SAMENVATTING
Landbouw en veeteelt zijn belangrijke economische activiteiten, omdat ze ons voedsel leveren. Tegenwoordig wordt geprobeerd om een zo groot mogelijke opbrengst te krijgen tegen minimale kosten. In de veeteelt worden daarom stoffen aan het voer toegevoegd. Tegen het gebruik van vitamines en mineralen bestaat weinig bezwaar, maar de toevoeging van geneesmiddelen is omstreden, zeker als dit uitsluitend gebeurt om de groei van het dier te bevorderen. Als een dier een geneesmiddel krijgt, dan blijven er gedurende korte of langere tijd kleine hoeveelheden achter in de weefsels en organen, de zogenaamde residuen. Omdat deze residuen schadelijk kunnen zijn voor de consument, zijn er wetten gemaakt die ervoor moeten zorgen dat de hoeveelheden aanvaardbaar blijven. Deze wetgeving wordt in Nederland grotendeels bepaald door de Europese Unie (EU). Sinds 1988 is het gebruik van groeibevorderaars verboden. In 1996 is dit verbod bevestigd en zijn de sancties verder uitgebreid. Een overzicht van de relevante wetgeving is te vinden in Hoofdstuk 1.1. Er worden verschillende soorten groeibevorderaars gebruikt: anabole steroïden, ß-agonisten en antibiotica. Antibiotica beïnvloeden de opname van voedingsmiddelen in de darm door de samenstelling van de microflora te veranderen. Deze stoffen worden verder in dit proefschrift niet behandeld. De anabole steroïden worden al sinds de jaren vijftig gebruikt als groeibevorderaars. Ze worden onderverdeeld in drie groepen op basis van hun effecten: androgenen, oestrogenen en progestagenen. Androgenen zijn afgeleid van het mannelijk hormoon testosteron. Ze hebben het meeste effect bij vrouwelijke, bij jonge en bij gecastreerde dieren. Tevens zijn dit de meest gebruikte dopingmiddelen door atleten. Oestrogenen en progestagenen zijn vrouwelijke hormonen, afgeleid van respectievelijk oestradiol en progesteron. Ze worden meestal samen gegeven met androgenen om bijwerkingen te verminderen. Bij jonge en bij gecastreerde dieren hebben ze ook een groeibevorderend effect. Er worden nog twee groepen stoffen met een oestrogene werking bij de anabole steroïden behandeld: de stilbenen en de “resorcylic acid lactones”. Het bekendste stilbeen is diethylstilbestrol (DES), dat vooral bekend is geworden door de DES-dochters en zonen. De “resorcylic acid lactones” zijn afgeleid van het schimmel product zearalenon. Omdat de meeste steroïden snel afgebroken worden, nadat ze uit de darm opgenomen zijn, worden ze via implantaten of injecties in spieren toegediend. Op de toedieningsplaats blijven relatief grote hoeveelheden stof achter. Wanneer vlees met residuen van anabole steroïden gegeten wordt, geldt ook weer dat de meeste na opname snel af-
235
Samenvatting
gebroken worden. Wanneer de stof toch in het lichaam terecht komt, wordt dit meestal niet opgemerkt, omdat er slechts een kortdurende verstoring van het hormonenevenwicht optreedt. Het gebruik van de anabole steroïden is met name verboden, omdat deze stoffen kankerverwekkend zijn. Het verbod op het gebruik van anabole steroïden wordt gecontroleerd door monsters, genomen in het slachthuis en op de boerderij tijdens het vetmesten, te analyseren. Hiervoor worden op dit moment hoofdzakelijk methoden gebaseerd op gaschromatografie (GC) met als detector een massaspectrometer (MS) gebruikt. De voordelen van deze methoden zijn dat veel stoffen in één keer gescheiden kunnen worden en dat het massaspectrum gebruikt kan worden voor identificatie van de gedetecteerde stoffen. Nadelen zijn dat er uitgebreide en tijdrovende monstervoorbewerkingsmethoden nodig zijn en dat de techniek duur is. In het huidige onderzoek is geprobeerd om een aantal snelle en kostenbesparende methoden te ontwikkelen die het opsporen en identificeren van een groot aantal potentiële groeibevorderaars in de urine van slachtrunderen mogelijk zouden maken. Dit is gebeurd in het kader van een door de EU gefinancierd onderzoeksproject (AIR3-CT94-1511). Dit onderzoek is uitgevoerd in samenwerking met het Laboratoire d’Hormonologie, Centre d’Economie Rurale, Marloie, België; Lab Chrom 1, Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland; en het Laboratorium voor Analytische Residu Onderzoek/ Community Reference Laboratory, RIVM, Bilthoven, Nederland. In Hoofdstuk 2 wordt de ontwikkeling van een nieuwe screeningsmethode voor anabole steroïden in kalfurine beschreven. Eerst werden de steroïden gedeconjugeerd met behulp van enzymen uit de Helix Pomatia slak. Vervolgens werd het monster geëxtraheerd, eerst met een C18 SPE kolom en daarna met een alumina SPE kolom (SPE is vaste fase extractie). Het extract werd geanalyseerd met een nieuwe HPLC methode (HPLC is hoge druk vloeistofchromatografie). De steroïden werden gescheiden op een reversed phase kolom met behulp van een gradient van acetonitril en water. De stoffen werden gedetecteerd met een diode array detector, die het hele UV spectrum opneemt. Door een combinatie van de gecorrigeerde retentietijd en het UV spectrum te gebruiken werd het identificerend vermogen van de methode vergroot. De methode werd getest met 19 vertegenwoordigers van de vijf hierboven genoemde groepen anabole steroïden. De recoveries lagen boven de 65% met een acceptabele herhaalbaarheid van minder dan 32%, wanneer de steroïden toegevoegd werden aan kalfsurine in een concentratie van 25 ng/ml. De detectielimieten lagen tussen 0.6-80 ng, maar voor de helft van de stoffen - waaronder de meeste synthetische steroïden - waren ze lager dan 10 ng. De methode lijkt daarom vooral geschikt voor monsters genomen op boerderijen, omdat de concentraties van de steroïden dan hoger zijn. De HPLC-methode kan ook gebruikt worden als 236
Samenvatting
hulpmiddel bij de identificatie van in beslag genomen preparaten. Door de aanwezigheid van metabolieten van endogene hormonen in de urine van volwassen dieren bleek het niet mogelijk om de synthetische steroïden te detecteren, met uitzondering van trenbolon. De ß-agonisten worden sinds het eind van de jaren tachtig als illegale groeibevorderaars gebruikt. Clenbuterol is de bekendste en belangrijkste vertegenwoordiger van deze groep. De ß-agonisten zijn oorspronkelijk ontwikkeld als medicijnen tegen asthma, maar later bleek dat bij een dosis die 10 keer zo hoog is als de therapeutische dosis, een groeibevorderend effect optreedt; hierbij neemt de hoeveelheid vet af en de hoeveelheid spierweefsel toe. Na toediening blijven er residuen achter in de organen en de weefsels van het dier. Hoewel clenbuterol vrij snel uitgescheiden wordt, is het al in hele lage doses werkzaam. Inmiddels zijn er al een aantal voedselvergiftigingen bij grotere groepen personen veroorzaakt door residuen van clenbuterol beschreven. Voor de controle van het verbod op het gebruik van de ß-agonisten worden, net als voor de steroïden, monsters genomen in slachthuizen en op boerderijen. Voor de analyse worden zowel GC-MS- als HPLC-methoden gebruikt, voorafgegaan door een meer of minder uitgebreide monstervoorbewerking. De beschreven methoden zijn meestal ontwikkeld voor één of een paar stoffen. Dit heeft onder andere te maken met het feit dat er twee chemisch nogal verschillende groepen ß-agonisten zijn: fenolen en anilines. In Hoofdstuk 3 is de ontwikkeling van verschillende nieuwe analysemethoden voor de ßagonisten beschreven. Er zijn twee strategieën gevolgd: directe analyse met ionenmobiliteitsspectrometrie (IMS, Hoofdstuk 3.1) en HPLC-analyse na extractie uit het monster (Hoofdstukken 3.2, 3.3 en 3.4). Bij IMS wordt het monster op een teflon filter door verhitting in de gasfase gebracht en naar een ionisatiekamer getransporteerd. Hier vinden verschillende soorten reacties plaats, waardoor zowel positief als negatief geladen ionen ontstaan. Bij ons onderzoek werden de positief geladen ionen in de scheidingskamer gelaten. Hier worden de ionen gescheiden op lading