Regionální centrum Olomouc

Sborník příspěvků ze semináře

„Česnek ve 21. století“

Regionální centrum Olomouc 16. 5. 2012 Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.

Olomouc 2012

Sborník příspěvků ze semináře

Česnek ve 21. století Editoři:

Karel Dušek, Jaroslav Rod

Organizátor: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Olomouc, 2012 Vydal:

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i, Praha, 2012

Tisk:

Media Dida, s.r.o., Olomouc

ISBN:

978-80-7427-102-1

Vytištěno za finanční pomoci projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043.

Program semináře 1. Úvod: Str. 1

Ing. Karel Dušek, CSc., VÚRV, v.v.i., Olomouc

2. Genetické zdroje česneku: Str. 2-6 Ing. Helena Stavělíková, Ph.D., VÚRV, v.v.i., Olomouc 3. Národní odrůdový úřad; Odrůdové zkoušky; Odrůdová skladba česneku v ČR: Str. 7-19 Ing. Lenka Lefnerová, Ing. Věra Řičicová, ÚKZÚZ, Brno 4. Škůdci a choroby česneku: Str. 20-28 Bc. Ing. Eva Sapáková, MENDELU, Brno 5. Chemická ochrana česneku – povolené přípravky: Str. 29-30 Ing. Ladislav Prečan, SRS, Olomouc 6. Virové choroby česneku kuchyňského: Str. 31-39 Ing. Martina Kudělková, MENDELU, Lednice 7. Virové choroby u genetických zdrojů česneku – NAZV QH71228: Str. 40-44 Ing. Kateřina Smékalová, Ph.D., VÚRV, v.v.i., Olomouc 8. Detekce virů v česneku pomocí PCR: Str. 45-52 RNDr. Leona Svobodová, Ph.D., VÚRV, v.v.i., Praha 9. Ozdravování česneku: Str. 53-57

Mgr. Jana Krajíčková, VÚB Havlíčkův Brod Ing. Břetislav Křižan, Ph.D., MENDELU, Lednice

10. Kryokonzervace ozdravených GZ česneku: Str. 58-65 Ing. Jiří Zámečník, CSc., VÚRV, v.v.i., Praha 11. Využití česneku i jinak než v kuchyni; Co nám dnes mohou nabídnout česnekové potravinové doplňky? Str. 66-73 Allivictus, s.r.o., Česká Skalice 12. Meteorologický záznam počasí: Str. 74

za období 12/2010 – 2/2011 a 12/2011 – 2/2012

Po skončení přednáškového cyklu seminář pokračuje exkurzí na pozemcích VÚRV, v.v.i., Šlechtitelů 11, Olomouc. Pořadatel neodpovídá za věcnou stránku příspěvků a prezentací.

Partnerská síť v oblasti speciálních plodin, registrační číslo projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043 Tato akce je spolufinancována z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky.

1. ÚVOD DUŠEK KAREL Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Olomouc Vážení kolegové, přátelé a příznivci česnekového odéru, dovolte mi, abych Vás přivítal na semináři k problematice česneku, který se bude zabývat česnekem a to jak z pohledu odrůdové skladby, pěstitelských problémů, ale je také věnován zdravotnímu stavu česneku v současnosti a výhledům do budoucnosti. Doufám, že Vám přítomní přednášející fundovaně a dostatečně srozumitelně vysvětlí problematiku v naplánovaných přednáškových tematech, ale také vyčerpávajícím způsobem zodpoví Vaše doplňující zvídavé otázky.

PODĚKOVÁNÍ Díky finanční pomoci projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043 jsou ve sborníku prezentovány výsledky užitečné pro praxi.

1

2. GENETICKÉ ZDROJE ČESNEKU V ČESKÉ REPUBLICE STAVĚLÍKOVÁ HELENA Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Olomouc ABSTRAKT Na Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i., jsou udržovány kolekce vegetativně množených cibulovin – česneku kuchyňského (Allium sativum L.) a šalotky (Allium ascalonicum L.) Udržování kolekcí genetických zdrojů zelenin má v Olomouci dlouholetou tradici. Základy kolekcí byly položeny již v roce 1951. Kolekce genetických zdrojů česneku byla k 30. listopadu 2011 tvořena 657 genotypy, které pocházejí ze 30 států celého světa. V průběhu vegetace je u genotypů česneku popisováno 22 znaků. V rámci popisů je u všech genotypů prováděna take podrobná fotodokumentace. Kolekce česneku je udržována v polní kolekci a každoročně znovu vysazována. Všechny genotypy jsou vysazovány v podzimním termínu, tzn. v polovině října, do sponu 30 x 10 cm a hloubky 5 – 7 cm, v závislosti na velikosti sadby. KLÍČOVÁ SLOVA – česnek, genetické zdroje, kolekce, morfologický popis ÚVOD Na Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních, Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. jsou udržovány kolekce vegetativně množených cibulovin – česneku kuchyňského (Allium sativum L.) a šalotky (Allium ascalonicum L.) Udržování kolekcí genetických zdrojů zeleniny má v Olomouci dlouholetou tradici. Základy kolekcím byly položeny již v roce 1951, kdy byl v Olomouci založen Výzkumný ústav zelinářský, který svoji činnost ukončil v roce 1994; ve stejném roce bylo Oddělení genetických zdrojů organizačně přičleněno k Výzkumnému ústavu rostlinné výroby (VÚRV) v Praze – Ruzyni a od roku 2010 je Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i., součástí Centra regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum. Kolekce genetických zdrojů česneku byla k 30. listopadu 2011 tvořena 657 genotypy. Nejstarší dochované materiály byly do kolekce zařazeny již v roce 1954 (Tab. 1).

2

Tab. 1.

Nejstarší dochované genotypy v kolekci EVIGEZ Polní číslo Název Stát původu

09H0100032 09H0100046 09H0100036 09H0100041 09H0100042 09H0100043 09H0100053 09H0100057

1012 1015 1029 1035 1036 1037 1041 1045

Rok zařazení do kolekce P.V.147 Československo 1954 Sviatogorskij Sovětský svaz 1954 Kooneckij Sovětský svaz 1954 Andinzanskij Sovětský svaz 1954 Uzbeckij Sovětský svaz 1954 Dvurutchka Sovětský svaz 1954 Tianshanskij Sovětský svaz 1954 Monshanskij Sovětský svaz 1954

Na základě doporučení pracovní skupiny ECPGR (The European Cooperative Programme for Plant Genetic Resources) pro Allium byl v roce1986 kolekci přiznán statut mezinárodní polní kolekce pro vegetativně množené cibuloviny pro podmínky dlouhého dne. ROZDĚLENÍ KOLEKCE Kolekci lze rozdělit podle několika kritérií do různě velkých skupin. ZEMĚ PŮVODU V kolekci jsou zastoupeny materiály ze 30 států celého světa. V tabulce je uveden přehled genotypů podle nejpočetněji zastoupených států původu (Tab. 2). Významnou část kolekce představují krajové odrůdy nashromážděné v průběhu sběrových expedicí na přelomu 80. - 90. let minulého století na Jižní Moravě a v Bílých Karpatech. Důležitou součástí jsou rovněž plané druhy a primitivní formy česneku, pocházející z Centrální Asie a západní Sibiře, které byly nashromážděny v průběhu mezinárodních expedicí (Centrální Asie, 1988; západní Sibiř, 1990). V kolekci jsou zařazeny současné, ale především také restringované české odrůdy. Tab. 2.

Počty genotypů podle nejpočetněji zastoupených států původu

Stát původu Sovětský svaz Českoslovesko Bulharsko Polsko Česká republika

Počet genotypů 144 108 59 43 37

Stát původu Slovensko Maďarsko Čína Rakousko Španělsko

3


PŮVOD MATERIÁLU V kolekci česneku jsou materiály čtyř původů (Tab. 3) - planá forma, krajová nebo primitivní odrůda, šlechtitelská odrůda a šlechtitelský zdroj. Nejpočetněji je zastoupen původ krajová odrůda. Počty genotypů podle původu materiálu

Tab. 3.

