Samenvatting en Discussie

Addendum

Addendum

188

Samenvatting en Discussie

Addendum

190


Overzicht Onder omstandigheden met lage beschikbaarheid van nutriënten, worden microorganismen verondersteld extreem langzaam te groeien. Beschreven in dit proefschrift is de studie van Bacillus subtilis bij specifieke groeisnelheden van (bijna) nul. Deze condities werden bereikt tijdens retentostaat cultivatie door middel van extreme calorische restrictie, waardoor er alleen nog energie beschikbaar is voor onderhoudsprocessen. De fysiologische- en transcriptionele respons daarop is hier onderzocht.

Figuur 1. Overzicht proefschrift.

B. subtilis bij niet-groeiende condities was al onderwerp van talrijke studies (Banse et al., 2008; Bernhardt et al., 2003; Blom et al., 2011; Britton et al., 2002; Koburger et al., 2005; Navarro Llorens et al., 2010; Nyström, 2004; Robleto et al., 2007). De afwezigheid van groei was in deze gevallen veroorzaakt door honger

191

Addendum

tijdens de stationaire fase in batch-cultuur. Echter, de niet-groeiende toestand, waarin er enkel nog energie beschikbaar is voor onderhoudsprocessen, doet zich slechts tijdelijk voor bij deze kweekmethode en is daarom moeilijk te bestuderen. Niettemin, door het gebruik van retentostaat cultivatie, is deze toestand experimenteel toegankelijk geworden en daardoor het onderwerp van onderzoek aan verschillende micro-organismen (Arbige en Chesbro, 1982; Bisschops et al., 2014; Boender et al., 2009; Ercan et al., 2013; Goffin et al., 2010; Tappe et al., 1996, 1999; van Verseveld et al., 1984, 1986). In dit proefschrift wordt de eerste retentostaat cultivatie met de bodembacterie B. subtilis beschreven. Daarom richt dit proefschrift zich niet alleen op de cellulaire respons bij extreem lage groeisnelheden, maar ook op de experimentele opstelling voor aërobe retentostaat cultivatie. Een overzicht van het in dit hoofdstuk beschreven onderzoek is afgebeeld in Fig. 1.

Energiebehoefte van onderhoudsprocessen bij extreem lage groeisnelheiden Reeds in 1898 werd gepostuleerd door Ducleaux, en later opnieuw door Marr et al. (1963) en Pirt (1965), dat cellen een deel van het geconsumeerde energie-substraat (voedsel) gebruiken voor onderhoudsdoeleinden, onafhankelijk van de groeisnelheid (Duclaux, 1898). Het resterende deel wordt gebruikt voor biomassa synthese (groei), en is als gevolg afhankelijk van de groeisnelheid. Daarom wordt de benodigde energie voor onderhoud relatief belangrijker bij lage specifieke groeisnelheden. Schultz en Gerhardt (1969) beschreven dat voor cultures waarbij alle gevormde biomassa in de bioreactor wordt vastgehouden, de uiteindelijke maximale biomassa zal worden bepaald door de onderhouds-energiebehoeften van de cellen. Retentostaat cultivatie, voor het eerst gepresenteerd door Herbert (1961) en later verfijnd door Pirt en Kurowski (1970), maakt het theoretisch mogelijk om cellen te cultiveren waarbij ze alleen energie verbruiken voor onderhoud. Dit leidt tot specifieke groeisnelheden van (bijna) nul. Het wordt bereikt door een constante hoeveelheid toegevoerde energie-substraat in combinatie met het behoud van de zich nog steeds voortplantende biomassa. In 1979, werd de eerste retentostaat studie gepubliceerd. Deze had als doel een microbiële cultuur tot de groeilimiet te brengen, opgelegd door de onderhouds-energiebehoeften van zijn cellen (Chesbro et al., 1979). De hieruit volgende conclusie dat de beschikbare energie altijd wordt verdeeld tussen

192


onderhoud en groei, maar dat onderhoudsprocessen niet het totale aanbod kunnen opeisen, wijkt af van het concept van de groeisnelheid-onafhankelijke onderhoudsenergiebehoefte. In de jaren daarna volgden diverse retentostaat studies met andere micro-organismen (Arbige en Chesbro, 1982; Tappe et al., 1996, 1999;. Van Verseveld et al., 1984, 1986.) en het concept onderhouds-energie bleef onderwerp van debat (van Bodegom, 2007). Bij lage tot middelmatige specifieke groeisnelheden, beschrijft de groeisnelheid-onafhankelijke onderhoudsenergie-behoefte van microorganismen de stoichiometrie van biomassa en productvorming adequaat (Tijhuis et al., 1993). Het bleef echter onduidelijk in hoeverre dit concept van toepassing is op groeisnelheden van (bijna) nul. Hoe dan ook is de retentostaat een geschikt middel om het microbiële gedrag te bestuderen bij zeer lage specifieke groeisnelheden. Met de komst van genomics technieken kwam een hernieuwde interesse in groeisnelheden van (bijna) nul. Dit leidde tot een multi-laboratorium samenwerking binnen het Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, met als doel het analyseren van industriële microben onder deze condities van bijna geen groei. In 2009 werd de eerste energie-beperkte retentostaat-studie van dit initiatief gepubliceerd, dat de fysiologie van Saccharomyces cerevisiae bij extreem lage groeisnelheden analyseerde (Boender et al., 2009). Uit deze en andere retentostaat studies met Lactobacillus plantarum (Goffin et al., 2010) en Lactococcus lactis (Ercan et al., 2013), bleek dat de onderhouds-coefficient (maintenance coefficient; ms) berekend uit retentostaten, in samenhang was met een geëxtrapoleerde onderhouds-coefficient op basis van chemostaten met hogere groeisnelheden. De conclusie dat de onderhoudsenergiebehoefte van deze organismen onafhankelijk is van de groeisnelheid (Boender et al., 2009; Ercan et al., ingediend, 2013; Goffin et al., 2010), is in tegenstelling tot de waarneming dat de onderhouds-energiebehoefte wordt verminderd bij lage specifieke groeisnelheden zoals te zien is in de eerdere retentostat studies (Arbige en Chesbro, 1982; Tappe et al., 1996, 1999; van Verseveld et al., 1984, 1986). Waarschijnlijk zijn de afwijkende resultaten van de nieuwere studies veroorzaakt door het feit dat langdurige retentostaat cultivaties (22-45 dagen) zijn gebruikt, in tegenstelling tot eerdere studies, welke van kortere duur waren (3 dagen) en waarbij niet echt condities van (bijna) geen groei zijn bereikt.

