Relaxace a chemická výměna
excitace
relaxace
Relaxační doby Metody měření relaxačních dob Relaxační mechanismy Dipól-dipólová relaxace Nukleární Overhauserův efekt Příklad – dynamika trisacharidu Chemická výměna + příklady
Pár definic • Abychom mohli pochopit relaxace, je nutné zavést statistický soubor spinů. • To je v praxi celý vzorek pro NMR měření, čili cca 1023 spinových systémů. Takový soubor se popisuje pomocí statistické fyziky (⇒ např. Boltzmannovo rozdělení obsazení energetických hladin). • Hodnoty fyzikálních veličin v takovém souboru mohou fluktuovat. • Magnetizace vzorku, kterou měříme je hustota magnetického dipólového momenu = vektorový součet příspěvků jednotlivých jader / objem vzorku. • Proto precese kolem statického magnetického pole neprobíhá pro každý ekvivalentní spin přesně stejnou úhlovou rychlostí, a tedy nemáme nekonečně úzké čáry ve spektru.
Detailnější pohled na relaxaci jaderné magnetizace Podélná relaxace snižování energie souboru jaderných spinů a jeji přenos na „mřížku“. Příčná relaxace – ztráta koherence precese mezi jednotlivými spiny
z
Průběh relaxace v čase:
M
Mz
y
T1 = 2 s T2 = 2 s Ω/2π = 1 Hz
Mxy
x
y x
Mz
Obrázek upraven podle knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, Chichester 2002.
Mxy
t
t
Relaxační jevy Relaxace je proces navracení spinového systému do rovnováhy (nebo do stacionárního stavu). Fenomenologicky jsou zavedeny dva základní druhy relaxace, které se popisují jako exponenciální v čase. To je ve skutečnosti zjednodušení, které platí jen za speciálních podmínek!!!!! Podélná (= longitudinální, spin-mřížková) relaxace (T1): • Týká se komponenty Mz spinové magnetizace, která je rovnoběžná s magnetickým polem v ose z. - Spinový systém ztrácí energii – energie se přenáší na okolí (mřížku) ve formě tepla. - Dipolární interakce s ostatnimi spiny, interakce s paramagnetickými částicemi, apod...
z
Mz x y
z
Příčná (= transversální, spin-spinová) relaxace (T2): • Týká se komponent magnetizace Mxy, které leží v rovině <xy>. - Spin-spinové interakce rozfázují Mxy - přispívá též nehomogenita magnetického pole. - nemůže být větší než T1.
x y
Mxy
Detailnější pohled na příčnou relaxaci y
Rozfázování = ztráta koherence. Důvody: • Fluktuace silových polí působících na jednotlivé spiny (síly mohou mít původ ve vzorku samotném nebo v okolí). • Statické nehomogenity magnetického pole. Platí
T2 ≤ T1 (pro běžné vzorky)
obecně
T2 ≤ 2T1
x
rozfázování
Pokles x,y-magnetizace Mx,y při volné precesi:
Mx,y M0
Mx,y = M0exp(-t/T2) t
NMR spektrum vzniká jako Fourierova transformace FIDu, a tedy rychlost poklesu FIDu ovlivňuje tvar spektra.
Detailnější pohled na příčnou relaxaci (pokrač.) Po Fourierově transformaci F (Mx(t)) dostaneme Lorentzovu křivku se šířkou ∆ν (Hz) v polovině výšky:
∆ν Velikost chemického posunu určuje pozici čáry. Relaxace určuje její tvar !!!!
∆ν=1/πT2
0/2π
Příspěvek nehomogenity magnetického pole 1/T2n se nazývá nehomogenní rozšíření a většinou není zajímavý a snažíme se ho odstranit – shimování magnetického pole, vhodný tvar vzorku, kvalitní kyvety apod.
Změna značení: 1/T2* = 1/T2 + 1/T2n Rychlost poklesu FIDu je nyní dána 1/T2*. Potenciálně zajímavá informace je skryta jen ve složce 1/T2 (homogenní rozšíření). Vždy, když budete chtít ze spektra odečítat pološířky čar, si vzpomeňte, že obsahují nehomogenní rozšíření, které je těžké oddělit – pološířka je levná, ale mnohdy nepřesná informace!!!!
Spinové echo
90x
180y
techo/2
techo/2
• Vektorová analýza po 90x pulzu (v rotující soustavě souřadné): z
Mx,y y
180y
techo/2
≡
y
x
techo/2
y
y
x
x
x
rozfázování
refokusace
Dojde ke kompenzaci statických nehomogenit mag. pole (nehomogenní rozšíření). Úbytek Mx,y je v důsledku fluktuací lokálních polí v místě každého spinu.
x
Mx,y
Mx,y = M0exp(-t/T2)
M0 t
Metody měření relaxačních dob Nejlepší metoda pro měření T2 je sekvence CPMG (Carr, Purcell, Meiboom, Gill) – mnohonásobné spinové echo s konstantním echočasem a proměnným počtem cyklů n.
90x
Typické nastavení pro 13C:
180y techo/2
techo = 1 ms
techo/2
délka pulzu << techo << 1/2JCH n
(Heteronukleární případ – decoupling)
Komplikace Spinové echo je ovlivněno J-interakcí – zejména homonukleární Velké množství pulzů – nutnost velmi přesné kalibrace pulzů, jinak vznikají artefakty. Shrnutí Přesné měření T2 patří ve skutečnosti mezi obtížné experimenty. Spinové echo se velmi často používá jako segment pulzních sekvencí s jiným určením.
