RNDr. Marie Karlíková, PhD. Lékařská fakulta UK Plzeň
Matrixové metalloproteinázy jsou skupina zink-dependentních enzymů se schopností proteolyticky štěpit téměř všechny složky extracelulární matrix (ECM) a bazální membrány.
MMPs se účastní téměř všech biologických procesů, kde docházů k degradaci a remodelaci ECM: ◦ fyziologické procesy (embryogeneze, hojení ran, morfogeneze, angiogeneze,..) – regulovaná remodelace ECM ◦ patologické procesy (artritida, kardiovaskulární onemocnění, nádorová onemocnění,..) – dysregulovaná remodelace ECM
Jsou obsaženy v organismu obratlovců, bezobratlých i rostlin V lidském genomu je 24 genů kódujících 23 MMPs (duplicitní gen Mmp23) Obdobná struktura, jednotlivé MMPs se liší substrátovou specificitou Většina MMPs má širokou substrátovou specificitu
Van der Jagd et al., J Surg Oncology, 2010;101:259–269
Fig. 2. The three-dimensional diagram of human proMMP-2 and TIMP-2 complex. The pro-domain is shown in green, catalytic domain in red, fibronectin type II domains in blue, hemopexin domain in orange, and TIMP-2 in pink. Zinc ion is in green sphere, calcium ion in blue sphere and disulfide bonds in yellow. The image was prepared by Rob Visse of Imperial College London based on Brookhaven Protein Data Bank entry 1GXD
Podle
struktury
Podle
substrátu
Folgueras et al., Int. J. Dev. Biol. 48: 411-424 (2004)
Kolagenázy Želatinázy Stromelysiny Matrilysiny Membránově vázané MMP (MT(MT-MMP) Ostatní
Kolagenázy
Nomenklatur a
Název
Substráty
MMP-1
Kolagenáza-1, intersticiální)
Kolageny (I, II, III, VII, VIII a X), želatina, proteoglykany, entaktin, tenaskin, MMP-2, MMP-9
MMP-8
Kolagenáza-2, neutrofilová)
Kolageny (I, II, III, V, VII, VIII a X), želatina, proteoglykany, entaktin, tenaskin
MMP-13
Kolagenáza-3
Kolageny (I, II, III, IV, IX, X a XIV), želatina, MMP-9
MMP-18
Kolagenáza-4
neznámý
Želatinázy (Gelatinases)
Nomenklatu ra
Název
Substráty
MMPMMP-2
Želatináza A, želatináza 72 kDa
Kolageny (I, IV, V, VII, X, XI a XIV), želatina, elastin, fibronectin, agrekan, MBP, osteonektin, laminin-1, MMP1, MMP-9, MMP-13
MMPMMP-9
Želatináza B, želatináza 92 kDa
Kolageny (IV, V, VII, X a XIV), želatina, fibronectin, elastin, plasminogen, agrekan, vitronektin
Stromelysiny
Nomenklatura
Název
Substráty
MMP-3
Stromelysin-1
Kolageny (III, IV, V a IX), želatina, agrekan, perlekan, dekorin, laminin, elastin, kasein, osteonektin, ovostatin, antaktin, plasminogen, MBP, IL-1β, MMP2/TIMP-2, MMP-7, -8, -9, -13
MMP-10
Stromelysin -2
Kolageny (III-V), želatina, kasein, agrekan, elastin, MMP-1, -8
MMP-11
Stromelysin -3
Želatin, kolagen IV, fibronektin, kasein, agrekan, proteoglykany
MMP-19
RASI
Kolagen IV, želatina, agrekan, fibronektin, laminin, entaktin, fibrin, fibrinogen
Matrilysiny
Nomenklatura
Název
Substráty
MMP-7
Matrilysin-1
Kolageny (III, IV, V, IX, X a XI), želatina, agrekan, dekorin, fibronektin, laminin, entaktin, elastin, kasein, transferin, plasminogen, MBP, β4integrin, MMP-1, -2, -9, MMP-9/TIMP-1
MMP-26
Endometáza, matrilysin-2
Želatina, fibrinogen, fibronektin, vitronektin, kolagen IV, elastin, proMMP-9
