Samenvatting Computationeel onderzoek naar de histamine H4 receptor-ligand interacties Het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift maakt gebruik van moderne computationele medicijn-ontdekkingsmethoden om zo de ligand-receptor interacties beter te begrijpen en om nieuwe verbindingen te ontwikkelen die gericht zijn op de histamine H4 receptor (H4R). Dit subtype van de histamine receptor is in 2000 ontdekt en speelt een belangrijke rol in de pathologie van ontsteking gerelateerde ziektes, zoals astma, allergische rhinitis en pruritis. Door deze veelbelovende toepassingsmogelijkheden heeft de H4R mensen uit de academische - en industriële wereld aangetrokken om gezamenlijk een ontdekkingstocht te ondernemen naar medicijnen gericht op deze receptor. Deze gecombineerde aanpak resulteert in een weelde aan H4R-gerelateerde informatie, waaronder de moleculaire biologie van de receptor en de eigenschappen van H4R liganden. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de scaffolds van bekende H4R liganden en hun structuur-activiteitsrelaties (SAR). Deze ligand-gebaseerde informatie is geïntegreerd met driedimensionale eiwitmodellen die gemaakt zijn aan de hand van homologie modellering en plaatsgerichte mutagenesestudies (SDM). Dit resulteert in een gedetailleerd structureel en moleculair begrip van de H4R-ligand interacties. In hoofdstuk 2 wordt de reikwijdte van dit proefschrift gedefinieerd. De onderzoeken maken gebruik van moderne computationele medicinale chemie methoden om zowel ligand-gebaseerde als eiwit-gebaseerde informatie te analyseren en te integreren, met als doel belangrijke moleculaire eigenschappen gemoeid met de H4R-ligand interacties bloot te leggen. Het hierdoor verkregen inzicht en de moleculaire modellen kunnen gebruikt worden om H4R hit optimalisatie te sturen en om nieuwe H4R liganden te identificeren met behulp van virtuele screeningsprotocollen. In hoofdstuk 3 wordt de creatie van een kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie (QSAR) model van quinazoline sulfonamide-bevattende H4R liganden beschreven. Uit een grote verscheidenheid aan berekende moleculaire descriptoren van deze H4R liganden zijn de eigenschappen die het beste correleren met de H4R geïdentificeerd. Het QSAR model heeft een goed voorspellend vermogen ten aanzien van de affiniteit van quinazolinen met variaties van de sulfonamide groep. Het onderzoek wijst uit dat het deel van de H4R bindingsholte dat de sulfonamide substituenten bindt redelijk klein is, maar dat het evenwel een verscheidenheid aan variaties toestaat. Het is bekend dat het model niet in staat is de affiniteit van een stof te voorspellen wanneer deze structureel verschilt van de liganden die gebruikt zijn voor het trainen van het model. Deze bevindingen geven tevens het toepassingsdomein van het QSAR model aan. In hoofdstuk 4 wordt de creatie van QSAR modellen voor clobenpropit analogen als duaal actieve liganden voor zowel H3R als H4R besproken. De clobenpropit analogen
153
Samenvatting
geven waardevolle informatie voor de identificatie van belangrijke eigenschappen met betrekking tot de H3R - en H4R binding. De groep van descriptoren is verschillend voor de twee histamine receptor subtypes, wat de subtiele verschillen in de ligand binding van deze twee homologe eiwitten reflecteert. De QSAR modellen geven aan dat het onderzoeken van energie gerelateerde descriptoren nuttig kan zijn om selectieve H4R liganden te ontwerpen. De descriptor die het beste in staat is om onderscheid te maken tussen H3 - en H4 affiniteit is E_stb: de potentiële energie descriptor van de verbindingsstrek-buig kruisterm. Dit geeft aan dat de ligand bindingsholte van de H4R nauwer is dan die van de H3R. De geselecteerde descriptoren van de QSAR modellen geven ligand-gebaseerde informatie om zo de driedimensionale computationele modellen van zowel H3R-ligand als H4R-ligand interacties te vervaardigen. In hoofdstuk 5 worden de moleculaire determinanten die de preferentie van duaalactieve liganden voor H3R boven H4R bepalen geïdentificeerd door ligand-gebaseerde QSAR modellen, eiwit-gebaseerde H4R modellen en in silico gestuurde plaatsgerichte mutagenese experimenten. Deze informatie is vervolgens gebruikt om de bindingspose van clobenpropit en zijn analogen in de H4R bindingsholte op te helderen. In lijn met hoofdstuk 3 en 4 geven de QSAR studies aan