Inversion recovery Podélná relaxační doba T1 – návrat po inverzi (inversion recovery). 180
90x
mix
Analýza pomocí vektorového modelu: z
z y 180 x
z y
y mix x
x
z 90x
y FT x
Během směšovací periody mix necháme z-složku magnetizace relaxovat. Postupně v následných experimentech měníme délku mix.
Inversion recovery (pokračování)
intensity
Když vyneseme závislost intenzity signálu na směšovacím čase mix, dostaneme exponenciální závislost.
mix I(mix) = I∞ * ( 1 - 2 * e - mix / T1 )
• Velmi robustní metoda – získaná hodnota T1 závisí velmi málo na přesné kalibraci pulzů (jen její statistická přesnost). Případně je vhodné nahradit faktor 2 ve vzorci proměnným parametrem. Měřit raději T1 než T2 !!!!
K čemu je vůbec detailní znalost relaxací dobrá? a) Optimalizace NMR experimentů: optimální nastavení relaxační periody, která determinuje celkovou délku experimentu s více skeny. b) Nové informace o vzorku. Otázky: ¾ Proč je někdy relaxační doba krátká, jindy dlouhá? ¾ Jak souvisí relaxační doby s velikostí molekuly, vzdáleností jednotlivých spinů, s druhem rozpouštědla?
Relaxační mechanismy Bo = 0
Bo > 0 Zeemanova interakce + isotropní ch. posun
Bo > 0 ostatní interakce, pro které 〈H〉 ≠ 0
∆E = hJ/2
β ∆E=hν α
∆E = hJ/2
• Každá interakce (působení) je charakterizována svým energetickým příspěvkem k celkové energii systému (veličině popisující příspěvek k energii systému se ve fyzice říká hamiltonián, H). • Základní interakcí, která je zodpovědná za jev NMR je Zeemanova interakce. Jejím důsledkem je existence 2 hladin (pro spin ½) a možnost přechodů mezi nimi za současné absorpce a emise radiofrekvenčního el.-mag. záření na kruhové frekvenci ω = - γ B0 (|ω| = 2πν) • Interakce, které jsou v čase konstantní – H(t) = konst ≠ 0, způsobují dodatečný posun nebo štěpení resonancí. Jsou to např. isotropní složka magnetického stínění (způsobuje chemický posun) a nepřímá spin-spinová (J-coupling).
Relaxační mechanismy (pokračování) •
Pro relaxaci mají význam ty interakce (nebo jejich složky), které rychle fluktuují v čase H(t) ≠ konst. Pokud mají střední hodnotu 〈H(t)〉 = 0, nepřispívají k frekvenci, ani nezpůsobují štěpení čáry.
•
Některé z těchto interakcí mohou být i velmi silné.
•
Jejich význam pro relaxaci tak závisí na jednak na jejich síle (amplitudě) a jednak na charakteristických frekvencích jejich fluktuací.
•
Interakce
Přímá dipól-dipólová (DD) Paramagnetická (paramg.) Anisotropie chemického stínění (CSA) Kvadrupolární (Q) (Spin-rotační) (Skalární (J))
Anisotropie chemického stínění (CSA)
B0
Bi(t)
Obrázek z knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, Chichester 2002.
•
Velikost a směr indukovaného pole Bi(t) závisí na orientaci molekuly vzhledem k B0. Střední hodnota indukovaného pole určuje (isotropní) chemický posun: δ = 〈Bi(t)〉 / B0
•
Fluktuující (anisotropní) složka (Bi(t) - 〈Bi〉) způsobuje relaxaci.
•
Velikost ~ 10 kHz.
•
Příspěvek k relaxaci závisí na B02, má větší význam ve velkých magnetických polích.
Kvadrupolární interakce
Multipólový rozvoj rozložení elektrického náboje v jádře:
Bodový náboj
Dipól =0
Kvadrupól
Interakce s gradientem elektrického pole v místě jádra.
Obrázky z knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, Chichester 2002.
•
Velikost a směr gradientu elelektrického pole fluktuuje v důsledku molekulárního pohybu.
•
Velikost ~ 1-100 MHz
Dipól-dipólová relaxace Přímá interakce mezi dvěma magnetickými dipóly •Volně přes prostor (dosah cca 0.5 nm) – není ovlivněna chemickými vazbami, na rozdíl od nepřímé dipól-dipólové interakce. Velikost:
K dip = (
µ0γ Iγ S h −3 )rIS 8π 2
• Praktická poznámka: Relaxační doby a velikost krospíků závisí na Kdip2 ~ rIS-6 rIS < 0.5 nm
H
H
dipól - dipólová interakce mezi magnetickými dipóly
Dipól-dipólová relaxace (pokračování) • Příklad: jádra 1 a 2 v rigidní molekule, magnetický spin 2 se nachází v magnetickém poli spinu 1 (a opačně). • Rotační pohyb molekuly způsobuje změnu pole Bdip(t) v místě spinu 2.