Membránově vázané MMP (MT(MT-MMP)
Nomenklatura
Název
Substráty
MMP-14
MT1-MMP
Kolageny (I-III), želatina, kasein, fibronektin, laminin, vitronektin, entaktin, proteoglykany, MMP-2, 13
MMP-15
MT2-MMP
Fibronektin, entaktin, laminin, perlekan, MMP-2
MMP-16
MT3-MMP
Kolagen III, želatina, kasein, fibronektin, MMP-2
MMP-17
MT4-MMP
Želatin, pro MMP-2
MMP-24
MT5-MMP
Proteoglykany, proMMP-2, kolagen I, želatin, fibronektin, laminin
MMP-25
MT6-MMP
Pro-želatináza A, fibrin, fibronektin, kolagen IV, želatina, pro MMP-9, pro MMP-8
Ostatní MMP
Nomenklatura Název
Substráty
MMP-12
Makrofágová Kolagen IV, želatina,fibronektin, metaloelastáza laminin, entaktin, elastin, kasein, fibrinogen, fibrin, plasminogen, MBP
MMP-20
Enamelysin
MMP-23 MMP-28
Amelogenin, agrekan želatin
Epilysin
Kasein
3 typy endogenní regulace:
Na úrovni genové exprese – aktivace x suprese aktivace proenzymu – mechanismus „cysteine-switch“ (cysteinové sepnutí) regulace enzymatické aktivity – inhibitory β2-makroglobulin, TIMPs, regulátory EMMPRIN, RECK
MMPs jsou exprimovány jako proenzymy a jsou aktivovány mimo buňku odštěpením propeptidové domény (proteolytická proteolytická aktivace) aktivace – vzájemná aktivace MMPs
EMMPRIN (basigin, CD147) glykoprotein, vyskytuje se v normálních tkáních, zvýšený v nádorových buňkách. Je produkován na povrchu nádorových buněk a vyvolává tvorbu několika typů MMPs přilehlými fibroblasty a endoteliálními buňkami
Potenciální protinádorová terapie snížení hladiny EMMPRIN: Prostřednictvím protilátek Snížením jeho exprese
Menashi et al., Connective Tissue Research, 49:175–179, 2008
β2-makroglobulin – nespecifická inhibice, reguluje MMPs v tekuté fázi TIMPs (tissue inhibitor of MMP Další proteiny inhibují selektivně některé MMPs, např. RECK (supresor angiogeneze) miRNA Syntetické MMPIs
TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4 tvoří s MMP komplexy a blokují vazebná místa Jednotlivé TIMPs schopné inhibovat široké spektrum MMPs
Nelson et al., 2000, J Clin Oncol 18:1135-1149
Remodelace ECM prostřednictvím proteolýzy migrace nádorových buněk, metastazování (pokročilá stadia nádor. onemocnění) Aktivátory molekul (komplexní a často duální funkce jednotlivých MMPs) : ◦ uvolňování
◦ ◦ ◦ ◦
chemokinů, angiogenetických faktorů, adhezivních molekul,
aktivace růstových faktorů (např. MMP-9 VEGF) ztráta adheze buněk, iniciace nebo naopak suprese apoptozy, suprese nebo naopak stimulace imunitních reakcí
vliv již v časných stadiích nádor. onemocnění
Rao, Nature Reviews Cancer 3, 489-501 (July 2003)
Zvýšené hladiny většiny MMPs u nádorových onemocnění (především v pozdějších stadiích) možnost využití inhibitorů MMPs pro terapii? Některé MMP – snížené hladiny u nádorových onemocnění – opačný efekt Patofyziologické funkce MMP jsou složitější než se předpokládalo
U nádorových onemocnění je většina MMPs vylučována pojivovými buňkami v okolí nádoru (méně často maligními buňkami
maligní buňky mohou stimulovat toto vylučování pomocí interleukinů, interferonů, růstových faktorů,…
