JurnalSains& Matematika(JSM) Volume 17Nomor 2 April2009
. .. rssN 0854-0675 ArtikelPenelitian: 90-96
ANALISN KUAIiTITATIF B-KAROTEN DAI\[ UJI AKTTVITAS KAROTENOII) DALAM ALGA COKLAT TT]RBINARIA DECURRENS
Fransisca Birantir), Muhammad Nursid2), Bambang C"nyooo" r) LaboratoriumKimia Organik, JurusanKimia MIPA UniversitasDiponegoroJl. hof. Sudarto,Tembalang Semarang50275, Telp/Faks62(024)76480824,E-mail :
[email protected] Balai BesarRisetPengolahanProdukdan Bioteknologi Kelautandan PerikananJl. K.S. Tubun Petamburan " VI Jakarta10260,E-mail :
[email protected]
ABSTRACT---One of the Indonesian marine natural resources, brown alga of Turbinaria decurrens,used in pharmacy in order of carotenoidpigment as sntioxidant. We interestedin analysis p : caroten in Turbinaria decurrensand antioxidqnt and anti-tumor activity. The methodthat is use to divide carotenoid is the hierarclry rnaserationrnethodusing n-huane, ethyl acetateand methanoland then using chromMographycolumn. To analyze the qualitative carotenoid uses HPLC by Crc column and eluen methanol-acetonitrile(3:I). Meanwhile, the test of bioactivity carotene usesradical DPPH (1I'difenil-2pibilhidrozil) to test of antioxidant qnd sitotoksik asscy with MTT [3,(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyltetrcaoliumbromideJfor HeLa tumor cells to test of anti-tumor. The result of this researchis B caroten thqt is in qctract has 0.00387%.Moreover, bioacttvity test showsthat B -carotenfraction doesnot activeto neutralizeof DPPHfree radical than ascorbicaci{ but it showsthe acttvity to kill HeLa tumor cells. Keywords: Turblnaria decunens,Carolenoid,Antioksidan, Antitumor
PNFIDAHULUAFI Senyawa antioksidan memiliki peran yang sangat penting dalam dunia kesehatan mengr4gat kemampuannya dalam menghambat pembentukan radikal bebas (Ladas dkk., 2004), dalam menhambat oksidasi asamnukleat, protein, lemak, DNA sehinggadapatmengurangiberbagaipenyakit degeneratif serta mencega penyakit tumor (McGeedkk.,2006). Penelitian yang mengarah pada penemuan senyawaantioksidanyang dapatmenghambat tumor akhir-akhir ini merupakan topic menarikuntuk dikembangkan,sebagaicontoh analisismengenaiefek dari biota lauf seperti spons Pefrosia cf, Nigricans (Nursid dkk., 2006), spns Sarcophytonglaucum (Zakafia 2006) dan alga coklat seperti Turbinaria conoides (Sheu dkk., 1999). disinyalir merupakan bahan yang dapat digunakan untuk keperluantersebut. Alga coklat dari spesies Tarbinaria merupakan salah satu bahan yang banyak ditemukan di lndonesi4 terutama di daerah rataan terumbu bagian luar seperti daerah
pantai Binangeun Banten dan hampir di seluruh pantai yang banyak terkena ombak langsung (Atmadja, 1996). Hasil penelitian terakhir menyatakan bahwa alga coklat Turbinaria sp. memiliki aktivitasterhadapsel tumor (Wikanta dkk., 2006). Menurut penelitian Chasanah dkk. Q007), diduga s€nyawayang berperanbesardalam aktivitas tersebut berasal dari golongan pigmen karotenoid yang teroksigenasi dalam strukturnya,yaitu fucosantin.Selain senyawa ini, alga coklat secara umum juga mengandung senyawa violaksantin, flavosantin serta neosantin a dan b, sedangkankelompok karotenoidyang umum ditemukan dalam alga ini adalah p-karoten, yakni karotenoid yang tidak rnemiliki atom oksigen dalam strukturnya (Blunt dkk., 2006). Golongan senyawaini sudahdikenal memiliki aktivitas antitumor yang baik (Clevidencedkk., 1997). Hingga saat ini, suatu penelitian yang sistematik mengenai kandungan p-karoten dalamalga coklat Turbinaria decwrens yang tumbuhdi Indonesiabelum pernahdilakukan. Penelitian dimulai dengan isolasi dan
FrqnsiscqBirsrti, MuhammadNursid, BambangCalryono:Analisis Kuantitatif...