1
2
1 2
B0
Bdip(t)
• Zdroj fluktuací: pohyb spojnice dvou dipólů vzhledem k B0, tedy náhodný rotační pohyb molekul a jejich částí (tzv. rotační difúze). • Nulová střední hodnota dipól – dipólové interakce je v kapalných vzorcích způsobena právě rychlým rotačním pohybem. • U pevných vzorků nebo u velkých molekul je velmi efektivní ve zkracování T2 (rozšíření čar), v případě nedokonalého středování i vliv na chemický posun. • Velikost ~ 20 kHz • Srovnej s nepřímou dipólovou interakcí J ~ 100 Hz Obrázek z knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, Chichester 2002.
Dipól-dipólová relaxace (pokračování) • Z DD-relaxace můžeme zjistit: I) Střední vzdálenost dvou dipólů. II) Charakteristiky molekulárních rotačních pohybů (např. rotační korelační časy) – potřebujeme odhadnout typ pohybu (izotropní rotace rigidní kulové molekuly (adamantan) atd.). Závislost T1, T2 na rotačním korelačním času τC. Obrázek z publikace: P. J. Hore: Nuclear Magnetic Resonance, Oxford University Press, Oxford 1995.
• Speciálním případem je i paramagnetická relaxace (paramg.). Dipólová interakce magnetického momentu jádra s elektronovým magnetickým momentem v radikálech, paramagnetických iontech kovů apod. Magnetický moment elektronu je zhruba 1000 x větší než jaderný. • Velikost ~ 1-100 MHz
• Srovnání relaxačních mechanismů Q (jen I > ½) ~ (paramg.) >> DD > CSA
Nukleární Overhauserův Efekt (NOE) NOE je typický případ, kde selhává představa mono-exponenciální podélné relaxace – jedná se o tzv. křížovou relaxaci, kdy změna stavu jednoho spinu (způsobená uměle nebo i jeho vlastní podélnou relaxací) ovlivňuje stav spinu druhého a naopak. • NOE je nedílnou součástí podélné relaxace. • Jedná se o skutečný přenos z-magnetizace = energie. V důsledku toho potom ve spektru vidíme změněné intenzity.
Nukleární Overhauserův Efekt (NOE) pokrač. • Příklad: relaxace izolovaného spinového páru 1H - 13C po převrácení spinu 1H do směru -z. (B0 = 9,4 T, rCH = 0,109 nm, τC = 10 ps). relativní intenzita signálu
1
x
0.8
1H
0.6 0.4
0
13C
x
0.2 0
10
20
30
-0.2
40
čas (s)
50
-0.4 -0.6 -0.8 -1
x x
1H 1H bez cross-relaxace 13C 13C bez cross-relaxace
Pokud budeme měřit podélnou relaxaci za přítomnosti NOE, nebude mono-exponenciální.
Energetický diagram dvouspinového systému IS: Saturace spinu I
ββ W1I
W2IS
ββ
W1S
βα
W1I
W0IS
W2IS
βα
W0IS W1I
αβ
W1S
W1S
αα
W1I W1S
αα
• W je pravděpodobost přechodu mezi hladinami. Pro systém v rovnováze máme W1I a W1S přechody, které jsou jednokvantové. • W0IS a W2IS jsou nul- and dvou kvantové přechody. • Intenzita pozorovaného signálu spinů I,S je dána rozdílem populací jejich stavů α, β.
Nukleární Overhauserův Efekt (NOE) pokrač. • NOE homonukleární – např. mezi jádry 1H • Přechodné: RF pulzem vybudíme selektivně jeden spin interagujícího páru a pozorujeme přenos magnetizace na druhý spin. Množství přenesené magnetizace = energie závisí na délce směšovacího času = NOE je relaxační proces, takže k přenosu dochází v průběhu určitého času, ne okamžitě. • NOE heteronukleární – např. mezi 13C a 1H • Stacionární: po dlouhou dobu selektivně ozařujeme jednoho partnera (1H) a následně změříme signál druhého spinu (13C). Tak se normálně měří 13C spektra: 90y 13C
Navýšení 13C intenzity v ideálním případě: NOE = 1 + 0,5 γH/γC ≅ 3
1H
ozařování
dekapling
Využití: • Navýšení signálu málo citlivých jader (γ > 0 !). • Protože je to projev DD interakce, závisí na r6 - určení vzdálenosti spinů, a tedy určení konformace molekuly v prostoru. • Získání dynamické informace o rotačních pohybech molekuly.
Nukleární Overhauserův Efekt (NOE) pokrač. Podrobnější úvahy o rychlosti rotace molekuly a jejího vlivu na velikost NOE • Vždy se týká rychlosti rotace spojnice příslušného spinového páru (pro různé páry v molekule mohou mít spojnice různou rychlost). • Jak rychlé pohyby ovlivní DD interakci? I) na rezonanční frekvenci každého ze spinů V kombinaci Larmorovou precesí vedou k lineární kombinaci pravděpodobností přechodu na I) na rezonanční frekvenci každého ze spinů II) na součtu obou frekvencí III) na rozdílu obou frekvencí IV) T2 - také na nulové frekvenci – tj. velmi pomalé pohyby.
