O alergenOVÉ
imunoterapii
Č. 26 – červen 2007
Rekombinantní alergeny: důležité otázky v roce 2006
Klinická problematika
Sublinguální desenzibilizace v pediatrii
Vážená paní doktorko, vážený pane doktore, je mi potěšením předložit Vám 1. číslo vědecké revue Expressions v češtině. Jak víte, přípravky STALLERGENES jsou v České republice přítomny od roku 1997. Během posledních 10 let jsme vytvořili silnou vazbu na alergologickou komunitu. Naším nepřetržitým záměrem vždy bylo navrhovat Vám poslední inovace a přípravky nejvyšší kvality pro léčbu Vašich alergických pacientů. Společnost STALLERGENES se též rozhodla posílit od ledna 2006 svou přítomnost v České republice otevřením vlastní pobočky a propagací svých přípravků prostřednictvím vlastních obchodních zástupců. Naším cílem je přiblížit se Vám a lépe pochopit Vaše potřeby a praktické postupy. Tímto způsobem Vám chceme nabídnout veškeré informace a služby pro to, abyste mohli pro své pacienty navrhnout nejvhodnější a dobře přizpůsobené způsoby léčby.
Obsah n Vědecká problematika
3
n Klinická problematika
6
n Přehled publikací
8
Rekombinantní alergeny: důležité otázky v roce 2006
Sublinguální desenzibilizace v pediatrii
Jako jeden z praktických výsledků Vám nabízíme Expressions ve Vašem jazyce. Víme, že většina z Vás „Expressions“ dobře hodnotí a že byste ocenili možnost jejich čtení ve vlastním jazyce. Nyní se to stává skutečností a my jsme tomu velmi rádi. Neváhejte nám poskytnout svou zpětnou vazbu a případně navrhnout články pro další čísla. Sébastien IVA General Manager STALLERGENES Česká republika a Slovenská republika
Expressions Stallergènes, oddělení marketingu Vedoucí vydání: Julie Badoche Šéfredaktoři: Michèle Lhéritier-Barrand, Lise Lemonnier Zástupce šéfredaktora: Chantal Didiot Redakční rada: Victor Alvà, Olivier de Beaumont, Riad Fadel, Franco Frati, José-Luis Justicia, Michèle Lhéritier-Barrand, Philippe Moingeon, Paola Puccinelli, François Saint-Martin, Jochen Sieber, Thao Tran Xuan Grafická úprava: Ektopic Adaptace a produkce: Signature s.r.o. Odpovědní redaktoři: Christiane Mura, Arielle le Masne Sekretariát redakce: Catherine Huzer, Estelle Pasquier Vydavatel: Stallergènes, 6 rue Alexis de Tocqueville – 92183 Antony Cedex, France
VùdeckÁ problematika
Rekombinantní alergeny: důležité otázky v roce 2006 Díky metodám molekulární biologie (klonování a sekvenování) bylo do současné doby identifikováno a charakterizováno více než 500 alergenů. Následkem toho lze přírodní biologické extrakty používané v diagnostice a terapii nahradit rekombinantními alergeny získanými metodami genetického inženýrství.
Od přirozených extraktů k rekombinantním vakcínám vorba rekombinantních alergeT nů biotechnologickými metodami otevírá cestu k novým způsobům desenzibilizační léčby.
S
pecifická alergenová imunoterapie (SAIT) je jediným kauzálním způsobem léčby chorob vznikajících na základě IgE mediované přecitlivělosti (tj. I. typu alergické reakce). Účinnost SAIT byla prokázána zejména v léčbě alergické rinitidy, mírného až středně těžkého astmatu a přecitlivělosti na jed blanokřídlého hmyzu.
Přirozené extrakty jsou složité proteinové směsi V současné době spočívá SAIT v subkutánním nebo sublinguálním podávání rozpustných extraktů připravených z přirozeného zdroje alergenů (zdroje: kultury roztočů domácího prachu, pyly, plísně, buňky živočišného epitelu atd.). Tyto alergenové extrakty jsou ve skutečnosti složité proteinové směsi obsahující kromě hlavních a vedlejších alergenů také celou řadu biologicky neúčinných složek, jako jsou další nealergenní proteiny, glykoproteiny a sacharidy. Heterogenita alergenových extraktů získaných z přírodních zdrojů vyžaduje provedení specifických standardizačních postupů pro zajištění jednotnosti mezi jednotlivými šaržemi.