Původ planá forma krajová odrůda šlechtitelská odrůda šlechtitelský zdroj Neuvedeno


SCHOPNOST VYTVÁŘET KVĚTNÍ STVOL Podle schopnosti vytvářet květní stvol je kolekce rozdělena do tří skupin: -

skupina 217 genotypů, které nevytvářejí květní stvol – např. Matin, Lumír, Benátčan skupina 332 genotypů, které vytvářejí květní stol - např. Džambul, Elin, Stanik, Dukát skupina 108 genotypů, které jsou polovybíhající do květu, tvořící pacibulky v různých místech pseudostonku – např. Záhorský

MORFOLOGICKÝ POPIS V průběhu vegetace je na genotypech česneku popisováno 22 znaků; 19 znaků pochází z “Descriptor for Allium, Allium spp. (IPGRI, 2001)”, kde je 15 znaků povinných a 4 doporučené. Daší 3 znaky jsou nad rámec IPGRI deskriptoru hodnoceny z rozhodnutí kurátorky kolekce. Na jednotlivých částech rostliny se popisují následující znaky: Rostlina - habitus (1 znak) List – barva, průřez, šířka, postavení – jaro, léto (5 znaků) Pseudostonek – délka, průměr v nejširší části (2 znaky) Cibule - tvar plně vyvinutých cibulí česneku, barva obalových suknic složené cibule, barva stroužků, počet stroužků ve složené cibuli, uspořádání složené cibule, tvar složené cibule na příčném řezu, váha stroužků (česnek) (7 znaků) Květenství - schopnost vytvářet květ, schopnost vytvářet květní svol, počet pacibulek, hmotnost 100 pacibulek, počet hemisfér, typ fertility, počet květů v okolíku (7 znaků)

4

Fotodokumentace - v rámci popisů se u všech genotypů provádí podrobná fotodokumentace, která je zaměřena na příčný a podélný řez složenou cibulí, na stroužek, lichookolík s pacibulkami a pacibulky. AGROTECHNIKA Kolekce česneku je udržována v polní kolekci a každoročně znovu vysazována. Všechny genotypy jsou vysazovány v podzimním termínu, v polovině října, do sponu 30 x 10 cm a hloubky 5 – 7 cm, v závislosti na velikosti sadby. Na výsadbu jsou použity zdravé, mechanicky nepoškozené, obvodové stroužky, které jsou před výsadbou mořeny roztokem obsahujícím přípravky Rowral Flo (účinná látka: iprodian 255 g/l), Reldan 40 EC (účinná látka: chlorinepyrifos – methyl 400g/l ) a Karben Flo Stefes (účinná látka: carbendazin 500 g/kg), po dobu 20 minut. Před výsadbou je na pole aplikováno hnojivo Cererit (4q/ha). V jarním období (březen, duben) se provádí další přihnojení Cereritem v množství 2q/ha. V jarních měsících je porost 2x ošetřován insekticidem Reldan 40 EC (účinná látka: chlorinepyrifos – methyl 400g/l). Během vegetace je porost udržován v bezplevelném stavu mechanicky. Sklizeň probíhá na přelomu června a července. Rostliny jednoho klonu jsou svázány do snopků, které jsou pověšeny do prostoru, kde je zajištěna dostatečná cirkulace vzduchu. Po 6 – 8 týdnech, kdy jsou rostliny dostatečně usušené, jsou očištěny – kořeny jsou zakráceny na 5 mm a jsou odstraněny suché listy. Očištěné složené cibule jsou v síťovaných pytlíčcích opět pověšeny v prostoru, kde je zajištěna dostatečná cirkulace vzduchu, a tím jsou nachystány k podzimní výsadbě. Vysazuje se 19 stroužků od každého klonu. PASPORTNÍ DATA Pasportní data kolekce česneku jsou on - line dostupná v internetové aplikaci EVIGEZ (EVIdence GEnetických Zdrojů rostlin v České republice): http://genbank.vurv.cz/genetic/resources/ Data jsou rovněž zahrnuta do mezinárodní databázi ECPGR European Allium, databázi lze najít na internetové adrese: http://www.ecpgr.cgiar.org/fileadmin/www.ecpgr.cgiar.org/NW_and_WG_UPLOADS/ Allium_WG_2011/Allium7PereaFINALWeb_20_12_11.pdf LITERATURA IPGRI, ECPGR, AVRDC (2001). Descriptors for Allium (Allium spp.) International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy; European Cooperative Programme for Crop Genetic Resources Networks (ECPGR), Asian Vegetable Research and Development Center, Taipei, Taiwan

5

KONTAKT: Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc; [email protected]

PODĚKOVÁNÍ Udržování genetických zdrojů česneku kuchyňského (Allium sativum L.) je financováno Ministerstvem zemědělství České republiky, 20139/2006-13020, čj. 206553/2011-MZe-17253.

6

3. a) NÁRODNÍ ODRŮDOVÝ ÚŘAD, ODRŮDOVÉ ZKOUŠKY LEFNEROVÁ LENKA Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Hroznová 2, Brno Odrůdové zkoušky probíhají za účelem registrace odrůdy, udělení ochranných práv k odrůdě a za účelem doporučování. Skládají se ze zkoušek odlišnosti, uniformity a stálosti a zkoušek užitné hodnoty. REGISTRACE ODRŮD Registrace odrůd je základním předpokladem uznávání a uvádění do oběhu rozmnožovacího materiálu odrůd hospodářsky důležitých zemědělských a zeleninových druhů, révy a chmele. Řízení o registraci odrůdy probíhá podle zákona č. 219/2003 Sb. o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů (zákon o oběhu osiva a sadby), ze dne 25. června 2003, ve znění pozdějších předpisů. O registraci odrůdy rozhoduje Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský prostřednictvím Národního odrůdového úřadu. Odrůdy, registrované v České republice, jsou zapsány ve Státní odrůdové knize. Pravidelně, každé dva měsíce, jsou zveřejněny ve Věstníku Ústavu na webové stránce www.ukzuz.cz. Registrovány mohou být odrůdy -

druhů uvedených ve Vyhlášce č. 378/2010 Sb., o stanovení druhového seznamu pěstovaných rostlin

-

všech druhů okrasných rostlin.

Odrůdy zemědělských, zeleninových a ovocných druhů neuvedených v druhovém seznamu registrovat nelze. Předpokladem pro registraci odrůdy je zjištění, že odrůda - je odlišná, uniformní, stálá, - má užitnou hodnotu – to se týká druhů polních plodin, - má název vyhovující požadavkům dle zákona, - má zajištěné udržovací šlechtění. Doba registrace je od roku zaregistrování odrůdy do - konce desátého kalendářního roku nebo - konce dvacátého kalendářního roku (u odrůd révy, chmele, ovocných a okrasných dřevin). Na žádost udržovatele může být registrace opakovaně prodloužena o dalších deset respektive dvacet let. 7

OCHRANA PRÁV K ODRŮDÁM Ochrana práv k odrůdám rostlin zajišťuje držiteli šlechtitelských práv výlučné právo k využívání chráněné odrůdy. Držitel šlechtitelských práv může jiné osobě poskytnout souhlas s využíváním chráněné odrůdy a stanovit výši licenčních poplatků za využívání odrůdy. V podmínkách Evropského společenství je ochrana práv k odrůdám řešena ve dvou úrovních: - národní odrůdová práva - jsou uplatňována na území jednoho nebo více členských států, - odrůdová práva Společenství - jsou uplatňována na území všech členských států ES.

Řízení o udělení ochranných práv k odrůdám a jejich uplatňování v České republice probíhá podle zákona č. 408/2000 Sb., o ochraně práv k odrůdám, ve znění pozdějších předpisů. O udělení ochranných práv k odrůdám rozhoduje Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský prostřednictvím Národního odrůdového úřadu vydáním šlechtitelského osvědčení. Odrůdy chráněné v České republice jsou zapsány v Seznamu chráněných odrůd a zveřejněny ve Věstníku ústavu na webové stránce www.ukzuz.cz. O udělení odrůdových práv Evropského společenství rozhoduje Odrůdový úřad Společenství (CPVO). Ochranná práva mohou být udělena k odrůdám všech rodů a druhů rostlin, včetně jejich hybridů. Ochranná práva nelze udělit k odrůdě, které je uděleno odrůdové právo Společenství. Předpokladem pro udělení ochranných práv je zjištění, že odrůda -

je odlišná, uniformní, stálá,

-

splňuje podmínky novosti vyhovující požadavkům zákona,

-

má název vyhovující požadavkům zákona.