dat descriptoren gerelateerd aan de grootte van een ligand en de conformationele energie correleren met de H4R bindingsaffiniteit. Deze 2D-QSAR modellen sturen de 3D-QSAR studie, welke de moleculaire interactiepunten identificeert die de eerder genoemde H3R boven H4R preferentie bepaalt. Het koppelen van deze interactiepunten aan specifieke residuen in de H4R modellen heeft de plaatsgerichte mutagenese studies gestuurd om de H4R ligand binding te elucideren. Clobenpropit kan twee verschillende bindingsposes aannemen in de H4R, maar door de additie van een cyclohexyl groep aan de clobenpropit isothiourea groep kan het ligand slechts één bindingsoriëntatie aannemen in de H4R bindingsholte. Dit eiwitmodel, dat sterk ondersteund wordt door ligandgebaseerde experimentele data, geeft nieuwe inzichten in de ligand herkenning door de H4R en is ook bruikbaar om de structuur van andere eiwit-ligand complexen op te helderen. De H4R modellen die ontwikkeld en verfijnd zijn tijdens dit PhD onderzoek zijn gebruikt voor medicijn ontdekking. Het creëren van structuur-gebaseerde virtuele screening (SBVS) protocollen om nieuwe H4R liganden te identificeren is besproken in hoofdstuk 6. De SBVSs zijn gevalideerd door retrospectieve analyses en zijn opvolgend gebruikt om fragmenten te screenen. Deze resultaten tonen aan dat de SBVS protocollen vergelijkbaar zijn met de resultaten van 2D-LBVS met betrekking tot het herkennen van H4R fragmenten, maar de structurele diversiteit van de resulterende hits is hoger wanneer er gebruik gemaakt wordt van de SBVS protocollen. Door de prospectieve screening zijn deze SBVS protocollen gevalideerd als een krachtige methode om nieuwe H4R fragmenten te identificeren in een verzameling van commercieel beschikbare screening stoffen.
154
Intisari Interaksi antara reseptor histamin H4 dengan ligannya: Sebuah studi kimia medisinal komputasi Pemanfaatan pendekatan penemuan obat berbantukan komputer untuk lebih memahami interaksi ligan-reseptor dan pengembangan senyawa baru dengan reseptor histamin H4 (H4R) sebagai target molekuler merupakan bahasan utama disertasi ini. Subtipe H4R ditemukan pada tahun 2000 dan dilaporkan memilki peran penting dalam patofisiologi penyakit-penyakit terkait inflamasi seperti asma, alergi dan pruritis. Potensi tersebut menarik perhatian akademisi dan kalangan industri farmasi untuk bersinergi dalam upaya penemuan obat bertargetkan H4R ini. Upaya bersama tersebut hingga kini telah menghasilkan informasi-informasi penting dan berharga terkait H4R, meliputi biologi molekuler H4R dan karakteristik ligan-ligannya yang disajikan secara komprehensif di Bab 1. Bab tersebut memberikan gambaran hubungan struktur-aktivitas (HSA) liganligan dari H4R yang diintegrasikan dalam model protein tiga dimensi (3D) yang dibentuk berdasar informasi dari studi site-directed mutagenesis (SDM). Hal ini memberikan pemahaman awal bagaimana H4R berinteraksi dengan ligannya. Ruang lingkup disertasi ini didefinisikan pada Bab 2. Tujuan penelitian ini adalah menggunakan pendekatan kimia medisinal komputasi termutakhir untuk menganalisis dan mengintegrasikan informasi-informasi baik yang berbasis ligan maupun berbasis struktur protein untuk mengungkap fitur-fitur molekuler yang memegang peran penting dalam interaksi H4R dengan ligannya. Pemahaman yang diperoleh diwujudkan dalam model matematika maupun model molekul dan digunakan untuk membangun protokol penapisan virtual guna menemukan senyawa aktif H4R baru dan memandu strategi optimasi aktivitas senyawa tersebut. Analisis hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA) turunan quinazolina sulfonamida sebagai ligan H4R dipaparkan dalam Bab 3. Berbagai macam deskriptor molekuler ligan-ligan ini dihitung dan dikorelasikan dengan kekuatan interaksi (afinitas)-nya pada H4R. Deskriptor yang memiliki korelasi terbaik dengan afinitas molekul tersebut pada H4R diidentifikasi dan disajikan dalam satu model persamaan HKSA. Hasil validasi menunjukkan bahwa model HKSA tersebut akurat dalam memprediksi afinitas senyawasenyawa quinazolina sulfonamida dengan variasi substitusi di bagian sulfonamida. Model HKSA ini mengindikasikan keberadaan ruang pada sisi aktif H4R untuk
155
Intisari