193

Addendum

Aanpassing van B. subtilis bij groeisnelheden van (bijna) nul De fractie van de totale hoeveelheid geconsumeerde koolstof- en energiebronnen die besteed werden aan onderhoudsprocessen nam toe van een initiële 31% tot 98% in B. subtilis retentostaat culturen. Dit bevestigt de overgang van een groeiende toestand naar een toestand van nagenoeg geen groei. Het feit dat de onderhouds-coëfficiënt die berekend is op basis van retentostaat cultivatie vrijwel identiek is aan die op basis van geëxtrapoleerde chemostaat culturen bij hogere groeisnelheden, duidt op een groeisnelheid-onafhankelijke onderhouds-energiebehoefte bij groeisnelheden van (bijna) nul (Hoofdstuk 4). Dit is in lijn met resultaten uit onderzoek naar andere microorganismen onder retentostaat condities (Ercan et al., ingestuurd) en suggereert dat B. subtilis niet zijn onderhouds-energiebehoefte aanpast om te kunnen blijven groeien onder de extreme calorische restrictie in de retentostat. Echter, B. subtilis bracht een aantal systemen voor import en gebruik van koolstof tot expressie, hetgeen wijst op een aanpassing van haar actieve metabole repertoire (hoofdstuk 5). Deze geleidelijke vermindering van koolstof cataboliet repressie (CCR) bij het naderen van extreem lage groeisnelheden is een veel voorkomende reactie bij verscheidene micro-organismen (Boender et al., 2011; Ercan et al., ingediend, 2014; Goffin et al., 2010). Deze is ook waargenomen tijdens de bifasische groei (diauxie) en stationaire fase (Blencke et al., 2003; Fujita, 2009; Kotte et al., 2014; Solopova et al., 2014). De anabole vraag is sterk verminderd bij groeisnelheden van (bijna) nul en dit wordt weerspiegeld in het transcriptoom door een verminderde expressie van genen die betrokken zijn bij biosynthetische routes. De geobserveerde expressievermindering van translatie machines in Hoofdstuk 5, wordt ook gezien in S. cerevisiae en A. niger (Boender et al., 2011; Jørgensen et al., 2010). De waargenomen aanpassingen, die overleven ondersteunen in plaats van groei, stemmen overeen met de toegenomen focus van de cellulaire activiteit op onderhouds-geassocieerde processen. Dat het een doeltreffende respons is op de ondervonden strenge calorische beperking in de retentostaat, blijkt uit de hoge levensvatbaarheid van de cultuur (99%) gedurende de teelt. Dergelijke hoge levensvatbaarheid wordt ook waargenomen in andere retentostaat studies (Boender et al., 2009; Ercan et al., 2013; Goffin et al., 2010; Jørgensen et al., 2010). Hoewel expressie gerelateerd aan sporulatie, de kenmerkende stressbestendigheidsrespons in B. subtilis, niet is gedetecteerd in het transcriptoom van

194


de retentostaat cultuur, induceert koolstofbeperkte chemostaat cultivatie wel het sporulatie proces (Dawes en Mandelstam, 1970). Waarschijnlijk heeft een fractie van de retentostaat cultuur sporulatie geïnitieerd, aangezien het een strategie is om risico te spreiden (Fujita en Losick, 2005; De Jong et al., 2010; Veening et al., 2008a). B. subtilis staat bekend om het vormen van verschillende fenotypes binnen een isogene populatie, met name tijdens de stationaire fase (Branda et al., 2001; Dubnau, 1991; Errington, 2003; Kearns en Losick, 2005; Msadek, 1999; Smits et al., 2005; Veening et al., 2008a, 2008b, 2008c), en vele processen zouden deze heterogeniteit kunnen vertonen bij (bijna) niet-groeiende condities. Echter, of regeling van de hierboven beschreven gebieden onderhevig zijn aan heterogeniteit kan niet worden bepaald door experimenten op populatie niveau. De morfologie van de cellen in retentostaat cultivatie is duidelijk heterogeen. De waargenomen ketens van cellen in Hoofdstuk 4 worden waarschijnlijk veroorzaakt door onderdrukking van SigD gereguleerde genen die coderen voor autolysines (Hoofdstuk 5), waarvan de expressie heterogeen is (Cozy en Kearns, 2010). De voordelen van de ketenformatie onder omstandigheden van (bijna) geen groei zijn niet duidelijk. Wat betreft de ondervonden calorische restrictie lijkt het zinvol om energie-uitgaven te verminderen, zoals blijkt uit de expressie van genen betrokken bij biosynthese (Hoofdstuk 5). De energie die niet wordt besteed aan de productie van enzymen en hydrolyse van de celwand kunnen nu worden gebruikt voor het onderhoud van cellulaire functies die essentieel zijn om levensvatbaar te blijven. Anderzijds, het migreren naar meer voedselrijke milieus door beweeglijke cellen kan ook middelen verschaffen om te overleven, zoals gebeurt tijdens de overgang naar de stationaire fase (Mirel et al., 2000; Rao et al., 2008). Er is een mogelijkheid dat een klein deel van de cellen in de retentostat beweeglijk is, omdat microscopische beelden tonen dat sommige cellen zich niet in ketens begeven (Hoofdstuk 4). Dit is in overeenstemming met het idee dat B. subtilis cultures differentiëren in twee subpopulaties met cellen AAN of UIT voor σD-afhankelijke genexpressie (Kearns en Losick, 2005; Chai et al., 2010). Zo'n klein percentage cellen die motiliteit-genen tot expressie brengen zal niet worden gedetecteerd met een populatie-brede transcriptoom analyse. De toepassing van groen fluorescerend eiwit (GFP) gefuseerd met een promotor van interesse, heeft bewezen een waardevol instrument te zijn voor analyse van individuele cellen (Chalfie et al., 1994; De Jong et al., 2012; Smits et al., 2005; Southward en Surette, 2002; Valdivia en Cormack, 2005;. Veening et al.,

195

Addendum

2008b). Zogenaamde ‘single cell studies’ (experimenten waar specifiek gekeken wordt naar genexpressie van individuele cellen in plaats van naar gemiddelde genexpressie van een hele culture) in het kader van retentostaat cultivatie zal meer gedetailleerde informatie opleveren over expressie van specifieke genen in subpopulaties. De transcriptoom analyse in dit proefschrift geeft een waardevol overzicht van genregulatie bij omstandigheden van (bijna) geen groei en verschaft toegangspunten voor toekomstige studies. Tijdens diauxie, waar de groeibeperking veroorzaakt door glucose uitputting wordt opgelost door het gebruik van beschikbare secundaire koolstofbronnen, kan de expressie van de betrokken genen heterogeen zijn (Hoofdstuk 6, Kotte et al., 2014; Solopova et al., 2014). Daarom is het mogelijk dat de waargenomen regulatie betreffende het vervoer en het gebruik van koolhydraten en aminozuren ook heterogeen is onder omstandigheden van (bijna) geen groei.