Ochranná práva k chráněné odrůdě trvají 25 let, u chráněných odrůd dřevin, chmele, révy vinné a bramboru ochranná práva trvají 30 let. Po uplynutí této doby ochranná práva zanikají.

8

ZKOUŠKY ODLIŠNOSTI, UNIFORMITY A STÁLOSTI – DUS (Distinctness, uniformity and stability). Zkoušky odlišnosti, uniformity a stálosti jsou prováděny u všech odrůd, které jsou v řízení o registraci, udělení právní ochrany, prodloužení registrace a zapsání dalšího udržovatele. Pouze na základě zkoušek odlišnosti, uniformity a stálosti se provádí udělení právní ochrany, prodloužení registrace a zapsání dalšího udržovatele, dále pak registrace odrůd ovocných druhů, zelenin, okrasných druhů a druhů trav určených pro trávníky – ne pro pícní využití. U většiny druhů polních plodin jsou součástí řízení o registraci odrůdy ještě zkoušky užitné hodnoty, případně technologické rozbory. Zkoušky odlišnosti, uniformity a stálosti jsou dvouleté. Pro registraci, případně udělení ochranných práv, musí odrůda splňovat podmínky odlišnosti, uniformity a stálosti. ODLIŠNOST Odrůda je považována za odlišnou, jestliže se zřetelně odlišuje projevem nejméně jednoho znaku od každé jiné odrůdy obecně známé. Odrůda obecně známá je -

právně chráněná v ČR nebo v zahraničí,

-

registrovaná v ČR nebo v zahraničí,

-

v řízení v ČR nebo v zahraničí,

-

nabízená k prodeji nebo prodávaná v ČR nebo v zahraničí.

Kolekce odrůd, na které jsou srovnávány odrůdy v řízení, se nazývá referenční kolekcí. Odrůda je považována za součást referenční kolekce, pokud je k dispozici její popis a živý rostlinný materiál. Pro kvalitní zkoušení je třeba, aby referenční kolekce byla co nejširší. Zdroje informací o odrůdách obecně známých jsou -

Společný katalog odrůd,

-

národní úřední seznamy odrůd,

-

databáze CPVO,

-

databáze UPOV,

-

OECD katalog,

-

odborné publikace,

-

publikace a databáze profesních organizací, 9

- komerční katalogy. Zdroje živého rozmnožovacího materiálu obecně známých odrůd jsou -

udržovatelé,

-

zahraniční zkušební úřady,

-

instituce udržující genové zdroje,

-

výzkumné ústavy,

-

volný prodej.

UNIFORMITA Odrůda je považována za uniformní, jestliže je dostatečně jednotná v projevu znaků, které se zahrnují do zkoušení odlišnosti, jakož i znaků používaných k popisu odrůdy. Povolené množství odchylek je dáno populační standardou a je uvedeno v jednotlivých plodinových metodikách, liší se v závislosti na plodině, použitých metodách apod. STÁLOST Odrůda je považována za stálou, jestliže v projevu znaků, které se zahrnují do zkoušení odlišnosti, jakož i znaků používaných k popisu odrůdy, zůstává beze změny. Zkoušení odlišnosti, uniformity a stálosti probíhá podle metodik obecných a plodinových. Obecné zásady zkoušení odlišnosti, uniformity a stálosti jsou popsány v dokumentech UPOV (Union for the Protection of New Varieties of Plants), především v Obecném úvodu do zkoušení odlišnosti, uniformity a stálosti, dokumentu TG/1/3. Zkoušení odlišnosti je detailně popsáno v dokumentu TGP/9, uniformity v TGP/10 a stálosti v dokumentu TGP/11. Plodinové metodiky jsou zpracovány na základě příslušných technických protokolů Evropského odrůdového úřadu CPVO (Community Plant Variety Office), případně technických směrnic UPOV, to v případě, že neexistuje pro danou plodinu protokol CPVO. U minoritních plodin, pro které neexistuje ani směrnice UPOV, probíhá zkoušení na základě zkušební směrnice ÚKZÚZ. ZDROJE: Informace pro žadatele o registraci odrůdy, www.ukzuz.cz Informace k ochraně práv k odrůdám rostlin, www.ukzuz.cz Metodika zkoušek odlišnosti, uniformity a stálosti

10

3. b) ODRŮDOVÁ SKLADBA ČESNEKU V ČR ŘIČICOVÁ VĚRA Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Hroznová 2, Brno K dnešnímu dni je ve Státní odrůdové knize zapsáno celkem 22 odrůd česneku a jen jedna odrůda je zahraniční (Matúš – Slovensko). Všechny ostatní jsou z tuzemského šlechtění. Tři odrůdy jarní a devatenáct odrůd ozimých. S účinností od roku 2008 je jedním z požadavků na sadbu odrůd přihlašovaných k registraci, aby byla prostá viru OYDV. Odrůdy, které nejsou viruprosté, Ústav do registračních zkoušek nepřijímá. Vzhledem k tomu, že v našem sortimentu je ještě 15 odrůd, které byly registrovány před účinností tohoto požadavku, jsou oba sortimenty zkoušeny a porovnávány odděleně. Ozdravené materiály jsou vysázeny do technické izolace (Obr. 1).

Obr. 1:

Technická izolace, odrůda Havran

11

REGISTROVANÉ ODRŮDY JARNÍHO ČESNEKU Ke dni 1. 6. 2011 byly v Seznamu odrůd zapsaných ve Státní odrůdové knize zapsány následující odrůdy jarního česneku: Lumír, Matin, Japo II Lumír je poloraná odrůda. Olistění polovzpřímené, barva listu středně zelená se slabou až střední voskovou vrstvou. Antokyanové zbarvení na bázi nepravého stvolu není nebo velmi slabé, květní stvol není. Cibule malá, na příčném řezu kruhovitého tvaru, s bočními stroužky, základní barva suchých vnějších suknic žlutavě bílá, antokyanové pruhy na suché vnější suknici nejsou. Stroužek malý až středně velký, základní barva suknice stroužku krémová s antokyanovými pruhy, intenzita základní barvy slabá. Barva dužniny stroužku nažloutlá. Konec dormance stroužku v cibuli pozdní až velmi pozdní (Obr. 2).

Obr. 2:

Česnek jarní Lumír 12

Matin je raná až poloraná odrůda Olistění vzpřímené až polovzpřímené, barva listu středně zelená se střední až silnou voskovou vrstvou. Antokyanové zbarvení na bázi nepravého stvolu není nebo velmi slabé, květní stvol není. Cibule malá až středně velká, na příčném řezu elipsovitého tvaru, s bočními stroužky, základní barva suchých vnějších suknic bílá s antokyanovými pruhy na suché vnější suknici. Stroužek středně velký, základní barva suknice stroužku krémová s antokyanovými pruhy, intenzita základní barvy slabá až střední. Barva dužniny stroužku nažloutlá. Konec dormance stroužku v cibuli pozdní až velmi pozdní (Obr. 3).

Obr. 3:

Odrůda Matin

13

Japo II je středně pozdní až pozdní odrůda. Olistění vzpřímené, barva listu středně až tmavě zelená se střední voskovou vrstvou. List středně dlouhý, úzký až středně široký, na příčném řezu slabě konkávní. Antokyanové zbarvení na bázi nepravého stvolu není nebo velmi slabé, květní stvol není. Cibule středně velká až velká, na příčném řezu elipsovitého tvaru, s bočními stroužky. Stroužek středně velký, základní barva suknice růžová s antokyanovými pruhy, intenzita základní barvy střední. Barva dužniny stroužku nažloutlá. Konec dormance stroužku v cibuli velmi pozdní. (Obr. 4)

Obr. 4:

Odrůda Japo II (viruprostý jarní česnek)

K dnešnímu dni je v Seznamu odrůd zapsaných ve Státní odrůdové knize zapsáno celkem 19 odrůd ozimého česneku. Jedná se o následující odrůdy (červeně vyznačené odrůdy viruprosté): Anin, Anton, Benátčan, Bjetin, Blanin, Brick, Dukát, Džambul, Havran, Jovan, Lukan, Matúš, Mirka, Slavin, Stanik, Tantal, Tristan, Unikat, Vekan

14

Benátčan je viruprostý nepaličák. Cibule velká s bočními stroužky. Stroužek středně velký s antokyanovými pruhy. Konec dormance stroužku v cibuli velmi pozdní (Obr. 5).

