SAMENVATTING
Samenvatting
SAMENVATTING De operatieve verwijdering van de ooglens, tegenwoordig gevolgd door implantatie van een kunstlens, is vandaag de dag de voorkeurstherapie voor de behandeling van ouderdomscataract (staar). Vanaf de eerste toepassingen van deze therapie zijn ernstige bijwerkingen in de macula van het netvlies gerapporteerd, welke het gezichtsvermogen van de patiënt ernstig kunnen aantasten. Deze complicatie werd voor het eerst beschreven in 1953 en staat bekend onder de naam cystoid macula oedeem. De incidentie van deze aandoening varieert van 2 tot 50%, maar sporadisch worden percentages van 70% gemeld. Eind jaren zeventig werd in een aantal Japanse publicaties het gebruik van indomethacine oogdruppels ter preventie van het cystoid macula oedeem beschreven. Op grond hiervan werd in 1980 in de klinieken van Arnhem door een van de oogartsen aan de ziekenhuisapotheker gevraagd of deze een indomethacine oogdruppel kon samenstellen, omdat deze (nog) niet in de handel was. Deze vraag was uiteindelijk de aanleiding tot het ontstaan van dit proefschrift. Na deze eerste publicaties over de preventie van cystoid macula oedeem, zijn er diverse formuleringen van indomethacine oogdruppels beschreven in de Nederlandse en internationale literatuur. Indomethacine is een remmer van de synthese van prostaglandines, een belangrijke klasse van ontstekingsmediatoren, ook bij deze aandoening. Indomethacine oogdruppels werden geïntroduceerd in verschillende formuleringen waaronder oplossingen in sesamolie, waterige suspensies en waterige oplossingen. Concentraties van oplossingen in olie varieerden van 0,1 tot 1,0%, in suspensie oogdruppels van 0,5% tot 1% en in waterige oplossingen van 0,35 tot 1,0%. Helaas leidde het gebruik van olieachtige oogdruppels tot klachten over wazig zien, veroorzaakt door het verschil in brekingsindex. De waterige oplossingen daarentegen - hetzij als suspensie, hetzij als oplossing - veroorzaakten vaak irritatie van het oog. Om van deze, hinderlijke bijwerking af te komen werd een verlaging van de indomethacine concentratie voorgesteld van 1% naar 0,2% of 0,1%. In 1981 werd aan de hand van vergelijkend onderzoek van vier indomethacine suspensie-oogdruppels (0,5%) geconstateerd, dat de mate van prostaglandinesynthese remming nogal varieerde, waarschijnlijk als gevolg van verschillen in fysisch chemische eigenschappen. Geconcludeerd werd dat het gebruik van suspensieoogdruppels niet reproduceerbare farmacokinetische en farmacodynamische uitkomsten gaf. In antwoord op bovengenoemde vraag werd door ons met succes een waterige fosfaat-gebufferde indomethacine oplossing (pH 7,4) ontwikkeld in een concentratie van 0,1%, waarbij de indomethacine in oplossing werd gebracht met behulp
130
Samenvatting
van de organische base meglumine. Deze oogdruppel werd in 1981 in de kliniek geïntroduceerd en had geen irriterende bijwerkingen in het oog. In 1984 werd Indoptol®, een 1% indomethacine suspensie oogdruppel, op de Nederlandse markt geïntroduceerd en 1986 werd Indocid®, met een vergelijkbare samenstelling, in Frankrijk op de markt gebracht. In 1987 volgde een nieuw ontwikkelde vorm van de indomethacine oogdruppel, Indocollyre®, in een sterkte van 0,1%. Introductie van dit product op de Nederlandse markt geschiedde in 1994. Deze formulering bevat indomethacine als gevriesdroogd product, hetgeen in oplossing gebracht kan worden door additie van een steriele boraatbuffer. Nader onderzoek van de eigen indomethacine oogdruppel met verschillende organische basen zoals