Retentostaat cultivatie van B. subtilis Een bioreactor bestaat uit vele onderdelen, en met een experimentele duur van meer dan 40 dagen, is er groot risico op storing. Vroegtijdige verstoring van een retentostaat cultivatie maakt deze nutteloos voor verdere analyse. Een aantal aanpassingen aan de retentostaat opstelling, zoals de installatie van een druppelaar die voorkomt dat B. subtilis cellen gaan groeien in de medium slang, waren vereist voor langdurige retentostaat kweken (Hoofdstuk 4). Naast oplossingen zoals technische aanpassingen aan de bioreactor, kunnen toevoegingen aan de experimentele opzet ook helpen om de retentostaat cultivatie te optimaliseren. Het risico op verontreiniging van de kweek met een ander micro-organisme neemt toe met duur van de retentostaat cultivatie. Door gebruik van GFP konden we B. subtilis cellen visueel onderscheiden van ongewenste verontreinigingen in de retentostaat. De gekweekte B. subtilis stam bevatte een fusie van de promoter van het constitutieve ribosomale gen rrnB met GFP, waardoor cellen altijd fluorescent waren. De gebruikte GFP variant was GFP+, een verbeterde versie van de regelmatig gebruikte GFPmut1. Hoofdstuk 3 beschrijft een vergelijking van zeven GFP varianten in B. subtilis en twee andere model-organismen L. lactis en Streptococcus pneumoniae. Het resultaat dat de varianten die het hoogste fluorescentiesignaal in B. subtilis vertonen eigenlijk codon-geoptimaliseerd waren voor S. pneumoniae en vice versa, toont aan dat er

196


nog ruimte voor verbetering op het gebied van codon optimalisatie. Samen met de grote variatie in fenotypische ruis-sterkte van elk GFP, onderstreept dit dat de GFP variant zorgvuldig moet worden gekozen per experiment. Een GFP met lage fenotypische ruissterkte zou meer geschikt zijn voor een ‘single-cell’ experiment dat heterogeniteit onderzoekt. Eén van de GFP's met een sterker fluorescentiesignaal zou toepasbaar voor visualisatie van zwakke promotor activiteit. Zoals bepaald met de vergelijking, is GFP+ ongeveer twee keer zo intens fluorescerend in B. subtilis als de regelmatig gebruikte GFPmut1. Zeker in combinatie met de sterke rrnB promoter is deze bruikbaar voor positieve identificatie van B. subtilis in retentostat culturen. Retentostaat cultivatie van sporenvormende organismen zoals Aspergillus niger leidde tot sporulatie (Jørgensen et al., 2010). Om zeer lage groeisnelheden in een retentostaat te bereiken, is het noodzakelijk dat er geen verlies van metabolischactieve biomassa optreedt (Boender et al., 2009; Jørgensen et al., 2010). Het feit dat de nieuw gevormde sporen inactief zijn en waarschijnlijk de bioreactor kunnen verlaten via het filter, voorkomt dat extreem lage groeisnelheden worden bereikt. Om deze redenen is de sporulatie-negatieve sigF-deletie stam gebruikt in de studie naar extreem langzame groei tijdens retentostaat cultivatie van B. subtilis. Onder sporulatie omstandigheden is het genotype en het fenotype van de sigF-mutant gekarakteriseerd (Dworkin en Losick, 2005; Fawcett et al., 2000; Steil et al., 2005; Wang et al., 2006). Hoofdstuk 2 bevestigt dat deel van het sporulatie-netwerk in onze B. subtilis 168 sigF- stam uitgeschakeld is en dat de stam geen sporen kan vormen. Om een zo volledig mogelijk beeld te krijgen van de regulatoire netwerken die opereren bij extreem lage groeisnelheden, is het belangrijk om niets anders dan een deel van het sporulatie-netwerk te beïnvloeden. Reeds was bekend dat sigF een specifieke functie heeft in sporulatie (Dworkin en Losick, 2005; Fawcett et al., 2000; Steil et al., 2005; Wang et al., 2006). Uit Hoofdstuk 2 blijkt dat de verstoring van sigF slechts een gering effect heeft op genexpressie tijdens vegetatieve groei, een situatie waarin de meeste cellen sporulatie niet initiëren. Daarom werd de sigF mutant geschikt geacht om de aanpassing van B. subtilis aan omstandigheden van extreem lage groeisnelheden te bestuderen. Hoewel het gebruik van deze mutant het deel van het sporulatie-netwerk dat direct- of indirect afhankelijk is van sigF ‘verbergt’, en dit kan worden gezien als een onnatuurlijke situatie, is het nog steeds mogelijk om sporulatiegenen die eerder dan sigF tot expressie komen te monitoren. De mogelijkheid om waar te nemen of cellen de onomkeerbare route van sporulatie in gaan, levert een

197

Addendum

situatie op die zo dicht mogelijk bij het wildtype is. Onder omstandigheden waarin spore-formatie het bereiken van de te onderzoeken extreem lage groeisnelheid onmogelijk zou maken, lijkt de gedeeltelijke uitschakeling van het sporulatie-netwerk een redelijk compromis. Of deze beslissing echt een compromis, of eerder -naar verwachting- een pure noodzaak is, moet worden bepaald door het uitvoeren van een retentostaat studie op een B. subtilis wild-type stam.

