Rekombináns fehérje alapú gyógyszerek, diagnosztikumok
Fehérjék •
Az életfolyamatok során lejátszódó biokémiai reakciók túlnyomó többségét fehérjék katalizálják
•
A sejtek, szövetek, szervek szerkezetét fehérjék alkotják, ezek formáját, stabilitását/átalakulását fehérjék határozzák meg
•
A fehérjék működése elengedhetetlen a mozgáshoz, érzékeléshez
•
A sejtekben lejátszódó folyamatok szabályozásában kulcsszerepet játszanak a fehérjék
•
A szervezet működésének összehangolását fehérjék végzik
•
A fehérjék meghatározó szerepet játszanak a kórokozók elleni védekezésben
A fehérjék építőelemei az aminosavak A fehérjék 20 (22) féle aminosavból felépülő (ko)polimerek, (de a fehérjék utólagos módosítások következtében rendkívül sokféle molekulát tartalmazhatnak: cukrokat, lipideket, szerves és szervetlen molekulákat, különleges elemek atomjait: Se, Co, Cu, Mo) Az aminosavak oldallánca lehet poláros (hidrofil) ill. apoláros (hidrofób, víztaszító), A poláros aminosavak között vannak semlegesek, negatív ill. pozitív töltésűek Az oldallánc lehet alifás vagy aromás (gyűrűs) Az aminosavak oldalláncai között is kialakulhatnak kölcsönhatások ill. kémiai kötések: van der Waals erők, hidrogén híd kötések, komplex(koordinációs-), ionos- és kovalens kötések Az aminosavak nagy változatossága miatt a fehérjék szerkezete elképesztően sokféle lehet: 8000 féle tripeptid, 3.2 millió pentapeptid és több, mint egy milliárd féle heptapeptid létezik! Egy átlagos fehérje kb. 300 aminosavból áll
A peptidkötés és a polipeptidek Az egyik aminosav karboxilcsoportja és a másik aminosav aminocsoportja között alakul ki a peptidkötés A fehérjék gerince –N-C-Cegységekből álló, monoton szerkezet, amely (mivel nincsenek benne kettős kötések) szabadon tud rotálni. Az aminosavak sorrendjét tekintjük a fehérjék elsődleges (primér) szerkezetének
A fehérjék másodlagos szerkezete A polipeptidlánc flexibilitása sokféle másodlagos szerkezetet tesz lehetővé: lehet véletlenszerű (random coil), de kialakulhat alfa hélix és béta redő (lemez) szerkezet is Az alfa hélix egy spirális lánc, a spirál „emeletei” közötti távolságot az aminosavak NH és CO csoportjai között kialakuló H-híd kötések stabilizálják Az alfa hélix igen stabil, de ugyanakkor rugalmas szerkezet Az aminosavak oldalláncai a hélix felszínén, kifelé állnak, így meghatározzák a hélix töltését, poláros vagy apoláros természetét
A fehérjék másodlagos szerkezete
Az alfa hélix szerkezete, az aa-k oldalláncai nélkül. A szaggatott vonal H-hidakat jelez.
A fehérjék másodlagos szerkezete
Az alfa hélix szerkezete, oldalláncokkal együtt ábrázolva
A fehérjék másodlagos szerkezete A párhuzamosan, de ellentétes irányban, futó peptidláncok között is kialakulhatnak Hhidak által stabilizált szerkezetek: ezeket a lemez-szerű képződményeket nevezzük béta redőknek vagy lemezeknek. Az 5-8 aa hosszú béta lemezek különösen stabil szerkezetűek, igen nagy szilárdságot biztosítanak a béta lemezekből álló fehérjéknek Az egymás felett elhelyezkedő lemezek paralel vagy antiparalel lefutásúak lehetnek. Egymáson elcsúszhatnak, ezért rugalmas pl. a selyem
A fehérjék másodlagos szerkezete
A béta lemez szerkezete, az aminosavak oldalláncai nélkül
A fehérjék másodlagos szerkezete •
A motívumokból kinyúló oldalláncok ki tudnak alakítani poláros, vagy apoláros felszíneket.