Nukleární Overhauserův Efekt (NOE) pokrač. Výsledný vliv příspěvků má vliv na polaritu homonukleárního NOE (1H – 1H): 1) Malé molekuly - ωτc << 1 (v praxi: ωΗ = 109 s-1,τc = 10-11 s) molekula rotuje rychle, NOE je kladné, tzv. limita extrémního zúžení. 2) Velké molekuly - ωτc >> 1 (v praxi: ωΗ = 109 s-1, τc = 10-8 s) molekula rotuje pomalu, NOE je záporné. 3) Středně velké molekuly – NOE je nulové nebo velmi malé.
Závislost homonukleárního NOE na ωτc (pro stacionární případ) 1 NOE navýšení 0.5
0.1
1
10
100
ωoτc
-0.5 -1
NOE
Metoda měření přechodného NOE RF pulsem vybudíme selektivně jeden spin interagujícího páru a pozorujeme přenos magnetizace na druhý spin. Množství přenesené magnetizace závisí na délce směšovacího času tm.
experiment I 180
Hb
90
Ha
tm
C Hc
selektivní inverze tm směšovací čas - čas, ve kterém se buduje NOE
Ha
90
experiment II
Hb
Hc
tm
experiment I
Intenzita červené erveného signá signálu odpoví odpovídá navýš navýšení ení v důsledku NOE.
experiment II
diferenč diferenční spektrum: spektrum: odeč odečtení tení 2 fidů fidů (spekter)
Měření pohyblivosti pomocí 13C relaxací Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy 6 CH2OH 5 4
O OH g2
OH 3
1CH2OH 1
O
2
O f OH 5
2
OH OH
3
4
CH2OH 6
O
OH g3 O
3g2 5g3 3g3 5g2 2g2
3f
CH2OH
f4
1g2
2g3 4g2 4g3
5f
1g3
1f 6g3 6g2 6f
2f
ppm 13C
100
90
80
NMR spektrum, D2O/DMSO 7/3, 303 K, 11.8 T
70
60
Příklad – lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Lipari-Szabóův přístup Pro analýzu je nutný model pohybu molekuly jako celku a jejích částí. Jeden z nejúspěšnějších je Lipari-Szabóův „bezmodelový“ přístup (“modelfree“ approach) Předpoklady Lipari-Szabóova modelu: • relaxace je modulována dvěma pohyby: globálním a lokálním • oba pohyby jsou statisticky nezávislé • globální reorientace je izotropní • molekulární pohyb je charakterizován parametry: τM
korelační čas globálního pohybu
S2
parametr uspořádanosti (hodnota 0 - 1)
τe
korelační čas lokálního pohybu
Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Závislost jaderné relaxace na molekulárním pohybu nH 2 D [J (ωH − ωC ) + 3J (ωC ) + 6J (ωH + ωC )] 4 n T2−1 = H D2 [4J (0) + J (ωH − ωC ) + 3J (ωC ) + 6J (ωH ) + 6J (ωH + ωC )] 8 T1−1 =
⎛γH ⎞ 6J (ωH + ωC ) − J (ωH − ωC ) ⎟⎟ ⎝ γ C ⎠ J (ωH − ωC ) + 3J (ωC ) + 6J (ωH + ωC )
η = ⎜⎜
Dipól-dipolární interakční konstanta:
Lipari-Szabóovy spektrální hustoty:
−3 D = (µ0 / 4π )γ Cγ H rCH
(1 − S 2 )τ ⎞⎟ 2 ⎛ S 2τ M + J (ω ) = ⎜⎜ 5 ⎝ 1 + ω 2τ M2 1 + ω 2τ 2 ⎟⎠
τ −1 = τ M−1 + τ e−1
• Rotační molekulární pohyb ovlivňuje jadernou relaxaci prostřednictvím spektrálních hustot J(ω) - udávají (zhruba) „množství“ molekulárního pohybu na frekvenci ω. Pro jadernou relaxaci jsou nejvýznamnější ωH, ωC, (ωH + ωC), (ωH - ωC) a 0 s-1. • Při různém magnetickém poli B0 se mění i kruhové frekvence ω, a tedy zkoumáme pohyby při různých frekvencích.
Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Základní princip • Reorientační molekulová dynamika moduluje jadernou relaxaci. • Jádra 13C v molekule cukru, která nesou přímo vázaný proton, relaxují téměř výlučně vlivem přímé dipól-dipólové interakce s tímto protonem. Experimentální metodika • Měření 13C relaxačních dob T1, T2 a heteronukleárního NOE při různých intenzitách magnetického pole B0. Podmínkou je režim mimo „extrémní zúžení” (extreme narrowing) - musí být ωτM ≥ 1, aby relaxační doby byly závislé na B0. • Základní pulzní sekvence: inversion recovery (T1) spinové echo - CPMG (T2) měření stacionárního heteronukleárního NOE
Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Závislost relaxačních rychlostí a NOE pro 13C jádra cukerných kruhů (R1 = 1/T1, R2 = 1/T2) na magnetickém poli B0 při teplotách 303 K (a) a 323 K (b). 6 CH2OH 5 4
OH 3
R2
R1
R2
R1 1+η
O OH g2
1CH2OH 1
O f OH 5
2
O
2
3
OH OH
4
CH2OH 6
O
OH g3 O
1+η
CH2OH
Závislost relaxačních rychlostí a NOE pro 13C jádra exocyklických CH2OH skupin na magnetickém poli B0 při teplotě 303 K. 6g3
6g2
R1
R2 1+η
R1
1f
R2 1+η
R1
R2 1+η
Dynamické charakteristiky trisacharidu melezitosy Atom C-cykl. C-6g2 C-6g3 C-1f C-cykl. C-6g2 C-6g3 C-1f C-6f
T(K) 303 303 303 303 323 323 323 323 323
τΜ (ns)
S2 0.84 ± 0.01 0.61 ± 0.01 0.63 ± 0.02 0.77 ± 0.02 0.79 ± 0.01 0.59 ± 0.02 0.62 ± 0.02 0.70 ± 0.03 0.52 ± 0.03
0.67 ± 0.02 0.67 0.67 0.81 ± 0.07 0.35 ± 0.02 0.35 0.35 0.38 ± 0.03 0.35
τe (ns) 0.04 ± 0.01 0.03 ± 0.01
6 CH2OH 5 4
O OH g2
OH 3
0.02 ± 0.01 0.01 ± 0.01
1CH2OH 1
O
2
OH OH
0.03 ± 0.01
O f OH 5
2 3
4
CH2OH 6
O
OH g3 O CH2OH
Závěr: • Jednotlivé kruhy jsou dynamicky ekvivalentní. • Hydroxymethylová skupina C-1f je podstatně méně pohyblivá než ostatní hydroxymethylové skupiny. Obecné: • Pomocí měření relaxací se studuje pohyblivost jak malých tak velkých molekul a jejich funkčních skupin v časové škále 10-12 - 10-8 s.
Chemická výměna zahrnuje všechny procesy, kdy sledované jádro přechází do jiného chemického okolí – tj. chemické reakce, konformační změny, mezomerní přechody, tvorbu komplexu apod.
Kex
Konformační rovnováha
KB
Chemická rovnováha
• Neřadí se přímo mezi relaxační mechanismy, ale velmi se jim podobá – místo samotné magnetizace nám po systému putuje celé jádro, včetně svého spinu. • Důsledky i popis chemické výměny jsou velmi podobné spinové relaxaci. • Vliv na z-složku magnetizace je matematicky téměř totožný s NOE. • Na rozdíl od NOE má chemická výměna vliv i na příčnou složku magnetizace.
Měření rychlostních konstant O
Příklad: inverze NN-dimethylformamidu: N
O H
N
H
Máme výměnu mezi červeným a modrým methylem kvůli dvojnému charakteru amidické vazby. Oba methyly jsou chemicky a magneticky různé, takže NMR spektrum DMF obsahuje dva různé methylové signály:
kk<< <<∆ν ∆ν •To znamená, že rychlost výměny mezi dvěma místy je malá ve srovnání s relativní vzdáleností (v Hz) mezi rezonancemi obou míst (červeného a modrého):
Měření rychlostních konstant (pokračování) Rychlost reakce závisí na ∆G inverze, které je teplotně závislé. Rychlost inverze se zvýší při zvyšování teploty T. NMR spektra budou vypadat takto:
T
TC
• Při koalescenční teplotě Tc se rychlost o výměny k mezi jednotlivými stavy stává srovnatelná s rozdílem chemických posunů ∆ν (v Hz),
při Tc: k = π(∆ν)/√2 Definice koalescence: 2.derivace signálu v bodě ½(νA+ νB) je rovna 0. • Chemická výměna ovlivňuje jak posun, tak tvar signálu a tedy má vliv na příčnou relaxaci.
Měření rychlostních konstant (pokračování) • Realističtější obrázek: symetrická chemická výměna mezi dvěma stavy - závislost NMR spekter na teplotě:
Obrázek z publikace: P. J. Hore: Nuclear Magnetic Resonance, Oxford University Press, Oxford 1995.
Pro chemickou výměnu rozlišujeme dva režimy vzhledem k rozdílu chemických posunů (v Hz) dvou vyměňujících stavů k << ∆ν
pomalá výměna
k >> ∆ν
rychlá výměna
Protože je rozdíl chemických posunů v Hz a nikoli v ppm, je tento rozdíl závislý na magnetickém poli (při 200 MHz: 1 ppm = 200 Hz, při 500 MHz: 1 ppm = 500 Hz), může být chemická výměna k = 350 Hz v prvním případě rychlá a v druhém pomalá. Proto při klasifikaci chemické výměny je třeba stanovit rezonanční frekvenci.
Časové škály v NMR k << ∆ν
pomalá výměna
k >> ∆ν
rychlá výměna
Navíc, existuje celá řada důležitých časových režimů: 10-12 – 10-8 s – molekulární rotace 10-8 s – Larmorova precese > 10-7 s – chemická výměna > 10-3 s – spinová relaxace Oblíbená věta: “Chemická výměna je rychlá v NMR škále.“ je bez specifikace rezonanční frekvence nesmysl! I tak ale udává jen dolní limit pro rychlostní konstantu – chemickou výměnou indukovaný posun zpravidla nepřesahuje cca 5 ppm, při 500 MHz potom k > 2500 Hz. Pojem časové škály se pro různé jevy v NMR liší, proto je třeba vždy specifikovat přesně, o které škále se mluví. V případě chemické výměny např.: Rychlá výměna v časové škále dané 1H chemickým posunem při rezonanční frekvenci 500 MHz.