Industrieel gebruik van extreem lage groeisnelheden bij B. subtilis Micro-organismen hebben vele toepassingen als ‘celfabrieken’ voor de productie van eiwitten en metabolieten. B. subtilis en zijn naaste familieleden worden bijvoorbeeld gebruikt voor de productie van vitamines, enzymen, antibiotica en geneesmiddelen (Baek et al., 2012;. van Dijck, 1998; Olmos-Soto en Contreras-Flores, 2003; Papagianni, 2012; Westers et al., 2004; Zamboni et al., 2003). Traditioneel worden verschillende microben toegepast bij voedselproductie zoals wijn fermentatie met behulp van Saccharomyces cerevisiae (Maurice et al., 2001), kaasrijping door melkzuurbacteriën (Smit et al., 2005), en natto fermentatie door B. subtilis (Steinkraus, 2004). Onder deze industriële omstandigheden is de beschikbaarheid van voedingsstoffen beperkt en ten gevolge daarvan de groeisnelheid zeer laag. De kennis over niet-groeiende cultures zou dan ook bruikbaar kunnen zijn voor de optimalisatie van deze industriële processen. Daarnaast is deze kennis over extreem langzaam groeiende cellen waardevol in de toepassing van micro-organismen als celfabrieken, omdat ze zelf replicerende katalysatoren zijn en biomassa vaak een nietwenselijk bijproduct is (Papagianni, 2012; van Verseveld et al., 1986). De groei loskoppelen van metabolische productvorming, door middel van niet-groeiende retentostaat cultures die productiviteit handhaven, zou dan gunstig zijn voor de productopbrengst. Opbrengsten die dicht bij het theoretisch mogelijke lagen werden in anaërobe retentostaat culturen van S. cerevisiae bereikt (Boender et al., 2009) en L. lactis (Ercan et al., 2013). Hierbij werd vrijwel alle energie substraat omgezet in het voornaamste fermentatie product. Bijvoorbeeld, bij de productie van bio-ethanol door S. cerevisiae in retentostaat cultures, waren de rendementen van de belangrijkste bijproducten, gistbiomassa en glycerol (Brandberg et al., 2007), verwaarloosbaar (Boender et al., 2009). Dit illustreert het voordeel van niet-groeiende cultures voor

198


rendementsverbetering van katabole producten. Echter, als een toekomstige gasuitwisseling analyse op aërobe B. subtilis retentostaat culturen bevestigt dat alle energie substraat inderdaad werd omgezet in kooldioxide en water (Hoofdstuk 4), is de toepassing van B. subtilis voor katabole product vorming in aërobe koolstofbeperkte retentostaat cultivatie twijfelachtig. Wat katabole productie betreft, kan retentostaat cultivatie eventueel beter gebruikt worden onder anaërobe en/of omstandigheden met energie overvloed waar metabolieten zoals lactaat, acetaat, acetoïne, ethanol, succinaat en 2,3-butaandiol worden gevormd (Cruz Ramos et al., 2000; Dauner et al., 2001; Nakano et al, 1997). De waargenomen down-regulatie van de eiwitsynthese bij extreem lage groeisnelheden biedt een uitdaging voor de synthese van anabole producten in B. subtilis, zoals enzymen. Beperken van de groei door het limiteren van een niet-energetisch substraat, in plaats van de energiebron limitatie, zou veelbelovend kunnen zijn. Dit is echter onder de voorwaarde dat verminderde efficiëntie van energiebron gebruik en ‘overflow’ metabolisme kan worden voorkomen onder condities met overmaat aan energie (Dauner et al., 2001). De verhoogde expressie die wordt waargenomen onder retentostaat condities van sommige genen die coderen voor industrieel relevante enzymen zoals alkalischprotease en mannose-6-fosfaat isomerase kan nuttig zijn. Voor de productie hiervan kan retentostaat cultivatie gunstig blijken te zijn als de behaalde productie niveaus hoog genoeg zijn.

Conclusies en toekomstig onderzoek Tijdens het promotietraject is veel tijd en moeite besteed aan de opzet en de validatie van het retentostaat systeem. De opzet en het verrichten van langdurige retentostaat culturen is arbeidsintensief, maar deze cultivatiewijze maakt de studie mogelijk van een belangrijk domein van de microbiële fysiologie, dat niet experimenteel toegankelijk is via andere methoden. Het retentostaat systeem dat wordt gebruikt in dit proefschrift is goed geschikt voor gecontroleerde en reproduceerbare cultivatie van B. subtilis onder extreme calorische restrictie. Eventueel kan het bij vervolgstudies naar niet-groeiende metabolisch actieve B. subtilis cellen worden toegepast, omdat deze benadering niet alleen waarde heeft voor het algemeen begrijpen van microbiële levensstijlen in de natuur maar ook voor de ontkoppeling van groei en productvorming in industriële microben.

199

Addendum

Om een beter begrip te krijgen van B. subtilis onder een omstandigheid die lijkt op zijn natuurlijke habitat, en die relevant is voor de industrie, werd onderzocht hoe B. subtilis zich aanpast aan, door calorische restrictie opgelegde, extreem lage groeisnelheden. De gecombineerde kracht van gecontroleerde retentostaat cultivatie en analytische technieken op genoom-schaal wordt benadrukt door dit project. Fysiologische gegevens bevestigden dat een B. subtilis retentostat cultuur nagenoeg alle substraat verbruikt voor onderhoud en dat de onderhoudscoëfficiënt groeisnelheid-onafhankelijk is (Hoofdstuk 4). De verminderde vraag naar bouwstenen als aanpassing aan de verminderde beschikbaarheid van substraat en de verminderde groei is duidelijk terug te vinden in het transcriptoom (Hoofdstuk 5). Transcriptionele regulatie vond plaats bij vele cellulaire processen, voornamelijk bij transport en gebruik van koolhydraten en aminozuren, en biosynthese. Dit onderzoek zou kunnen profiteren van een toekomstige integratie met metaboloom analyse van de cultuur, omdat dit meer inzicht zal geven in de metabole aanpassingen aan de calorische restrictie. Hoewel er door HPLC-analyse geen organische zuren in het cultivatiemedium werden gedetecteerd, dient de voorgestelde dissimilatie van glucose tot kooldioxide en water te worden bevestigd met gasuitwisseling analyse om een volledig beeld van de koolstofbalans krijgen. Naast gegevens op populatie niveau, kan veel worden geleerd van ‘single cell’ experimenten. Genen waarvan bekend is dat ze heterogeen tot expressie komen in typische schudfles cultivatie vormen interessante doelwitten voor ‘single cell’ studies met promotor-GFP fusies in retentostaat culturen. Daarnaast kunnen de regulatoire netwerken die betrokken zijn bij de aanpassing aan de (bijna) niet-groeiende condities, onthuld door transcriptomics (Hoofdstuk 5), worden gescreend op heterogeniteit. Dit kan door gebruik te maken van relevante promotor-GFP fusies. Heterogeniteit kan een belangrijke rol spelen in de eiwitproductie van individuele cellen (Veening et al., 2008b). Screening van genen die betrokken zijn bij de productie van stoffen die van industrieel belang zijn kunnen ingangen voor procesoptimalisatie verschaffen. Scheiding van verschillende subpopulaties (door bijvoorbeeld Fluorescentie geAssisteerde Cel Sortering (FACS)) kan nog meer informatie opleveren. Met een verdere bestudering door transcriptoomanalyse zouden namelijk alle leden van de regulons die heterogeen tot expressie kwamen onthuld kunnen worden.

