok során felmerülhet. A T1+T2 laphámrákokban a TJ fehérjék expressziójának jelentıs csökkenése volt megfigyelhetı a praemalignus elváltozásokhoz viszonyítva, azonban magasabb volt a normális hámban detektált értékekhez viszonyítva. Ezen

64

adatainkat munkánk megjelenése óta számosan igazolták az irodalomban, hivatkozva megfigyeléseinkre. Meglepı, hogy a TJ proteinek még jelentıs mennyiségben kimutathatók az invázió során és fokozottabban expresszálódhatnak az invazív daganatban, mint a normális hámban. Ezen adatok a sejtkapcsolatok szabályzása igen bonyolult folyamátának fontosságát hangsúlyozzák a carcinogenesis folyamatában és igazolják azt, hogy az u.n. TJ fehérjéknek a sejtkapcsoló szerepük mellett a jelátviteli mechanizmusokban is jelentıs szerepük van.

65

8. ÖSSZEFOGLALÁS A carcinogenesisben a sejtadhézió változása fontos mechanizmus. Az emberben 24 tagú claudin család, a tight junction (TJ) sejtkapcsoló struktúra gerincét képezi és résztvesz a sejt polaritás, a paracellularis diffúzió szabályozásában és az intracellularis jelátvitelben. Az egyes sejteket és szöveteket meghatározott claudin mintázat jellemzi, melynek összetétele, expressziójának szintje a carcinogenesis során változhat. Vizsgálataink során claudin-1,-2,-3,-4 és -7 ellenes antitestekkel, immunhisztokémiai módszerrel és szemikvantitatív analízissel 105 emberi cervixbıl származó szövetmintát analizáltunk, melyek diagnózisa: normális (n=20), cervicalis intraepithelialis neoplasia I/II (CIN I/II, n=27), CIN III/ cervicalis in situ carcinoma (CIS, n=25) és invazív laphámrák (n=33) volt. A vizsgálatok igazolták, hogy a claudin-1,-2,-4 és -7 expresszálódik a normális humán cervicalis laphámban, míg a claudin-3 nem. CIN I/II és CIN III/CIS léziókban szignifikánsan megnı a fenti claudinok, valamint az occludin expressziója a normális hámhoz viszonyítva. Invazív laphámrákban csökken a vizsgált claudinok és az occludin expressziója, azonban meghaladja a normális laphámban mért értékeket. Vizsgálatainkkal a világon elsıként igazoltuk, hogy a cervicalis carcinogenesis folyamatában

számos TJ

fehérje

expressziója

megváltozik.

A praemalignus

elváltozásokban fokozódik a claudinok expressziója, míg az invázió során csökken, azonban meghaladja a normális hám expresszióját. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a TJ módosulása a cervix daganataiban nem feltétlenül az egyes alkotó proteinek elvesztésével jár, hanem az egyes alkotóelemek összetételének megváltozásával. A leírt claudin expressziós változások, különösen a claudin-1 és -7 esetében, diagnosztikus értékőek.

66

9. IRODALOMJEGYZÉK Agarwal R, D’Souza T, Morin PJ. (2005) Claudin-3 and claudin-4 expression in ovarian epithelial cells enhances invasion and is associated with increased matrix metalloproteinase-2 activity. Cancer Res 65: 7378-7385. Bahnassy AA, Zekri ARN, Saleh M, Lotayef M, Moneir M, Shawki O. (2007) The possible role of cell cycle regulators in multistep process of HPV-associated cervical carcinoma. BMC Clinical Pathology 7: 4. Balda MS, Matter K (2009) Tight junctions and regulation of gene expression. Biochim Biophysd Acta doi:10.1016/j.bbamem.2008.11.024 Bello IO, Vilen ST, Niinimaa A, Kantola S, Soini Y, Salo T. (2008) Expression of claudins 1, 4, 5 and 7 and occludin, and relationship with prognosis in squamous cell carcinoma of the tongue. Hum Pathol 39: 1212-1220. Borka K, Kaliszky P, Szabó E, Lotz G, Kupcsulik P, Schaff Zs, Kiss A. (2007) Claudin expression in pancreatic endocrine tumors as compared with ductal adenocarcinomas. Virch Arch, 450: 549-557. Carrilho C, Alberto M, Buane L, David L. (2004) Keratins 8, 10, 13, and 17 are useful markers in the diagnosis of human cervix carcinomas. Hum Pathol 35: 546-551. Castle PE. (2004) Beyond human papillomavirus: the cervix, exogenous secondary factors, and the development of cervical precancer and cancer. J Low Genital Tract Dis 8: 224-230. Chao YC, Pan SH, Yang SC, Yu SL, Che TF, Lin CW, Tsai MS, Chang GC, Wu CH, Wu YY, Lee YC, Hong TM, Yang PC. (2009) Claudin-1 is a metastasis suppressor and correlates with clinical outcome in lung adenocarcinoma. Am J Respir Crit Care Med 179: 123-133. Chiba H, Gotoh T, Kojima T, Satohisa S, Kikuchi K, Osanai M, Sawada N. (2003) Hepatocyte nuclear factor (HNF)-4α triggers formation of functional tight junctions and establishment of polarized epithelial morphology in F9 embryonal carcinoma cells. Exp Cell Res 286: 288-297.

67

De Boer CJ, van Dorst E, van Krieken H, Jansen-van Rhijn CM, Warnaar SO, Fleuren GJ, Litvinov SV. (1999) Changing roles of cadherins and catenins during progression of squamous intraepithelial lesions in the uterine cervix. Am J Pathol 155: 505-515. Dhawan P, Singh AB, Deane NG, No Y, Shiou SR, Schmidt C, Neff J, Washington MK, Beauchamp RD. (2005) Claudin-1 regulates cellular transformation and metastatic behavior in colon cancer. J Clin Invest 115: 1765-1776. Dos Reis PP, Bharadwaj RR, Machado J, MacMillan C, Pintilie M, Sukhai MA, Perez-Ordonez B, Gullane P, Irish J, Kamel-Reid S. (2008) Claudin 1 overexpression increases invasion and is associated with aggressive histological features in oral squamous cell carcinoma. Cancer 113: 3169-3180. Ebnet K. (2008) Organization of multiprotein complexes at cell-cell junctions. Histochem Cell Biol 130: 1-20. Evans MJ, von Hahn T, Tscherne DM, Syder AJ, Panis M, Wolk B, Hatziioannou T, McKeating JA, Bieniasz PD, Rice CM. (2007) Claudin-1 is a hepatitis C virus coreceptor required for a late step in entry. Nature 446: 801-805. Förster C. (2008) Tight junctions and the modulation of barrier function in disease. Histochem Cell Biol 130: 55-70. Frappart L, Fontanière B, Lucas E, Sankaranarayanan R. Histopathology and Cytopathology of the Uterine Cervix. Digital Atlas, IARC Press, Lyon, 2004. Frazer IH. (2004) Prevention of cervical cancer through papillomavirus vaccination. Nature Rev Immunol 4: 46-54. Fritzsche FR, Oelrich B, Johannsen M, Kristiansen I, Moch H, Jung K, Kristiansen G. (2008) Claudin-1 protein expression is a prognostic marker of patient survival in renal cell carcinomas. Clin Cancer Res 14: 7035-7042. Fujita K, Katahira J, Horiguchi Y, Sonoda N, Furuse M, Tsukita S. (2000) Clostridium perfringens enterotoxin binds to the second extracellular loop of claudin-3, a tight junction integral membrane protein. FEBS Lett 476: 258-261.