•
A képen azt látjuk, hogy a külső felszín poláros oldalláncai vízben oldhatóvá tesznek egy polipeptidet, amely számos víztaszító oldalláncot is tartalmaz. Ezek egy hidrofób magot alkotnak a szerkezet belsejében. Számos fehérje alegységeit ilyen, apoláros csoportok tartják össze
•
A fehérjék másodlagos szerkezete Az alfa hélix és a béta lemez mellett gyakori szerkezeti elemek a fehérjékben a hurkok (turns, loops, fingers). A rövid U-alakú „kanyarokat” (turn) H-híd kötések stabilizálják. A turn-ök a fehérjék felszínén helyezkednek el, rendszerint prolint és glicint tartalmaznak. A turn köti össze a hélixeket és lemezeket (megfordítva a polipeptidlánc irányát). A nagyobb hurkok (loops, fingers) a fehérje-fehérje ill. a fehérje-nukleinsav kölcsönhatásban játszanak szerepet. A fenti elemekből számos „motívum” állhat össze. pl. helix-loop-helix
A cink ujj (zinc finger) Két olyan aminosav van, amelyik a Zn ionokkal kötést tud létrehozni: a cisztein (SH) és a hisztidin (imidazol nitrogén) Két cys és két his által koordinációs kötésben kötött Zn alakítja ki a cink ujjnak nevezett szerkezetet:
•
Rövid hurkokat a Ca ion is stabilizálni tud (pl. helix-loop-helix típusú fehérjékben).
A fehérjék szerkezete: domének •
A szekvencia és a motívumok együttesen alakítják ki a fehérjék szerkezeti és működési elemeit, a doméneket (domain).
•
Az evolúció során kialakult, jól használható szerkezeti elemek a domének, amelyeket gyakran egyetlen exon kódol, de ha több, akkor is a domén szekvencia határai mindig egybeesnek az exon-intron határokkal
•
Igen sok fehérjében megtalálhatjuk ugyan azt a domént (ahol hasonló funkciókat látnak el)
•
Minél több feladatot lát el egy fehérje, annál több domén található benne
•
Az alternatív splicing eredményeképpen eltérő domén-szerkezetű fehérjék termelődhetnek
A fehérjék harmadlagos és negyedleges szerkezete • A domének együttesen alkotják a fehérjék (a polipeptid lánc) harmadlagos szerkezetét. • A negyedleges szerkezet arra utal, hogy hány alegységből (polipeptid láncból) áll egy fehérje. • Sok fehérjének van két alegysége, de meglepően gyakoriak még a négy, hat láncból álló fehérjék is (ritkább a 3-, 5-mer).
A fehérje szerkezetének kialakulása •
Az elsődleges szerkezet (aminosav sorrend) általában meghatározza a fehérje magasabb-rendű szerkezetét és a szerkezet magától kialakul (self assembly)
•
A fehérje natív (működőképes) szerkezete az energetikailag legelőnyösebb forma (formák egyike)
•
A membránfehérjék a ER lumenjébe bejutva nyerik el szerkezetüket. A bonyolult felépítésű fehérjék szerkezetének kialakulását „dajka-fehérjék”, chaperonok segítik elő
•
Szintén a dajkafehérjék feladata a rosszul feltekeredett láncok szerkezetének „javítása”, vagy a fehérje-károsító hatások következtében denaturálódott fehérjék renaturálása
A fehérje szerkezetének kialakulása
random coil
molten globule
native state
•
A szerkezet kialakulása lépésenként történik és megfordítható folyamat. Magas hőmérséklet, extrém pH, szerves oldószerek, víz-levegő határa (pl. habverő), stb. a fehérjék szerkezetének végleges vagy reverzibilis átalakulásához, denaturációhoz vezethet.
