Samenvatting
Samenvatting Het lumen van een bloedvat is bedekt met endotheelcellen, welke veranderingen in fysieke, metabole en inflammatoire status in de circulatie doorgeven aan vasculaire gladde spiercellen om zo de homeostase te kunnen handhaven. Regulatie van de vasculaire functie van een vaatbed is de resultante van de interactie tussen gladde spiercellen en lokaal geproduceerde endotheliale signalen. Zowel klinische als experimentele studies hebben aangetoond dat in chronisch orgaanfunctieverlies de vasculaire functie verslechtert. Om deze reden wordt eindstadium chronisch orgaanfalen niet langer gezien als geïsoleerde orgaanschade, maar een progressieve aandoening met vasculaire veranderingen door veranderingen op het niveau van de endotheel- en/of gladde spiercellen. Zodoende omvat de term “vasculaire disfunctie” zowel veranderingen in de functie van het endotheel en de functie van gladde spiercellen ten gevolge van het ziekteproces. De experimenten beschreven in deel 1 van dit proefschrift richten zich op de endotheel-afhankelijke vasculaire relaxatie in diermodellen van chronisch nier- en hartfalen. Endotheel-afhankelijke vasculaire relaxatie in eind-stadium orgaanfalen a. Chronisch nierfalen: Om te onderzoeken wat de bijdrage van endotheelafhankelijke veranderingen in chronisch nierfalen is zoals beschreven in hoofdstuk 2, hebben we de vasculaire functie in een ratmodel van adriamycinegeinduceerd nierfalen onderzocht. Hoewel dit een veelgebruikt model is voor onderzoek naar nierfalen, vonden we in deze studie dat blootstelling aan adriamycine (een cytostaticum) naast nierschade en nefrose ook andere veranderingen in het cardiovasculaire systeem induceerde. Na blootstelling aan adriamycine
was
de
endotheel-afhankelijke
vasodilatatie
verminderd,
waarschijnlijk door een afgenomen receptor-gemedieerde stikstofoxide (NO) productie ten gevolge van adriamycine en nierfalen zelf. Nefrose daarentegen, was geassocieerd met een verminderde basale NO-productie, terwijl adriamycine hier geen effect op had. Basale NO-productie speelt een belangrijke rol bij de homeostase van de vasculaire functie en een verminderd functioneren speelt
187
Chapter 9
mogelijk een rol bij de hogere incidentie van cardiovasculaire ziekten in patiënten met proteïnurie. Deze bevindingen tonen aan dat het erg belangrijk is om bij interpretatie van de resultaten rekening te houden met de verschillende effecten van nefrose en blootstelling aan adriamycine op de vasculaire functie. Experimenten in genetische modellen van chronisch nierfalen geven mogelijk beter inzicht in de effecten op de vasculaire functie en de cardiovasculaire gevolgen. In hoofdstuk 3 beschrijven we de endotheel-afhankelijke vasculaire relaxatie in Fawn-hooded hypertensieve ratten (FHH), een genetisch model van chronisch nierfalen met spontane hypertensie, proteïnurie en ernstige glomerulosclerose, allen ontwikkelend op jonge leeftijd en uiteindelijk leidend tot prematuur overlijden ten gevolge van eindstadium nierfalen. In deze experimenten onderzochten we vasculaire functie van FHH op verschillende leeftijden, zowel in de aan- als afwezigheid van milde en ernstige nierschade, zodat we relaties tussen vasculaire dysfunctie en chronisch nierfalen konden ontdekken. We hebben een heterogene verdeling van systemische vasculaire veranderingen waargenomen, die ofwel plaats vonden na het ontstaan van nierschade of tegelijk met het ontstaan van nierschade plaats vonden. Bovendien bleek systemische vasulaire dysfunctie te correleren met de hoeveelheid nierschade, suggererend dat therapeutische interventie gericht op beperking van de nierschade mogelijk ook een (indirect) positief effect op de vasculaire functie uitoefenen. Met het oog op de waargenomen veranderingen in vasculaire functie volgend op chronisch nierfalen zoals hierboven beschreven, hebben we in hoofdstuk 4, de de vasculaire functie van FHH ratten met Munich Wister Fromter (MWF) ratten vergeleken om de rol van nierfalen in het ontstaan van vasculaire disfunctie te bevestigen. MWF ratten staan bekend als een genetisch model van spontane proteïnurie, hypertensie, focale segmentale glomerulosclerose en nierfalen. Hoewel we verwacht hadden dat endotheel functie en hierbij betrokken signaaltransductieroutes gelijkelijk aangedaan zouden zijn in zowel FHH als MWH ratten, vonden we opmerkelijke verschillen in de endotheel functie na nierschade 188