68

Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S. (1993) Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol 123: 17771788. Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto K, Tsukita S. (1998) Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J Cell Biol 141: 1539-1550. Furuse M, Sasaki H, Tsukita S. (1999) Manner of interaction of heterogeneous claudin species within and between tight junction strands. J Cell Biol 147: 891-903. Ganesan R, Rollason TP. Pathology of neoplastic squamous lesions. In: Jordan JA, Singer A. et al (eds.), The Cervix. Blackwell Publishing Ltd, Massachusetts, Second edition, 2006: 301-316. Giroglou T, Florin L, Schäfer F, Streeck RE, Sapp M. (2001) Human papillomavirus infection requires cell surface heparan sulfate. J Virol 75: 1565-1570. González-Mariscal L, Betanzos A, Nava P, Jaramillo BE. (2003) Tight junction proteins. Prog Biophys Mol Biol 81: 1-44. González-Mariscal L, Lechuga S, Garay E. (2007) Role of tight junctions in cell proliferation and cancer. Prog Histochem Cytochem 42: 1-57. Goodman A, Wilbur DC. (2003) Case records of the Massachusetts General Hospital. Weekly clinicopathological exercises. Case 32-2003. A 37-year-old woman with atypical squamous cells on a Papanicolaou smear. N Engl J Med 349: 1555-1564 Gorodeski GI. (2007a) Estrogen modulation of epithelial permeability in cervicalvaginal cells of premenopausal and postmenopausal women. Menopause 14: 10121019. Gorodeski GI. (2007b) Estrogen decrease in tight junctional resistance involves matrix-metalloproteinase-7-mediated remodeling of occludin. Endocrinology 148: 218231. Gumbiner BM. (1996) Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell 84: 345-357.

69

Gyırffy H, Holczbauer Á, Nagy P, Szabó Zs, Kupcsulik P, Páska Cs, Papp J, Schaff Zs, Kiss A. (2005) Claudin expression in Barrett’s esophagus and adenocarcinoma. Virch Arch 447: 961-968. Hewitt KJ, Agarwal R, Morin PJ. (2006) The claudin gene family: expression in normal and neoplastic tissues. BMC Cancer 6: 186. Hewitt RE, McMarlin A, Kleiner D, Wersto R, Martin P, Tsokos M, Stamp GW, Stetler-Stevenson WG. (2000) Validation of a model of colon cancer progression. J Pathol 192: 446-454. Higashi Y, Suzuki S, Sakaguchi T, Nakamura T, Baba S, Reinecker HC, Nakamura S, Konno H. (2007) Loss of claudin-1 expression correlates with malignancy of hepatocellular carcinoma. J Surg Res 139: 68-76. Hirohashi S, Kanai Y. (2003) Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci 94: 575-581. Hough CD, Shermann Baust CA, Pizer ES, Montz FJ, Im DD, Rosenshein NB, Cho KR, Riggins GJ, Morin PJ. (2000) Large-scale serial analysis of gene expression reveals genes differentially expressed in ovarian cancer. Cancer Res 60: 6281-6287. Ikenouchi J, Furuse M, Furuse K, Sasaki H, Tsukita Sa, Tsukita Sh. (2005) Tricellulin constitutes a novel barrier at tricellular contacts of epithelial cells. J Cell Biol 171: 939-945. Ikenouchi J, Sasaki H, Tsukita S, Furuse M, Tsukita S. (2008) Loss of occludin affects tricellular localization of tricellulin. Mol Biol Cell 19: 4687-4693. Inki P, Stenback F, Grenman S, Jalkanen M. (1994) Immunohistochemical localization of syndecan in normal and pathological human uterine cervix. J Pathol 172: 349-355. Itoh M, Furuse M, Morita K, Kubota K, Saitou M, Tsukita S. (1999) Direct binding of three tight junction-associated MAGUKs, ZO-1, ZO-2, and ZO-3, with the COOH termini of claudins. J Cell Biol 147: 1351-1363.

70

Ivanov AI, Nusrat A, Parkos CA. (2004) Endocytosis of epithelial apical junctional proteins by a clathrin-mediated pathway into a unique storage compartment. Mol Biol Cell 15: 176-188. Katahira J, Inoue N, Horiguchi Y, Matsuda M, Sugimoto N. (1997) Molecular cloning and functional characterization of the receptor for Clostridium perfringens enterotoxin. J Cell Biol 136: 1239-1247. Katoh M, Katoh M. (2003) CLDN23 gene, frequently down-regulated in intestinaltype gastric cancer, is a novel member of claudin gene family. Int J Mol Med 11: 683689. Kálmán E, Pajor L. A nıi nemi szervek patológiája. In: Kopper L, Schaff Zs (szerk.), Patológia 2. Medicina, Budapest, Második, javított kiadás, 2001: 1039-1115. Kominsky SL, Argani P, Korz D, Evron E, Raman V, Garrett E, Rein A, Sauter G, Kallioniemi OP, Sukumar S. (2003) Loss of the tight junction protein claudin-7 correlates with histological grade in both ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma of the breast. Oncogene 22: 2021-2033. Kominsky SL. (2006) Claudins: emerging targets for cancer therapy. Expert Rev Mol Med 8: 1-11. Kondo J, Sato F, Kusumi T, Liu Y, Motonari O, Sato T, Kijima H. (2008) Claudin-1 expression is induced by tumor necrosis factor-α in human pancreatic cancer cells. Int J Mol Med 22: 645-649. Kovács J. Sejtkapcsoló molekulák és struktúrák. In: Sass M, Zboray G (szerk.), Sejttan. Eötvös Loránd Tudományegyetem Eötvös Kiadó, Budapest, 1999: 64-65. Kramer F, White K, Kubbies M, Swisshelm K, Weber BH. (2000) Genomic organisation of claudin 1 and its assessment in hereditary and sporadic breast cancer. Hum Genet 107: 249-256. Landers KA, Samaratunga H, Teng L, Buck M, Burger MJ, Scells B, Lavin MF, Gardiner RA. (2008) Identification of claudin-4 as a marker highly overexpressed in both primary and metastatic prostate cancer. Br J Cancer 99: 491-501.

71

Lee JW, Lee SJ, Seo J, Song SY, Ahn G, Park CS, Lee JH, Kim BG, Bae DS. (2005) Increased expressions of claudin-1 and claudin-7 during the progression of cervical neoplasia. Gynecol Oncol 97: 53-59. Leotlela PD, Wade MS, Duray PH, Rhode MJ, Brown HF, Rosenthal DT, Dissanayake SK, Earley R, Indig FE, Nickoloff BJ, Taub DD, Kallioniemi OP, Meltzer P, Morin PJ, Weeraratna AT. (2007) Claudin-1 overexpression in melanoma is regulated by PKC and contributes to melanoma cell motility. Oncogene 26: 3846-3856. Lioni M, Brafford P, Andl C, Rustgi A, El-Deiry W, Herlyn M, Smalley KSM. (2007) Dysregulation of claudin-7 leads to loss of E-cadherin expression and the increased invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells. Am J Pathol 170: 709721. Litvinov SV, van Driel W, van Rhijn CM, Bakker HA, van Krieken H, Fleuren GJ, Warnaar SO. (1996) Expression of Ep-CAM in cervical squamous epithelia correlates with an increased proliferation and the disappearance of markers for terminal differentiation. Am J Pathol 148: 865-875. Lódi Cs, Szabó E, Holczbauer Á, Batmunkh E, Szijártó A, Kupcsulik P, Kovalszky I, Paku S, Illyés Gy, Kiss A, Schaff Zs. (2006) Claudin-4 differentiates biliary tract cancers from hepatocellular carcinomas. Mod Pathol 19: 460-469. Lopardo T, Lo Iacono N, Marinari B, Giustizieri ML, Cyr DG, Merlo G, Crosti F, Costanzo A, Guerrini L. (2008) Claudin-1 is a p63 target gene with a crucial role in epithelial development. PloS ONE 3: e2715. Martin TA, Harrison GM, Watkins G, Jiang WG. (2008) Claudin-16 reduces the aggressive behaviour of human breast cancer cells. J Cell Biochem 105: 41-52. Matsuda M, Kubo A, Furuse M, Tsukita S. (2004) A peculiar internalization of claudins, tight junction-specific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells. J Cell Sci 117: 1247-1257. Matter K, Balda MS. (2003) Signalling to and from tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 225-236.