90 '
'Artikel Penelitian
fraksinasi untuk mendaptkan karotenoid" diikuti dengan standardisasi dan diakhiri dengan analisis pemanfaatan sebagai antioksidandan anti tumor. BAI{AN DAN METODE Ekstraksi. Sampel Turbinaria decwrens sebanyak I7,4 kg dimaserasi bertingkat (sampai seluruh jaringan terendam) dengan pelarut z-heksana,etil asetat, dan metanol kualitas p.a. Filtrat disaring dengan menggunakan kertas saring Whafrnan, kemudian pelarut diuapkan kembali dengan menggunakan rotary evaporator dan sisa pelarut yang mungkin tertinggal diuapkan denganLabconco Freeze dry. Ekstrak yang diperoleh ditimbang dengan menggunakan neraca analitik, sehingga diperoleh ekstrak kasar n-heksana, etil asetat dan metanol (Allen,2003). Ketiga ekstrak dtuji KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dengan bahan pengemban Aluminium SheetsSilica Gel Merck, standar pkaroten, dalam eluen n-heksana-etilasetat (l/1). Ekstrakyang memiliki hargaRf sama dengan standar, difraksinasi dengan kolom kromatografi silika gel 2 x 30 cm dengan sistem gradient eluen z-heksanadiikuti etil asetat dan kemudian metanol. Eluat yang diperoleh ditampung sehinggadiperoleh 45 eluat. Semua eluat terebut kemudian diuji KLT kembali dengan eluen n-heksana-etil asetat(1/1),untuk menggabungkan hasileluat berdasarkan harga Rf-nya. Eluat yang memiliki spot samadikelompokkanmenjadi satufraksi. Fraksi yang diperoleh kemudian diuapkan pelarutnyadenganrotary evaporatordan sisa pelarut yang mungkin tersisa diuapkan dengan Labcorrco Freeze dry kemudian ditimbang(Wikanta dkk., 2006). Analisis Kuantitatif, Fraksi yang diperoleh, diuji dengan KLT menggunakaneluen zheksana-etilasetat(20:1) denganstandarpkaroten, fraksi yang memiliki Rf sama dengan standar dielusi dengan HPLC Shimadzu, kolom Princeton Omni Crs, detector W-VIS PhotodiodeAooy, dengan fasagerakmetanol-asetonitril(3/1) paAafiow pllmenit. 0,5 Kromatogram fraksi
J. Sains& Mat. Yol 17 No. 2 April2009: 98-104
dibandingkandengankromatogramstandarBkaroten, dengan konsentrasimasing-masing 25, 50, 100, 250 dan 500 ppm. Data yang diperoleh adalahwaktu retensi dan luas area standar, yang kemudian diplotkan menjadi kurva standarkonsentrasiversus luas'area. Dari kurva tersebut maka luas area fraksi diplotkan, sehingga diperoleh hasil konsentrasi(Zhao,2004). Uji Aktivitas Antioksidan. Pengujian dilakukan pada fraksi (ekstrak) dengan menggunakan DPPH pada microplate 96 wel/. Ekstrak dibuat dalam 5 seri konsentrasi 25,5A,100, 500, 1000pg/ml dalamlarutan metanol p.a, masing-masing2 kali ulangan. Sebanyak 160 & ekstrak dari setiap seri konsentrasidimasukkanke dalammicroplate, kemudian ditambahkan40 pl larutan DPPH pada setiap seri konsentrasi.I"arutan DPPH dibuat dengancaramelarutkan3,2 mg DPPH dalam l0 mL metanol p.a. Sebagaikontrol positif di gunakanasamaskorbat(vitamin C) dengan seri konsentrasi dan volume yang sama dengan perlakuan ekstrak. Sebagai blanko digunakanmetanol p.a sebanyak200 pL- Kontrol negatif (tanpaperlakuanekstrak) dibuat dengan cara menambahkan160 pL metanol p.a pada 40 F.L DPPH, dan sebagai kontrol ekstrak, sebanyak 160 pL ekstrak ditambahkan40 pL metanol p.a. Microplate kemudian diinkubasi pada suhu ruang dan tempat yang gelap selama30 menit. Setelah 30 menit absorbansidari tiap sumurandibaca dengan dynex microplate reader pada panjang gelombang 510 nm. Persentase hambatan radikal bebas ditentukan dengan rumus:
o/olnhibisi= (A- B)-(c
- D)
(A_ B)
xlOU/o
Ket A: Absorbansikonfrol negatif (metanol + DPPH), B : Absorbansiblanko (metanol), C: Absorbansiperlakuan(Ekstrak+OPPH),D : Absorbansi kontrol eksfiak (Ekstrak+metanol). Data persentasepenghambatandigunakan untuk mencarinilai Inhibition Concentration 50 (IC50)dalamFg/mL.Nilai ICsoditentukan dengananalisisprobit (Tamat 2007).