•
Minden fehérjének több lehetséges szerkezete van, de nem mindegyik képes ellátni a fehérje feladatát. Az egyik (vagy néhány) stabil szerkezet a „natív”, működőképes szerkezet.
Dajkafehérjék, chaperonok A dajkafehérjék a frissen készülő fehérjékhez kapcsolódva alakítják ki azok natív szerkezetét A denaturálódott fehérje jellemzője a sok, felszínre került apoláros oldallánc a chaperonok ezeket ismerik fel és tüntetik el a fehérje szerkezetének módosításakor. A dajkafehérjéket hő-sokk fehérjéknek is nevezik, mert a hőhatás indukálja termelésüket.
Denaturáció, renaturáció A H-hidakat megbontó vegyületek (karbamid, guanidin, fenol) a fehérje szerkezetének összeomlását, a fehérje denaturációját okozzák. Redukáló anyagokkal a diszulfid hidak is felbonthatók, így a fehérje random coil állapotba kerül. Számos olyan fehérje van, amelyek szerkezete viszonylag egyszerűen visszaáll, ha a denaturáló anyagokat eltávolítjuk (self assembly). Ezzel a módszerrel lehet pl. baktériumokban előállított (de azokban rosszul feltekeredett) gyógyhatású fehérjéket aktív szerkezetűvé alakítani. Detergensek (pl. SDS) a hidrofób kölcsönhatásokat megszüntetve okozzák a denaturációt. Eltávolításuk nehézkes, de ha sikerül, renaturációhoz vezethet
Vezikuláris transzport és fehérje érés A fehérjék jelentős része és a membrán lipidek az ER-hoz kötve szintetizálódnak. Ezeket a molekulákat szét kell szortírozni és működésük helyére kell szállítani – megfelelő átalakítások után. Az összes enzim, amely a fehérjék éréséhez, módosításához kell megtalálható az ER és a Golgi lumenében ill. a membránjaihoz kötve. Az egyes cél-organellumok megtalálását segíti a fehérje aminosav sorrendjében fellelhető „szignál szekvenciák” jelenléte.
Az SRP tevékenysége Az SRP a készülő fehérje szignál szekvenciájához kötődve megakadályozza a fehérje szintézisét, mindaddig, amíg kölcsönhatásra nem tud lépni receptorával, amely az ER felszínén helyezkedik el. A kapcsolat kialakulása után a fehérjeszintézis folytatódik, a szignálpeptid a pórusban kötve marad, de a peptid folyamatosan csúszik be a lumenbe. Végül a szignál peptidáz lehasítja a szignálpeptidet a fehérjéről.
Nascens polipeptidláncok bejutása az ER-be
Fehérje módosítás az ER-ben:
Oldható fehérjék
diszulfid híd képződés, glikoziláció (N-, O-) foszforiláció, arginiláció, oxidáció (lizin), acilálás (hosszú zsírsavak), metiláció, acetiláció, proteolízis, keresztkötések, ubikvitináció, poliubikvitináció
Nascens polipeptidláncok bejutása az ER-be
Type I membránfehérjék
Type II membránfehérjék
A fehérjék glikozilációja A fehérjék glikozilációja több lépéses folyamat, amit specifikus enzimek katalizálnak az ER és a Golgi lumenjeiben. A glikoziláló enzimek működése nem olyan pontos, mint amit korábban megszoktunk: egyes lépések megtörténte esetleges, így sokféle fehérje izoforma alakulhat ki.
A vezikuláris transzport folyamat A sejt valamennyi kompartmentje az összes többivel (és a külvilággal) folyamatos anyagcserében áll, ennek eszköze a vezikuláris transzport. A vezikulumok a citoszkeleton mentén, motor fehérjéket felhasználva közlekednek. A fehérje aminosav sorrendje meghatározza a fehérje későbbi elhelyezkedését A prokarióták, az egysejtűek, a gerinctelenek és a gerincesek eltérő enzimkészlettel rendelkeznek: más módosításokat képesek kialakítani
Transzport vezikulumok és a Golgi network A piros fluoreszcencia jelzi transzport vezikulumok helyzetét a kék mag és a zölden festett ER mellett. A jobboldali képen a trans-Golgi network, TGN, látható zöld színben, míg a plazmamembrán pirossal világít.