72

McClane BA, McDonel JL. (1979) The effects of Clostridium perfringens enterotoxin on morphology, viability, and macromolecular synthesis in Vero cells. J Cell Physiol 99: 191-200. Meertens L, Bertaux C, Cukierman L, Cormier E, Lavillette D, Cosset FL, Dragic T. (2008) The tight junction proteins claudin-1, -6, and -9 are entry cofactors for hepatitis C virus. J Virol 82: 3555-3560. Michl P, Buchholz M, Rolke M, Kunsch S, Löhr M, McClane B, Tsukita S, Leder G, Adler G, Gress TM. (2001) Claudin-4: A new target for pancreatic cancer treatment using Clostridium perfringens enterotoxin. Gastroenterology 121: 678-684. Michl P, Barth C, Buchholz M, Lerch MM, Rolke M, Holzmann KH, Menke A, Fensterer H, Giehl K, Lohr M, Leder G, Iwamura T, Adler G, Gress TM. (2003) Claudin-4 expression decreases invasiveness and metastatic potential of pancreatic cancer. Cancer Res 63: 6265-6271. Mitic LL, Anderson JM. (1998) Molecular architecture of tight junctions. Annu Rev Physiol 60: 121-142. Miwa N, Furuse M, Tsukita S, Niikawa N, Nakamura Y, Furukawa Y. (2000) Involvement of claudin-1 in the beta-catenin/Tcf signaling pathway and its frequent upregulation in human colorectal cancers. Oncol Res 12: 469-476. Miyamori H, Takino T, Kobayashi Y, Tokai H, Itoh Y, Seiki M, Sato H. (2001) Claudin promotes activation of pro-matrix metalloproteinase-2 mediated by membranetype matrix metalloproteinases. J Biol Chem 276: 28204-28211. Moldvay J, Jackel M, Páska Cs, Soltész I, Schaff Zs, Kiss A. (2007) Distinct claudin expression profile in histologic subtypes of lung cancer. Lung Cancer 57: 159-167. Morin PJ. (2005) Claudin proteins in human cancer: promising new targets for diagnosis and therapy. Cancer Res 65: 9603-9606. Morita K, Furuse M, Fujimoto K, Tsukita S. (1999) Claudin multigene family encoding four-transmembrane domain protein components of tight junction strands. Proc Natl Acad Sci USA 96: 511-516.

73

Morohashi S, Kusumi T, Sato F, Odagiri H, Chiba H, Yoshihara S, Hakamada K, Sasaki M, Kijima H. (2007) Decreased expression of claudin-1 correlates with recurrence status in breast cancer. Int J Mol Med 20: 139-143. Mould TAJ, Chow C. The vascular, neural and lymphatic anatomy of the cervix. In: Jordan JA, Singer A et al (eds.), The Cervix. Blackwell Publishing Ltd, Massachusetts, Second edition, 2006: 38-48. Muller N, Reinacher-Schick A, Baldus S, van Hengel J, Berx G, Baar A, van Roy F, Schmiegel W, Schwarte-Waldhoff I. (2002) Smad4 induces the tumor suppressor Ecadherin and P-cadherin in colon carcinoma cells. Oncogene 21: 6049-6058. Mullin JM, Leatherman JM, Valenzano MC, Huerta ER, Verrechio J, Smith DM, Snetselaar K, Liu M, Francis MK, Sell C. (2004) Ras mutation impairs epithelial barrier function to a wide range of nonelectrolytes. Mol Biol Cell 16: 5538-5550. Murphy N, Ring M, Heffron CCBB, King B, Killalea AG, Hughes C, Martin CM, McGuinness E, Sheils O, O’Leary JJ. (2005) p16INK4A, CDC6, and MCM5: predictive biomarkers in cervical preinvasive neoplasia and cervical cancer. J Clin Pathol 58: 525534. Nakanishi K, Yoshioka N, Oka K, Hakura A. (1999) Reduction of syndecan-1 mRNA in cervical-carcinoma cells is involved with the 3’ untranslated region. Int J Cancer 80: 527-532. Németh Zs, Szász AM, Somorácz Á, Tátrai P, Németh J, Gyırffy H, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff Zs. (2009) Zonula occludens-1, occludin, and E-cadherin protein expression in biliary tract cancers. Pathol Oncol Res, in press Nishino R, Honda M, Yamashita T, Takatori H, Minato H, Zen Y, Sasaki M, Takamura H, Horimoto K, Ohta T, Nakanuma Y, Kaneko S. (2008) Identification of novel candidate tumour marker genes for intrahepatic cholangiocarcinoma. J Hepatol 49: 207-216. Numa F, Hirabayashi K, Kawasaki K, Sakaguchi Y, Sugino N, Suehiro Y, Suminami Y, Hirakawa H, Umayahara K, Nawata S, Ogata H, Kato H. (2002) Syndecan-1 expression in cancer of the uterine cervix: association with lymph node metastasis. Int J Oncol 20: 39-43.

74

Oku N, Sasabe E, Ueta E, Yamamoto T, Osaki T. (2006) Tight junction protein claudin-1 enhances the invasive activity of oral squamous cell carcinoma cells by promoting cleavage of laminin-5 gamma2 chain via matrix metalloproteinase (MMP)-2 and membrane-type MMP-1. Cancer Res 66: 5251-5257. O’Leary JJ, Astbury K, Prendiville W. (2006) Tumour markers in cervical cancer – I. In: The Cervix. Jordan JA, Singer A. et al (eds.), Blackwell Publishing Ltd, Massachusetts, Second edition, pp. 399-413. Oliveira SS, Morgado-Diaz JA. (2007) Claudins: multifunctional players in epithelial tight junctions and their role in cancer. Cell Mol Life Sci 64: 17-28. Pan XY, Li X, Weng ZP, Wang B. (2008) Altered expression of claudin-3 and claudin-4 in ectopic endometrium of women with endometriosis. Fertil Steril 2008 April 1, E-pub ahead of print Papp Z. (2008) A szülészet-nıgyógyászat tankönyve. Semmelweis Kiadó, Budapest, Második, átdolgozott, bıvített kiadás. Papp Z, Csapó Zs, Mayer Á, Hupuczi P. (2006) Wertheim-mőtét: 501 operált méhnyakrákos beteg ötéves túlélési adatai. Orv Hetil 147: 537-545. Parkin DM. (2001) Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol 2: 533543. Páska Cs, Bögi K, Szilák L, Tıkés AM, Szabó E, Sziller I, Rigó J, Sobel G, Szabó I, Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Zs. (2004) Effect of formalin, acetone and RNAlater fixatives on tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffin-embedded tissue. Diagn Mol Pathol 13: 234-240. Rahner C, Mitic LL, Anderson JM. (2001) Heterogeneity in expression and subcellular localization of claudins 2, 3, 4, and 5 in the rat liver, pancreas, and gut. Gastroenterology 120: 411-422. Rangel LB, Agarwal R, D’Souza T, Pizer ES, Alo PL, Lancaster WD, Gregoire L, Schwartz DR, Cho KR, Morin PJ. (2003) Tight junction proteins claudin-3 and claudin4 are frequently overexpressed in ovarian cancer but not in ovarian cystadenomas. Clin Cancer Res 9: 2567-2575.