Obr. 5:

Odrůda Benátčan

15

Džambul je středně raná odrůda typu paličáku. Cibule středně velká, kulovitého tvaru, bez bočních stroužků. Stroužek středně velký, barva suknice hnědá, intenzita barvy střední až silná. Konec dormance stroužku v cibuli pozdní (Obr. 6).

Obr. 6:

Odrůda Džambul

16

Mirka je pozdní odrůda ozimého paličáku. Cibule středně velká, na podélném i příčném řezu kruhovitého tvaru, boční stroužky nejsou. Stroužek středně velký, základní barva suknice stroužku hnědá bez antokyanových pruhů. Konec dormance stroužku v cibuli pozdní (Obr. 7).

Obr. 7:

Odrůda Mirka

Pro zajímavost další snímky registrovaných odrůd (Obr. 8 a 9)

Obr. 8:

Odrůda Jovan 17

Obr. 9:

Odrůda Matúš

Bohužel zima roku 2011/2012 nepřipravila vysázeným porostům česneku příznivé podmínky. Neobvykle teplé a suché počasí od listopadu až do ledna způsobilo, že většina ozimých odrůd začala vegetovat. Na ZS Chrlice byly na začátku února 2012 velmi silné mrazy, místy až – 18o C. Velice nízké teploty byly naměřeny také v hloubce 5 cm a protože na porostech nebyl sníh, došlo ke zmrznutí stroužků. Některé rostliny měly podpučí poškozeno jen částečně a po oteplení a závlaze vyrašily. Druhotně se na stroužcích objevily zejména bakteriózy. Mrazy při zemi až – 6o C o Velikonocích takto oslabené rostliny zničily (Obr. 10 a Obr. 11).

18

Obr. 10:

Porost česneku, duben 2011, ZS Chrlice

Obr. 11:

Porost česneku, duben 2012, ZS Chrlice

ZDROJ Věstník ÚKZÚZ – Seznam odrůd zapsaných ve Státní odrůdové knize ke dni 1.6.2011 Věstník ÚKZÚZ – Popisy odrůd zapsaných ve Státní odrůdové knize Fotografie z DUS testů prováděných na ZS ÚKZÚZ Chrlice 19

4. ŠKŮDCI A PATOGENY ČESNEKU KUCHYŇSKÉHO V RŮZNÝCH NADMOŘSKÝCH VÝŠKÁCH SAPÁKOVÁ EVA1, ŠEFROVÁ HANA2 1

Mendelova univerzita v Brně, 2Mendelova univerzita v Brně, ÚPŠRR AF

ABSTRAKT Česnek kuchyňský je plodina, která byla v minulosti pěstována v ČR zejména na Moravě. S rostoucí poptávkou po „českém česneku“ se drobní pěstitelé vrací k pěstování této tradiční plodiny. Škůdci česneku byli sledováni ve vegetační sezóně 2010–2011 v oblasti střední a jihovýchodní Moravy. Pět studijních ploch se nacházelo v různé nadmořské výšce: Nedakonice (178 m), Olomouc (241 m), Dolní Němčí (256 m), Suchá Loz (304 m) a Vápenky (484 m). Vysázeny byly ozimé i jarní odrůdy. Výskyt škůdců byl sledován pravidelnou kontrolou rostlin, pomocí různě barevných misek naplněných 4 % formaldehydem a lepových desek. Ve vyšší početnosti byly zjištěny dva druhy škůdců: květilka cibulová Delia antiqua (Meigen, 1826) a krytonosec cibulový Oprohinus suturalis (Fabricius, 1787). Ve vyšší intenzitě se vyskytla rzivost cibule, kterou způsobuje patogen Puccinia allii. KLÍČOVÁ SLOVA: Allium sativum, Delia antiqua, Oprohinus suturalis, Puccinia allii

ÚVOD Česnek kuchyňský (Allium sativum L.) je jednoletá, vytrvalá, vegetativně množená rostlina, která se řadí se do II. nebo III. tratě. Využívá se jako koření, zelenina a léčivá rostlina. Obsahuje řadu látek s léčebnými a nutričně prospěšnými vlastnostmi, jedná se o sloučeniny obsahující síru, glycidy, vitamíny (A, B1, B3, B5, B6, C, E, H), hormonální látky, enzymy, bezsirná antibiotika a mikroelementy (Ca, P, Mg, K, Na, Al, Fe, Cu, Zn, Mn, Sr, Br, Se). Obsah jednotlivých látek v česneku se silně mění v závislosti na odrůdě, původu, půdě, počasí, hnojení a ošetřování. Základní rozdělení sortotypů česneku je na paličáky a nepaličáky. Paličáky (modré zimní česneky) jsou určeny především k podzimní výsadbě, barvy nafialovělé, výnosově průměrné, jejich skladovatelnost je průměrná až podprůměrná. Mají tvrdý, pevný krček, který je spodní častí květního stvolu. Nepaličáky širokolisté tvoří velkou cibuli, většinou špinavě zbarvené, někdy i nafialovělé. Mají měkký krček a vyznačují se dobrou skladovatelností a nadprůměrnými výnosy, vysazují se na podzim. Nepaličáky úzkolisté (bílé jarní česneky) mají úzké ploché listy a úzké tenké výrazně srpovitě prohnuté stroužky. Skladovatelnost je nadprůměrná, výnosy průměrné až podprůměrné, vysazují se na jaře. Na česneku může škodit poměrně široké spektrum škůdců z různých skupin živočichů. 20

Háďátko zhoubné Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857), patří mezi hlístice, vlnovník česnekový Aceria tulipae (Keifer, 1938), mezi roztoče. Nejvyšší počet škůdců patří do hmyzu: mšice broskvoňová Myzus persicae (Sulzer, 1776), (polokřídlí), třásněnka zahradní Thrips tabaci (Lindeman, 1889), (třásnokřídlí), molík česnekový Acrolepiopsis assectella (Zeller, 1839), (motýli), krytonosec cibulový Oprohinus suturalis (Fabricius, 1787), drátovci (brouci), houbomilka česneková Suillia univittata (von Roser, 1840), květilka cibulová Delia antiqua (Meigen, 1826), vrtalka pórová Phytomyza gymnostoma (Loew, 1858), (dvoukřídlí). Mezi nejvýznamnější škůdce se řadí háďátko zhoubné a houbomilka česneková. Těmto druhům mohou být připisovány škody způsobené jinými škůdci. Rzivost cibule způsobené patogenem Puccinia allii je jedním z nejběžnějších onemocnění česneku. Napadené rostliny žloutnou a mohou odumírat. Cibule česneku jsou zakrnělé a zdeformované. Při silnějším napadením dochází k výnosovým ztrátám a snížení kvality česneku. Puccinia allii je monoecická rez, kromě česneku napadá i ostatní cibuloviny. Zpočátku se napadení projeví drobnými bílými tečkami na obou stranách listů a na stoncích, které postupně přecházejí v oranžové kupičky uredospor. Později se na stejných místech vytvářejí kupky černých teleutospor. Rzivost cibule je obligátní parazit. MATERIÁL A METODY Studijní plochy se nacházely na střední a jihovýchodní Moravě v různé nadmořské výšce: Nedakonice (178 m), Olomouc (241 m), Dolní Němčí (256 m), Suchá Loz (304 m) a Vápenky (484 m). V Nedakonicích byly vysazeny 2 odrůdy: Dukát (paličák) a Džambul (paličák). V Olomouci bylo hodnoceno 13 odrůd: Záhorský (nepaličák), Blanin (paličák), Vekan (paličák), Mojmír (nepaličák), Dukát (paličák), Bjetin (paličák), Lukan (nepaličák), Benátčan (nepaličák), Džambul (paličák), Slavin (paličák), Matin (nepaličák), Lumír (nepaličák) a Tristan (paličák). V Dolním Němčí 2 odrůdy: Mojmír (nepaličák) a Džambul (paličák). V Suché Lozi 2 odrůdy: Záhorský (nepaličák), Bjetin (paličák). Ve Vápenkách 2 odrůdy: Dukát (paličák) a Blanin (paličák). Zdravotní stav porostů byl hodnocen vizuálně od konce měsíce února. Pozorování bylo prováděno v době výskytu prvního poškození listů, v období hromadného kladení vajíček, žíru larev, v období líhnutí imag z kukel a v období páření. Byl zaznamenáván počátek letu a maximum početnosti imag a další případné životní projevy. Porost byl podle velikosti plochy procházen po řádcích nebo úhlopříčně a kontrolován počet imag, larev a příznaky poškození na rostlinách. Výskyt dospělců byl také zjišťován pomocí různě barevných PVC misek (červená, zelená, žlutá), po pěti opakováních, rozmístěných 5–9 metrů od sebe, rovnoměrně a na náhodně zvolených místech, naplněných roztokem 4% formaldehydu. Barevné lepové desky (žlutá, modrá, bílá) byly umístěny na okrajích pěstebních ploch. Determinace druhů byla prováděna ihned na studijní ploše a v laboratoři použitím metody preparační a mikroskopické. Intenzita napadení květilkou cibulovou byla zjišťována podle počtu larev v jednotlivých paličkách česneku. Vzhledem k velikosti pěstebních ploch bylo nutné porost procházet 21