200


Escherichia coli, Caulobacter crescentus en B. subtilis lijden aan replicatieve veroudering. (A)symmetrisch gedeelde cellen die de oudere cel-pool erven hebben een verminderde groeisnelheid, produceren minder nakomelingen en sterven waarschijnlijk eerder (Ackermann et al., 2003; Stewart et al., 2005; Veening et al., 2008a). Aangezien de celcyclus van de cellen enorm vertraagd is tijdens langdurige retentostaat cultivatie, is de chronologische leeftijd van afzonderlijke cellen toegenomen. De retentostaat zou daarom een interessante cultivatiemethode kunnen bieden voor het bestuderen van veroudering.

Referenties Ackermann, M., Stearns, S.C., and Jenal, U. (2003). Senescence in a bacterium with asymmetric division. Science 300, 1920. Arbige, M., and Chesbro, W.R. (1982). Very slow growth of Bacillus polymyxa: Stringent response and maintenance energy. Arch. Microbiol. 132, 338–344. Baek, J.O., Seo, J.W., Kwon, O., Park, S.M., Kim, C.H., and Kim, I.H. (2012). Production of human papillomavirus type 33 L1 major capsid protein and virus-like particles from Bacillus subtilis to develop a prophylactic vaccine against cervical cancer. Enzyme Microb. Technol. 50, 173–180. Banse, A.V., Chastanet, A., Rahn-Lee, L., Hobbs, E.C., and Losick, R. (2008). Parallel pathways of repression and antirepression governing the transition to stationary phase in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 15547–15552. Bernhardt, J., Weibezahn, J., Scharf, C., and Hecker, M. (2003). Bacillus subtilis during feast and famine: visualization of the overall regulation of protein synthesis during glucose starvation by proteome analysis. Genome Res. 13, 224–237. Bisschops, M.M.M., Zwartjens, P., Keuter, S.G.F., Pronk, J.T., and DaranLapujade, P. (2014). To divide or not to divide: a key role of Rim15 in calorie-restricted yeast cultures. Biochim. Biophys. Acta 1843, 1020–1030. Blencke, H.-M., Homuth, G., Ludwig, H., Mäder, U., Hecker, M., and Stülke, J. (2003). Transcriptional profiling of gene expression in response to glucose in Bacillus subtilis: regulation of the central metabolic pathways. Metab. Eng. 5, 133–149.

201

Addendum

Blom, E.-J., Ridder, A.N.J.A., Lulko, A.T., Roerdink, J.B.T.M., and Kuipers, O.P. (2011). Time-resolved transcriptomics and bioinformatic analyses reveal intrinsic stress responses during batch culture of Bacillus subtilis. PloS One 6, e27160. van Bodegom, P. (2007). Microbial Maintenance: A Critical Review on Its Quantification. Microb. Ecol. 53, 513–523. Boender, L.G.M., de Hulster, E.A.F., van Maris, A.J.A., Daran-Lapujade, P.A.S., and Pronk, J.T. (2009). Quantitative physiology of Saccharomyces cerevisiae at near-zero specific growth rates. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5607–5614. Boender, L.G.M., Maris, A.J.A., Hulster, E.A.F., Almering, M.J.H., Klei, I.J., Veenhuis, M., Winde, J.H., Pronk, J.T., and Daran‐Lapujade, P. (2011). Cellular responses of Saccharomyces cerevisiae at near‐zero growth rates: transcriptome analysis of anaerobic retentostat cultures. FEMS Yeast Res. 11, 603–620. Branda, S.S., González-Pastor, J.E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., and Kolter, R. (2001). Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 11621–11626. Brandberg, T., Gustafsson, L., and Franzen, C. (2007). The impact of severe nitrogen limitation and microaerobic conditions on extended continuous cultivations of Saccharomyces cerevisiae with cell recirculation. Enzyme Microb. Technol. 40, 585–593. Britton, R.A., Eichenberger, P., Gonzalez-Pastor, J.E., Fawcett, P., Monson, R., Losick, R., and Grossman, A.D. (2002). Genome-Wide Analysis of the Stationary-Phase Sigma Factor (Sigma-H) Regulon of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 184, 4881–4890. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., and Prasher, D.C. (1994). Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 802–805. Chesbro, W., Evans, T., and Eifert, R. (1979). Very slow growth of Escherichia coli. J. Bacteriol. 139, 625–638. Cozy, L.M., and Kearns, D.B. (2010). Gene position in a long operon governs motility development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 76, 273–285. Cruz Ramos, H., Hoffmann, T., Marino, M., Nedjari, H., Presecan-Siedel, E., Dreesen, O., Glaser, P., and Jahn, D. (2000). Fermentative Metabolism of

202


Bacillus subtilis: Physiology and Regulation of Gene Expression. J. Bacteriol. 182, 3072–3080. Dauner, M., Storni, T., and Sauer, U. (2001). Bacillus subtilis Metabolism and Energetics in Carbon-Limited and Excess-Carbon Chemostat Culture. J. Bacteriol. 183, 7308–7317. Dawes, I.W., and Mandelstam, J. (1970). Sporulation of Bacillus subtilis in Continuous Culture. J. Bacteriol. 103, 529. van Dijck, P.W.M. (1998). Alzheimer tau test and detergent cellulase: Made by genetic engineering (No. 9 in a series of articles to promote a better understanding of the use of genetic engineering). J. Biotechnol. 66, 229–233. Dubnau, D. (1991). Genetic competence in Bacillus subtilis. Microbiol. Rev. 55, 395– 424. Duclaux, E. (1898). Traité de microbiologie (Paris, Masson et cie). Dworkin, J., and Losick, R. (2005). Developmental Commitment in a Bacterium. Cell 121, 401–409. Ercan, O., Bisschops, M.M.M., Overkamp, W., Jørgensen, T.R., Kuipers, O.P., Ram, A.F., Smid, E.J., Pronk, J.T., Daran-Lapujade, P., and Kleerebezem, M. (submitted). Physiology and transcriptomes of different industrial microbes at near-zero specific growth rates. Submitted. Ercan, O., Smid, E.J., and Kleerebezem, M. (2013). Quantitative physiology of Lactococcus lactis at extreme low-growth rates. Environ. Microbiol. 15, 2319– 2332. Ercan, O., Wels, M., Smid, E.J., and Kleerebezem, M. (2014). Molecular and metabolic adaptations of Lactococcus lactis at near-zero growth rates. Appl. Environ. Microbiol. Errington, J. (2003). Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 1, 117–126. Fawcett, P., Eichenberger, P., Losick, R., and Youngman, P. (2000). The transcriptional profile of early to middle sporulation in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 8063–8068.