75

Riethdorf S, Neffen EF, Cviko A, Löning T, Crum CP, Riethdorf L. (2004) p16INK4A expression as biomarker for HPV 16-related vulvar neoplasias. Hum Pathol 35: 14771483. Rintala J, Inki P, Klemi P, Jalkanen M, Grénman S. (1999) Association of syndecan-1 with tumor grade and histology in primary invasive cervical carcinoma. Gynecol Oncol 75: 372-378. Rubin P, Hansen JT. TNM Staging Atlas, Chapter 48: Uterine Cervix, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2008: 408-416. Sanada Y, Oue N, Mitani Y, Yoshida K, Nakayama H, Yasui W. (2006) Downregulation of the claudin-18 gene, identified through serial analysis of gene expression data analysis, in gastric cancer with an intestinal phenotype. J Pathol 208: 633-642. Sawada N, Murata, M, Kikuchi K, Osanai M, Tobioka H, Kojima T, Chiba H. (2003) Tight junctions and human diseases. Med Electron Microsc 36: 147-156. Schneeberger EE, Lynch RD. (2004) The tight junction: a multifunctional complex. Am J Physiol Cell Physiol 286: C1213-C1228. Sebestyén A, Kovalszky I, Mihalik R, Gallai M, Bocsi J, Lászlo E, Benedek S, Sréter L, Kopper L. (1997) Expression of syndecan-1 in human B cell chronic lymphocytic leukaemia. Eur J Cancer 33: 2273-2277. Sebestyén A, Gallai M, Knittel T, Ambrust T, Ramadori G, Kovalszky I. (2000) Cytokine regulation of syndecan expression in cells of liver origin. Cytokine 12: 15571560. Shafti-Keramat S, Handisurya A, Kriehuber E, Meneguzzi G, Slupetzky K, Kirnbauer R. (2003) Different heparan sulfate proteoglycans serve as cellular receptors for human papillomaviruses. J Virol 77: 13125-13135. Shen L, Weber CR, Turner JR. (2008) The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. J Cell Biol 181: 683-695. Shiohara S, Shiozawa T, Miyamoto T, Feng Y-Z, Kashima H, Kurai M, Suzuki A, Konishi I. (2005) Expression of cyclins, p53, and Ki-67 in cervical squamous cell

76

carcinomas: overexpression of cyclin A is a poor prognostic factor in stage Ib and II disease. Virch Arch 446: 626-633. Simon DB, Lu Y, Choate KA, Velazquez H, Al-Sabban E, Praga M, Casari G, Bettinelli A, Colussi G, Rodriguez-Soriano J, McCredie D, Milford D, Sanjad S, Lifton RP. (1999) Paracellin-1, a renal tight junction protein required for paracellular Mg2+ resorption. Science 285: 103-106. Singer A, Jordan JA. The functional anatomy of the cervix, the cervical epithelium and the stroma. In: Jordan JA, Singer A. et al (eds.), The Cervix. Blackwell Publishing Ltd, Massachusetts, Second edition, 13-37. Singh AB, Harris RC. (2004) Epidermal growth factor receptor activation differentially regulates claudin expression and enhances transepithelial resistance in Madin-Darby canine kidney cells. J Biol Chem 279: 3543-3552. Smedley JG, Uzal FA, McClane BA. (2007) Identification of a prepore largecomplex stage in the mechanism of action of Clostridium perfringens enterotoxin. Infect Immun 75: 2381-2390. Smith J.J, Deane NG, Dhawan P, Beauchamp RD. (2008) Regulation of metastasis in colorectal adenocarcinoma: A collision between development and tumor biology. Surgery 144: 353-366. Sobel G, Páska Cs, Szabó I, Kiss A, Kádár A, Schaff Zs. (2005) Increased expression of claudins in cervical squamous intraepithelial neoplasia and invasive carcinoma. Human Pathol 36: 162-169. Sobel G, Szabó I, Páska Cs., Kiss A., Kovalszky I., Schaff Zs. (2005) Changes of cell adhesion and extracellular matrix (ECM) components in cervical intraepithelial neoplasias. Pathol Oncol Res 11: 26-31. Sobel G, Németh J, Kiss A, Lotz G, Szabó I, Udvarhelyi N, Schaff Zs, Páska Cs (2006) Claudin 1 differentiates endometrioid and serous papillary endometrial adenocarcinoma. Gynecol Oncol 103: 591-598. Soini Y. (2005) Expression of claudins 1, 2, 3, 4, 5 and 7 in various types of tumours. Histopathology 46: 551-560.

77

Soler AP, Miller RD, Laughlin KV, Carp NZ, Klurfeld DM, Mullin JM. (1999) Increased tight junctional permeability associated with the development of colon cancer. Carcinogenesis 20: 1425-1431. Solomon D, Davey D, Kurman R, Moriarty A, O’Connor D, Prey M, Raab S, Sherman M, Wilbur D, Wright T, Young N. For the Forum Group Members and the Bethesda 2001 Workshop (2002) The 2001 Bethesda System.Terminology for Reporting Results of Cervical Cytology JAMA 287: 2114-2119. Song X, Li X, Tang Y, Chen H, Wong B, Wang J, Chen M. (2008) Expression of claudin-2 in the multistage process of gastric carcinogenesis. Histol Histopathol 23: 673-682. Swisshelm K, Macek R, Kubbies M. (2005) Role of claudins in tumorigenesis. Adv Drug Deliv Rev 57: 919-928. Tavassoli FA, Devilee P. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs. Chapter 5: Tumours of the Uterine Cervix. IARC Press, Lyon, 2003: 259-289. Tobioka H, Isomura H, Kokai Y, Tokunaga Y, Yamaguchi J, Sawada N. (2004) Occludin expression decreases with the progression of human endometrial carcinoma. Hum Pathol 35: 159-164. Tıkés AM, Kulka J, Paku S, Máthé M, Páska Cs, Lódi Cs, Kiss A, Schaff Zs. (2005a)

The expression of five different claudins in invasive breast carcinomas:

comparison of pT1pN1 and pT1pN0 tumours. Pathol Res Pract 201: 537-544. Tıkés AM, Kulka J, Paku S, Szik Á, Páska Cs, Kaposi Novák P, Szilák L, Kiss A, Bögi K, Schaff Zs. (2005b) Claudin -1, -3 and -4 proteins and mRNA expression in benign and malignant breast lesions: a research study. Breast Cancer Res 7: R296-R305. Tsukita S, Furuse M. (1999) Occludin and claudins in tight-junction strands: leading or supporting players? Trends Cell Biol 9: 268-273. Tsukita S, Furuse M. (2000) Pores in the wall: claudins constitute tight junction strands containing aqueous pores. J Cell Biol 149: 13-16. Tsukita S, Furuse M, Itoh M. (2001) Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 285-293.

78

Tsukita S, Yamazaki Y, Katsuno T, Tamura A, Tsukita S. (2008) Tight junctionbased epithelial microenvironment and cell proliferation. Oncogene 27: 6930-6938. Van Itallie CM, Anderson JM. (2004) The molecular physiology of tight junction pores. Physiology (Bethesda) 19: 331-338. Vessey CJ, Wilding J, Folarin N, Hirano S, Takeichi M, Soutter P, Stamp GW, Pignatelli M. (1995) Altered expression and function of E-cadherin in cervical intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma. J Pathol 176: 151-159. Weber CR, Nalle SC, Tretiakova M, Rubin DT, Turner JR. (2008) Claudin-1 and claudin-2 expression is elevated in inflammatory bowel disease and may contribute to early neoplastic transformation. Lab Invest 88: 1110-1120. Wiksten JP, Lundin J, Nordling S, Lundin M, Kokkola A, von Boguslawski K, Haglund C. (2001) Epithelial and stromal syndecan-1 expression as predictor of outcome in patients with gastric cancer. Int J Cancer 95: 1-6. Winter MJ, Nagtegaal ID, van Krieken JHJM, Litvinov SV. (2003) The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. Am J Pathol 163: 2139-2148. Wright TC Jr, Cox JT, Massad LS, Twiggs LB, Wilkinson EJ; ASCCP-Sponsored Consensus Conference (2002) 2001 Consensus Guidelines for the management of women with cervical cytological abnormalities. JAMA 287: 2120-2129 Zur Hausen H. (1976a) DNA viruses in human cancer: biochemical approaches. Cancer Res 36: 414-416. Zur Hausen H. (1976b) Condylomata acuminata and human genital cancer. Cancer Res 36: 530.

79

10.