úhlopříčně do tvaru písmene W. V každém opakování bylo 100 rostlin. Rostlina, která vykazovala charakteristické příznaky poškození od květilky, byla vytažena z půdy i s kořenovým systémem. Palička česneku se očistila od obalových slupek a rozdělila se na jednotlivé stroužky, mezi kterými migrovaly larvy květilky. Determinace larev květilky se prováděla jak na studijní ploše, tak v laboratoři. Dále pak byla provedena preparace larev a determinace ústních háčků podle Duška (1969). Vývojová stadia larev květilky byla sledována od jejího třetího instaru až po vylíhnutí imag. Pokus probíhal v uzavřených nádobách překrytých jemnou textilií v laboratoři. Intenzita napadení květilkou se vyhodnotila statisticky programem UPAV (jednofaktorová ANOVA a Tukey-HSD testem (α = 0,05)). Intenzita napadení krytonoscem cibulovým byla zjišťována podle počtu imag v různě barevných miskách. Misky byly v kritickém období kontrolovány 2× týdně. Dále byl porost procházen po řádcích a kontrolován počet imag a příznaky poškození na 10 rostlinách v řádku. Přesná determinace krytonosce cibulového byla prováděna ihned na studijní ploše. Pro hodnocení intenzity napadení patogenem Puccinia allii byla sestavena pětibodová stupnice (Tab. 1) a (Obr. 3). Z každé rostliny byl odebrán list, na kterém byly viditelné kupičky uredospore, a podle uvedené stupnice byla hodnocena intenzita napadení. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny programem UPAV (jednofaktorová ANOVA a Tukey-HSD testem (α = 0,05). VÝSLEDKY A DISKUZE První výskyt imag květilky cibulové byl zaznamenán 10. 5. 2011 na studijní ploše v Dolním Němčí a 14. 5. 2011 na studijní ploše v Suché Lozi. Květilka klade vajíčka do půdy v blízkosti rostlin, na báze rostlin a na mladé listy. Ishikawa & Yamashita & Nomura (1999) uvádějí, že samička květilky může naklást až 30 vajíček. Výsledky našeho monitoringu se téměř shodují s uvedenými poznatky. Nejvyšší počet byl zjištěn 28 vajíček v jedné paličce česneku na studijní ploše v Dolním Němčí. Larvy se líhnou z vajíček za tři dny. Vylíhlá larva vyžírá cibuli česneku těsně nad kořenem. Postupně dochází k zahnívání cibulí a charakteristickému zápachu hnijících pletiv. Navenek se poškození projevuje žloutnutím, vadnutím a hnědnutím listů. Rostlina česneku lze obtížně vytáhnout z půdy, dochází k zahnívání krčků cibulí a ulamování natě. Larva prochází třemi instary. Dospělá larva dosahuje velikosti 8 mm, je bílé barvy s výrazně vyvinutým ústním ústrojím. Dušek (1969) uvádí, že charakteristický tvar ústních háčků slouží jako determinační znak. Preparací a determinací podle Duška (1969) bylo potvrzeno, že poškození cibulí česneku způsobují larvy květilky. Jak uvádějí Ishikawa & Yamashita & Nomura (1999) vývoj květilky v uzavřených podmínkách trvá přibližně 17 dnů. V našich podmínkách vývoj trval 15 dnů. Rozdíly v délce vývoje mohly být způsobeny odlišnou okolní teplotou. Pro vývoj larev květilky je nezbytné rozkládající se pletivo cibulovitých rostlin a potřebná vlhkost. Statisticky byly potvrzeny významné rozdíly v napadení květilkou mezi okrajovými a vnitřními částmi pěstební plochy (Obr. 1). 22

První výskyt imag krytonosce byl zaznamenán 24. 4. 2011 na studijní ploše v Olomouci a 29. 4. 2011 v Nedakonicích. Krytonosec vykusuje chodbičky, které na vnější straně listů vypadají jako bílé podélné proužky. Larva prochází třemi vývojovými stupni. Nejvyšší aktivita imag krytonosce byla pozorována za slunečného počasí v poledne. Přes štít se mu táhne podélný bílý proužek, kterým je dobře determinovatelný. Vajíčka klade do požerků do spodní vnitřní strany listů. Vajíčko je široce oválné dlouhé kolem 0,7 mm a 0,4 mm široké, bílé barvy. Podle Millera (1956) dospělí brouci čile pobíhají a při nejmenším nebezpečí se spouštějí a padají k zemi, kde zůstávají nehybně ležet. Ke stejnému zjištění jsem došla během vlastních pozorování na studijních plochách. Dospělci krytonosce cibulového jsou neobyčejně čilí brouci, rychle se pohybují a obtížně chytají. Při hrozícím nebezpečí jsou strnulí, ale v momentě se dokážou znovu rychle pohybovat a poměrně dobře létat. Imaga krytonosce nejvíce přitahovala barva misky žlutá. V kritickém období 10. 5. – 20. 5. byl ve žlutých miskách zjištěn nejvyšší počet imag 103 na studijní ploše v Nedakonicích a 98 na studijní ploše v Olomouci (Obr. 2). První výskyt česneku postiženého rzivostí cibule byl zjištěn na těchto studijních plochách: Olomouc (30. 5. 2011), Suchá Loz (5. 6. 2011) a Vápenky (10. 6. 2011). Na ostatních studijních plochách (Dolní Němčí a Nedakonice) nebyl česnek rzivostí postižen. Intenzita napadení byla hodnocena podle pětibodové stupnice (Tab. 1) a (Obr. 3). Podle statistického vyhodnocení programem UPAV (jednofaktorová ANOVA a Tukey-HSD testem (α = 0,05) byly na studijní ploše v Olomouci nejvíce napadeny odrůdy: Blanin (stupeň napadení 3,11), Dukát (2,943) a Záhorák (2,207) (Obr. 4). Na odrůdách Džambul, Slavin, Matin, Lumír a Tristan nebylo napadení zjištěno. V Suché Lozi měla vyšší stupeň napadení odrůda Záhorský (3,125) s nejvyšším stupněm napadení ve variantě 1 (3,74) než odrůda Bjetin (2,635) s nejvyšším stupňem napadení ve variantě 1 (3,3). Ve Vápenkách byla více napadena odrůda Blanin (2,290) s nejvyšším stupněm napadení ve variantě 1 (3,22). Odrůda Dukát měla průměrný stupeň napadení (2,64) s nejvyšším stupněm napadení ve variantě 1 (2,64). Studiem patogena Puccinia allii se zabývali Furuya a kol. (2001). Zjistili, že výskyt a intenzitu napadení česneku patogenem Puccinia allii ovlivňuje především teplota, vlhkost a náchylnost (susceptibilita) odrůdy. Ideální teplota pro rozvoj tohoto patogena je kolem 18 °C. V průběhu měsíce května a června 2011 dosahovaly teploty i více než 20 °C, což jsou podle Furuya a kol. (2001) vhodné podmínky pro rozvoj tohoto patogena.

23

Intenzita napadení květilkou cibulovou - studijní plocha v Dolním Němčí

Obr. 1:

120 100

početnost

80 60 40 20 0 24.4.

29.4.

6.5.

10.5.

20.5.