L-lysine, D-lysine, L-arginine, D-arginine en trometamol leverde geen verbeterde oplossing op. De in 1981 geïntroduceerde, aseptisch bereide, gebufferde indomethacine oplossing (pH 7,4) in een concentratie van 0,1%, zonder verdere farmaceutische toevoegingen bleef dientengevolge dé oplossing in onze kliniek. Deze oplossing werd farmacologisch onderzocht middels het paracentese model, waarbij vocht aan de voorste oogkamer van het konijnenoog wordt onttrokken en de influx van eiwit en fluoresceïne in het secundair gevormde oogkamerwater (als maat voor de verbreking van de bloed-kamerwater barrière) gemeten wordt. Uit de resultaten bleek dat een concentratie van slechts 0,05% indomethacine al resulteerde in 90 - 100% remming van eiwit- en fluoresceïne- instroom. Op grond van deze resultaten werd de door ons ontwikkelde indomethacine formulering in 1986 opgenomen in het FNA. Nadeel van deze formulering is echter, dat het hier een aseptische bereiding van een oogdruppeloplossing betreft met een beperkte houdbaarheid. Hierdoor ontstond het idee om te onderzoeken of er ook oogdruppels te formuleren waren op basis van een andere NSAID. In 1990 werd gerapporteerd dat S(+) ibuprofen in een concentratie van respectievelijk 0,9% en 0,8% effectief was in de bestrijding van door interleukine-1 of door paracentese geïnduceerde uveitis. Ook van S(+) naproxen, op de markt gebracht door de firma Syntex als een zuiver enantiomeer, werd het anti-inflammatoir effect als oogdruppel (0,5%) experimenteel aangetoond. Op zoek naar een farmaceutisch meer compatibele oplossing voor een andere NSAID werd in de United States Pharmacopeia (USP) de monografie van flurbiprofen sodium ophthalmic solution aangetroffen , terwijl in Nederland de introductie van een diclofenac oogdruppel (Naclof®) op handen was. In 1992 werd het plan opgevat om flurbiprofen oogdruppels te gaan bereiden. Het project werd ter beoordeling aangeboden aan de Stichting Wetenschappelijk
131
Samenvatting
Onderzoek Rijnstate (9206SO.008) en in een brief van 8 januari 1993 werd beperkte financiële steun toegezegd. De scope van dit proefschrift betreft een onderzoek naar de farmaceutische bereiding en -eigenschappen van flurbiprofen oogdruppels en de farmacologie van dit NSAID. Flurbiprofen is een chiraal molecuul, wat inhoudt dat de racemische vorm mogelijk niet de gewenste farmacologische entiteit is voor de bereiding van oogdruppels. Derhalve werd het noodzakelijk geacht de bijdrage van elk enantiomeer afzonderlijk te onderzoeken, zodat een gefundeerde keuze gedaan kon worden voor de bereiding van een oogdruppel met de meest actieve chirale entiteit. Bij de aanvang van dit onderzoek werd aangenomen dat de farmacologische werking van flurbiprofen gebaseerd is op remming van het enzym cyclooxygenase (COX), dat verantwoordelijk is voor de synthese van prostaglandines. In 1991 werd duidelijk, dat niet één maar twee isoenzymen (COX-1 en COX-2) betrokken zijn bij de synthese van prostaglandines. Het onderzoek kreeg hierdoor een nieuwe uitdaging want er was ook geconstateerd, dat dit tweede isoenzym sterker aan ontsteking gerelateerd zou zijn - en derhalve een beter doelwit voor NSAIDs - dan COX-1. Er werd besloten het racemisch mengsel alsmede de individuele enantiomeren van flurbiprofen te onderzoeken op hun prostaglandinesynthese remmende activiteit zowel intra- als extra-oculair, en zowel op COX-1 als op COX-2. In hoofdstuk 2 wordt het gekozen buffer-systeem beargumenteerd. Ofschoon het oog, speciaal de neushoek, de oogleden en de huid rondom