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK IMPACT FAKTORA: 14.847

Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke: (IF: 6.004) Sobel G, Páska Cs, Szabó I, Kiss A, Kádár A, Schaff Zs (2005) Increased expression of claudins in cervical squamous intraepithelial neoplasia and invasive carcinoma.

Human Pathol 36: 162-169, IF: 2.550

Sobel G, Szabó I, Páska Cs., Kiss A., Kovalszky I., Schaff Zs (2005) Changes of cell adhesion and extracellular matrix (ECM) components in cervical intraepithelial neoplasias. Pathol Oncol Res 11: 26-31, IF: 1.162 Páska Cs, Bögi K, Szilák L, Tıkés A-M, Szabó E, Sziller I, Rigó J, Sobel G, Szabó I, Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Zs (2004) Effect of formalin, acetone and RNAlater fixatives on tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffin-embedded tissue. Diagn Mol Pathol 13: 234-240, IF: 2.292

Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények: Sobel G, Németh J, Kiss A, Lotz G, Szabó I, Udvarhelyi N, Schaff Zs, Páska Cs (2006) Claudin 1 differentiates endometrioid and serous papillary endometrial adenocarcinoma. Gynecol Oncol 103: 591-598, IF: 2.319 Borka K, Patai K, Rendek A, Sobel G, Paulin F (2006) Pleomorphic rhabdomyosarcoma of the uterus in a postmenopausal patient Pathol Oncol Res 12: 102-104, IF: 1.241 Rigó J, Bıze T, Derzsy Z, Derzbach L, Treszl A, Lázár L, Sobel G, Vásárhelyi B (2006) Family history of early-onset cardiovascular disorders is associated with a higher risk of severe preeclampsia. Europ J Obstet Gynecol Reprod Biol 128: 148-151, IF: 1.273

80

Sobel G, Halász J, Bogdányi K, Szabó I, Borka K, Molnár P, Schaff Zs, Paulin F, Bánhidy F (2006) Prenatal diagnosis of a giant congenital primary cerebral hemangio-pericytoma. Pathol Oncol Res 12: 46-49, IF: 1.241 Patai K, Sobel G, Csömör S, Paulin F (2005) Four pregnancies and two deliveries after unilateral orchidectomy and chemotherapy for testicular embryonal carcinoma. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct, 16: 313-314, IF: 1.907 Sobel G, Mericli M, Langmár Z, Vajda J, Bánhidy F, Paulin F (2005) Rupturált intracranialis aneurysma mőtéti megoldása terhesség alatt. Esetismertetés. Magy Nıorv Lapja 68: 134-145, Sobel G, Szabó I, Wiegandt P, Nobilis A, Bánhidy F, Paulin F (2005) IVF által létrejött ikerterhesség egyik magzatának vetélése után sikeresen kihordott koraszülött (esetismertetés). Magy Nıorv Lapja 68: 333-335

Szabó I, Sobel G, Lintner B, Schaff Zs, Paulin F (2004): Praesacralis utóbélcysta. Orv Hetil 145: 1141-1143, 2004 Lotz G, Kiss A, Kaposi Novák P, Sobel G, Schaff Zs (2001) Hepatitis viruses and hepatocarcinogenesis. J Physiol-Paris 95: 417-422, IF: 0.862

Az értekezéssel összefüggı, lektorált folyóiratban megjelent idézhetı absztrakt: Páska Cs, Bögi K, Szilák L, Tıkés A, Szabó E, Sziller I, Rigó J.Jr, Sobel G, Szabó I, Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Zs: RNA quality and tissue preservation of different fixatives in paraffin embedded tissue. 20th European Congress of Pathology, Paris, France, 3-8 September, 2005. Virch Arch 447: 515, 2005

81

Egyéb kutatási témából készült, nem idézhetı absztraktok: Németh J, Páska Cs, Kiss A, Schaff Zs, Sobel G, Szabó I, Udvarhelyi N: Az endometrioid és serosus papilláris típusú endometrium carcinoma elkülönítése a claudin expresszió alapján. 65. Pathológus Kongresszus, Hajdúszoboszló, október 5-7, 2006 Sobel G, Mericli M, Langmár Z, Várbíró Sz, Vajda J, Paulin F, Bánhidy F: Rupturált intracranialis aneurysma mőtéti megoldása koraterhesség alatt. Magyar Perinatológiai Társaság III. Országos Kongresszusa, Nyíregyháza, szeptember 2-4, 2004 Kulka J, Simon Zs, Tóth J, Dank M, Székely E, Járay B, Sobel G, Schaff Zs: A szövettani diagnózist segítı új eljárások a pathológiában. 61. Pathologus Kongresszus, Gyır, szeptember 26-28, 2002 Schaff Zs, Jármay K, Gallai M, Sobel G, Kovalszky I: Decorin and actin expression in chronic hepatitis C after inferferon α treatment. Third International Conference on Therapies for Viral Hepatitis, Maui, USA, 12-16 December, 1999

82

11.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni Kádár Anna professzor asszonynak,

témavezetımnek, hogy éveken át támogatta kutatásaimat és segített a munkámban. Hálával tartozom Paulin Ferenc professzornak, aki lehetıséget biztosított, hogy a Semmelweis Egyetem II.sz Szülészeti és Nıgyógyászati Klinikáján, PhD hallgatóként a témát mővelhessem. Ezt késıbb Pajor Attila professzor is megadta a lehetıséget, hogy ezt folytathassam, amiért hálával tartozom. Vizsgálataimat 2000 körül kezdtem, hallgatóként, Dr.Bögi Krisztinához csatlakozva, aki türelemmel vezetett be az endometriosis és fıleg a claudinok vizsgálatába. Segítségével

tanulhattam meg az anyagkezelés szabályait és

érdeklıdésemet felkeltette a téma iránt. Késıbb Dr.Kiss András docens úr vette át témavezetésemet TDK veztıként. Mindez nem valósulhatott volna meg, ha számosan az I.sz és II.sz Patológiai Intézet asszisztensei közül nem segítenek a technikai kérdésekben. Köszönettel tartozom Somogyi Évának, az évtizedeken át tartó segítségért, Kanyik Magdolnának, a technikák elsajátításáért, Szík Ágnesnek, Tóth Máriának és Tordai Hedinek a metszetek készítésért és a reakciók kivitelezésében nyújtott segítségért. A dolgozatok írásában, irodalmazásban és az angol nyelvtudásom polírozásában Kálé Elvirának tartozom hálás köszönettel. Végül családomnak, édesanyámnak, Dr.Schaff Zsuzsának köszönöm a sok segítséget és támogatást. A legnagyobb hálával édesapámra, Dr. Sobel Mátyásra emlékezem, akit elvesztettem, de akinek mindent köszönthetek. Az İ példája sarkalt arra, hogy szülész-nıgyógyász legyek és arra, hogy nyomdokaiba lépve méltó lehessek szeretettel ırzött emlékének.