27.5.

datum Nedakonice

Obr. 2:

Olomouc

Intenzita napadení krytonoscem cibulovým - studijní plochy v Olomouci a Nedakonicích

24

0

1

2

3

4

Obr. 3: Stupnice pro hodnocení intenzity napadení patogenem Puccinia allii

Stupnice pro hodnocení napadení listů

Tab. 1:

Stupeň napadení

Charakteristika příznaků napadení

0

bez napadení

1

ojedinělé chlorózy a drobné kupky uredospor

2

asi 5 % listové plochy nejvíce napadeného listu je pokryto kupkami uredospor

3

kupky uredospor tvoří proužky, které pokrývají asi 25 % listové plochy napadeného listu

4

je napadeno 50 a více % listové plochy nejvíce napadeného listu kupkami uredospor

25

3,5 3,11 2,943

3

2,5 2,223

stupeň napadení

2,207 2

1,833

1,777

1,777

1,667 1,5

1

1

1

1

1

Slavin

Matin

Lumír

Tristan

1

0,5

0 Záhorák

Blanin

Vekan

Mojmír

Dukát

Bjetin

Lukan

Benátčan Džambul

odrůdy

Obr. 4:

Stupeň napadení různých odrůd česneku patogenen Puccinia allii v Olomouci

ZÁVĚR První výskyt květilky cibulové byl zjištěn 10.5. na studijní ploše v Dolním Němčí a 14.5. na studijní ploše v Suché Lozi. Nejvyšší počet vajíček nakladených květilkou v jedné paličce česneku byl 28. Intenzita napadení květilkou byla prokázána statisticky významně vyšší v okrajových částech pěstební plochy než ve středových částech pěstební plochy. Poškození od květilky se navenek projevuje žloutnutím a usycháním listů a zahníváním krčků cibulí. Rostlina lze obtížně vytáhnout z půdy, jednotlivé stroužky nedrží u sebe. Larva květilky migruje v paličce česneku těsně nad kořenovým systémem a vyžírá vnitřní pletivo stroužků. Následkem toho dochází k zahnívání a charakteristickému zápachu. Česnek poškozený květilkou by neměl být použitý jako sadbový a měl by být sázen, co nejdále od loňských ploch pěstování. Krytonosec cibulový se vyskytoval na studijní ploše v Olomouci od 29.4. a v Nedakonicích od 24.4. Nejvyšší aktivita imag krytonosce byla pozorována za slunečného počasí v poledne. Miska barvy žluté nejvíce přitahovala imaga krytonosce cibulového. V kritickém období 10.5.–20.5. byl zjištěn nejvyšší počet imag 103 na studijní ploše v Nedakonicích a 98 na studijní ploše v Olomouci ve žlutých miskách. Krytonosec je škůdce, kterému vyhovuje teplé a slunečné počasí a lokality s nižší nadmořskou výškou. Ačkoliv krytonosec nepatří mezi významné škůdce, poškození, která způsobuje, mohou být 26

vstupní branou pro další infekce. Intenzita napadení patogenem Puccinia allii je především ovlivněna susceptibilitou odrůdy k tomuto patogenu. Nejvíce byly napadeny odrůdy: Záhorský (s průměrným stupňem napadení 3,125 na studijní ploše v Suché Lozi) a Blanin (s průměrným stupňem napadení 3,11 na studijní ploše v Olomouci). Odrůdy Džambul, Slavin, Matin, Lumír a Tristan tímto patogenem napadeny nebyly. Pro počáteční hodnocení intenzity napadení se osvědčila pětibodová stupnice (Tab. 1) a (Obr. 3). Dále je intenzita napadení ovlivněna teplotou a vlhkostí stanoviště. Zda intenzitu napadení ovlivňuje nadmořská výška nelze ze současných výsledků hodnotit a bude předmětem dalšího výzkumu.

LITERATURA ACKERMANN P., 1998: Metodiky ochrany zahradních plodin pro zahradníky a zahrádkáře. Květ, Praha, 303 s. ANIKSTER Y., SZABO L. J., EILAM T., MANISTERSKI J., KOIKE S. T., BUSHNELL W. R. (2004): Morphology, life cycle biology, and DNA sequence analysis of rust fungi on garlic and chives from California. Phytopathology, 94(8): 569– 577. BARTOŠ J., 2000: Pěstování a odbyt zeleniny. Agrospoj, Praha, 262 s. DUŠEK J., 1969: Präimaginale stadien mitteleuroäischer anthomyiiden (diptera) I. Československá akademie věd, Praha 37 s. ISHIKAWA I., YAMASHITA T., NOMURA M., 1999: Characteristics of summer diapause in the onion maggot, Delia antiqua (Diptera: Anthomyiidae). Journal of Insect Physiology 46 (2000): 161–167 DUŠKOVÁ L., KOPŘIVA J., 2009: Ochrana proti chorobám a škůdcům. Grada, Praha, 96 s. HRUDOVÁ E., POKORNÝ R., VÍCHOVÁ E., 2006: Integrovaná ochrana rostlin. MZLU, Brno, 151 s. HUDEC K., GUTTEN J., 2007: Encyklopedie chorob a škůdců. Computer Press, Brno, 359 s. KAZDA J. (ed.), 2003: Choroby a škůdci polních plodin ovoce a zeleniny. KUŽMA Š. (ed.), 2002: Metodická příručka pro ochranu rostlin II. SRS, Brno, 414 s.Vydavatelství odborných časopisů, Praha, 158 s.

27

FURUYA H., TAKANASHI H., FUJI S., NAGAI Y., NAITO H. (2009): Modeling Infection of Spring Onion by Puccinia allii in Response to Temperature and Leaf Wetness. Phytopathology, 99(5): 951-956 KOIKE S. T., SMITH R. F., DAVIS R. M., NUNEZ J. J., VOSS R. E. (2001): Characterization and control of garlic rust in California. Plant Disease, 85 (6): 585–591 MILLER F., 1956: Zemědělská entomologie. Československá akademie věd, Praha, 1057 ROD J., HLUCHÝ M., ZAVADIL K., PRÁŠIL J., SOMSSICH I., ZACHARDA M., 2005: Obrazový atlas chorob a škůdců zeleniny střední Evropy. Biocont Laboratory, Brno, 392 s. STUDZIŇSKI A., KAGAN F., SOSKA Z., 1987: Atlas chorob a škodcov zeleniny. Priroda, Bratislava, 327 s. TICHÁ H., 1997: Nejčastější choroby škůdci česneku. Zemědělec, 5(13): 10 TYMČENKO V., 1987: Atlas škůdců a chorob zeleniny a bramboru. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 181

KONTAKT 1. autor: Ing. Bc. Eva Sapáková; Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, 613 00, [email protected]

PODĚKOVÁNÍ Bez finanční pomoci projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043 by nemohly být prezentovány výsledky výzkumného záměru č. MSM6215648905 "Biologické a technologické aspekty udržitelnosti řízených ekosystémů a jejich adaptace na změnu klimatu" uděleného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky a projektu IP 7/2012 IGA/.