berinteraksi secara hidrofobik dengan substituen sulfonamida. Ruang yang relatif terbatas tersebut memiliki konsekuensi bahwa hanya substituen tertentu yang dapat berinteraksi optimal terkait konformasi parsial substituen tersebut. Patut pula diperhatikan bahwa model HKSA yang dikembangkan dalam bab ini gagal saat digunakan untuk memprediksi sebuah senyawa yang secara struktural berbeda dari ligan-ligan yang digunakan dalam pembentukan model. Temuan ini menunjukkan keterbatasan penerapan model HKSA tersebut. Analisis HKSA pada klobenpropit dan turunannya sebagai senyawa yang aktif pada reseptor H3 (H3R) dan H4R disajikan pada Bab 4. Subtipe H3R merupakan homolog terdekat dari H4R dengan kemiripan pada sisi aktif lebih dari 80%. Fitur molekuler yang bertanggungjawab pada selektivitas ligan untuk berikatan dengan H4R dibandingkan dengan reseptor histamin H3R berhasil dikenali. Model-model HKSA yang dihasilkan menunjukkan bahwa untuk mendesain senyawa selektif pada H4R perlu diperhatikan energi potensial stretch-bend cross-term (E_stb) senyawa tersebut. Deskriptor ini juga mengindikasikan bahwa ruang pada sisi aktif H4R untuk interaksi hidrofobik yang ditemukan pada Bab 3 relatif lebih sempit daripada ruang yang serupa pada sisi aktif H3R. Deskriptor-deskriptor yang menyusun model HKSA ini memberikan informasi yang berguna untuk konstruksi model tiga dimensi interaksi ligan-ligan tersebut pada H3R maupun pada H4R. Transformasi pendekatan kimia medisinal komputasi berbasis ligan menjadi berbasis struktur protein dielaborasi pada Bab 5 dengan mengintegrasikan analisis HKSA dan pemodelan homologi molekul 3D H4R, serta studi SDM berdasarkan hasil analisis in silico. Beberapa pendekatan tersebut dikombinasikan untuk mengidentifikasi residu asam amino penentu selektivitas ligan pada H3R dibandingkan pada H4R. Kombinasi berbagai pendekatan ini menghasilkan penjelasan dalam level atomik tentang bagaimana klobenpropit dan analognya berinteraksi dengan H4R. Sejalan dengan Bab 3 dan Bab 4, analisis HKSA dua dimensi (2D) pada Bab 5 menunjukkan bahwa deskriptor penentu selektivitas senyawa adalah deskriptor yang berkaitan dengan ukuran ligan dan energi konformasi. Transformasi informasi ke dalam model 3D diawali dengan menindaklanjuti hasil HKSA 2D dengan analisis HKSA 3D untuk mengidentifikasi bagian spesifik molekul secara tiga dimensi yang menentukan afinitas dan selektivitas ligan tersebut. Analisis secara visual dengan mengkorelasikan posisi-posisi spesifik hasil HKSA 3D dengan residu pada model protein H4R hasil pemodelan homolog menunjukkan residu-residu asam amino H4R yang bertanggung jawab pada selektivitas
156
Intisari
ligan, yang kemudian diverifikasi oleh studi SDM. Hasil verifikasi ini selain mengindentifikasi residu asam amino yang berperan penting dalam selektivitas senyawa juga menunjukkan bahwa klobenpropit mampu mengadopsi dua posisi yang berbeda dalam berikatan dengan H4R, sedangkan penambahan gugus sikloheksil ke bagian isotiourea dari klobenpropit memungkinkan ligan untuk mengadopsi hanya satu orientasi dalam berikatan dengan H4R. Pemodelan molekul yang didukung data eksperimen yang komprehensif ini memberikan informasi pada level atomik bagaimana H4R mengenali ligannya. Pendekatan serupa dapat diaplikasikan pada sistem kompleks ligan-protein yang lain. Penggunaan dalam penemuan obat model 3D kompleks ligan-H4R yang dikembangkan dan disempurnakan dalam penelitian ini disajikan pada Bab 6. Berdasar pada model 3D tersebut, protokol penapisan virtual berbasis struktur (PVBS) dikembangkan untuk mengidentifikasi
ligan
H4 R
baru.
Validasi
terhadap
protokol-protokol
PVBS
bertulangpunggungkan simulasi penambatan molekul yang dikembangkan dlakukan dengan penapisan fragmen H4R aktif secara retrospektif. Hasil validasi menunjukkan bahwa kualitas protokol PVBS sebanding dengan penapisan virtual berbasis ligan (PVBL) dalam mengenali fragmen aktif H4R, tetapi fragmen aktif H4R yang diidentifikasi lebih beragam secara struktural pada penapisan dengan protokol PVBS. Hal ini menunjukkan bahwa PVBS yang dikembangkan dalam disertasi ini berpotensi untuk menemukan dan mengembangkan ligan H4R baru yang berbeda dari yang sudah ditemukan dan diidentifikasi. Protokol PVBS optimal hasil validasi ini digunakan untuk menapis secara prospektif basis data fragmen yang tersedia secara komersial (~6,7 juta fragmen) dan mengusulkan 23 senyawa. Hasil verifikasi secara in vitro menunjukkan bahwa 6 di antara 23 senyawa tersebut memiliki afinitas tinggi (dengan nilai Ki 0,14-6,3 M) pada H4R.
157
Intisari
158