9l
" "- Artikel Penelitian
Uji Aktivitas Antitumor. Uji sitotoksik menggunakanMTT pada sel tumor HeLa phasage 30. Pencairansel (cell thawing) dilakukan dengan cara mengeluarkantabung berisi sel dari tangki nitrogen cair dan dibenamkan dalam waterbatchbersuhu37oC.Seluruhcairan sel dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 5mL medium RPMI 1640, kemudian disenhifus dalam kecepatan1500rpm selama5 menit. Setelah itu supernatan dibuang dan pellet yang diperoleh disuspensikandalam 6 mL RPMI suspensisel dipipet dan dimasukkankedalam labu kultur kemudian diinkubasi gelama24 jam dalam inkubator CO2 pada 37"C. Sel yang telah berumur 24 jam dikultur dalam medium RPMI 1640, FBS l0Vo, Fungision 0,5Vodanpenisilin-streptomisin2%. Ekstak dibuat denganseri konsentrasi12,5, 25, 50 dan 100 lrg/ntL dalam media RPMI dengan 3 kali ulangan. Sel dimasukkanke dalam microplate-96well sebanyak100 pL setaradengan10'seVlO0 pL. Kemudiansel diinkubasi selama24 jarn pada37oCdengan aliran COz 5 ml-imenit sampaisel menempel denganbaik. Setelah24 jant sebanyak100 FL sampel ditambahkanpada tiap well. Dalam pengujian ini digunakan 3 kontrol, yaitu kontrol sel (100 pL sel + 100 pL media), kontrol media (200 FL media) dan kontrol sampel(100 pL sampel+ 100 pL media). Miboplate diinkubasikembali selama24 jam dalam inkubator CO1 Setelah 24 jam ditambahkanMTT sebanyak10pL ke dalam tiap well. Microplate diinkubasi kembali selama 4 jam, kemudian reaksi MTT dihentikan dengan cara menambahkan100 & SDS l0o/o. Microplate diinkubasikan kembali selama12 jam pada suhukamar dan dalamkeadaangelap.Setelaht2jarn, kondisi sel di cek denganmikroskop invertedphasecontrast(Rajeshand Gupta,2007).