Standardizace je založena především na stanovení celkové vazebné kapacity extraktu na IgE (tj. na celkové alergenní aktivitě). K upřesnění profilu proteinů přítomných v extraktu jsou v současné době používány nové technologie (SELDITOF, 2D gelová elektroforéza a PF2D). Uvedené metody nejsou kvantitativní, a proto nemohou sloužit za základ kalibrace nebo kontroly kvality farmaceutických šarží [1].
lavní charakteristiH ka rekombinantních alergenů
g Perspektivy
budoucího využití rekombinantních alergenů v terapii
Evropská multicentrická studie s použitím subkutánního podání poprvé ukázala, že rekombinantní alergeny (a zejména Bet v 1) jsou stejně účinné jako přirozené alergeny [2]. Nyní probíhají klinické studie sublinguálních tablet Bet v 1. Optimalizace volby adjuvans a úprava formy alergenu by měla přinést další výrazné zlepšení léčby respiračních alergií. Na tomto základě jsou vyvíjeny „alergeny se zvýšenou účinností“, s cílem definovat prototyp rekombinantní sublinguální léčby.
Vlastnosti Rekombinantní alergeny mají ve srovnání s alergenními extrakty četné výhody [1]: - precizní charakteristika na molekulární a imunochemické úrovni; - vysoký stupeň purifikace; - snadná standardizace; - umožnění přesnější diagnostiky a léčby.
Přírodní nebo hypoalergenní? Rekombinantní alergeny známé jako „alergeny přírodního typu“ se připravují tak, aby ve všech svých detailech napodobovaly přirozené alergeny. Alergeny „hypoalergenní“ jsou na rozdíl od nich pozměněny přímou
Hlavní výhodou užití rekombinantních alergenů je jejich čistota, reprodukovatelnost, sledovatelnost a výtěžek.
3
VùdeckÁ problematika
Strategie SLIT je založena na použití nativní konformace rekombinantních alergenů, která umožňuje jejich rozpoznání a vychytávání dendritickými buňkami Langerhansova typu přítomnými v ústní sliznici.
mutagenezí či modifikací jejich trojrozměrné struktury tak, aby se snížila jejich vazebná kapacita na IgE. Užití hypoalergenních forem alergenů by teoreticky mělo vést ke zvýšení bezpečnosti léčby podávané subkutánně. Možnost jejich užití v sublinguální terapii není zatím jednoznačně potvrzena. Při SLIT se zdá být výhodnější prezentace rekombinantních alergenů v přirozené konfiguraci, vzhledem k tomu, že na úrovni sublinguální sliznice je na jedné straně přítomno málo mastocytů a na druhé straně rozpoznání alergenů prostřednictvím IgE molekul umožňuje využití Langerhansových dendritických buněk typu FcεRI+, schopných tvorby TGF-ß a IL-10 [3].
Způsoby přípravy rekombinantních alergenů Z výchozího zdroje alergenů je izolována informační RNA (mRNA), která je použita jako templát pro odpovídající syntézu komplementární DNA (cDNA) (obrázek 1). Dalším krokem je PCR (polymerasová řetězová reakce) amplifikace genového kódování pro identifikovaný alergen (seznam je k dispozici na www.allergome.org). Daný gen se poté vloží do příslušného vektoru, obecně plasmidu, pro umožnění jeho exprese v hostiteli.
Různé hostitelské systémy
4
purifikuje s použitím vhodných chromatografických metod. Míra specifikace a standardizace rekombinantních alergenů je teoreticky mnohem vyšší než u alergenních extraktů. Týká se homologie, čistoty, koncentrace alergenové aktivity a potencionální hladiny kontaminace.
Adjuvantní a galenické přípravky Vysoce purifikované nebo rekombinantní proteiny jsou málo imunogenní. Přídatný signál (ko-signál) pro imunitní buňky, nutný k vyvolání příslušné imunitní odpovědi, zabezpečíme doplněním vhodného adjuvans [1, 4]. Latinské ‘adjuvare’ znamená „pomáhat“; adjuvantní prostředek lze proto definovat jako jakoukoliv biologickou či syntetickou molekulu, která je v kombinaci s antigenem schopna modulovat imunitní odpověď.