83

TÉZISEK 1. BEVEZETÉS A méhnyakrák a nık 2. leggyakoribb malignus daganata a világon, a fejlett országokban a 3. helyet, a fejlıdı országokban az elsı helyet foglalja el gyakoriságban. Hazánkban az új esetek száma évente 1500 körül van, sajnálatosan a halálozás 500 körüli. A citológiai szőrıvizsgálatok bevezetése lehetıvé tette, hogy már a rákelıtti elváltozásokat, mai terminológia szerint cervicalis intraepithelialis neoplasiának (CIN), illetve a citológiai elnevezés alapján „squamous intraepithelialis lesion”–nak (SIL) nevezett eltéréseket, valamint az in situ carcinomákat (CIS) is felismerjük. A méhnyakrák kóroka sokáig rejtve maradt. Harald zur Hausen professzor munkássága egyértelmően bizonyította a humán papilloma vírus (HPV) nagy kockázatú típusainak kórokozó szerepét a méhnyakrákban, melynek jelentıségét elismerve a professzor 2008ban Nobel díjban részesült. Az elmúlt években a sejtadhéziónak egyre nagyobb jelentıséget tulajdonítottak a tumorok kialakulásában és progressziójában. A sejtkapcsolatok létrejöttében a plazma membrán speciális fehérjéinek jelentıs szerepe van. A sejtek között, valamint a sejt és extracellularis matrix (ECM) között kialakult kapcsolat hatására

a

sejtben

válaszfolyamat indul el, mely legtöbbször a cytoskeleton átrendezıdésében, a kinázok aktiválódásában, további foszforilációjában nyilvánul meg. Az endothel és epithel sejtek között többféle sejtkapcsoló struktúra különböztethetı meg, némileg eltérı funkcióval. Ezen sejtkapcsoló struktúrák az úgynevezett zonula occludens vagy „tight junction” (TJ), a zonula adherens, a desmosoma (macula adherens), a hemidesmosoma és a gap junction. A TJ folyamatos, körkörös, övszerő struktúra az epithelialis és endothelialis sejtek apicalis és basolateralis határán. A sejt polaritásának biztosítása mellett (“fence” vagy kerítés funkció) a TJ-k részt vesznek a diffúzió, a víz és oldatok transepithelialis

áthaladásának

szabályozásában,

valamint

a

szelektív

protein

transzportban (barrier vagy kapu funkció). Emellett a TJ-t alkotó molekulák a membránból kiinduló szignálokra is reagálnak, és a jelátvitelben is szerepet játszanak. A TJ molekuláris felépítésének megismerése S.Tsukita japán kutató és munkacsoportjának nevéhez főzıdik. Az elsı TJ fehérjét 1993-ban izolálta

84

munkatársaival, melyet a zonula occludens alapján occludinnak neveztek el, melyet további alkotórészek, 1998-ban a TJ gerincét alkotó claudinok felfedezése követte. Jelenleg a claudin család 24 típusa különíthetı el emberben. Az egyes claudinok dinamikus interakciója az embriogenezis és a differenciáció során is megfigyelhetı. A claudinok kapcsolatban állnak a cytoskeleton aktin komponenseivel és az intracellularis jelátviteli mechanizmusokban is részt vesznek. Az egyes claudin típusok összetétele, eloszlása jellemzi a sejteket, szöveteket, az u.n. claudin mintázat meglehetısen állandó normális körülmények között. Számos adat utal arra, hogy a claudinok fokozott vagy csökkent expressziója a carcinogenesisben is szerepet játszik, legalábbis kóros eltérésük számos tumorban megfigyelhetı. A daganatok kialakulásában és terjedésében a tumorsejtek disszociációja döntı fontosságú. A daganatsejtek egyik jellemzıje, hogy elvesztik polaritásukat és specifikus funkciójukat és ez összefügghet a claudinok alterációival, mely számos tumorban megfigyelhetı.

2. CÉLKITŐZÉS Az irodalom adatai alapján bizonyítottnak tekinthetı, hogy a TJ fehérjék expressziója változik a carcinogenesis és a daganatok progressziója során. A fenti adatok felvázolták a TJ statikus-dinamikus modelljét, az alkotó fehérjék kapcsolatát. A külsı hatásokra a TJ szerkezete és funkciója megváltozik, mely az alkotó fehérjék expressziója változásának függvénye. A cervix hámszerkezete, mint kifejezetten polarizált, „rezisztens” hám, fokozottan érzékeny a sejtkapcsolatokban beálló eltérésekre, mely a neoplasia során megfigyelhetı, azonban ennek molekuláris alapjai nem teljesen tisztázottak. Ezen ismeretekre és irodalmi adatokra alapoztuk hipotézisünket, mely a következı: A TJ egyes protein összetevıi már a carcinogenesis korai szakaszában változnak,

eltérnek

a

normális

sejtkapcsoló

struktúrák

összetételétıl.

Feltételezésünk szerint a cervix praemalignus elváltozásaiban már észlelhetık a TJ-t

alkotó

egyes

fehérjék,

elsısorban

a

”gerincet”

képezı

claudinok

expressziójának eltérése és ez dinamikusan alakul a praemalignus-malignus progresszió folyamán. Feltételezzük, hogy a CIN I-III, CIS szakaszokban, majd a

85

daganat inváziójával a TJ fehérjék eltérı expressziós mintázata alakul ki, mely jellemzi az egyes szakaszokat, az elváltozás elırehaladott voltát. A fenti hipotézis igazolására a következı kérdések megválaszolását tőztük ki célul, melyre nem találtunk adatot az irodalomban:

2.1. Mennyire jellemzı a cervicalis hám claudin mintázata normális, nem daganatos állapotban? Milyen claudin típusok jellemzik az ép cervicalis hámot? 2.2. Változik-e az egyes claudinok expressziója, claudin mintázata a praemalignus CIN léziókban? 2.3. Milyen mértékben változnak az egyes claudin típusok és ezek közül melyek jellemzik legkifejezettebben a cervix korai és elırehaladott daganatos elváltozásait? 2.4. Van-e különbség az in situ carcinoma (CIS), a CIN I/II és az invazív rák claudin mintázatában és az egyes claudin típusok expressziójában? 2.5. Az occludin expresszió változik-e a cervicalis carcinogenesis során és lokalizációja, valamint változásának iránya korrelál-e a claudinokkal? 2.6. Van-e összefüggés a HPV receptor proteoglikán, a syndecan-1 expresszió, az occludin és a claudinok expressziójában a cervicalis carcinogenesis korai, elsısorban premalignus szakaszaiban? 2.7. A cervicalis carcinognesis során észlelt TJ protein eltérések felhasználhatók-e a daganatelıtti elváltozások diagnosztikájában?

3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. Betegek és vizsgálati minták Az anyagot a Semmelweis Egyetem II. számú Szülészeti és Nıgyógyászati Klinikájának betegeibıl diagnosztikus és kuratív célból eltávolított, és a II. sz. Pathologiai Intézetben feldolgozott portio uteri mintákból nyertük. A vizsgálatokhoz rendelkeztünk a Regionális Etikai Bizottság engedélyével (172/2003.). Összességében 105 biopszia és sebészi exstirpáció során eltávolított portio mintát dolgoztunk fel, melyek diagnózisa a következı volt; normális cervix (n=20), cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN) Grade I (n=10), CIN II (n=17), CIN III (n=10), carcinoma in situ (CIS) (n=15), valamint invazív laphámrák (T1 és T2, n=33).

86

3.2. Hisztológia és immunhisztokémia

A minták kezelése a SE II.sz. Patológiai Intézete biopsziás laboratóriumi protokollja szerint formalin fixálás és paraffin beágyazással történt. A diagnózis megállapítása haematoxilin-eosin (H&E) festett metszeteken alapult. Deparaffinálás után a metszeteken imunhisztokémiai reakciókat végeztünk. Specifikus primer antitestként monoclonalis (claudin-2, -4, syndecan-1 ellenes) és polyclonalis (claudin-1, -3, -7, occludin ellenes) antitesteket használtunk (Zymed Inc., (San Francisco, CA, USA, Serotec Ltd, Oxford, UK). A megfelelı biotinizált másodlagos antitesteket (Ventana Medical System Inc., Tucson, AZ, USA) avidinbiotin-peroxidáz reakció követte, a vizualizálást diaminobenzidinnel végeztük. A nem specifikus reakció kimutatására negatív kontrollokat használtuk: az elsıdleges antitestet nem-immun nyúl illetve egér szérummal (Zymed), valamint PBSsel helyettesítettük, a primer antitestnek megfelelı hígításban. Pozitív kontrollként a claudin-1 kimutatása esetén bırt, a claudin-2, -3, -4-hez colon és endometrium nyálkahártyát, a claudin-7-hez emlıszövetet használtunk. Az immunreakció lokalizációját a normális többrétegő el nem szarusodó laphám sejtrétegeiben elemeztük; így a basalis, parabasalis, intermedier és felszínes rétegben és meghatároztuk a pozitív sejtek számát. A CIN léziókban, valamint a carcinomákban ugyancsak a laphámeredető diszplasztikus, illetve tumorsejtek között határoztuk meg a pozitívan reagáló sejtek számát, a mirigykomponensek reakcióját nem értékeltük. Az immunhisztokémiai reakciót szemikvantitativ módon analizáltuk: 10 random szelektált területet választottunk ki metszetenként, 20x-os objektív nagyítással, látóterenként 100 sejtet számolva. A pozitívan reagáló sejtek számát százalékban adtuk meg, majd a további értékeléshez pontrendszerbe illesztettük (0-5 pont). A statisztikai számolást a MANN-Withney U teszttel végeztük, amely során az immunhisztokémiai pont értékeket hasonlítottuk össze a különbözı csoportokban. Az értékeket szignifikánsnak tekintettük p<0,05. A korrelációs koefficienst a Spearmann rank módszerrel elemeztük.