dalam etil asetatdaripadakedua pelarut lain yang diaplikasikan, sehingga untuk proses pengujian selar{ufirya hanya menggunakan ekstrakkasaretil asetat. Fraksinasi ekstrak kasar etil asetat dengan kromatografikolom. diperolehhasil 45 eluat yang selanjutnya digabung kembali didasarkan pada kesamaanharga Rf pada KLT sehinggadiperoleh9 fraksi. Kesembilan fraksi diuji KLT kembali denganstandarBkarotendalameluenn-heksana-etil asetat1:1. Dari spot-spot yang terdapat pada KLT diperolehhasil fraksi 1 rnemiliki spot dengan hargaRf yang samadenganstandar.Dilihat dari sifat fisik fraksi 1 yang berwarnamerah kekuningan,maka dugaankarotenoidberada dalam ftaksi tersebutselarasdenganliteratur yang menyatakan bahwa karotenoid merupakanpigmen berwama warna kuning, oranyedanmerah(Gross,1991). Senyawap-karotendalamfraksi 1 ditentukan kadarnya dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi atau HPLC dengan standar eksternal(Zhao, 2004). Untuk mendapatkan kadar B-karoten, data kromatogram standar diplotkan pada kurva kalibrasi sebagai berikut: XunaKalibrrci Shdarp.hmbn
0m m t400 o
r Ssi€sl
:3m jm
LIlg
y:0,83r&+90,s =0,97S R2
100 0 2S
4S
Kurettm{(pprf
HASIL DAI\TPEMBAHASAI\I Dalam penelitian ini, kshak kasar dari Turbinaria decuwenstelah diperolehmelalui ekshaksi kasar z-heksana, etil.asetat dan metanol. Analisis ketiga ekstrak tersebut dengan KLT menujukkan bahwa ekstrak kasar etil asetatmemiliki spot samadengan standar, jadi karotenoid diduga lebih larut
Gambar l. Kurva kalibrasi standar B-karoten Langkah selanjutnyaekstrak karoten dalam fraksi I diiqiek ke dalam IIPLC dengan kondisi yang sama denganstandar,hasilnya kromatogramberikut:
FransiscaBiranti, MuhammadNursid, BambangCahyono:Analisis Kuantitatif,..
92
Artikel Penelitian
riq G
€o
rfllr('ner,
DrE{(krire)
n
Gambar3. Reaksipenetralanradikal DPPH
tItrdtur*uSlmntl
Gambar2. KromatogramFraksi 1 Ekstrak Etil asetatTurbinaria decurrens Dari kromatogram maka disimpulkan terdapat 2 senyawa karotenoid yang terdeteksi pada par{ang gelombang440nm. Ditinjau dari waktu retensinya, maka area yang mendekati standar adalah puncak 2. Dengan memplotkan pada persamaanlinier dari kurva standarp-karoten,diperoleh hasil kadar B-karoten dalam ekstrak etil asetat sebesar38,7Yo. Aktivitas antioksidan karotenoid ditentukan dengan penetralanradikal bebas DPPH atau 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (Wikanta, 2006). Prinsip yang digunakan dalam uji ini adalahabsorbansidari radikal yang dinefralkan oleh karotenoid sebanding dengan aktivitas karotenoid sebagai antioksidan. Uji ini merupakanuji positifnegatif yang dipilih karena cepat dalam menentukan aktivitas antioksidan dalam sampel. Radikal DPPH yang telah dib€ri ekstrak akan mengalami perubahan warna dari ungu menjadi kuning perubahanwarna tersebut diukur absorbansinyapada panjang gelombang510 nm karenaabsorbansiDPPH maksimumpadapanjanggelombang510-520 nm (Miliauskas dkk., 2003). Perubahan warna terjadi karena ada reaksi antara molekul 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil(DPPH*) denganatom H yang dilepaskanoleh molekul komponen bahan uji (senyawaantioksidan) sehingga terbentuk senyawa 1,1-difenil-2pikrilhidrazin (DPPH)yang berwarnakuning.
J. Sains& MaL Vol 17 No.2 April 2009: 90-96
Nilai absorbansidikonversi menjadi nilai inhibisi (hambatan). Besarnya nilai persen inhibisi digunakan sebagai data untuk menghitung nilai ICso, ya$B ditentukan denganmenggunkanaanalisis probit. hobit merupakanmetode statistik yang digunakan untuk menentukan hubungan antara dosis (stimultan) dan respon yang dihasilkan. Hasilnya kemudiandiplotkan kedalamgraf* kurva linier log konsentrasi versus probit (gambar4.). Aktivihs anliohkhn frahiI 456 4,5 1,45 . 1,1
5+s !.4,r 425 12 4,15 1,1
o Sedesl UfH
y=0,2S*+qqB4 fi2:[,!g44
Gambar4. Kurva linier log konsentrasiVS probit fraksi 1 ekstraketil asetatsampel Turbinaria decurrens Dari persamaan linier y : 0,2384x+ 3,8034, maka diperoleh ICsodari karotenoid sebesar 104543,08 ppm. Sebagai pembanding aktivitas antioksidan, digunakan asam askorbatdenganhasil nilai IC5s 53,39ppm. Altivitas antioksidankar,otenoiddalam alga coklat Turbinaria dec rens sebesarA,A50A aktivitas asamaskorbat.