door het aanwezige electrische veld en op basis van hun ruimtelijke structuur door botsingen met neutrale gasdeeltjes die in tegengestelde richting bewegen. De tijd die een ion nodig heeft om bij de detector te komen wordt gemeten en omgerekend naar de gereduceerde mobiliteit (K0). Deze K0 is een hulpmiddel bij de identificatie van de gedetecteerde ionen. De grote voordelen van IMS zijn dat er heel snel resultaten zijn en dat de detectielimieten over het algemeen heel laag zijn. Een nadeel is dat het signaal beïnvloed wordt door andere stoffen die in het monster aanwezig zijn. Vanwege de genoemde voordelen hebben we de Ionscan 350 van Barringer Instruments Ltd getest. Dit apparaat wordt onder andere door de douane en op luchthavens gebruikt om drugs en explosieven op te sporen. Eerst is bepaald wat voor signaal de anabole 237
Samenvatting
steroïden en de ß-agonisten gaven en hoe hoog de detectielimieten ongeveer lagen. De ßagonisten gaven, in tegenstelling tot the anabole steroïden, een goed signaal. Hierna zijn vervolgexperimenten uitgevoerd met clenbuterol, dat de laagste detectielimiet had. Allereerst is naar de reproduceerbaarheid van het signaal gekeken. Clenbuterol vertoonde twee pieken, die telkens op dezelfde plaats in het plasmagram te zien waren. Wanneer steeds dezelfde hoeveelheid in de Ionscan werd gebracht, bleken de piekhoogtes van de twee pieken nogal te varieren, zowel binnen een serie als tussen twee series. Door de filters voor de analyse op een verwarmingsplaat te drogen in plaats van aan de lucht werd de variatie binnen een serie duidelijk minder. De variatie tussen series kon gereduceerd worden door de signalen te normaliseren op een 100-ng of 300-ng standaard. Vervolgens is gekeken of haarmonsters geanalyseerd konden worden. Menselijk haar bleek gebruikt te kunnen worden om vast te stellen of iemand drugs gebruikt. Door het haar vanaf de wortel in stukjes van 1 cm te knippen en deze segmentjes te analyseren kon het gebruik van cocaïne door de tijd gevolgd worden. De concentraties van clenbuterol in kalfshaar waren ongeveer 100 keer lager dan die van cocaïne in menselijk haar. Tevens bleek dat het clenbuterolsignaal door de aanwezigheid van het kalfshaar onderdrukt werd. Hierdoor bleek het niet mogelijk om clenbuterol in haar van behandelde kalveren aan te tonen. Tenslotte is onderzocht of extracten van urinemonsters geanalyseerd konden worden. Ook nu werd het signaal onderdrukt en wel zover dat er bijna niets van overbleef. Het gebruikte oplosmiddel bleek de grootste signaalvermindering te veroorzaken, maar ook andere reagentia en mee geëxtraheerde urinecomponenten onderdrukten het signaal. Helaas bleek de Ionscan dus onbruikbaar voor complexe monsters als haar en urine, maar IMS kan wel als hulpmiddel bij de identificatie van illegale preparaten gebruikt worden. Omdat clenbuterol de meest misbruikte ß-agonist is, zijn hiervoor twee single-residu methoden ontwikkeld. Voor de extractie zijn disks en traditionele SPE kolommen gebruikt. In beide gevallen werd het extract met een HPLC-UV methode geanalyseerd op een reversed phase kolom met een gebufferde mobiele phase met 22% acetonitril. Voor de extractie werden verschillende reversed phase extractie disks gebruikt. Clenbuterol werd als base bij pH 12-13 geëxtraheerd. Zowel C2 als C8 disks bleken bruikbaar om een schoon extract en een goede recovery van clenbuterol te verkrijgen. Voor beide soorten disks werd een detectielimiet van ongeveer 15 ng/ml gevonden. Ten tijde van ons onderzoek waren er nog geen disks met kationwisselaars beschikbaar. Deze zouden mogelijk een beter resultaat gegeven hebben. Bij de andere extractiemethode werd gebruik gemaakt van traditionele SPE kolomen met zowel C8- als kationwisselaars-functies (een mixed mode kolom). Het monster werd in zuur milieu op de kolom gebracht, zodat 238
Samenvatting