het oog gevoelig zijn voor externe stimuli, zijn fysiologische reacties ten gevolge van afwijkingen buiten de normaalwaarden van osmolaliteit of pH niet altijd duidelijk. Bij ziekte of bij chronisch gebruik van oogheelkundige preparaten kan dit echter meer op de voorgrond treden. Het farmacologische agens in een oogdruppel kan, wanneer niet goed opgelost, een prikkelende of branderige sensatie veroorzaken, hetgeen weer kan leiden tot traanproductie, soms zelfs tot bloedingen of tot gevaarlijke knipperreflexen gedurende een operatieve ingreep. Overmatige traanproductie leidt tot ongewenste verdunning van de oogdruppel en zelfs tot het uitspoelen van het geneesmiddel. De individuele gevoeligheid kan variëren en de fysiologische waarden van het traanvocht kunnen fluctueren afhankelijk van de gezondheidsstatus van het betreffende oog. Irritatie van het oog moet echter onderscheiden worden van een allergische reactie. In het laatste geval dient een ander farmacologisch agens gekozen worden. Niet-irriterende oogdruppels moeten in principe voldoen aan eisen betreffende: (1) steriliteit (2) isotoniciteit en (3) pH waarde. Steriliteit is van eminent belang bij toepassing van oogdruppels in een beschadigd oog. Wanneer de oplossing isotoon is met het traanvocht, zullen irritaties en reacties van het oog tot een minimum beperkt blijven. De pH waarde van de formulering is van groot belang, zowel voor de stabiliteit gedurende opslag als voor het handhaven van fysiologische condities
132
Samenvatting
in het oog. Gedurende opslag kunnen hydroxyl ionen, afkomstig uit het glas van de oogdruppeldispenser, de pH omhoog brengen hetgeen de stabiliteit van het farmacologisch agens in gevaar kan brengen. Aan de andere kant heeft traanvocht slechts een beperkte buffercapaciteit. Bij de keuze voor een buffer ten behoeve van de bereiding van een flurbiprofen oogdruppel moest met de volgende gegevens rekening gehouden worden: (1) flurbiprofen is instabiel bij hoge pH, (2) de oplosbaarheid in waterige oplossingen is slecht bij pH waarden lager dan 7, (3) de normale pH waarde van traanvocht is 7,4 en (4) de tolerantie van de patiënt ligt tussen pH 6,6 tot 7,8. Op basis van de ervaring met de indomethacine oogdruppel werd voor het bereiden van de S(+) flurbiprofen oogdruppels gekozen voor een fosfaatbuffer (pH 7,4). Het specialité Ocuflur® (racemisch flurbiprofen natrium) is bereid in een citraatbuffer van pH 6,45. Dit werd door ons echter als een ongeschikt buffersysteem beschouwd, omdat voor een citraatbuffer een bovenste grens in buffercapaciteit van pH 6,5 bekend is. Een zelfde conclusie wordt overigens ook getrokken in het United States patent 4.996.209, waar een fosfaatbuffer wordt gemeld voor de samenstelling van een anti-inflammatoire S(+) flurbiprofen oogdruppel. In deze oogdruppel komen echter ook andere componenten voor. De samenstelling van de oogdruppel toegepast in dit proefschrift is vrij van die andere componenten. In hoofdstuk 3 wordt de stabiliteit van de formulering onderzocht. Van het actieve S(+) enantiomeer van flurbiprofen, is een stereoselectieve, ballastvrije oogdruppel geformuleerd in een concentratie van 0,015%. Analyse per capillaire zone electroforese techniek toonde een houdbaarheid aan van 4 jaar bij kamertemperatuur. De prostaglandine-synthese remmende activiteit van S(+) flurbiprofen, gemeten in een homogenaat van runder iris/corpus ciliare weefsel, bleek drie jaar na bereiding onveranderd. Hoofdstuk 4 beschrijft de farmacologische activiteit van verschillende flurbiprofen