Studium rotační bariéry kolem vazby aromát-karben η2-chelatovaný (N,N-diallylamino)(aryl)karben wolframu zabržděná rotace
diastereotopní H chirální (helikální) ia d
rs te
p to n
H c ií
irá h c
a í(h ln ri
c á lik e
Motivace: Stanovení původu bariéry rotace ze dvou předpokládaných možností: 1) sterická interakce mezi aromatickým kruhem a karbenovou částí, 2) překryv aromatického π-systému s elektronově chudým karbenovým uhlíkem, který způsobuje zvýšení řádu vazby.
b c
2
b A
c
3 C 4
5
6
rozpouštědlo: CDCl3, 500 MHz
B
o-Ph 308 K
298 K
288 K
273 K
263 K
3, 5 4
2,6
B
A
C
b
c
243 K
Hana Dvořáková, Tomáš Tobrman, Dalimil Dvořák, OMCOS Taipei 2001
a
Praktické aspekty měření • Měří se základní 1D homonukleární spektra při různých teplotách. Metodicky velmi jednoduché. • Je nutné zajistit: přesnou kalibraci teploty (standardní vzorek MeOH 200- 300 K, ethylenglykol 330-450 K), stejně kvalitní homogenity magneticého pole (shimování) v celém rozsahu teplot. nutný vysoký poměr signál/šum.
Zpracování spekter a výpočty O co je jednodušší měření, o to jsou těžší výpočty. Nezbytné je velmi pečlivé zpracování spekter: Fourierova transformace - bez LB a jiných apodizací, fázování, kvalitní odečtení pozadí (baseline correction)
Zpracování spekter a výpočty (pokrač.) Rychlostní konstanty chemické výměny se získají fitováním pološířek a poloh příslušných rezonancí (např. program g-NMR). U pomalé výměny: ∆ν = k/π, v přechodné oblasti je závislost složitá. Správné nafitování signálů je překvapivě moc citlivé na kvalitu zpracování spekter!!!
Získají se rychlostní konstanty při každé měřicí teplotě. K vysvětlení teplotní závislosti je možné použít Arrheniovu či Eyringovu rovnici 300
≠
k [s-1 ]
250
k=
200 150
≠
100 50 0 269
279
289
299
T [K]
309
kB T h
- ∆H + ∆S R e RT
≠
∆G≠ aktivační volná energie (∆G≠ = ∆H≠ - T ∆S≠) ∆H≠ aktivační enthalpie ∆S aktivační entropie kB Boltzmannova konstanta 1.3805 x 10-23 J/K h Planckova konstanta 6.6256 x 10-34 Js R univerzální plynová konstanta 8.3144 J/K/mol T termodynamická teplota v K
Důležité poznámky: 308 K
298 K
288 K
Relativné přesně se rychlostní konstanty získají jen při teplotách, kdy je rozšíření čáry >> než „přirozená“ šířka čáry (bez chemické výměny), tj. v relativně malém rozmezí kolem teploty koalescence. „Přirozená“ šířka čáry není a priori známa - může se mezi jednotlivými signály lišit. A navíc se mění s teplotou, což běžný výpočet zanedbává.
273 K
263 K
243 K
Výsledek Obdobná měření byla provedena pro různě substituované (R) deriváty.
electron acceptors
electron donors
R
∆Η≠ kJ/mol ∆S≠ J/mol/K ∆G≠298 kJ/mol
CF3
81.8 ± 9.5
53.0 ± 17
66.5
CO2CH3
73.4 ± 2.5
20.1 ± 4.4
67.7
H
59.8 ± 4.5
9.0 ± 8.2
62.5
Cl
55.8 ± 1.2
-18.6 ± 2.2
61.4
CH3
49.1 ± 1.6
-34.2 ± 3.0
59.3
OCH3
39.6 ± 2.5
-50.7 ± 4.8
54.7
b A
2
c
3 C 4
5
6
B
• Bráněná rotace je enthalpicky řízená reakce. • Měření různých derivátů prokázalo, že bariéra rotace je vyšší pro substituenty, které jsou akceptory elektronů. Původ bariéry rotace je tedy sterická interakce mezi aromatickým kruhem a karbenovou částí.
Konformační výměna v kalix[4]arenech A
4 3 2 S
S O Pr
S
1 O
O
Pr
1
Pr
S O Pr
1’ - 3’
Tetrapropoxythiakalix[4]aren - konický konformer, 1H spektrum v C D Cl , teplota 373 K 2 2 4
B S
S S S O OOO Pr Et Et Pr Pr Et Et Pr
S
S O
Et Pr
OO Pr PrEtEt
S
O
S
Et Pr
Odpovídá spektrum statické struktuře A nebo dynamické rovnováze B?