Samenvatting
in beide rattenstammen. Algehele endotheel-afhankelijke relaxatie van de aorta was verminderd in MWF, terwijl dit in FHH zelfs nog in een later stadium van nierfalen intact bleek te zijn. De waargenomen verschillen in de ontwikkeling van de vaculaire disfunctie kunnen mogelijk verklaard worden door toegenomen productie van contractiele cyclooxygenase (COX) eindproducten uit het endotheel. Endotheleel disfunctie zoals waargenomen in MWF ratten kan verklaard worden als een verschuiving van endotheel-afhankelijk COX producten met een relaxerend effect naar COX producten met contractiele effecten, zoals ook eerder beschreven is in andere diermodellen van chronische aandoeningen zoals hypertensie en metabool syndroom, wat een gemeenschappelijk mechanisme voor de ontwikkeling van endotheleel disfunctie suggereert. b. Chronisch hartfalen: Identiek aan de situatie in chronisch nierfalen is bij chronisch hartfalen ook sprake van verslechtering van de systemische vaatfunctie ten gevolge van de aandoening. Hartfalen volgend op een myocardinfacrt is een vorm van perifeer vaatlijden, bestaande uit endotheleel disfunctie en toegenomen perifere weerstand. Huidige behandelingsstrategiën in hartfalen richten zich niet alleen op cardiale functie, maar hebben ook tot doel om perifeer vaatlijden te verminderen/te voorkomen. Eén van de nieuwe behandelingsstrategiën
in
hartfalen
bestaat
uit
vermindering
van
de
hartslagfrequentie, waarvan gunstige effecten zijn aangetoond op cardiale angiogenese. Daarom hebben we in hoofdstuk 5, de effecten van vroege en late selectieve chronische vermindering van hartslagfrequentie op preventie of vermindering van endotheel disfunctie onderzocht in een experimenteel model van post-myocardinfarct hartfalen. In dit onderzoek bleek perifere endotheel functie van de thoracale aorta verminderd door een verschuiving van NOafhankelijke naar voornamelijk EDHF-afhankelijke relaxatie, zoals ook gevonden in eerdere studies. Deze bevinding in overeenstemming met het concept waarbij verschuiving van NO- naar EDHF-gemedieerde relaxatie wordt opgevat als een indicator voor endotheleel disfunctie. Echter, vroege noch late interventie gericht op reductie van de hartslagfrequentie kon endotheel disfunctie van de thoracale aorta volgend op een myocardinfarct verminderen of voorkomen. De resultaten 189
Chapter 9
van dit onderzoek tonen aan dat reductie van de hartslagfrequentie an sich mogelijk geen directe invloed op de perifere endotheel disfunctie heeft in chronisch hartfalen. Desalniettemin, het vaatsysteem is nogal heterogeen met duidelijke verschillen tussen kleinere en grotere bloedvaten (zoals de in bovenstaande studie gebruikte aorta); toekomstige onderzoeken in verschillende vaatsystemen, in het bijzonder in kleine weerstandsarteriën, leveren mogelijk nog veelbelovende resultaten. Vasculaire contractiele functie in chronisch eind-stadium orgaanfalen Hoewel endotheel-afhankelijke relaxatie veel bestudeerd is als indicator van vasculaire functie bij chronische aandoeningen is er slechts weinig informatie beschikbaar over de contractiele eigenschappen van de bloedvaten. Om deze reden hebben we ons in deel 2 van dit proefschrift ook gericht op de vasculaire contractiele functie. Reeds bekend is dat vascular remodeling in chronische aandoeningen
gepaard
gaat
met
overmatige
stimulatie
van
alpha1-
adrenoreceptoren (α1-AR), waarschijnlijk via transactivatie van de epidermale groeifactor receptor (EGFR). Daarom hebben we in hoofdstuk 6 de rol van EGFR in de α1-AR-gemedieerde vasculaire contractie bepaald door farmacologische karakterisatie van de contractiliteit van de aorta in gezonde proefdieren. Onze resultaten tonen aan dat EGFR-transactivatie een significante rol speelt in endotheel-onafhankelijke, α1-AR-afhankelijke contractie via activatie van de phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) en extracellular signal-regulated kinases (ERK) signaaltransductieroutes in de aorta van de rat. Deze bevindingen hebben mogelijk een grote impact op de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategiën voor chronisch hart- en nierfalen middels het voorkomen van de EGFRtransactivatie. In de studie gepresenteerd in hoofdstuk 7 was ons primaire doel de vasculaire functie van een ander ziektemodel met chronisch orgaanfalen te onderzoeken (Zucker Diabetic Fatty rats, ZDF; metabool syndroom), waarbij voornamelijk de rol van EGRF-transactivatie in α1-AR-gemedieerde vasculaire contractiliteit onderzocht is. Ons secundaire doel was de effecten van therapeutische interventie geïndiceerd voor behandeling van het metabool 190