clenbuterol geladen was en aan de kationwisselaar gebonden werd. Er kon nu een hoog percentage methanol in water gebruikt worden in de wasstap. Vervolgens werd de kolom basisch gemaakt en met water gewassen. Tenslotte werd clenbuterol met een basisch mengsel van ethanol en hexaan geëlueerd. De recoveries waren goed en herhaalbaar en de extracten van humaan en kalfsurine waren redelijk schoon. Om een nog schoner extract te krijgen wilden we een extractiestap met immunoaffiniteitschromatografie (IAC) toevoegen. Hierbij worden antilichamen tegen de stof die geëxtraheerd moet worden, aan een dragermateriaal gebonden en tot extractiekolom verwerkt. Een antilichaam tegen salbutamol is geschikt voor de extractie van de meeste ß-agonisten. Hiervan is gebruik gemaakt voor de ontwikkeling van een multi-residu methode. Een voorextractie met Extrelut materiaal bleek noodzakelijk te zijn om goede recoveries te krijgen. Na de IAC extractie volgde nog een SPE extractie met de mixed mode kolom. De SPE procedure moest aangepast worden omdat een aantal stoffen al voor de elutiestap van de kolom gewassen werden. Het extract werd geanalyseerd met een nieuwe HPLC-methode met amperometrische detectie. De stoffen werden gescheiden op een reversed phase kolom met een gebufferde mobiele fase met een ion-paar reagens waaraan tot 30% acetonitril toegevoegd werd. Uiteindelijk konden alleen de vijf anilines bepaald worden, waarbij de procedure voor cimaterol afweek van die voor de andere vier stoffen. De drie geteste fenolen konden niet van de Extrelut kolom geëlueerd worden. De methode bleek zowel met als zonder de IAC extractie bruikbaar te zijn. Met de IAC stap was het extract schoner, maar zonder waren de recoveries hoger. De detectielimieten lagen in het lage ng/ml gebied. De methode lijkt dus goed bruikbaar als screeningsmethode voor de anilines in kalfsurine. De ontwikkelde methoden zijn bedoeld als onderdelen van een nieuw screeningssysteem gebaseerd op de principes van de systematisch toxicologische analyse (STA). STA heeft als doel het aantonen en identificeren van schadelijke stoffen in een monster en het vaststellen dat andere schadelijke stoffen afwezig zijn. Voor algemeen gebruik zijn inmiddels een GC- en een HPLC- methode en diverse TLC-systemen ontwikkeld. Ook voor de anabole steroïden en de ß-agonisten zijn in dit project door ons en onze partners GC-, HPLC- en TLC-methoden ontwikkeld. De GC- en HPLC-procedures zijn beschreven in Hoofdstuk 4.1. In Hoofdstuk 4.2 wordt het beoogde identificatiesysteem besproken. De detectielimieten van de GC- en HPLC-methoden zijn echter hoger dan de eis in de EU-wetgeving (0.5 ng/ml). Deze methoden zijn daarom (nog) niet bruikbaar voor de analyse van urinemonsters genomen in het slachthuis. Wij denken dat deze methoden toch bruikbaar zijn voor monsters genomen op boerderijen. Immers tijdens het vetmesten worden de groeibevorderaars gebruikt en zijn de concentraties van de verboden stoffen in 239
Samenvatting
de urine veel hoger. De detectielimieten van de TLC-systemen zijn meestal nog hoger. Deze zijn dus alleen bruikbaar, wanneer grote hoeveelheden monster geëxtraheerd kunnen worden. Uiteraard zijn alle systemen geschikt als hulpmiddel bij de identificatie van in beslag genomen, illegale preparaten. Bij STA wordt een gedetecteerde stof geïdentificeerd door de resultaten verkregen met verschillende analysesystemen te combineren. Hiervoor is een computerprogramma ontwikkeld. Een essentieel onderdeel van het programma vormen de databases met analyseresultaten voor circa 900 toxicologisch relevante stoffen. Voor de groeibevorderaars moeten deze databases nog gemaakt worden. Als deze er zijn, kan hetzelfde software programma gebruikt worden om stoffen gedetecteerd met de verschillende methoden te identificeren. Tenslotte bevat Hoofdstuk 5 een drietal appendices met gegevens van relevante stoffen, een lijst met omschrijvingen van de verschillende namen voor runderen en een lijst met gebruikte afkortingen.