203

Addendum

Fujita, Y. (2009). Carbon Catabolite Control of the Metabolic Network in Bacillus subtilis. Fujita, M., and Losick, R. (2005). Evidence that entry into sporulation in Bacillus subtilis is governed by a gradual increase in the level and activity of the master regulator Spo0A. Genes Dev. 19, 2236–2244. Goffin, P., van de Bunt, B., Giovane, M., Leveau, J.H.J., Höppener-Ogawa, S., Teusink, B., and Hugenholtz, J. (2010). Understanding the physiology of Lactobacillus plantarum at zero growth. Mol. Syst. Biol. 6, 413. Herbert, D. (1961). A theoretical analysis of continuous culture systems. In Continuous Culture of Micro-Organisms, (London: Society of chemical industry), pp. 21–53. de Jong, I.G., Veening, J.-W., and Kuipers, O.P. (2010). Heterochronic Phosphorelay Gene Expression as a Source of Heterogeneity in Bacillus subtilis Spore Formation. J. Bacteriol. 192, 2053–2067. de Jong, I.G., Veening, J.-W., and Kuipers, O.P. (2012). Single cell analysis of gene expression patterns during carbon starvation in Bacillus subtilis reveals large phenotypic variation. Environ. Microbiol. 14, 3110–3121. Jørgensen, T.R., Nitsche, B.M., Lamers, G.E., Arentshorst, M., van den Hondel, C.A., and Ram, A.F. (2010). Transcriptomic insights into the physiology of Aspergillus niger approaching a specific growth rate of zero. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5344–5355. Kearns, D.B., and Losick, R. (2005). Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083–3094. Koburger, T., Weibezahn, J., Bernhardt, J., Homuth, G., and Hecker, M. (2005). Genome-wide mRNA profiling in glucose starved Bacillus subtilis cells. Mol. Genet. Genomics 274, 1–12. Kotte, O., Volkmer, B., Radzikowski, J.L., and Heinemann, M. (2014). Phenotypic bistability in Escherichia coli’s central carbon metabolism. Mol. Syst. Biol. 10, 736. Marr, A.G., Nilson, E.H., and Clark, D.J. (1963). The Maintenance Requirement of Escherichia coli. Ann. N. Y. Acad. Sci. 102, 536–548.

204


Mauricio, J.C., Valero, E., Millán, C., and Ortega, J.M. (2001). Changes in nitrogen compounds in must and wine during fermentation and biological aging by flor yeasts. J. Agric. Food Chem. 49, 3310–3315. Mirel, D.B., Estacio, W.F., Mathieu, M., Olmsted, E., Ramirez, J., and MárquezMagaña, L.M. (2000). Environmental regulation of Bacillus subtilis sigma(D)dependent gene expression. J. Bacteriol. 182, 3055–3062. Msadek, T. (1999). When the going gets tough: survival strategies and environmental signaling networks in Bacillus subtilis. Trends Microbiol. 7, 201–207. Nakano, M.M., Dailly, Y.P., Zuber, P., and Clark, D.P. (1997). Characterization of anaerobic fermentative growth of Bacillus subtilis: identification of fermentation end products and genes required for growth. J. Bacteriol. 179, 6749–6755. Navarro Llorens, J.M., Tormo, A., and Martínez-García, E. (2010). Stationary phase in gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 476–495. Nyström, T. (2004). Stationary-Phase Physiology. Annu. Rev. Microbiol. 58, 161– 181. Olmos-Soto, J., and Contreras-Flores, R. (2003). Genetic system constructed to overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 369–373. Papagianni, M. (2012). Recent advances in engineering the central carbon metabolism of industrially important bacteria. Microb. Cell Factories 11, 50. Pirt, S.J. (1965). The maintenance energy of bacteria in growing cultures. Proc. R. Soc. Lond. Ser. B Contain. Pap. Biol. Character R. Soc. G. B. 163, 224–231. Pirt, S.J., and Kurowski, W.M. (1970). An extension of the theory of the chemostat with feedback of organisms. Its experimental realization with a yeast culture. J. Gen. Microbiol. 63, 357–366. Rao, C.V., Glekas, G.D., and Ordal, G.W. (2008). The three adaptation systems of Bacillus subtilis chemotaxis. Trends Microbiol. 16, 480–487. Robleto, E.A., Yasbin, R., Ross, C., and Pedraza-Reyes, M. (2007). Stationary phase mutagenesis in B. subtilis: a paradigm to study genetic diversity programs in cells under stress. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 42, 327–339.

205

Addendum

Schultz, J.S., and Gerhardt, P. (1969). Dialysis culture of microorganisms: design, theory, and results. Bacteriol. Rev. 33, 1–47. Smit, G., Smit, B.A., and Engels, W.J.M. (2005). Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiol. Rev. 29, 591–610. Smits, W.K., Eschevins, C.C., Susanna, K.A., Bron, S., Kuipers, O.P., and Hamoen, L.W. (2005). Stripping Bacillus: ComK auto-stimulation is responsible for the bistable response in competence development. Mol. Microbiol. 56, 604–614. Solopova, A., van Gestel, J., Weissing, F.J., Bachmann, H., Teusink, B., Kok, J., and Kuipers, O.P. (2014). Bet-hedging during bacterial diauxic shift. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 7427–7432. Southward, C.M., and Surette, M.G. (2002). The dynamic microbe: green fluorescent protein brings bacteria to light. Mol. Microbiol. 45, 1191–1196. Steil, L., Serrano, M., Henriques, A.O., and Völker, U. (2005). Genome-wide analysis of temporally regulated and compartment-specific gene expression in sporulating cells of Bacillus subtilis. Microbiol. Read. Engl. 151, 399–420. Steinkraus, K. (2004). Industrialization of Indigenous Fermented Foods, Revised and Expanded. In Industrialization of Indigenous Fermented Foods, Revised and Expanded, (New York: CRC Press), pp. 226–238. Stewart, E.J., Madden, R., Paul, G., and Taddei, F. (2005). Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division. PLoS Biol. 3, e45. Tappe, W., Tomaschewski, C., Rittershaus, S., and Groeneweg, J. (1996). Cultivation of nitrifying bacteria in the retentostat, a simple fermenter with internal biomass retention. FEMS Microbiol. Ecol. 19, 47–52. Tappe, W., Laverman, A., Bohland, M., Braster, M., Rittershaus, S., Groeneweg, J., and Verseveld, H.W. van (1999). Maintenance Energy Demand and Starvation Recovery Dynamics of Nitrosomonas europaea and Nitrobacter winogradskyi Cultivated in a Retentostat with Complete Biomass Retention. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2471–2477. Tijhuis, L., Van Loosdrecht, M.C., and Heijnen, J.J. (1993). A thermodynamically based correlation for maintenance gibbs energy requirements in aerobic and anaerobic chemotrophic growth. Biotechnol. Bioeng. 42, 509–519.