Samenvatting
syndroom (dipeptidyl peptidase-IV enzyme remming door vildagliptin) op de vasculaire functie te onderzoeken. Endotheel-onafhankelijke contractie van de aorta bleek relatief weinig beïnvloed te worden door het metabool syndroom. Opgemerkt moet worden dat een verminderde gladde spiercelfunctie op de leeftijd van 25 weken in ZDF-ratten mogelijk ook niet opgemerkt kan worden door veroudering van de ratten; in eerder onderzoek werd een verminderde α1AR-gemedieerde contractie gevonden in ratten van deze leeftijd vergeleken met jongere ratten (16 weken oud) in dit ziektemodel. In lijn met onze eerder beschreven bevindingen in gezonde ratten in hoofdstuk 6, leidt remming van EGFR tot verslechtering van zowel de α1-AR- als ook de angiotensine II Type 1 receptor-gemedieerde contractie. Deze gegevens bevestigen nogmaals dat transactivatie van EGFR slechts ten dele contractie van geïsoleerde aorta ringen van de rat beïnvloedt. Bovendien bleek de algehele endotheel-afhankelijk relaxatie van de aorta verminderd te zijn in ratten met metabool syndroom, in lijn met resultaten uit eerdere studies. Tenslotte, chronische behandeling met een dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) remmer voorkwam vasculaire disfunctie van de aorta niet. Meer onderzoek is echter noodzakelijk om de effecten van DPP-IV enzymremming in andere vaatbedden te onderzoeken alvorens te concluderen dat de gunstige effecten van DPP-IV enzymremming geen invloed hebben vasculaire disfunctie in het metabool syndroom. Tenslotte, in hoofdstuk 8, hebben we ons tot doel gesteld de rol van EGFRtransactivatie in α1-AR-gemedieerde vasculaire contractie na ischemie van de nier te onderzoeken in ratten na chronische behandeling met een placebo of EGFRremmer. Recente studies impliceren een rol voor EGFR-signaaltransductie in de adaptatiemechanismen na renale ischemie/reperfusie (I/R)-schade via een signaaltransductieroute afhankelijk van zuurstofradicalen en poneren daarom de hypothese dat systemische activatie van EGFR plaatsvindt na renale I/R-schade. Daarom hebben we het effect van chronische EGFR-remming in vivo op vasculaire contractiliteit van de aorta onderzocht door gebruik te maken van een experimentele EGFR-kinase-remmer, PKI-166, in een ratmodel van renale I/Rschade. Resultaten van de controlegroepen (ratten zonder nierschade) tonen aan dat chronische EGFR-remming in vivo geen invloed heeft op α1-AR-gemedieerde 191
Chapter 9
contracties, in tegenstelling tot acute in vitro EGFR-remming waar een verminderde α1-AR-gemedieerde contractie waargenomen was (hoofdstuk 6). Het verschil tussen de effecten van acute en chronische EGFR-remming op de α1AR-gemedieerde
contractie
kan
mogelijk
verklaard
worden
door
de
tussenliggende periode zonder remming van EGFR-transactivatie en de snelle kinetiek van EGFR. Desalniettemin, in ratten na I/R, leidt chronische remming van EGFR met PKI-166 tot een significant verminderde PE-geinduceerde contractie van de aorta. Bovendien verergerde additionele remming van EGFR door AG1478 het effect van PKI-166-behandeling na I/R. Deze bevindingen suggereren dat chronische remming van EGFR na renale I/R-schade de nietEGFR-afhankelijke component van PE-geïnduceerde contractie van de aorta verslechtert. Gezien het feit dat contracties van de aorta geïnduceerd met KCl onveranderd waren na I/R vergeleken met sham, is een verandering in de gevoeligheid voor Ca2+ onwaarschijnlijk. Vervolgsonderzoek is noodzakelijk om het mechanisme van deze uitgesproken rol voor EGFR in α1-AR-gemedieerde vacsulaire contractiele functie na renale I/R-schade aan te tonen. Conclusies Zoals uitgebreid behandeld in dit proefschrift, wordt het duidelijk dat risicofactoren voor hart- en nierfalen niet te onderschatten effecten hebben door beïnvloeding van de structuur en functie van arteriele