240
DANKWOORD
Als je denkt dat je proefschrift helemaal af is, dan blijkt dat je nog een dankwoord mag/moet schrijven. Het resultaat van mijn overpeinzingen over wie er allemaal zeker bedankt moeten worden, staat hieronder. Allereerst wil ik mijn promotor Rokus de Zeeuw en mijn co-promotor Jan-Piet Franke bedanken. Zij hebben dit onderzoek mogelijk gemaakt en mij de mogelijkheid geboden om het uit te voeren. Hoewel het vooral het laatste jaar een probleem was om jullie op hetzelfde moment in dezelfde kamer om de tafel te brengen, lukte het altijd wel om ergens een gaatje te vinden als er een serieus probleem was. Hiervan was de werkbespreking in de hotelkamer in Marche-en-Famenne een voorbeeld dat het vermelden waard is. Onze reisjes naar Marloie, Darmstadt en Bilthoven vormden meestal de aanleiding voor werkoverleg en waren overigens altijd gezellig. I am indebted to the main sponsor of and the partners in my research project, which was financed by Directorate VI of the European Commission under contract AIR3-CT941511. I want to thank Dr. Ph. Delahaut from CER, Marloie, Dr. G. Wieland and Dr. B. Meyer from Merck KGaA, Darmstadt, and Dr. L.A. van Ginkel and Dr. R.W. Stephany from RIVM, Bilthoven for the nice meetings and the fruitful discussions. Hierbij wil ik speciaal Dr. R.W. Stephany bedanken, die mij de mogelijkheid bood om bijna een jaar in zijn laboratorium te werken terwijl ik wachtte tot ik naar Groningen kon vertrekken. Hierdoor kon ik goed voorbereid aan mijn promotie-onderzoek beginnen. Mijn oudcollega’s van het RIVM wil ik bedanken voor de prettige samenwerking ook tijdens mijn promotieonderzoek en voor de discussies tijdens bijeenkomsten en congressen. I want to thank Barringer Instruments Ltd and Andreas Rudolph for giving us the opportunity to test the Ionscan 350 and for their support during the evaluation period. I am also indebted to Graseby Security for giving us the opportunity to test the Narcotec and for their support during the test days. I want to thank Theresa Dirksen for providing us with 3M extraction disks and for the fruitful discussions meetings we had. Alle (ex)-collega’s van de vakgroep Analytische Chemie en Toxicologie wil ik bedanken voor de fijne tijd. De talloze discussies tijdens de pauzes en op het lab leveren niet alleen nuttige tips op voor het onderzoek, maar geven ook aan dat er meer is op deze wereld dan alleen ACT. Een aantal collega’s wil ik hier speciaal noemen. Zonder JanB was het met dit onderzoek nooit goed afgelopen. Jan, bedankt voor de ontelbare reparaties aan onwillige, oude HPLC-pompen en voor het uitvoeren en op-schrijven van
241
het onderzoek met de ß-agonisten (hoofdstuk 3.4). Jaap wil ik bedanken voor de vele nuttige tips bij de ontwikkeling van de SPE methoden. Bij Jolanda heb ik de laatste maanden vaak een praatje gemaakt, als ik het even niet meer zo zag zitten met het schrijven. Ik ben blij dat je mijn paranimf wilt zijn. Verder wil ik hier mijn talloze kamergenoten noemen: JanH en Gerhard op ADL 2 en Yi, Ria, Rixt en tenslotte Mischa op ADL 1. Ook alle andere mensen van de ondersteunende diensten mogen niet ongenoemd blijven. Bij de onderzoeksschool GUIDE heb ik uiteindelijk toch noch een aantal interessante cursussen kunnen volgen. Part of the research described in chapter 3.1.2, 3.1.4 and 3.2 was performed by Yi Luo, a postdoc from the Institute of Pharmacology and Toxicology in Beijing who visited us in 1995/1996. Yi, I want to thank you for the work you did, for the numerous discussions and for the things you learned me about the Chinese and the Japanese culture. Ik wil ook de studenten bedanken die een deel van het onderzoek hebben uitgevoerd: mijn capita studenten Bas, Diederik en Ingrid en mijn bijvak student Anna. De leden van de leescommissie, Prof. dr. G.J. de Jong, Prof. dr. A. Ruiter en Prof. dr C. van Peteghem, wil ik bedanken voor de beoordeling van mijn manuscript. Prof. de Jong en Prof. Ruiter ben ik erkentelijk voor de correcties en suggesties voor verbeteringen, die ze na het lezen van de eerste versie doorgegeven hebben. Mijn (vele) teamleden en trainingsmaatjes van Badmintonclub Olympia wil ik bedanken voor de fijne wedstrijden en trainingsavonden. Onze prestaties waren niet altijd even goed, maar het gaat toch vooral om de lol. Erica, jou wil ik bedanken dat je mijn paranimf wilt zijn. Als laatste maar zeker niet als minste volgt nog mijn familie. Mijn ouders wil ik bedanken dat ze mij de mogelijkheid hebben gegeven om de studie van mijn keuze te volgen. Hoewel het wel even slikken was dat ik helemaal naar het hoge Noorden verhuisde, bleven jullie me elke keer trouw opzoeken. Ook vind ik het fijn dat jullie altijd veel belangstelling voor mijn onderzoek hebben getoond, ook al konden jullie mijn verhalen misschien niet altijd helemaal volgen. Ciska, ook al begrijp je helemaal niets van mijn onder-zoek zoals je zelf altijd zegt, dankzij jouw kledingadvies ben ik op 11 september in ieder geval netjes aangekleed.
242