Výhody užívání adjuvantních prostředků Použití adjuvans má řadu cílů: - zvýšit účinnost vakcíny; - umožnit snížení dávek se zachováním účinnosti; - zjednodušit způsob podávání.
Jaký adjuvantní prostředek je vhodné zvolit?
Prokaryotní systémy exprese, jako jsou bakterie (Escherichia coli), poskytují rekombinantní proteiny bez jakékoliv posttranslační modifikace. Proto lze ve většině případů levným, snadným a rychlým způsobem obdržet alergeny, jejichž reaktivita je srovnatelná s reaktivitou nativních alergenů. V případech, kdy je požadována zvláštní prostorová konformace či posttranslační modifikace, jako je glykosylace, lze použít eukaryotní systémy exprese, jako jsou kvasinky (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), hmyzí Bakulovirus a různé rostliny, jako je tabák (Nicotiana tabacum) nebo ječmen. Tyto systémy však nemusí vyvolávat glykosylaci identickou s nativním glykoproteinem. Volba systému exprese tedy závisí na požadované povaze proteinu, který má být exprimován, a na jeho dalším použití.
Úloha regulačních T buněk a imunosupresivních cytokinů (IL-10 a TGF-ß) jako mediátorů normální imunitní odpovědi na alergen i v průběhu SIT je dobře známa [5]. Vhodnými kandidáty na adjuvans jsou proto látky schopné indukovat tolerogenní dendritické buňky a/nebo T regulační lymfocyty [1, 4]. Pro výběr kandidátů adjuvantního prostředku byly vypracovány humánní modely (společná kultivace dendritických buněk odvozených od monocytů a T lymfocytů) a živočišné modely (myši Balb/C senzibilizované vaječným albuminem) (obrázek 2). Výsledky naší práce ukazují, že kombinace 1 a, 25-dihydroxyvitaminu D3 a dexamethasonu nebo mléčných bakterií, jako je Lactobacillus plantarum, může indukovat intenzivní produkci IL-10 lidskými T buňkami a zvýšit účinnost SLIT u senzibilizované myši po současném podání vaječného albuminu.
Purifikace
Galenické formy
Na konci procesu fermentace a indukce genové exprese se rekombinantní protein
K prodloužení doby kontaktu alergenu se sublinguální sliznicí a k usnadnění prů-
g Obrázek
1: Hlavní kroky při tvorbě rekombinantního alergenu
niku substance k lokálním dendritickým buňkám lze užít také inovované galenické formy, jako jsou tablety, biologické filmy nebo mukoadhesivní prášky [1, 4]. Naše práce ukázala, že mukoadhesivní formulace vaječného albuminu zvyšuje účinnost SLIT u myši senzibilizované vaječným albuminem.
Zdroje alergenu Purifikace mRNA
Dr. L. Van Overtvelt Antony (Francie)
Reverzní transkripce cDNA Sonda = oligonukleotidový primer
Závěr
Amplifikace daného genu PCR
Příprava rekombinantních alergenů otevírá cestu k rozvoji diagnostických testů a nových způsobů desenzibilizační léčby. V současné době jsou k dispozici rekombinantní alergeny užívané v in vitro diagnostice. Jsou přínosné zejména pro pacienty s mnohočetnou senzibilizací, u nichž umožňují lepší identifikaci zkřížených alergií a užití SIT. V budoucnosti se očekává také jejich využití v in vivo diagnostice kožními a provokačními testy.
Vektory
Vložení vektoru (klonování) Rekombinantní vektory
Hostitelská transformace
P. pastoris
E. coli
V nadcházejících letech budou rekombinantní alergeny nepochybně reprezentovat nový způsob léčby alergických chorob.