bloedvaten op het niveau van het endotheel en/of gladde spiercel. Zulke pathologische veranderingen in artieriën spelen een belangrijke rol en vormen een viscieuze cirkel, zowel door stimulatie van verdere disfunctie in organen en een toegenomen risico voor additionale vasculaire aandoeningen. Identificatie van de details van deze cirkel en mogelijkheden om de cirkel te onderbreken is dan ook erg belangrijk. Echter, het is niet altijd duidelijk of vasculaire dysfunctie de oorzaak of het gevolg van chronisch orgaanfalen is. Om deze vraag te kunnen beantwoorden zijn studies gericht op de vasculaire functie in hypertensie, één van de belangrijkste risicofactoren voor chronisch orgaanfalen, mogelijk zeer nuttig. Lange tijd is het algemene concept geweest dat endotheleel disfunctie het tijdsverloop van chronische veranderingen in bloeddruk volgt en daarmee het gevolg is van 192
Samenvatting
hypertensie. Later werd duidelijk dat behandeling van hypertensie de endotheleel functie niet (altijd) verbetert, wat aantoont dat endotheleel disfunctie niet enkel het gevolg van hypertensie is. In hoofdstuk 5 leveren we ondersteunend bewijs voor deze hypothese in chronisch hartfalen. Hoewel cardiale functie verbeterde na behandeling met metoprolol of ivabradine via chronische verlaging van de hartslagfrequentie, had geen van beide interventies invloed op de endotheel disfunctie in ratten met hartfalen. Recente onderzoeken tonen aan dat verlaging van de bloeddruk met bèta-blokker de endotheel functie niet verbetert, terwijl behandeling
met
angiotensin
converting
enzym
(ACE)-remmers
of
angiontensine-receptor blokkers dit wel doet. Deze gegevens ondersteunen de hypothese dat interventie in het renine-angiotensine-aldosteron systeem (RAAS) ook direct de vasculaire functie kan beïnvloeden. Meer ondersteunend bewijs voor de hypothese dat vasculaire disfunctie eerder oorzaak dan gevolg van hypertensie is, blijkt uit de verminderde endotheel functie in normotensieve kinderen van ouders met essentiële hypertensie. Experimenten in ons laboratorium tonen het vroeg optreden van vasculaire dysfunctie in de pathofysiologie van eind-stadium nierfalen aan. Een ander voorbeeld wat de oorzakelijke rol van vasculaire disfunctie in het ontstaan en de progressie van chronische orgaanfalen aantoont, blijkt uit onderzoek naar chronische rejectie na transplantatie waar men een belangrijke rol voor endotheleel disfunctie gevonden heeft. Schade aan endotheelcellen gaat vooraf aan gladde spiercel disfunctie, welke dan rejectie van het donororgaan versneld. Samengevat biedt dit proefschrift aanwijzingen dat vasculaire dysfunctie niet alleen een kernmerk van progressief orgaanfalen is, maar ook deel van de etiologie van eind-stadium chronisch orgaanfalen. Het mechanisme van vasculaire disfunctie zoals waargenomen in chronische aandoening is complex. Veelal worden NO en EDHF bestudeerd als factoren die een relaxerende invloed hebben via het endotheel. Resultaten van dit proefschrift laten zien dat de bijdrage van een derde component, endotheelafhankelijke COX-producten, waaronder prostacycline (PGI2) en thromboxaan A2, heroverweging verdient. Dit wordt ondersteund door het feit dat de effecten van PGI2 nauw samenhangen met effecten gemedieerd door NO aangezien PGI2 193
Chapter 9
de afgifte van NO stimuleert en NO vervolgens het effect van PGI2 op gladde spiercellen potentieert. Verder, zoals genoemd in zowel hoofdstuk 4 als hoofdstuk 7, speelt toename van contractiele COX-producten een significante rol in het ontstaan van endotheel disfunctie. Ondersteunend bewijs wordt geleverd door de bevinding dat een toegenomen expressie van endotheliaal COX-1, prostacycline synthase, thromboxaan synthase en verhoogde thromboxaan/prostaglandine endoperoxide (TP) receptor gevoeligheid allen een rol spelen in verbetering van endotheel-afhankelijke vasoconstrictie. Daarom is het erg belangrijk dat toekomstige studies de effecten van selectieve COX-remming of TP-receptor antagonisme in het voorkomen van endotheel-afhankelijke hypercontractiliteit onderzoeken. Een dergelijke therapeutische benadering kan de verstoorde balans tussen
de
afgifte
van
endotheel-afhankelijke
vasoactieve
stoffen
zoals