bereidingen in runder iris/corpus ciliare homogenaten. Concentratie-respons curven zijn gemeten voor S(+) flurbiprofen, R(-) flurbiprofen en het racemisch mengsel betreffende remming van PGE2 productie door COX-1. Een significant onderscheid in remmende werking werd vastgesteld tussen de enantiomeren, waarbij S(+) flurbiprofen honderd maal actiever bleek te zijn dan R(-) flurbiprofen. Geconcludeerd kon worden dat S(+) flurbiprofen het actieve farmacologische agens is dat onderdeel zou moeten uitmaken van een oogdruppel oplossing ten einde de prostaglandinesynthese te remmen. In hoofdstuk 5 wordt beschreven hoe, met toepassing van de methode van Patrignani et al., in humaan bloed, verschillen aangetoond werden in de remmende activiteiten van S(+) flurbiprofen, R(-) flurbiprofen en racemisch flurbiprofen op de isoenzymen cyclooxygenase-1 en cyclooxygenase-2. COX-1 activiteit werd gemeten aan de hand van TxB2 (de stabiele metaboliet van TxA2) geproduceerd door
133
Samenvatting
bloedplaatjes. COX-2 activiteit werd gemeten met behulp van PGE2 productie door monocyten na inductie van dit enzym door lipopolysaccharide (LPS). De stereoselectiviteit van S(+) flurbiprofen ten opzichte van R(-) flurbiprofen, uitgedrukt als de reciproke waarde van de ratio van de concentraties die 50% remming geven (IC50), liepen uiteen van 340 voor COX-1 tot 56 voor COX-2. De selectiviteit van racemisch flurbiprofen voor COX-1 versus COX-2 was 16-voudig. In hoofdstuk 6 is de interactie van S(+) flurbiprofen met COX-1 versus COX-2 in de humane iris bestudeerd. Na voorbehandeling met LPS kwam een aanzienlijke hoeveelheid COX-2 immunoreactiviteit naar voren. Verrassenderwijs toonde S(+) flurbiprofen een 3600-voudig hogere potentie tot remming van COX-1 versus COX2. Verder bleek de gevoeligheid van humaan iris COX-1 voor S(+) flurbiprofen 70 maal hoger dan de gevoeligheid van COX-1 in menselijk bloed. In hoofstuk 7 wordt de verdeling van een flurbiprofen analogon over het menselijk oog onderzocht. Technetium gelabeled diflunisal, een chemisch op flurbiprofen gelijkend NSAID - gefluorineerd met eveneens een bifenyl ring - werd toegepast om de COX-activiteit in de interne structuren van het oog te kunnen visualiseren. De scintigrafische resultaten van dit gelabelde farmacon werden vergeleken met die van de instillatie van eenzelfde volume en activiteit pertechnetaat anion. Een hoeveelheid van 3% van het geinstilleerde technetium gelabelde diflunisal kon in het oog worden getraceerd. COX-activiteit werd duidelijk gevisualiseerd in de regio van de iris. In dit onderzoek werd diflunisal toegepast omdat de labelingsefficiency van S(+) flurbiprofen aan de (te) lage kant was (hoofdstuk 8). R(-) flurbiprofen leverde weliswaar een betere labeling op, maar farmacologisch is dit het inactieve enantiomeer (hoofdstukken 5 en 6). In het laatste hoofdstuk is het voorkomen van een splice variant van COX-1 mRNA in de menselijke iris onderzocht als een mogelijke verklaring voor de hoge affiniteit van S(+) flurbiprofen gerapporteerd in hoofdstuk 6. Inderdaad werd een alternatieve splice variant (SV) van COX-1 aangetroffen in iris weefsel afkomstig van 3 patiënten. Echter, dezelfde splice variant werd ook gevonden in bloedcellen afkomstig van 4 vrijwilligers. De hoeveelheid COX-1SV aanwezig in de iris was niet significant verschillend van de hoeveelheid aanwezig in bloed cellen, hetgeen impliceert dat daarmee het verschil in IC50 van S(+) flurbiprofen tussen humane iris (0,8 nM) en humaan bloed (56 nM) niet kan worden verklaard.
134