Produkce, selekce a purifikace transformantu Daný rekombinantní protein g Obrázek
2: Výběr kandidátů na adjuvantní prostředek IL-12R
Humánní model in vitro
CD4+ Th1
Adjuvantní prostředky iDC
1- Moingeon P. Sublingual immunotherapy: from biolo- gical extracts to recombinant allergens. Allergy 2006; 61 (Suppl. 81): 15-9. 2- Pauli G, Mallin H, Rak S et al. Clinical efficacy of subcutaneous immunotherapy in birch pollen allergic patients: a randomized, double-blind, placebocon- trolled study with recombinant Bet v 1 versus natural Bet v 1 or standardized birch extract. XXVe EAACI, Vienna, 10-14 june 2006 [Abstract 83]. 3- Novak N. Targeting dendritic cells in allergen immu notherapy. Immunol Allergy Clin North Am 2006; 26: 307-19. 4- Mascarell L, Van Overtvelt L, Moingeon P. Novel ways for immune intervention in immunotherapy: Mucosal allergy vaccines. Immunol Allergy Clin North Am 2006; 26: 283-306. 5- Moingeon P, Batard T, Fadel R, Frati F, Sieber J, Van Overtvelt L. Immune mechanisms of allergenspecific sublingual immunotherapy. Allergy 2006; 61: 151-65.
+
DC
24 h
Tbet IFN-γ
Přirozené CD4+ 7 dnů Th0
CD4+
GATA 3 IL-4
Th2
ICOS Nezralé dendritické buňky
Modulované dendritické buňky
CD4+ Treg
Analýza fenotypu a produkce cytokinů
Foxp3 TGFβ IL-10
Analýza genové exprese
Myší model in vivo Analýza respirační funkce, humorální a buněčné odpovědi a zánětu
0 14
21 22 23 24 25
OVA+Alum interperitoneálně
Aerosol OVA
Senzibilizace
28
88
93
Sublinguální léčba Usmrcení 2x týdně po 2 měsíce OVA +/- adjuvant nebo formulace
Desenzibilizace
5
Klinická problematika
Sublinguální desenzibilizace v pediatrii: více než 10 let zkušeností
Sublinguální imunoterapie (SLIT) je způsob terapie, která je vhodná pro pacienty s alergickou rinitidou a/nebo dobře kontrolovaným mírným až středně těžkým bronchiálním astmatem od 5 let věku.
V
edle subkutánní specifické imunoterapie (SCIT) byly od počátku jejího vývoje testovány jiné neinjekční způsoby podávání alergenu, zejména perorální, které by vedly k usnadnění a zlepšení léčby alergických pacientů. Sublinguální podávání se jeví výhodnější než cesta perorální s polknutím alergenu, protože vykazuje lepší imunologickou odpověď a vyšší účinnost. Při SLIT aplikujeme několik kapek alergenu pod jazyk a zde je podržíme po dobu 2 až 3 min, abychom umožnili absorpci ústní sliznicí. U dětí se sublinguální imunoterapie používá po dobu zhruba 10 let.
SLIT přispívá k obnovení rovnováhy Th1/Th2
V průběhu léčby SLIT působí alergen na dendritické buňky ústní sliznice se stimulací tvorby Treg lymfocytů.
6
SLIT umožňuje léčbu IgE mediovaných alergií. Zvýšená tvorba IgE, s níž jsou tato onemocnění spojena, je způsobena relativní nerovnováhou v subpopulacích Th lymfocytů ve smyslu převahy Th2 nad Th1. Regulace poměru Th1/ Th2 je prováděna prostřednictvím T regulačních lymfocytů (Treg), jejichž aktivita je u atopických osob snížená. Léčba SLIT podporuje vychytávání alergenu dendritickými buňkami sublinguální sliznice, s následnou stimulací Treg lymfocytů. Tato stimulace vede k multiplikaci Treg buněk a zvýšené tvorbě cytokinů, jako je interleukin10 (IL-10). Výsledkem je zvýšená syntéza IgG4 a redukce tvorby IgE s relativním vzrůstem populace Th1. Všechny tyto děje přispívají k obnově rovnováhy Th1/Th2 [1].
Indikace SLIT a dlouhodobé účinky u dětí V současné době je prokázána účinnost SLIT v léčbě alergické rinokonjunktivity a mírného až středně těžkého kontrolovaného astmatu u dětí [2].
Údaje shromažďované více než deset let u astmatických dětí nebo u dětí alergických na roztoče dokumentují účinnost SLIT, která se udržuje po celé období léčby a přetrvává po jejím ukončení [3]. Nezaslepené studie zároveň dokládají snížení rizika prohloubení alergické choroby a zejména snížení rizika senzibilizace vůči novým alergenům po ukončení SLIT.