waargenomen in chronische aandoeningen corrigeren door selectieve remming van de COX signaaltransductieroute. De huidige manier van meting van vasculaire disfunctie in chronisch orgaanfalen richt zich met name op de endotheel-afhankelijke vasculaire relaxatie. Begrijpelijkerwijs is er daardoor minder inzicht verworven in de endotheel-afhankelijke
en
–onafhankelijke
veranderingen
in
gladde
spiercelcontractiliteit. Grotere responsiviteit op α1-adrenoceptor agonisten is echter wel waargenomen in patiënten met eind-stadium nierfalen, hypertensie, en hartfalen. Bovendien zijn de meeste onderzoeken die zich richten op vasculaire functie in chronische aandoeningen uitgevoerd in grote “conduit” arteriën. Echter, recentelijke studies tonen aan dat de gladde spiercelfunctie ook verandert in kleine arteriën die bepalend zijn voor de perifere vaatweerstand. Myogene tonus in kleine weerstandsarteriën bepaalt het basale niveau van perifere weerstand en een toename hierin is een belangrijke indicator van cardiovasculaire aandoeningn zoals hypertensie en hartfalen. Overeenkomstig daarmee hebben we een toegenomen myogene tonus van mesenteriale arteriën gevonden in ratten met chronisch hartfalen of met hypertensie, terwijl juist een afgenomen myogene tonus werd waargenomen in het model van 5/6-nefrectomie in ons laboratorium. In het bijzonder hebben we de rol van EGFR in de toegenomen myogene constrictie in deze modellen onderzocht. In de eerste 194
Samenvatting
plaats leiden experimenten die zich richten op zowel relaxatie als contractiele functie en het in kaart brengen van vasculaire functie in beide dimensies na therapeutische interventie mogelijk tot ontdekking van nieuwe targets voor preventie/verminderen van vasculaire disfunctie in chronische aandoeningen. Ten tweede, gelet op de heterogeniciteit van het vasculaire systeem, weerspiegelt extrapolatie van resulaten behaald in grote arteriën niet zondermeer de vasculaire functie van de kleinere arteriën. Een complete explorerende studie van zowel de grote en kleine arteriën draagt bij aan identificatie van potentiele vasculaire targets voor de behandeling van chronische aandoeningen. Zoals beschreven in deel 2, houdt vasculaire disfunctie ook aantasting van de contractiele functie van arteriën in. Eén van de belangrijkste kenmerken van gladde spiercel dysfunctie ligt mogelijk verborgen in de bijdrage van EGFR hierin, met name door transactivatie via verschillende G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs). In onze experimenten tonen we een significante bijdrage van EGFR-transactivatie in α1-AR-afhankelijke contractie via activatie van phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) en extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaaltransductieroutes (Hoofdstuk 6). Bovendien speelt transactivatie van EGFR ook een rol in versterkte myogene tonus in kleine arteriën. Naast een rol voor α1-AR zoals beschreven in dit proefschrift, is transactivatie van EGFR waargenomen door verschillende GPCRs, waaronder angiotensine II Type 1, endotheline-1 Type A, β2-adrenergic, M1 muscarine acetylcholine, en serotonine receptoren. Tot op heden is interventie gericht op EGFR als nieuwe therapeutische strategie uitsluitend gebruikt in oncologisch onderzoek. Over het algemeen wordt er gebruik gemaakt van twee benaderingswijzen: monoclonale antilichamen tegen EGFR (cetuximab, panitumumab) of het gebruik van remmers van het tyrosine-kinase domein (erlotinib, gefinitib, lapatinib). Vervolgonderzoek dient zich te richten op het effect van beide klassen farmaca op vasculaire disfunctie zoals in chronisch orgaanfalen. Echter, gezien het effect van monoclonale antilichamen op transactivatie van EGFR tot nu toe nog niet gerapporteerd is, is het logischer eerst het effect van remmers van het tyrosinekinase domein te onderzoeken. Indien deze behandeling succesvol blijkt te zijn, dan kan remming van EGFR-transactivatie via andere componenten van de 195
Chapter 9
signaaltranductieroute
mogelijk
bijdragen
nieuwe
klassen
farmaca
te
identificeren voor de behandeling van vasculaire disfunctie in chronische aandoeningen. Om dit te kunnen bewerkstelligen, is er behoefte aan interventiestudies in proefdiermodellen van chronische aandoeningen die de rol van de EGFR-transactivatie in de regulatie van de vasomotorfunctie in eindstadium chronisch orgaanfalen bepalen.
196