4. EREDMÉNYEK

87

4.1. A normális cervicalis hám claudin mintázata Az egyes TJ molekulák eltérı módon expresszálódtak a hám különbözı rétegeiben: a claudin-1, -4 és -7 a suprabasalis és intermedier rétegben, a claudin-2 és az occludin a basalis sejtrétegben volt detektálható. A claudin-2 kivételével, mely granularis reakciót adott, a többi vizsgált molekula membranózus rajzolatot mutatott immunhisztokémiai módszerrel. A claudin-3 nem volt jelen a laphámban. A claudin és occludin eloszlás nem mutattott lényeges eltérést a vizsgált mintákban.

4.2. A claudinok vizsgálata a cervix praemalignus elváltozásaiban (CIN) és in situ carcinomájában (CIS ) A normális hámban észlelt TJ protein mintázat változását észleltük a cervicalis carcinogenesis során. A claudin-1, -2, -4, és -7 expresszió szignifikánsan növekedett (p<0,0001) a CIN I/II elváltozásokban, a claudin-1 és -7 a CIN III/CIS léziókban is szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a normális hámhoz viszonyítva (p<0,0001). A claudin pozitív sejtek számának fokozatos növekedése volt megfigyelhetı a hám felsıbb rétegei felé a magasabb fokozatú CIN elváltozásokban. A claudin immunmorfológiai megjelenése, azaz membranózus vagy granularis jellege nem változott a normális hámhoz viszonyítva a daganatos progresszió során. A claudint expresszáló sejtek intenzív reakciója élesen elhatárolta a dysplasia-anaplasia jeleit mutató sejteket a környezı, morfológiailag épnek tekinthetı sejtrétegtıl. Claudin-3 az intraepithelialis neoplasiákban nem volt megfigyelhetı.

4.3. A claudinok vizsgálata invazív cervicalis laphámrákban Az invazív laphám carcinomában csökkent a claudinok expressziója a CIN/CIS elváltozásokhozhoz viszonyítva, azonban a csökkent expresszió a T1+T2 stádiumban még mindig meghaladta a normális cervicalis laphámban mért értékeket. A claudin-4 kivételével a normális hámhoz viszonyított claudin expresszió emelkedés magasan szignifikáns volt (p<0,0001). A CIN I/II és invazív carcinomát összehasonlítva, a claudin-2, -4, -7 jelentısen csökkent (p<0,0001), a claudin-1 változatlan expressziót mutatott. A CIN III/CIS és invazív carcinomát összehasonlítva, a legkifejezettebb csökkenést a claudin-1-ben észleltük (p<0,0001), ezt követte a

88

claudin-2 (p=0,0006), azonban a claudin-4 és -7 eltérése nem volt szignifikáns, bár a tendencia megfigyelhetı volt.

4.4. Az occludin expressziója a CIN/CIS léziókban Az occludin a normális hámban a basalis sejtrétegben volt jelen, az intenzív pozitív reakció csökkent a CIN/CIS léziókban, azonban a pozitívan festıdı sejtek száma a hám felsıbb rétegeiben is megfigyelhetı volt, azok nagyobb számban voltak jelen. A CIN III/CIS léziókban a reakció fokális jellegő volt.

4.5. A syndecan-1 expressziója a CIN/CIS léziókban A syndecan-1 reakció intenzitása, mely a normális cervicalis hámban intenzív membranózus festıdést mutatott a parabasalis és intermedier rétegekben, nem változott a CIN I-III léziókban és kiterjedt a hám felsıbb rétegeire. A reakció intenzitása azonban csökkent és gócossá vált a CIS-ben.

5. ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK, KÖVETKEZTETÉSEK

5.1. A normális human cervicalis laphám claudin mintázata és occludin expressziója jellegzetes és állandó. A világon elıször vizsgáltuk több TJ molekula expresszióját normális emberi cervicalis laphámban.

Megállapítottuk,

hogy

az

egyes

TJ

molekulák

eltérı

módon

expresszálódnak a hám különbözı rétegeiben és a claudin-3 nincs jelen a laphámban. A jellegzetes claudin eloszlás jól jellemzi a cervicalis laphám egyes sejtrétegeit.

5.2. A cervix praemalignus elváltozásaiban (CIN I-III) és in situ carcinomájában (CIS) megváltozik a claudinok expressziója a normális hámhoz viszonyítva, a vizsgált claudinok expressziója jelentısen növekszik. Vizsgálataink elıször bizonyították a világon, hogy a cervicalis intraepithelialis neoplasia különbözı fokozataiban az egyes claudinok mennyisége nem csökken, hanem változó mértékben fokozódik.

89

5.3. Az invazív laphám carcinomában csökkent a claudinok expressziója a CIN/CIS elváltozásokhozhoz viszonyítva, azonban a csökkent expresszió a T1+T2 stádiumban még mindig meghaladta a normális cervicalis laphámban mért értékeket. A CIN III/CIS és invazív carcinomát összehasonlítva a legkifejezettebb csökkenést a claudin-1-ben észleltük.

5.4. Az occludin a normális hámban a basalis sejtrétegben adott reakciót, melynek intenzitása csökkent a CIN léziókban. A gyengébben pozitiv sejtek száma azonban a hám felsıbb rétegeiben is megfigyelhetı volt fokális jelleggel a neoplasia progressziója során. Az occludin expressziója a normális hámban megegyezett a claudin-2-vel, mindkét protein a basalis sejtekben volt megfigyelhetı. A pozitív sejtek számának növekedése CIN-ben mindkét TJ protein esetében megfigyelhetı volt, azonban az occludin festés intenzitása jelentısen csökkent CIN-ben és fokális jellegő volt CIS-ben, szemben a claudin-2-vel.

5.5. A syndecan-1 reakció a normális cervicalis hámban intenzív membranózus festıdést mutatott a parabasalis és intermedier rétegekben. A syndecan-1 reakció intenzitása nem változott a CIN I-II léziókban és kiterjedt a hám felsıbb rétegeire. A reakció intenzitása azonban csökkent és gócossá vált a CIS-ben. A syndecan-1 reakció hasonló lokalizációt mutatott a claudin-1, -4, és -7-hez a normális hámban. A reakció kiterjedése, azaz a pozitívan reagáló sejtek száma ugyancsak megfigyelhetı volt, a fenti claudinokhoz hasonlóan. 5.6. Összefoglalóan megállapítható, hogy az összes, a normális cervicalis laphámban is jelenlévı vizsgált claudin, occludin és a syndecan-1 expresszió jelentısen növekedett a cervicalis intraepithelialis neoplasiában a normális hámhoz viszonyítva. A fenti TJ proteinek expressziója viszont jelentısen csökkent az invazív carcinomában a CIN léziókhoz viszonyítva, bár a claudinok expressziója meghaladta a normális hámban mért értéket.