343 K
F
233 K 3,5
E
E
F
E,F
E
F
4
Spektra při nižších teplotách dokazují, že se jedná o dynamickou rovnováhu B. Počet signálů ve spektru souvisí se symetrií molekuly - čím vyšší symetrie, tím větší počet degenerovaných signálů. F
5
S
4
E
E
F 3
S S S O OOO Pr Et Et Pr Pr Et Et Pr
S
S O
Et Pr
OO Pr PrEtEt
S
chemická výměna mezi polohami E ↔ F
O
S
Et Pr
2D EXSY (EXchange SpectroscopY) 90
90
90
tm
t1
“inverze” Během směšovacího času času tm dochází k přenosu magnetizace vlivem chemické výměny. V 2D spektru jsou v obou dimenzích chemické posuny, mezi vyměňujícími se spiny jsou krospíky. Velikost krospíků závisí na rychlosti chemické výměny. Sekvence je totožná s NOESY - ve spektru budou též krospíky v důsledku NOE. δ (f1) Ha
Hb
Hc
Hb Ha
Hc
δ (f2) Poznámka: 1D EXSY je totožná s 1D NOESY (diferenční NOE). Výběr 1D nebo 2D sekvence je dán jen počtem počtem krospíků, které chceme analyzovat - v 1D excitujeme jediný signál jako „zdroj“ chemické výměny, ve 2D sekvenci takto slouží všechny signály.
EXSY - výměnná spektroskopie Měření rychlosti chemické výměny analýzou pološířek v 1D spektrech je komplikováno náhodným překryvem aromatických signálů kruhů E. Proto je výhodnější EXSY (v tomto případě 2D).
F1’ E1’
Toto spektrum: 237.5 K, tm= 200 ms Krospíky: chemická výměna: F3,5-E, F4-E, F1’-E1’ NOE: F3,5-F4
F3,5-E F4-E
E F3,5-F4
F4 F3,5
F1’-E1’
EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač.
F 5
S
4 E 3
S S S O OO O Pr Et Et Pr Pr Et Et Pr
Integrace krospíků i diagonálních píků ve 2D spektru: Diagonální píky vždy slouží jako reference. Pro stanovení rychlosti chemické výměny A → B potřebujeme relativní velikost krospíku I(A-B) vzhledem k velikosti I(A) (zdroje ch. výměny). Krospíky, symetrické vzhledem k diagonále, jsou vždy stejné (pokud ne, je to artefakt) I(A-B) = I(BA). Můžeme použít jen dobře separované signály (signál E je nepoužitelný!)
EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Změříme spektra pro několik hodnot směšovacího času tm. Obecně (tj. v případě nesymetrické výměny, ([A] ≠ [B]) ⇔ (I(A) ≠ I(B)) jsou rychlostní konstanta dány: I(A-B) / I(A) = k(A→B) * tm I(A-B) / I(B) = k(B→A) * tm Tento vzorec platí jen pro „počáteční nárůst“, který je lineární. Odchylka od linearity je způsobena členy s vyššími mocninami tm (tm2, tm3, tm4, …), které jsou pro dostatečně malé tm zanedbatelné (tzv. spinová difúze). 0.6
I(A-B) / I(A)
0.5
I(A-B) = F3,5-E; F4-E
Intenzita
0.4
F3,5 - E E-F3,5 F4-E E-F4
0.3 0.2 0.1 0 0
0.05
0.1
0.15
směšovací čas
0.2
0.25
I(A) = F3,5; F4 směšovací časy: 10, 20, 50, 100, 200 ms
EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. V našem případě je chemická výměna symetrická ([E]=[F]) a tedy jako reference postačí diagonální signály F a nepotřebujeme překývající se aromatické signály E.
k(E↔F) = 2.51 s-1 Podobně se změří rychlostní konstanta při jiných teplotách a spočítají se aktivační parametry. 8
rychlostní konstanta (s
-1
)
7 6 5 4 3 2 1 0 225
230
235
240
245
250
teplota (K)
∆G≠ = 56.0 kJ/mol
aktivační volná energie při 337 K
∆H≠ = 43.7 kJ/mol
aktivační enthalpie
∆S≠ = -51 J/mol/K
aktivační entropie
Srovnání EXSY a měření pološířek signálu + EXSY je přesnější než měření pološířek signálu, + EXSY nevadí složitá reakční schémata, – EXSY je mnohem pracnější - pro jeden bod teplotní závislosti je třeba změřit řadu spekter (třeba 5), X Z hlediska časových režimů chemické výměny jsou tyto metody komplementární pokrývají rozdílný rozsah rychlostí chemických výměn: EXSY - pomalá výměna, která příliš nerozšiřuje čáry (nesmí docházet k překryvu), měření pološířek je nejpřesnější, když chemická výměna rozšiřuje čáru maximálně, tj. v oblasti koalescence (oblast přechodu mezi pomalou a rychlou výměnou). ≈ Měření rychlé výměny, která znatelně nerozšiřuje signál je obtížné. Pomoci může měření relaxační doby T2.
EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Případ, kdy je použití EXSY nezbytné: komplikovanější reakční schéma. Chemická výměna konformérů tetraethyletheru thiakalix[4]arenu.
S
S Et
Et
Et
O
O
O
S
S
O O
S
O
Et Et
Et
kPC
S
Et
kCP
kAP SS
OO
O
S
S
kPA
S
O
Et
Et Et
S
O O
kCC kCC
kPC kCP
Et Et paco (P)
1,3-alt (A)
S S O OO O
S
S
Et Et
Et Et
pinched cone (C)
Různé konformery mají různou koncentraci a symetrii - výměna proto vesměs není symetrická. Jednotlivé rychlostní konstanty jsou odlišné (celkem 5 různých konstant).