Některé MMPs - význam pro prognózu onemocnění nebo pro monitoring TIMP1 – marker pro časnou detekci? TIMPs – nevhodné pro terapii, neboť jsou širokospektrální a inhibují i MMPs, které nejsou zvýšené nebo které mají pozitivní efekt, tím pádem interferují s přirozenou obranou organizmu TIMP1, RECK, miRNA – pro rozlišení stadií s nízkým a vysokým rizikem
TIMPs – nevhodné jako terapeutika, neboť jsou širokospektrální a inhibují i MMPs, které nejsou zvýšené nebo které mají pozitivní efekt, tím pádem interferují s přirozenou obranou organizmu Syntetické MMPs (batimastat, marimastat) – experimentální studie ok, klinické studie s neuspokojivým výsledkem Potenciální protinádorová terapie - snížení hladiny EMMPRIN: Prostřednictvím protilátek Snížením jeho exprese
Imunohistochemie a imunocytometrieimunocytometrie-
stanovení v tkáni, výhoda: lokalizace v tumoru Metody molekulární biologie
Elektroforéza in situ – stanovení proteázových aktivit v řezu tkáně
Multiplex RTRT-PCR
– stanovení genových expresí v
buňkách/tkáních
Imunoanalytické metody ELISA – stanovení v tkáňovém extraktu nebo séru/plazmě, využití: monitoring
multiplexová technologie xMAP – simultánní stanovení v tkáňovém extraktu nebo séru/plazmě
WideScreen® Human MMP Panel (Merck/Novagen, Německo) ◦ stanovení MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-10 and MMP-13 (aktivních, pro-enzymů i vázaných na TIMPs) v lidském séru, plazmě a supernatantu tkáňových kultur
Fluorokine MAP Multiplex Human MMP Panel (RD Systems, USA) ◦ stanovení MMP-1, MMP-8, MMP-2, MMP-9, MMP-3, MMP-12, MMP-7, MMP-13 v lidském séru, plazmě a supernatantu tkáňových kultur
Fluorokine MAP Human TIMP Multiplex Kit ◦ Stanovení TIMP-1, -2, -3, -4 v lidském séru, plazmě, moči, slinách a buněčném supernatantu
MILLIPLEX MAP Human MMP Panel 1 (Millipore, USA) ◦ MMP-3, -12, -13 MILLIPLEX MAP Human MMP Panel 2 ◦ MMP-1, -2, -7, -9, -10 Human TIMP Panel 1 (TIMP-1, -2) pro vzorky séra a plazmy Human TIMP Panel 2 (TIMP-1, -2, -3, -4) pro vzorky buněčných a tkáňových kultur Jednotlivé MMPs nebo v kombinaci s dalšími analyty (MMP 9 + adhezní molekuly,..)
Van der Jagd et al: Metalloproteinases and their regulation in colorectal cancer. Journal of Surgical Oncology 2010;101:259–269 Rodriguez et al: Matrix metalloproteinases: What do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics (review). Biochimica et Biophysica Acta 1803 (2010) 39–54 Koehrmann et al: Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in primary human breast cancer and breast cancer cell lines: New findings and review of the literature. BMC Cancer 2009, 9:188 Jezierska and Motyl: Matrix Metalloproteinase-2 involvement in breast cancer progression: A mini-review. Med Sci Monit, 2009; 15(2): RA32-40 Murphy and Nagase: Progress in matrix metalloproteinase research. Molecular Aspects of Medicine 29 (2008) 290–308 Jodele et al: Modifying the soil to affect the seed: role of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer progression. Cancer Metastasis Rev (2006) 25: 35–43 Folgueraz et al.: Matrix metalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies. Int. J. Dev. Biol. 48: 411-424 (2004)