28

5. CHEMICKÁ OCHRANA ČESNEKU LADISLAV PREČAN Státní rostlinolékařská správa Olomouc Pro chemické ošetření česneku je v roce 2012 povoleno 39 přípravků na ochranu rostlin s platnou registrací a 12 přípravků do spotřebování zásob. Vezmeme-li však v úvahu počet povolených účinných látek, máme jich k dispozici pouze 10. Z tohoto počtu jsou tři fungicidy, tři herbicidy a čtyři insekticidy. Z toho je jasné, že na výběr mnoho není. Pro ošetření česneku proti širokému spektru plevelů se používá účinná látka pendimethalin, obsažená v přípravku Stomp. S touto účinnou látkou je na trhu několik podobných přípravků. Hektarová dávka se řídí dle obsahu účinné látky - Stomp 330E (4-5 l/ha 400-600 l vody/ha) a Stomp 400 SC (3,3-4,1 l/ha 400-600 l vody/ha). Aplikace se provádí pouze 1x, v době před vzejitím česneku, nebo po vzejití, ale česnek musí mít minimálně 3 listy. Účinnost je závislá na půdní vlhkosti. Protože působí na vzcházející plevele, musí být aplikace provedena nejpozději při vzcházení plevelů. V současné době se nevyrábí malospotřebitelské balení přípravku. Dalším herbicidem je přípravek Ronstar 25 EC s účinnou látkou oxadiazon. Ronstar 25 EC se používá v dávce 3-4 l/ha 400-600 l vody/ha (30-40 ml/4-6 l vody/100 m2). Jeho využití je zejména na jaře, kdy plevele jsou ve fázi 1 – 2 pravých listů. Působí na široké spektrum dvouděložných plevelů a některé jednoděložné plevele (ježatka, chundelka, béry, rosičky). Chizalofop-P-ethyl je účinná látka obsažená v přípravku Targa Super 5 EC, Gramin a v některých dalších souběžných přípravcích. Targa Super 5 EC je graminicid, který se aplikuje v dávce 1,0 - 1,5 l/ha proti jednoletým travám a 2,0 - 2,5 l/ha proti pýru plazivému v dávce 200 - 300 l na 1 ha bez ohledu na fázi česneku. Přípravek je k dostání i v malospotřebitelském balení. Proti houbovým chorobám je povolen pro moření česneku před výsadbou přípravek Rovral Aquaflo a další souběžné dovozy (účinná látka iprodion). Pro moření se používá 0,4 % roztok (40 ml/10 l vody) po dobu 20 minut. Proti bílé hnilobě česneku, kladosporiové skvrnitosti listů česneku, plísni cibulové a rzi je povolena účinná látka azoxystrobin, obsažená v přípravku Ortiva a některých souběžných přípravcích. Dávka Ortivy je 1 l/ha (10 ml / 4 – 6 l vody / 100 m2). Ortivu je možné použít maximálně 2x za vegetaci nejlépe v intervalu 7–10 dnů. Ošetřujeme při prvních příznacích chorob. Ochranná lhůta je 14 dnů. Pro moření česneku proti háďátku zhoubnému je možné použít přípravek Sulka. Používá se moření po dobu 12 hodin v 5% roztoku. Toto, často podceňované moření, je důležité v případě, že se plánuje použití česneku pro další výsadbu. V současné době je možné použít přípravek jen do spotřebování zásob. Proti živočišným škůdcům je povolena účinná látka dimethoate, obsažená v přípravcích Perfekthion a nově pod názvem Bi-58. Tento systémový přípravek je 29

možné použít pouze v množitelských porostech proti mšicím v dávce 0,6 l/ha (0,1 % koncentrace). Ochranná lhůta je 7 dní. Přípravek je zvláště nebezpečný pro včely. Aplikace maximálně 1 krát za vegetaci. V množitelských porostech je proti mšicím povolena účinná látka pirimicarb, obsažená v přípravku Pirimor 50 WG a v dalších souběžných přípravcích. Používá se v dávce 0,5 kg/ha (3-5 g /3-6 l vody /100 m2). Ochranná lhůta je 14 dnů. Proti houbomilce česnekové je povolena účinná látka lambda-cyhalothrin obsažená v přípravku Karate se Zeon technologií 5 CS a Samuraj (jen malobalení) a v dalších souběžných přípravcích. Ošetření se provádí v březnu, když teplota po dobu 4 dnů vystoupí na 10°C. Přípravek se používá v koncentraci 0,05 % (200-600 l vody / ha), minimální hektarová dávka je 0,3 l/ha a postřik je vhodné opakovat po 14 dnech. Přípravek je k dostání i v malospotřebitelském balení. Do června 2012 lze do spotřebování zásob použít proti houbomilce česnekové také přípravek Reldan 40 EC. Používá se v dávce 0,125 %, nebo 7,5 ml / 6 l vody / 100 m2. Pro zlepšení účinnosti a přilnavosti přípravků na rostlinách lze k výše uvedeným fungicidům a insekticidům přidávat různé pomocné prostředky tzv. smáčedla. V malospotřebitelském balení je těchto přípravků dostupná celá řada.

30

6. VIROVÉ CHOROBY ČESNEKU KUCHYŇSKÉHO KUDĚLKOVÁ MARTINA Mendeleum – ústav genetiky, Zahradnická fakulta v Lednici, Mendelova univerzita v Brně ABSTRAKT Česnek kuchyňský (Allium sativum L.) napadá řada virů, jejichž vliv snižuje kvalitu a produkci česneku. Příznaky se projevují jako žloutnutí, pruhy nebo mozaiky na listech, ale viry mohou být také v latentní podobě. Ve většině případů se viry nevyskytují samostatně, ale objevuje se komplex dvou a více virů. Nejzávažnější virové choroby u česneku způsobuje rod Potyvirus a jeho hlavní zástupci OYDV a LYSV. Dalším důležitým rodem je Carlavirus, který ještě více zesiluje příznaky rodu Potyvirus. K jeho nejvýznamnějším zástupcům se řadí GCLV a SLV. Další rod vyskytující se u česneku je Allexivirus se zástupci virů označovanými souhrnným názvem Mite-borne viruses. Zatím jen lokálně byl zjištěn výskyt viru GDR, patřící do rodu Fijivirus. Tato práce je zaměřena na popis jednotlivých rodů a virů, které způsobují choroby u česneku kuchyňského. KLÍČOVÁ SLOVA: Potyvirus, Carlavirus, Allexivirus, Fijivirus ÚVOD Česnek kuchyňský (Allium sativum L.) patří k nejstarším kulturním plodinám. Je ceněn jako zelenina, koření, ale také jako léčivá rostlina pro své antibiotické a jiné účinky. Česnek napadá řada virů, které jsou rozšířené po celém světě a způsobují vážné ztráty na výnosu plodin a zhoršení jejich kvality (Bai a kol., 2010; Klukáčková a kol., 2004). Je známo několik patogenních virů, které se vyskytují ve všech oblastech pěstování česneku, z toho ve většině případů je česnek infikován komplexem virů (Smékalová a kol., 2010). K nejdůležitějším rodům virů napadajících česnek a celý rod Allium patří rody Potyvirus (Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus), Carlavirus (Garlic common latent virus, Shallot latent virus) a Allexivirus (Mite-borne viruses), a dále Fijivirus (Garlic dwarf reovirus). Na česneku se mohou vyskytovat i další viry, mají však pouze velice malý nebo lokální význam (Diekmann, 1997). Vzhledem k tomu, že česnek se množí výhradně vegetativně, jsou virové choroby u této plodiny závažným problémem. Komplex těchto hlavních virů se u česneku projevuje převážně mozaikami, proužkovitostí, zakrslostí a celkovým oslabeným vývojem rostlin. Viry mají špatný dopad nejen na jedince, ale i na celý porost a hrají důležitou roli ve výnosu. Jednotlivé viry samy o sobě se ale nemusí projevovat a mohou zůstávat v latentní formě (Conci a kol., 2002; Caciagli, 2008; Van Dijk, 1993; Dovas a Vovlas, 2003). 31