EXSY - výměnná spektroskopie A B
1' 2' CH2CH3
4 3
5 S
S O
Et
S
S
O O
Et Et paco
S
S O
C
Et
S O O
Et Et
S O
Et
cone
1,3-alt-3 paco-A3 paco-B3 paco-C3
X
paco-C4, paco-B4
Et
Et
cone-1’, paco-A1’
1,3-alt-4
paco-C1’ paco-A5 paco-A4
SS
S O O
Et
Et
O
O
O
O
O
S S
S
S O
Et Et
Et
1,3-alt
S O
Et 1,2-alt
1,3-alt-1’ paco-A1’’ paco-B1’
paco-A2’ paco-C2’
1,3-alt-2’
cone-2’ paco-B2’
cone-4 cone-3
//
1H
//
spektrum tetraethoxythiakalix[4]arenu v CDCl3 při 303 K.
Koncentrace jednotlivých konformérů jsou různé, vzájemně se vyměňující se signály mají rozdílnou míru degenerace. Je to nesymetrická chemická výměna.
EXSY - výměnná spektroskopie 1,3-alt-3 paco-A5 paco-A3 paco-C4, paco-B3 paco-B4 1,3-alt-4 paco-C3 paco-A4
1H
NOESY (EXSY) spektrum aromatické oblasti tetraethoxythiakalix[4]arenu v C2D2Cl4 při 298 K, tm = 1.5 s. Kladné píky (červené) = diagonála a chemická výměna, záporné píky (modré) = NOE. Koncentrace jednotlivých konformérů jsou různé, vzájemně se vyměňující se signály mají rozdílnou míru degenerace. Je to nesymetrická chemická výměna. Ve spektru jsou vidět jen signály 1,3-alt a paco konformérů. cone je rozšířený v blízkosti koalescenční teploty chemické výměny pinched cone - pinched cone.
EXSY - výměnná spektroskopie Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase. 0,06 0,05
paco C 3,5 - 1,3-alt 3,5 paco A 3,5 - 1,3-alt 3,5
intenzita
0,04
paco B 3 - 1,3-alt 3,5
0,03
paco B 5 - 1,3-alt 3,5 paco B 4 - 1,3-alt 4
0,02
fit
0,01 0 0
0,5
1
směšovací čas (s)
kPA = 0,0238 s-1 při 298 K
1,5
EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Při vyšší teplotě jsou v 1H spektru pozorovatelné i signály cone konformeru. Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase
1,3-alt-4 paco-A3 paco-C4, cone-4 paco-B4 paco-B3 1,3-alt-3 paco-A5 paco-C3 cone-3,5 paco-A4
0,25
intenzita
0,2 1,3-alt 4 - paco B 4 1,3-alt 4 - paco C 4 1,3-alt 4 - paco C 4 1,3-alt 3,5 - paco B 3; A 3,5 1,3-alt 4 - paco B 3; A 3,5 1,3-alt 3,5 - paco B 5 1,3-alt 3,5 - paco B 5
0,15 0,1 0,05 0 0
0,02
0,04
0,06
směšovací čas (s)
kPA = 4,97 s-1 při 363 K
tm = 0.05 s, 363 K
Poměrně rychlou chemickou výměnu paco → 1,3-alt je potřeba měřit při velmi krátkých směšovacích časech. Za těchto podmínek nejsou měřitelné krospíky v důsledku výměny paco ↔ cone.
EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Pro měření výměny paco → cone je nutné použít mnohem delších směšovacích časů. Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase 0,8 0,7
intenzita
1,3-alt-4 paco-A3 paco-C4, cone-4 paco-B4 paco-B3 1,3-alt-3 paco-A5 paco-C3 cone-3,5 paco-A4
0,6
paco B3 - cone 3,5
0,5
paco C3,5 - cone 3,5 paco B4 - cone 4
0,4
paco B4 - cone 4
0,3
skutečný počáteční build-up
0,2 0,1 0 0
0,5
1
směšovací čas (s)
kPC = 0,617 s-1 při 363 K • Vlivem mnohem (cca 10x) rychlejších procesů dochází k rozsáhlé spinové difúzi a počáteční lineární část výstavbové křivky prakticky neexistuje.
tm = 0.2 s, 363 K
• Je vhodné/nutné použít přesný výpočet pomocí relaxační a výměnné matice - na řádcích a sloupcích jsou jednotlivé spiny, maticové prvky obsahují příslušné rychlosti chemických výměn, kros-relaxační rychlosti a na diagonále též podélné relaxační rychlosti.
EXSY - výměnná spektroskopie - závěr S Et
Et
Et
O
O
O
S O O
S
kPA
S
S O
S O O
S
kPC
Et Et
kCC
kPC
S
Et
kCC
Et Et
S
kPA
O
kCP
paco (P)
1,3-alt (A)
S
kCP
Et
Et Et
OO
Et
kPC
kAP SS
S O
298 K
363 K *
0,0238
4,97 0,617
S S O O O O
Et Et
S
Et Et
pinched cone (C)
Závěr: • Pomocí EXSY lze studovat i systémy, ve kterých dochází k mnoha různým přenosům magnetizace (s odlišnými rychlostmi) vlivem NOE a chemické výměny. • Je potřebné matematicky rigorosní vyhodnocení (neplatí aproximace počátečního lineárního nárůstu). • Užitečná jsou měření při různých teplotách. Aktivační parametry jednotlivých procesů se stanoví v různých teplotních režimech. Přitom se mění relativní rychlosti různých přenosů magnetizace.