Rekombináns fehérjék – prokarióta rendszerek In vitro rekombináns DNS technológia (génsebészet, génmódosítás, ‘génpiszkálás’) Transzgén- vagy genetikailag módosított organizmusok (GMO vagy GE élőlények) Az izolált gének szekvenciáit új környezetbe helyezve, erős bakteriális promóterek (enhancerek) szabályozása alá rendelve expressziós vektorokat állítunk elő. A DNS konstrukcióval sejteket transzformálva transzgénikus szervezeteket állítunk elő, amelyek az illető gének termékeit nagy mennyiségben képesek termelni.
P
gene
Rekombináns fehérjék – prokarióta rendszerek A bioipar egyik első terméke az E. coliban termeltetett rekombináns inzulin volt (1986). A rekombináns inzulin több tízmillió ember életét menti meg Az emberi inzulinnal tökéletesen megegyező molekula, nem vált ki ellenanyag termelést.
Rekombináns fehérjék – prokarióta rendszerek Az elmúlt évek során számos rekombináns fehérje került forgalomba, amelyeket genetikailag módosított prokarióták segítségével állítanak elő. inzulin – cukorbetegség véralvadási faktor VIII és IX – vérzékenység TPA (szöveti plazminogén-aktivátor) – trombózis, infarktus növekedési hormon – törpenövés, interferonok – vírusfertőzések, vírus-indukálta daganatok GM-CSF és IL-3 – leukopenia, vérképzési rendellenességek angiostatin és endostatin – angiogenezis gátlása, daganatos betegségekben ADA (adenozin deamináz) – örökletes immunhiányos állapot kezelése vírális és bakteriális fehérjék – vakcinálás
Rekombináns fehérjék – eukarióta rendszerek Számos olyan fehérje van, amelynek aktív formáját a prokarióták nem tudják előállítani. Ezek termelésére csak eukarióta sejtek (néha csak gerincesek sejtjei) képesek. A DNS konstrukciókat (ingázó v. shuttle vektorokat) ilyen esetekben is baktériumokban állítják elő, de a transzformált, termelő sejt eukarióta eredetű: Élesztőgomba Rovarsejt / bakulovírus Állati (emberi) sejttenyészetek Transzgenikus állat (teje) eritropoetin, véralvadási faktorok, HBV, vírusfehérjék, stb.
Rekombináns fehérjék – eukarióta rendszerek A vese által termelt eritropoetin elengedhetetlen a vvt kialakulása szempontjából. Dialízisre szoruló vese betegek csak folyamatosan ismétlődő vérátömlesztéssel voltak életben tarthatók a rekombináns eritropoetin kifejlesztése előtt. Genetikailag módosított állatok tejéből lehet kinyerni emberi véralvadási faktorokat A rekombináns fehérje gyógyszereket (Epo, HGH, IGF-1) a "profi" sport doppingként használja, nem törődve az életveszélyes szövődményekkel
„Dizájner” fehérjék •
Az egyes domének működésének ismeretében mesterséges fehérjéket állíthatunk elő: – – – – –
• •
új kémiai reakciók katalízise tetszőleges molekulák megkötése tetszőleges (DNS) szekvenciák felismerése bizonyos molekulák jelenlétének detektálása mozgás-, kémiai-, elektromos- és fény-energiák átalakítása egymásba
IL-3-CSF fúziós fehérje Science: Mátés L.: Molecule of the year, 2009
Immunglobulinok (Ig), B sejt receptorok (BCR) Az immunglobulinok nagy méretű fehérjék, amelyek a szérumban ill. a B sejtek felszínén találhatóak (utóbbiak a B sejt receptorok). Az emberi Ig-ok legalább 4 polipeptidláncból állnak, jellemzően két könnyű (light, L) és két nehéz (heavy, H) láncból, amelyeket S-S hidak tartanak össze A H-lánc 4-5, az L 2 doménból épül fel
Immunglobulinok (Ig), B sejt receptorok (BCR) A molekulák egyedi, nagyon különböző antigén-kötő része (Fab = antibody binding fragment) a könnyű és a nehéz lánc kombinációjából alakul ki, a másik vége – amely az egyes típusú molekulákban azonos – csak a nehéz láncokból áll. A láncok antigén kötő doménjét variábilis doménnek nevezzük. Az Fc részen szénhidrát oldalláncok találhatók. A könnyű láncok másik darabját és az Fc-t alkotó doméneket konstans doméneknek nevezzük. A B sejt receptorok (BCR) egy transzmembrán doménnel hosszabbak az immunglobulinoknál, ez horgonyozza a molekulát a sejthártyába.