Alergeny užívané u SLIT Při SLIT jsou nejčastěji užívanými alergeny pyly a roztoči [4]. Imunoterapie musí být prováděna pokud možno pouze jedním alergenem nebo jednou skupinou alergenů; terapeutický účinek závisí na podané dávce (kumulativní terapeutické dávce). U potravinové alergie se SLIT používá v současné době pouze ojediněle a není součástí standardní klinické praxe. Některé provedené studie přinesly zajímavé výsledky [5], které je však třeba potvrdit dalšími studiemi.
SLIT u astmatických dětí Imunoterapie podávaná sublinguální nebo subkutánní cestou je kompatibilní se základní léčbou astmatu. Současné podávání SLIT spolu s inhalovanými kortikosteroidy, antihistaminiky nebo antagonisty leukotrienových receptorů je proto běžné. Ačkoli není přesně známo, zda tyto léky nějak ovlivňují účinnost SLIT, je jejich podávání v některých případech nezbytnou podmínkou pro zahájení SLIT nebo SCIT, protože imunoterapii je
možno provádět pouze při zajištění stability alergického onemocnění (např. astmatu).
Včasné zahájení IT S přihlédnutím ke spontánnímu průběhu alergického onemocnění je zahájení imunoterapie indikováno v časné fázi rozvoje alergie bez čekání na výskyt sekundárních symptomů a komplikací. Teoreticky lze použít SLIT již u dětí v předškolním věku, přičemž realizace léčby závisí především na jejím dodržování dítětem a rodiči. Optimální dobu je nutno stanovit individuálně, v závislosti na závažnosti projevů a schopnosti dítěte a jeho rodiny spolupracovat. V praxi se imunoterapie obvykle zahajuje jeden až dva roky po prvních projevech choroby. Otázka zlepšení terapeutických výsledků při včasném zahájení zůstává otevřená a měla by být předmětem dalších studií.
Důležitost údajů vztahujících se k bezpečnosti Vzhledem k tomu, že SLIT je prováděna doma, bez jakéhokoliv lékařského dohledu, je její naprostá bezpečnost nejvýše důležitá. Četné dosud publikované studie ani zkušenosti vyplývající z klinické praxe nikdy neza-
chytily závažné vedlejší alergické reakce (například anafylaktický šok) při SLIT prováděné výrobcem doporučenými dávkami [6]. Bezpečnost SLIT je v současné době doložena v léčbě dětí ve věku 5 a více let; klinické údaje týkající se mladších dětí jsou zatím nedostatečné. Obecně je SLIT dobře snášena s výjimkou obvyklých lokálních vedlejších účinků v místě aplikace. Celkové hodnocení SLIT rodinami i zdravotnickým personálem je všeobecně velice pozitivní. Užití SLIT je velmi vhodné zejména u dětí, které se vesměs obávají injekcí a preferují léčbu v rodinném prostředí. Tato forma SIT je velmi nadějná za předpokladu, že je zajištěna potřebná edukace a individuální přístup k pacientům.
Prof. C.P. Bauer Mnichov (Německo)
Imunoterapii je třeba provádět po získání kontroly astmatu a v průběhu IT je nutno trvale kontrolu alergického onemocnění udržovat.
Důvěryhodný rozhovor, podrobné vysvětlení problematiky a úplná a srozumitelná informovanost pacienta jsou některé ze základních podmínek úspěchu léčby.
1- Akdis CA, Barlan B, Bahceciler N, Akdis M. Immunological mechanisms of sublingual immunotherapy. Allergy 2006; 61 (suppl. 81): 11-14. 2- Pham-Thi N, de Blic J, Scheinmann P. Sublingual immunothera- py in the treatment of children. Allergy 2006; 61 (suppl. 81): 7-10. 3- Di Rienzo V, Marcucci F, Puccinelli P et al. Long-lasting effect of sublingual immunotherapy in children with asthma due to house dust mite: a 10-year prospective study. Clin Exp Allergy 2003; 33: 206-10. 4- Wilson DR, Torres Lima M, Durham SR. Sublingual immuno therapy for allergic rhinitis: systematic review and meta-analysis. Allergy 2005; 60: 4-12. 5- Enrique E, Pineda F, Malek T et al. Sublingual immuno therapy for hazelnut food allergy: a randomized, double-blind, placebo-controlled study with a standardized hazelnut extract. J Allergy Clin Immunol 2005; 116 : 1073-9. 6- Passalacqua G, Guerra L, Fumagalli F, Canonica GW. Safety profile of sublingual immunotherapy. Treat Respir Med 2006; 5: 225-34.