93
' ^' Artikel Penelitian
Uji aktivitas antitumor dilakuakan dengan uji sitotoksik denganmenggunakansel tumor lestariHeLa. Prinsip dari metodeMTT adalah reaksi reduksi seluler yang didasarkanpada pemecahan garam tetrazolium MTT yang berwarna kuning menjadi kristal fonnazan yang berwarna biru keunguan (Gambar 5). Enzim suksinat dehidrogenase pada mitokondriasel hidup mampumemecahMTT menjadi kristal formazan (Atkin, 1983). Reaksitersebutmelibatkanpiridin nukleotida kofaktor NADH dan NADPH yang hanya dikatalisis oleh sel hidup, sehinggajumlah formazan yang terbentuk sebandingdengan jumlah sel yang hidup (Zachary, 2003). Semakin banyak sel yang hidup, semakin banyakkristal formazanyangterbentuk.
Dari gambar mikroskopik sel lestari HeLa, setelah penambahan ekstrak sfuktur morfologi sel semakin berubah sebanding dengan kenaikan dosis yang ditambahkan. Al*ivitas sitotoksik pada fraksi p-karoten diperkuat dengangambarankristal formazan yangdisajikanpadagambarberikut:
Gambar7. Kristal Formazanyangterbentuk MTT setelahpenambahan
Gambar5. ReaksipemecahanMTT menjadi kristal formazan Sel HeLa merupakan sel tumor ephitelial pada organ cervical cmcinoma manusia. Setelah penambahan B-karoten pada sel HeLa, terlihat bentuk morfologi sel pada gambar6
Dari gambar7 terlihat hasil kristal formazan yang terbentuksemakinberkurangsebanding dengan kenaikan dosis ekstrak yang ditambahkan pada sel. Jadi B-karoten memiliki aktivitas sitotoksik pada sel tumor HeLapadakonsenfasi50-100ppm. SIMPT'LAI\I Kadar p-karotendalamalga coklat Turbinoria decurrens yang diambil dari daerah pasang surut pantai Binuangeun,Banten pada bulan Februari 2008, sebesar38,7ppmdari ekstrak Turbinaria decttrrens. Dalam penelitian ini karotenoid yang diisolasi dari Turbinafio decurrens tidak menunjukkan aktivitas antioksidan ter,hadapradikal DPPH tetapi menu4iukkanaktivitas sitotoksikterhadapsel tumorHeLa. UCAPAI\I TERIMAKASIII
Gambar6. Bentukmorfologi sel lestariHeLa setelahpenambahanFkaroten
UcapanterimakasihkepadaBalai BesarRiset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautandan Perikananyang telah mendanai serta menyediakanseluruh alat dan bahan yangdigunakandalampenelitianini.
FransiscaBiranti, MuhammadNursid, BambangCahyono:Analkis Kuantitatif,,.