Immunglobulinok (Ig), B sejt receptorok (BCR) Az Ig-okat jellegzetes, béta redőkből álló immunglobulin domének építik fel, amelyeket diszulfid hidak stabilizálnak A hinge régió nagy mozgékonyságot biztosít a molekula Fab karjainak
Hibridóma sejtek Az immunizált állat lépének B sejtjeit ellenanyagot termelnek, de rövid életűek. A mieloma sejtek (B tumorsejtek) nem termelnek, de 'halhatatlanok'. A kétféle sejt fúziójával hibrid sejteket (hibridóma) lehet előállítani. A hibrid sejtek közül kiválogathatók a folyamatosan osztódó és Ig-t termelő klónok. Ezek elszaporítva felhasználhatók ellenanyagok gyártására.
Ellenanyagok biotechnológiája Poliklonális és monoklonális ellenanyagok Az antigén epitópjai ellen igen sok, eltérő specificitású B sejt termel antitestet Egyetlen B sejt utódai (klónja) egy epitópot felismerő Ig-t állítanak elő (monoklonális)
'Humanizált' ellenanyagok A poliklonális ellenanyagokat általában állatokban, a monoklonálisakat egérben vagy patkányban állítják elő. Így az állati Ig-t ismételten emberbe juttatva idegen fehérjeként immunválaszt vált ki (és rövid a keringési féléletideje). Az antigén felismerésében csak a változó domének 3-3 ujja vesz részt, az állati eredetű konstans domének rekombináns technológiával lecserélhetők emberi Ig konstans doménekre. Így áll elő a kiméra ellenanyag. A változó domének antigén-felismerésben szerepet nem játszó részeinek kicserélésével 'humanizálni' lehet a molekulát, A 'humanizált' ellenanyag ezután emberi Ig-ként viselkedik. Az emberi immunglobulin géneket hordozó egerek immunizálása azonnal human Ig termelést eredményez
'Humanizált' ellenanyagok A poliklonális ellenanyagokat általában állatokban, a monoklonálisakat egérben vagy patkányban állítják elő. Így az állati Ig-t ismételten emberbe juttatva idegen fehérjeként immunválaszt vált ki (és rövid a keringési féléletideje). Az antigén felismerésében csak a változó domének 3-3 újja vesz részt, tehát az állati eredetű konstans domének rekombináns technológiával lecserélhetők emberi Ig konstans doménekre. Így áll elő a kiméra ellenanyag. A változó domének antigén-felismerésben szerepet nem játszó részeinek kicserélésével 'humanizálni' lehet a molekulát, A 'humanizált' ellenanyag ezután emberi Ig-ként viselkedik. Az emberi immunglobulin géneket hordozó egerek immunizálása azonnal human Ig termelést eredményez
Ellenanyagok és származékaik Monoklonális és bispecifikus ellenanyagok
Kétféle hibridóma sejt fúziójával olyan sejtet lehet előállítani, amely kétféle antigént ismer fel bispecifikus). Felszíni antigéneket és toxikus anyagokat felismerő bispecifikus Ig-ok, "mágikus lövedékek" alkalmasak lehetnek tumorsejtek pusztítására. Ha az effektor feladatokra (komplement aktiválás, opszonizáció) nincs szükség, az Ig molekula lerövidíthető, egy- vagy kétszálú Fab vagy Fv szakaszokra (ezek 'minibody' néven is ismertek).