7
P¤ehled publikacÍ A Fiocchi, G Pajno, S La Grutta et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2005; 95: 254-8.
SLIT je dobře tolerována dětmi ve věku 3 až 7 let
S
ublinguální imunoterapie je stále častěji užívána zejména u malých dětí, i když v této populaci chybí dostatek údajů o toleranci tohoto způsobu desenzibilizace. Autoři provedli v této souvislosti pilotní studii vyhodnocující toleranci SLIT prováděné pro astma nebo rinokonjunktivitu u dětí ve stáří 3 až 7 let. Hodnocení se provádělo v průběhu 1 roku ve skupinách dětí mladších než 5 let a starších než 5 let. Do této observační studie bylo zařazeno 65 dětí ve stáří 38 až 80 měsíců (průměrné stáří 60 měsíců). Děti byly léčeny sublinguální imunoterapií s 11denní indukční fází a udržovací dávkou 300 IR 3x týdně. Použitými alergeny byly extrakty prachových roztočů u 42 pacientů, extrakty pylů bylin u 11 pacientů, extrakty pylů olivy u 5 pacientů, extrakty parietarie u 4 pacientů a konečně extrakty cypřišových pylů u dalších 3 pacientů. Pacienti byli rozděleni do dvou pod-
skupin podle věku: 38 až 60 měsíců a 61 až 80 měsíců. Byly zaznamenávány veškeré vedlejší účinky nebo změny v léčbě a srovnávány v obou podskupinách. Kumulativní dávka SLIT byla v průměru 36 900 IR. Vedlejší účinky byly pozorovány u 11 pacientů, avšak žádný z nich nevyžadoval zastavení léčby. Šest vedlejších účinků se vyskytlo ve věkové skupině méně než 60 měsíců a 7 ve věkové skupině více než 60 měsíců. Mezi oběma skupinami nebyl pozorován žádný rozdíl. Celkově autoři uzavírají, že v nejmladší věkové skupině dětí nezpůsobovala SLIT více vedlejších účinků. Tato observační studie byla zaměřena na snášenlivost a bezpečnost terapie, takže nebylo možno vyhodnotit klinické účinky v této populaci. Vzhledem k tomu, že účinnost sublinguální imunoterapie v nejmladší věkové skupině dětí se jeví jako vyšší, je nutné doplnit další kontrolované studie potvrzující také její dobrou snášenlivost v této věkové kategorii.
Rodriguez-Rajo FJ, Tedeschini E, Aira MJ, Jato V, Frenguelli G. Eur Ann Allergy Clin Immunol 2006;38:265.
Změny klimatu a tvorba pylu trav ve Španělsku a Itálii
V
ýrazné změny v trvání pylových sezon pozorované v Evropě jsou vnímány jako důsledek globálních klimatických změn. V posledních desetiletích zaznamenala severní polokoule podstatný vzrůst atmosférické teploty, který vedl ke změnám přítomnosti polétavých pylů přenášených větrem. Meteorologické a pylové údaje o čeledích trav byly analyzovány ve třech geografických sektorech: jeden v Itálii (Perugia v období 1982–2003) a další dva ve Španělsku (Santiago de Compostela v období 1992–2003 a Vigo v období 1994–2003). Průměrná roční teplota v Perugii a Santiagu de Compostela v posledních letech vzrostla, zatímco ve Vigu způsoboval vliv oceánu opačný jev. Datum
zahájení pylové sezony má tendenci se snižovat v kontinentální oblasti, zatímco v nejteplejších španělských sektorech lze pozorovat opačnou tendenci. Následkem toho bylo v posledních letech trvání pylové sezony kratší. Celkem mají v nejchladnějších oblastech křivky tvorby pylu vyšší hodnoty kurtózy (měření distribučního vrcholu) a šikmosti (asymetrie distribuce). Tyto zaznamenané změny se primárně vztahují k chronologii tvorby pylů, avšak rovněž ovlivňují způsoby šíření pylů. V této studii, podobně jako v mnoha dalších, se ukazuje, že kolísání teploty je hlavním určujícím faktorem pozorovaných změn.