206


Valdivia, R.H., and Cormack, B.P. (2005). The uses of green fluorescent protein in prokaryotes. In Methods of Biochemical Analysis, Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols, M. Chalfie, and S.R. Kain, eds. (John Wiley & Sons), pp. 163–178. Veening, J.-W., Stewart, E.J., Berngruber, T.W., Taddei, F., Kuipers, O.P., and Hamoen, L.W. (2008a). Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4393–4398. Veening, J.-W., Igoshin, O.A., Eijlander, R.T., Nijland, R., Hamoen, L.W., and Kuipers, O.P. (2008b). Transient heterogeneity in extracellular protease production by Bacillus subtilis. Mol. Syst. Biol. 4. Veening, J.-W., Smits, W.K., and Kuipers, O.P. (2008c). Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193–210. van Verseveld, H.W., Arbige, M., and R. Chesbro, W. (1984). Continuous culture of bacteria with biomass retention. Trends Biotechnol. 2, 8–12. van Verseveld, H.W., de Hollander, J.A., Frankena, J., Braster, M., Leeuwerik, F.J., and Stouthamer, A.H. (1986). Modeling of microbial substrate conversion, growth and product formation in a recycling fermentor. Antonie Van Leeuwenhoek 52, 325–342. Wang, S.T., Setlow, B., Conlon, E.M., Lyon, J.L., Imamura, D., Sato, T., Setlow, P., Losick, R., and Eichenberger, P. (2006). The forespore line of gene expression in Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 358, 16–37. Westers, L., Westers, H., and Quax, W.J. (2004). Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Res. 1694, 299–310. Zamboni, N., Mouncey, N., Hohmann, H.-P., and Sauer, U. (2003). Reducing maintenance metabolism by metabolic engineering of respiration improves riboflavin production by Bacillus subtilis. Metab. Eng. 5, 49–55.

207

Addendum

208

Dankwoord

Addendum

210

Dankwoord

Dankwoord Mijn eerste bezoek bij MolGen was als middelbare scholier tijdens een open dag. Hier vertelde Chris den Hengst enthousiast (bedankt!) over het onderzoek dat gedaan werd en dat grofweg 80% van de experimenten mislukken. Gedurende m’n studie kwam ik af en toe bij MolGen terecht voor een cursus of practicum. De onderwerpen en sfeer bij MolGen spraken me aan en het lab voor een onderzoeksstage was dan ook snel gekozen. Het project liep op rolletjes (thanks Jacek Lubelski!) en het was een leuke tijd. Daarna tijd voor het grotere werk: een PhD project. Hier kijk ik met veel plezier op terug en ik weet bijna zeker dat ik inmiddels de bovengenoemde 80% gehaald heb. De overige 20% ligt hier voor je. Mijn herinneringen aan de leuke / gekke / mooie & interessante mensen / onderwerpen / gesprekken / gebeurtenissen & dingen uit deze tijd zijn me erg dierbaar. Natuurlijk is niet alles fantastisch wanneer bioreactors lekken, experimenten mislukken of je door moet werken tot na middernacht, maar MolGen is een hele fijne plek om te werken, met een prachtige mix van mensen die op één of andere manier bij elkaar passen. A place where colleagues turn into friends. Thank you to all that I’ve met throughout those years! Most likely I will forget to mention some of you, apologies for that. Ik wil Oscar Kuipers graag bedanken voor deze PhD positie en begeleiding de afgelopen jaren. Jouw positieve houding, humor en manier van motiveren is aanstekelijk en ik vond onze samenwerking dan ook erg prettig. Zelfs toen mijn project niet verlengd kon worden in verband met opgelopen vertraging door de verhuizing, vond jij een budget zodat ik toch verder kon gaan in het lab met het binnen halen van de benodigde data. Ook bedank ik graag de twee andere MolGen groepsleiders Jan Kok (los van science heb ik genoten van onze gesprekken over kunst e.d.) & Jan-Willem Veening (bedankt voor je scherpe inzichten en suggesties) mooi dat we nog samen gepubliceerd hebben. This thesis is the product of fruitful collaborations with many colleagues. I enjoyed these collaborations and therefore I would like to thank the co-authors of the chapters in this book: Onur Ercan (thanks for hosting me at NIZO, good luck in Sweden!), Michiel Kleerebeezem, Ton van Maris, Katrin Beilharz (Dear paranymph!

211

Addendum

Our time in India was awesome, you’re a great travel partner), Ana Solopova (always enjoyed your cheerfulness), Ruud Detert Oude Weme (Ruudje!), Akos Kovács (dive master, thanks for your guidance in my first year of PhD), Harma Karsens, Martijn Herber (office buddy, best-movie-night organizer, super model). Thanks to other members of the Kluyver Centre for invaluable meetings on the zerogrowth projects; looking forward to the publication of our zero-growth review paper: Jack Pronk, Pascale Daran-Lapujade, Mark Bisschops (succes in Zweden!), Erik de Hulster, Peter Bron, Eddy Smid, Tomas Jorgensen, Arthur Ram, Leonie Boendervan Dijk. Thank you to whom has executed student projects under my supervision: Renske Veenendaal, Reto Zwahlen and Inez de Jong. Ik wil graag de leescommissie en oppositie bedanken voor de geinvesteerde tijd en moeite. Maaike Vergouwen bedankt voor het proefschrift-ontwerp-consult! Thank you to all with whom I shared the office (aka, the Gipsy Cave) and/or the lab: Joao Pinto, Gipsyyy, thank you for being as crazy and passionate as you are. I always enjoyed our talks, you inspire me. We care a lot! Julio Stierdorp Hernandez, never a dull moment when you are around. Bedankt voor het brengen van leven in de brouwerij en voor de lekkere diners op ‘t Damsterdiep! And thanks for snoring on conference night’s. Jeroen Siebring (partner in fermentor crime), mijn lachspieren zijn goed getrained in jouw aanwezigheid. Bedankt voor de movie nights en muziek quizzen op het lab. Ik herinner me nog jouw introductie op het lab: ‘over de muziek worden we het wel eens’. Imkyyyy de Jong (LabBenchBuurvrouw!) het was altijd fijn om jou in de buurt te hebben op t lab, immer cheerful! Reizen met jou in India & Portugal was super! Bogusia Marciniak-Trip, thanks for upgrading my Polish during your computer work ;-) Depeche mode party! Ganesh Visweswaran (‘Come on!’) I really enjoyed our lunch breaks. Thank you for inviting us to your wonderful wedding in India! Maria Grande Burgos (always remember: Después de la tormenta viene la calma), Aleksandra Mironczuk, Mirjam Boonstra, Rustem Khusainov, Maarten Mols, Marielle van den Esker. Thank you Robin Sorg (Dear paranymph! I’m sure I wouldn’t have made it without our every-once-in-a-while ‘The Talk’ ;-) I always enjoy your enthusiasm on