Ellenanyag származékok A 'mágikus lövedékek' monospecifikus ellenanyagokból (felszíni tumor antigénekre specifikus antitestekből), vagy azok rövidített származékaiból is készíthetőek. Így a toxikus anyagok célba juttathatók, a mellékhatások jelentősen csökkenthetők.
Gyógyszerként használt ellenanyagok • Az Avastin meggátolja új erek, kapillárisok keletkezését, hatásos tumor-ellenes hatással rendelkezik. Az Avastin egy humanizált, VEGFellenes monoklonális ellenanyag
A Remicade, az Infliximab, a Humira a TNF hatását gátolja, reumás artritiszben, Crohn betegségben, krónikus gyulladásos esetekben gyógyító hatású. Hasonlóképpen, az IL-1 ellenes hatású Anakinra is nagyon hatásos krónikus gyulladásos kórképekben. A vaksághoz vezető makula degeneráció kezelésére alkalmas a Lucentis (Ranimizumab).
Gyógyszerként használt ellenanyagok • •
A Herceptin is humanizált monoklonális ellenanyag, ami az EGF receptorhoz kötődik és meggátolja annak dimerizálódását. Az EGF.R számos tumorban, pl. emlőrákokban túltermelődve fontos szerepet játszik a tumor kialakulásában, terjedésében.
A Xolair (Omalizumab) az IgE hatását neutralizálja, asztmás és súlyos allergiás betegekben jelentősen enyhíti a tüneteket.
Gyógyszerként használt ellenanyagok Colorectal cc. ellen hatásos két másik EGF.R-t felismerő ellenanyag, a Vectibix (Panitumumab) és az Erbitux (Cetuximab). Egyes vírusbetegségek ellen jelentenek védelmet más készítmények, pl. a respiratory syntitial virus (RSV) ellen a Synagis (Palivizumab). A szervátültetéseket követő kilökődési reakciók fékezésére alkalmas készítmények a Simulect (Basiliximab) vagy a Zenapax (Daclizumab). Non-Hodgkin limfóma kezelésében, autoimmun betegségekben nagyon jó eredményeket értek el (a B sejtekre jellemző CD20 antigén elleni) Rituxan-nal (Tositumomab) Sérült-, gyulladt szövetek csillapíthatatlan fájdalmát enyhíti a tanezumab, egy humanizált monoklonális ellenanyag, ami az NGF kötődését gátolja
Diagnosztikai ellenanyagok Immunogold 'festés' Szövettan Immunprecipitáció Sejt szeparálás Fehérje (kórokozó) azonosítás Affinitás kromatográfia Tumor diagnosztika Tumor terápia RIA, ELISA
Fluor-jelölt ellenanyagok
Diagnosztikai ellenanyagok Szövettan Immunprecipitáció Sejt szeparálás Fehérje (kórokozó) azonosítás Affinitás kromatográfia Tumor diagnosztika Tumor terápia RIA, ELISA
Tumor sejtek, magzati sejtek, ritka sejttípusok izolálására alkalmas, kíméletes eljárás
Diagnosztikai ellenanyagok Szövettan Immunprecipitáció Sejt szeparálás: Fluorescence-activated cell sorter Fehérje (kórokozó) FACS azonosítás Affinitás kromatográfia Tumor diagnosztika Tumor terápia RIA, ELISA