94
Artikel Peneliticnt
DAFTAR PUSTAKA Michael,R.,2003, 1. Allen, S.D.,Rusnack, "Process for Extracting Carotenoids from Fruits and Vegetable Processing 'Waste'',USPatent,USA, No.7I 38152. 2. Atkr& B.M-, 1983, "Preventing Cell Culture Contamination", Journal of Forma ScientiJic,No. 1-800-848-3080, 2-6. 3. Atmadja, W.S., Kadi, A., Sulistijo, Rachmaniar, 1996, "PengenalanJenisjenis Rumput Laut Indonesia", PuslitbangOseanologi-LPl, Jakart4 5657,75-77. 4. Blunt, J.W., Brent R.C., Murray, H.G.M., Peter, T.N., Michele, R.P., 2006, *Marine Natural Products", The Royal Societyof ClrcmistryJ. Nat. Prod., (23),26-78. 5. Chasanah,E., Wikanta, T., Sri A., Fajarningsih,N.D., Marraskuranto,8., Nursid M., Januar,H.L, 2007, "Riset Isolasi Dan Uji Farmakologi Senyawa Bioaktif dari Biota Laut', Laporan Teknis Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan perikanan, Badan Riset Kelautan dan perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan,Jakarta. 6. Clevidence,8.A., Khachilq F., Brown, E.D., Nair, P.P.,Wiley, E.R., Prior, R.I., Cao, G., Morel, D.W., Stone, W., Ktamer, T.R., 1997, "Human Consumption of Carotenoid-Rich Vegetables",AOCS Press,Champaign, Illinoids. 7. Gross, J., 1991, '?igments In Vegetables: Chlorophylls and Carotenoids", Van Nostrand Reinhold, New York, 90-91,I 01-l 05. 8. McGee,S.A., Sharee,A.W., Janet,D.P., 2006, *What Advanced Practice About Free Radicals", T'heIntemet Jownal of Advance Nursing Practise, Kansas, Vol.6No.1,l-9. 9. Nursi4 M, Wikanta T. , Fajarningsih, N.D., Marraskuranto, E., 2006, "Aktivitas Sitotoksik, Induksi Apoptosis dan Ekspresi Gen p53 Fraksi Metanol
J. Sains& Mat. Vol 17 No.2 April2009: 90-96
Spons Petrosia cf, nigricans Terhadap Sel Tumor HeLa", Jarnal Pascapanen dan Biatebtologi Kelautan dan Perikanon,Vol.1, No. 2, Desember,10311 0 . 10. Rajeslq S. and G.tpta A.K., 2AA7, "Antimicrobial and Antitumor Activity of The FractionatedExtracsof Kalimuli (Curculigo orchioides)'0, hil Green PharmResearchArticle Departementof Chemisty Agra College, Agra-Yttar Pradesh,lndiu2:34-6. 11. Sheu,J.H.,Wang G.H., SungoP.J.,and Duh, C.Y., 1999, 'T.Iew Cytotoxic OxygenatedFucosterolfrom the Brown Algae Turbinaria conoides", J.Nat. Prod.,62(2),224-227. 12. Tamat, S.R., Wikanta T., Lin4 S.M., 2007, *Aktivitas Antioksidan dan ToksisitasSenyawaBioaktif dari Ekstrak Rumput Laut Hrjau Wva Reticulata Forsskal", Jurnal llmu Kefarmasimt Indonesia, Jakarta vol. 5 no. I,3l-36. 13. Wikanta, T., Chasanah,8., Amini, S., Nursid, M., Fajarningsih,N.D., Januar, H.I., Marraskuranto,E., 2006, "Riset Isolasi dan Uji Farmakologi Senyawa Bioaktif dari Biota Laut", Laporan Tefuris Balai Besar Riset Pengolahmt Produk dm Biotebtologi Kela*an dan Perilunan, Badan Riset Kelautandan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan,Jakarta,3,9-I3, 32-36. 14. Wikanta T., Tamat, S.R, Magdalen4 S.M., 2006, "Identifikasi, Uji Antioksidan,dan Uji ToksisitasSenyawa Bioaktif dalam Caulerpo sertularioides (Vahl.) C. Agardooo Jurnal llmu Kefarmasian Indonesia, Jakart4 JIFI vol.4 no.1,25-32. 15.Z-akafia,Y.A., 2006,* Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etil Asetat Karang Lunak (Quoy & Sarcophyton glarcum Gaimard) terhadap Sel Lestari Tumor HeLa", Skripsi Universitas Pancasila FakultasFarmasi,Jakarta. 16. Ztno,B., Su-Yin"T., Jia, I,., Mui, H.L., Lionel, K.H.L., Shabbir, M.M., 2004, "SimultaneusDeterminationof Vitamin
95
Artikel Penelitian
C, E and Beta Carotene in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatographywith PhotodiodeArray Detectiono'" Journal Medical and
Enviromental Resesrch Institute, DSO National Laboratories, Singapore,Vol. 7, No. 2,200-204.
FransiscaBirmti, MuhammadNursid,BambangCahyono:Analisis Kuontitatif...
96'