212

Dankwoord

whatever topic. Do you remember that old hidden pub in Wroclaw?), Anne de Jong (jouw hulp bij de DNA microarrays was onmisbaar, bedankt. Succes met de foto’s, onze gesprekken hierover tijdens de pauzes vond ik een fijne afwisseling), Auke van Heel (bedankt voor de goede muziek vanuit het lactis lab), Tom Eckhardt (geen dag gelachen zonder een grap van jou), Robyn Eijlander (altijd fijn met jou praten), Sjoerd van der Meulen (super, die gifkikkers en paddestoelen), Manolo Montalban, Andrius Buivydas, Anne Hesseling, Siger Holsappel, Tomas Kloosterman (Bisphenol A?), Laetitia, Jelle Slager, Morten Kjos, Yoshimitsu Masuda, Jimmy Omony, Tonia Krawczyk, Lieke van Gijtenbeek, Dong Dong Mu, Evert-Jan Blom (I miss the bitty ever since), Claire Price, Sulman Shafeeq, Muhammad Afzal, Irfan Manzoor, Elrike Frenzel, Muhammad Tariq, Liang Zhou, Anne-Stefanie, Rutger Brouwer, Joanna Majchrzykiewics, Araz Zeyniyev. Mijn verblijf van 2 maanden bij NIZO was erg aangenaam en nuttig mede dankzij de volgende mensen: Sven Menschel, Patrick Jansen, Bert van der Bunt, Marjo Starrenburg, Roger Bongers (was een mooie WK wedstrijd), bedankt! De mensen bij MolGen die altijd zorgden dat we door konden gaan met onze wetenschappelijke stuff: Emma Plender-Hartman, Mirelle van Vliet-Zirkzee, Mozes Litaay (jam sessie) en Peter Hes, bedankt! Natuurlijk m’n vrienden buiten MolGen: Jeroen Gerritsen (ik kom gauw weer langs in Deutekom; belde laatst iemand op, dat ie achter de gordijnen stond ofzo) en Sietse Koenders (bedankt voor het maken van Figuur 1 in hoofdstuk 4 en je advies; ik zie je snel in Rotjeknor voor een potje ‘Spank the Monkey’). Ik zie jullie nog voor me, zittend in de basisschool klas als broekies. Ik ben blij dat we nu als iets grotere broekies nog evenveel lol hebben. Niek Kortooms, muziek-guru we gaan gauw weer een concertje doen. Michiel (schijnt binnenkort weer noorderlicht in Nederland te zijn ;-)) & Joris (foto avonturen!) bedankt voor de (winter)kampeer tripjes om het hoofd koel te houden. Geen enkele bios ruikt zo lekker als de RKZbios (of zijn jullie dat?), dus ik kom weer gauw m’n dosis halen. Sander, van metal+bier op donderdagavond naar yoga op dinsdagavond, allebei ultiem ontspannend, met jou als compagnon. Jelmer, deze zomer weer met gitaar bij de hoornseplas. Pim, voor alle Def Jam en spellenavondjes! Thijs, zie je in je nieuwe Utrecht casa!

213

Addendum

Michiel, Jelmer, Pim: Piet Paulusma had het er trouwens over dat ergens dit jaar nog best eens code geel van kracht zou kunnen worden. Niet te vergeten: iedereen die de chill / zwem / slackline / BBQ sessies bij de Hoornseplas extra fijn heeft gemaakt met zijn/haar aanwezigheid. En natuurlijk gaat speciale dank uit naar Alex, voor jouw permanente glimlach. En vergeet niet: ofstand huft gain ofschaaid wezen ;-) Zuster en broeder! Maaike en Juul ik had me geen betere huisgenoten kunnen voorstellen in casa di Jennerstraat. Het was/is altijd warm thuiskomen met jullie in huis. (Ik ben blij dat ik de afwasmachine nog even heb mee mogen maken ;-)). Hold back the river en de groetjes van Inspector Norse. Paps & mams. Jullie zijn de beste. Bedankt voor de mogelijkheid die jullie mij boden om te gaan studeren en jullie onvoorwaardelijke steun. Zonder die fundering had ik ook niet dit romannetje kunnen schrijven. (Bij deze beloof ik ook dat dit het enige proefschrift van mij is die je hoeft te lezen). Lieve Sophie, we hebben samen veel mooie avonturen beleefd sinds onze ontmoeting in het eerste jaar van m’n PhD. Bedankt voor je humor, geduld en liefde in tijden van lekkende fermentors en writer’s blocks. Over de schutting en op naar de volgende avonturen!

Wout

214

List of Publications Overkamp, W., Kuipers, O.P. (2015). Transcriptional profile of Bacillus subtilis sigFmutant during vegetative growth. Submitted for publication. (Chapter 2)

Ercan, O.*, Bisschops, M.M.M.*, Overkamp, W., Jørgensen, T.R., Kuipers, O.P., Ram, A.F., Smid, E.J., Pronk, J.T., Daran-Lapujade, P., and Kleerebezem, M. (2015). Physiology and transcriptomes of different industrial microbes at near-zero specific growth rates. Submitted for publication. *contributed equally (Chapter 4 & 5)

Overkamp, W., Ercan, O., Herber, M., van Maris, A.J.A., Kleerebezem, M., and Kuipers, O.P. (2015). Physiological and cell morphology adaptation of Bacillus subtilis at near-zero specific growth rates: a transcriptome analysis. Environ. Microbiol. 17, 346–363. (Chapter 4 & 5)

Overkamp, W., Beilharz, K.*, Detert Oude Weme, R.*, Solopova, A.*, Karsens, H.*, Kovács, Á.T., Kok, J., Kuipers, O.P., and Veening, J.-W. (2013). Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl. Environ. Microbiol. 79, 6481–6490. *contributed equally (Chapter 3)

Lubelski, J., Overkamp, W., Kluskens, L.D., Moll, G.N., and Kuipers, O.P. (2008). Influence of shifting positions of Ser, Thr, and Cys residues in prenisin on the efficiency of modification reactions and on the antimicrobial activities of the modified prepeptides. Appl. Environ. Microbiol. 74, 4680–4685.

215

216

Samenvatting en Discussie

Recommend Documents