90

KÖVETKEZTETÉSEK, A VIZSGÁLATOK JELENTİSÉGE

Elsıként igazoltuk a világon, hogy a cervicalis carcinogenesis folyamatában számos TJ protein expressziója jelentısen megváltozik. A praemalignus cervicalis elváltozásokban fokozódott az egyes claudinok expressziója. Ezen megfigyelés arra utal, hogy a TJ módosulása, mely ismert a carcinogenesis során, nem feltétlenül az egyes TJ-t alkotó proteinek elvesztésével jár, ellenkezıleg, átmenetileg fokozott expresszió mutatható ki, legalábbis a korai szakaszokban. Számos adat igazolta vizsgálataink elkezdését és közlését követıen az irodalomban, hogy ez más szervek laphám eredető praemalignus elváltozásiban is hasonlóan történik. A nagyobb mennyiségben kimutatható TJ protein jelenléte, mely a praemalignus léziókban észlelhetı, nem feltétlenül jelenti azonban a TJ funkció „erısödését”, azaz a sejtkapcsolatok szorosabbá válását, hanem ellenkezıleg, a barrier és permeabilitási funkció károsodását jelezheti, mely kedvezhet a daganatsejtek disszociációjának, a sejtkapcsolatok lazulásának és a növekedési faktorok hatásának fokozott érvényesülését teszi lehetıvé. A vizsgált claudinok expressziójának jelentıs növekedése a daganatelıtti elváltozásokban a sejtkapcsolatok alakulását új megvilágításba helyezi. A fenti eltérések arra utalnak, hogy a sejtkapcsolatok TJ-fehérjék által történı szabályozása a protein összetevık igen bonyolult kölcsönhatásának az eredménye, mely nem feltétlenül követi az elvárt mennyiségi „csökkenés” lehetıségét. A TJ pontosan felépített molekuláris szerkezetében az egyedi összetevık arányának megváltozása is alapvetı funkcionális zavart eredményezhet. A leírt TJ fehérjék expressziójának a fokozódása, elsısorban a claudin-1 esetében, a „rezisztens” típusú laphám praemalignus szakaszait jellemzı elváltozás. Mindez azt a reményt nyújthatja, hogy a fokozott claudin expresszió

kiegészítı

markerként

jelezheti

a

korai

eltéréseket

a

cervicalis

carcinogenesisben. Diagnosztikus felhasználása mind az immunhisztokémiai, mind az immuncitokémiai vizsgálatok során felmerülhet. A T1+T2 laphámrákokban a TJ fehérjék expressziójának jelentıs csökkenése volt megfigyelhetı a praemalignus elváltozásokhoz viszonyítva, azonban magasabb volt a normális hámban detektált értékekhez viszonyítva. Ezen adatainkat munkánk

91

megjelenése óta számosan igazolták az irodalomban, hivatkozva megfigyeléseinkre. Meglepı, hogy a TJ proteinek még jelentıs mennyiségben kimutathatók az invázió során és fokozottabban expresszálódhatnak a daganatban, mint a normális hámban. Ezen adatok a sejtkapcsolatok szabályzása igen bonyolult folyamátát mutatják a carcinogenesis folyamatában.

92

6. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Megjelent közlemények impact faktora (IF): 14.847 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke: (IF: 6.004) Sobel G, Páska Cs, Szabó I, Kiss A, Kádár A, Schaff Zs: Increased expression of claudins in cervical squamous intraepithelial neoplasia and invasive carcinoma. Human Pathol 36: 162-169, 2005 IF: 2.550 Sobel G, Szabó I, Páska Cs., Kiss A., Kovalszky I., Kádár A, Paulin F, Schaff Zs: Changes of cell adhesion and extracellular matrix (ECM) components in cervical intraepithelial neoplasias. Pathol Oncol Res 11: 26-31, 2005 IF: 1.162

Páska Cs, Bögi K, Szilák L, Tıkés A-M, Szabó E, Sziller I, Rigó J, Sobel G, Szabó I, Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Zs: Effect of formalin, acetone and RNAlater fixatives on tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffinembedded tissue. Diagn Mol Pathol 13: 234-240, 2004 IF: 2.292

Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények:

Sobel G, Németh J, Kiss A, Lotz G, Szabó I, Udvarhelyi N, Schaff Zs, Páska Cs: Claudin 1 differentiates endometrioid and serous papillary endometrial adenocarcinoma. Gynecol Oncol 103: 591-598, 2006 IF: 2.319

Borka K, Patai K, Rendek A, Sobel G, Paulin F: Pleomorphic rhabdomyosarcoma of the uterus in a postmenopausal patient. Pathol Oncol Res 12: 102-104, 2006 IF: 1.241

Rigó J, Bıze T, Derzsy Z, Derzbach L, Treszl A, Lázár L, Sobel G, Vásárhelyi B: Family history of early-onset cardiovascular disorders is associated with a higher risk of

93

severe preeclampsia. Europ J Obstet Gynecol Reprod Biol 128: 148-151, 2006 IF: 1.273

Sobel G, Halász J, Bogdányi K, Szabó I, Borka K, Molnár P, Schaff Zs, Paulin F, Bánhidy F: Prenatal diagnosis of a giant congenital primary cerebral hemangiopericytoma. Pathol Oncol Res 12: 46-49, 2006 IF: 1.241

Patai K, Sobel G, Csömör S, Paulin F: Four pregnancies and two deliveries after unilateral orchidectomy and chemotherapy for testicular embryonal carcinoma. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct, 16: 313-314, 2005 IF: 1.907 Sobel G, Mericli M, Langmár Z, Vajda J, Bánhidy F, Paulin F: Rupturált intracranialis aneurysma mőtéti megoldása terhesség alatt. Esetismertetés. Magy Nıorv Lapja 68: 134-145, 2005

Sobel G, Szabó I, Wiegandt P, Nobilis A, Bánhidy F, Paulin F: IVF által létrejött ikerterhesség egyik magzatának vetélése után sikeresen kihordott koraszülött (esetismertetés). Magy Nıorv Lapja 68: 333-335, 2005

Szabó I, Sobel G, Lintner B, Schaff Zs, Paulin F: Praesacralis utóbélcysta. Orv Hetil 145: 1141-1143, 2004

Lotz G, Kiss A, Kaposi Novák P, Sobel G, Schaff Zs: Hepatitis viruses and hepatocarcinogenesis. J Physiol-Paris 95: 417-422, 2001 IF: 0.862

94

Az értekezéssel összefüggı, lektorált folyóiratban megjelent idézhetı absztrakt: Páska Cs, Bögi K, Szilák L, Tıkés A, Szabó E, Sziller I, Rigó J.Jr, Sobel G, Szabó I, Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Zs: RNA quality and tissue preservation of different fixatives in paraffin embedded tissue. 20th European Congress of Pathology, Paris, France, 3-8 September, 2005. Virch Arch 447: 515, 2005

Egyéb kutatási témából készült, nem idézhetı absztraktok:

Németh J, Páska Cs, Kiss A, Schaff Zs, Sobel G, Szabó I, Udvarhelyi N: Az endometrioid és serosus papilláris típusú endometrium carcinoma elkülönítése a claudin expresszió alapján. 65. Pathológus Kongresszus, Hajdúszoboszló, október 5-7, 2006

Sobel G, Mericli M, Langmár Z, Várbíró Sz, Vajda J, Paulin F, Bánhidy F: Rupturált intracranialis aneurysma mőtéti megoldása koraterhesség alatt. Magyar Perinatológiai Társaság III. Országos Kongresszusa, Nyíregyháza, szeptember 2-4, 2004

Kulka J, Simon Zs, Tóth J, Dank M, Székely E, Járay B, Sobel G, Schaff Zs: A szövettani diagnózist segítı új eljárások a pathológiában. 61. Pathologus Kongresszus, Gyır, szeptember 26-28, 2002

Schaff Zs, Jármay K, Gallai M, Sobel G, Kovalszky I: Decorin and actin expression in chronic hepatitis C after inferferon α treatment. Third International Conference on Therapies for Viral Hepatitis, Maui, USA, 12-16 December, 1999

95