MATERIÁL A METODIKA Rod Potyvirus Je největší ze šesti rodů patřících do čeledi Potyviridae (Zhao a kol., 2011). Tato čeleď je nejpočetnější skupinou rostlinných virů, řadíme k ní skoro 200 členů. Mnoho z nich způsobuje značné ztráty u zemědělských, zahradních i okrasných plodin (Chen a Adams, 2001). Do rodu Potyvirus patří více jak 180 virů (Zhao a kol., 2011). Název rodu a jeho základní charakteristika jsou odvozeny od typového člena Y viru bramboru (Potato virus Y, PVY). Virové částice mají rozměry 12 nm x 680-900 nm (Astier a kol., 2007). Genom potyvirů je tvořen jednovláknovou + ssRNA. Tyto viry jsou přenosné mšicemi, nejvýznamnější jsou rody Aphis, Myzus a Macrosiphium, a to způsobem neperzistentním nebo semiperzistentním. K významným virům tohoto rodu napadajícím česnek patří Onion yellow dwarf virus (OYDV) a Leek yellow stripe virus (LYSV). Právě tyto dva viry způsobují největší ekonomické ztráty na výnose. U cibulí byla zjištěna redukce 69% u OYDV a 54% u LYSV (Canavelli a kol., 1998; Lot a kol. 1998; Lunello a kol., 2007). ONION YELLOW DWARF VIRUS (OYDV) - virus žluté zakrslosti cibule, napadá celý rod Allium a vyskytuje se kosmopolitně (Diekmann, 1997). Běžně se objevuje na cibuli, šalotce a česneku (Diekmann, 1997) i dalších druzích rodu Allium (A. moly, A. scorodoprasum, A. vineale) nebo Narcissus (Šutić a kol., 1999). Vir je kromě mšic přenášen také vegetativním způsobem množení. Přežívá v infikovaných cibulích, stroužcích, pacibulkách, ve vytrvalých zeleninách, v okrasných a volně rostoucích druzích rodu Allium. Může způsobovat až 60 a více procentní ztráty (Lot a kol., 1998). Virus má podobné příznaky jako při fyziologických poruchách (popálení herbicidy, nedostatek ve výživě, popřípadě poškození mrazem). Proto můžeme OYDV celkem snadno zaměnit s jiným poškozením (Diekmann, 1997; Rod a kol., 2005). Symptomy se objevují nejprve na listech rostoucích přímo z infikovaných cibulí jako četné, krátké žluté proužkování na bázi. Příznaky primární infekce objevující se na listech se později v sezoně ztrácí a listy se jeví jako zdravé. S vývojem nemoci infikovaných listů přichází brzy kompletní chloróza. U česneku se symptomy neprojevují tak silně jako u cibule (Šutić a kol., 1999). Smékalová a kol. (2010) detekovali OYDV v 80% z 648 testovaných genotypů z kolekce genové banky, která se udržuje v Olomouci. Klukáčková a kol. (2007) zjistila průměrnou přítomnost OYDV u pěti genotypů 74%. Dovas a kol. (2001) detekovali 100 % přítomnosti viru na rostlinách česneku v Řecku, Dovas a Vovlas (2003) zjistili 98% přítomnost viru (ze 120 testových vzorků) v jižní Itálii. Dle Bai a kol. (2010) je OYDV rozšířen 52% v Evropě a 86% v Asii. LEEK YELOW STRIPE VIRUS (LYSV) - virus žluté proužkovitosti póru, je morfologicky a hostitelsky podobný OYDV (Bos, 1981). Napadá výhradně rod Allium, především česnek a pór (Diekman, 1997). Dle Lunella a kol. (2007) může redukovat hmotnost a obvod česneku až o 74%. Jednoduše rozpoznatelné chlorotické skvrny se nejprve objevují na bázi listů a postupně se šíří až k vrcholu. Během vývoje choroby se 32

tyto žluté pruhy šíří a pokryjí celý list a přichází kompletní chloróza. Čepele listů jsou vrásčité a zkroucené, listy jsou hrubé a více křehké. Rostliny mají pomalý růst, jsou více stresovány a umírají během zimy nebo jara. Stonky infikovaných rostlin jsou tenké, zakrslé a světlejší a podstatně redukované kvality, jsou citlivé na mráz a umírají buď v zimě nebo v předjaří (Šutić a kol., 1999), cibule jsou hnědé (Jangu a kol., 2010). Virus je přenášen stejně jak mechanicky tak mšicemi (Lunello a kol., 2007). Smékalová a kol. (2010) detekovali LYSV v 65% z 648 testovaných genotypů. Klukáčková a kol. (2007) zjistila průměrnou přítomnost LYSV u pěti genotypů 31%. Dovas a Vovlas (2003) zjistili 83% přítomnost viru v jižní Itálii. GARLIC MOSAIC (POSSIBLE) POTYVIRUS (GcMV), redukuje růst a vitalitu a snižuje výnos o 30-40%. (Šutić a kol., 1999). Allium sativum L. je primární přirozeným hostitelem GcMV, zřídka napadá cibuli a pór. Příznaky se projevují na prvních listech vyrůstajících z infikovaných stroužků. Objevují se bledé, chlorotické, úzké pruhy nebo pruhované mosaiky. S vývojem nemoci se tyto příznaky postupně rozšiřují z listových bází až na vrcholy a způsobují chlorózy celých listů. Jednotlivé stroužky zůstávají nevyvinuté a zakrslé. Celkově snižuje růst a vitalitu rostliny (Šutić a kol., 1999). rod Carlavirus Celosvětově se vyskytující rod patří do čeledi Betaflexiviridae (Hulo a kol. 2011). Název rodu je odvozen od typového člena Carnation latent virus (Khan, Dijkstra, 2002). Genom carlavirů je tvořený jednovláknovou + ssRNA a virové částice mají rozměry 12-13 nm x 470-1000 nm (Hulo a kol. 2011). Vliv této čeledi na česnek je sice menší v porovnání s potyviry, nicméně někteří zástupci způsobují těžké poškození (Salomon, 2002). Symptomy na přirozených hostitelích jsou velmi slabé nebo žádné, pokud se objevují mosaiky, tak pouze v raných stádiích růstu. Většina je přenášena mšicemi neperzsistentním nebo semiprezistentním způsobem, mechanicky (Mahy, Regenmortel, 2010, Diekman, 1997) a hmyzem (Hulo a kol. 2011). K významným zástupcům napadajícím rod Allium patří Garlic common latent virus (GCLV), Shallot latent virus (SLV). Garlic latent virus (GLV) byl z česneku poprvé izolován v Japonsku (Lee a kol., 1979), ale je sérologicky nerozeznatelný od SLV(Tsuneyoshi a kol., 1998). GARLIC COMMON LATENT VIRUS (GarCLV, GCLV), byl detekován ve Francii v roce 1981 a popsán jako Garlic latent virus - GCL (Delecolle a Lot, 1981). Později je v Japonsku detekovaný GLV z importovaného česneku přejmenován na GCLV (van Dijk, 1993). Hostitelské rostliny se vyskytují v čeledích Alliaceae, Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae (Virus Description, 2002). Běžně se vyskytuje ve zdánlivě zdravých rostlinách (Šutić a kol., 1999). Vir je přenášen mechanicky nebo hmyzem (Hulo a kol. 2011). Často vyskytuje v latentní formě a dle Graichena (1991) zesiluje symptomy potyvirů. Klukáčková a kol. (2004) testovali 111 vzorků česneku různých původů. GCLV byl z 93% detekován ve vzorcích z Genové banky a z 33% ve vzorcích komerčně vyprodukovaného česneku. V importovaném čínském česneku nebyl tento vir detekován. Klukáčková a kol. (2007) testovali 5 33

českých genotypů česneku na přítomnost GCLV. Z celkového počtu 463 vzorků, bylo infikováno v průměru 99% (3 genotypy 100%). Smékalová a kol. (2010) detekovali GCLV v 82% z 648 testovaných vzorků. Senula a kol. (2000) testoval 100 vzorků česneku, u kterých byla ve více jak 90% zjištěna přítomnost GCLV. Dovas a Vovlas (2003) zjistili přítomnost viru mezi 23-98%. SHALLOT LATENT VIRUS (SLV) – latentní vir šalotky, napadá široký okruh zástupců čeledi Alliaceae, uváděno je až 80 druhů, a Nicotiana occidentalis a N. hesperis. Vir se vyskytuje v latentní formě, pokud se vyskytují slabé symptomy na česneku, cibuli, šalotce a póru, vytváří se světle zelené proužkování na listech (Diekmann, 1997). V kombinaci s LYSV způsobuje těžkou chlorózu nebo bílé pruhování listů, někdy může dojít až k úhynu. (Paludan, 1980). Virus se šíří mechanickým způsobem nebo mšicemi (Šutić a kol., 1999). Smékalová a kol. (2010) detekovali SLV v 83% z 648 testovaných vzorků. Klukáčková a kol. (2007) zjistila průměrnou přítomnost SLV u pěti genotypů 81%. Dovas a Vovlas (2003) testovali 120 rostlin a SLV byl přítomen jen u několika vzorků. Rod Allexivirus Tento rod se řadí do čeledi Alphaflexiviridae a vyskytuje se celosvětově (Hulo a kol. 2001). Do tohoto rodu je řazena skupina blíže nespecifikovaných virů označována souhrnným názvem Mite-borne viruses. Druhy jsou svou délkou příbuzné Potyviridae (Boss, 1999). Název rodu je odvozen od typového člena Shallot virus X. Virové částice jsou obvykle flexibilní, vláknité, o délce přiblížen 800 nm a průměru 12 nm. Genom allerxivirů je tvořený jednovláknovou + ssRNA (Hulo a kol. 2001). Tento rod má omezený rozsah hostitelů, vztahuje se pouze na rod Allium a byl zjištěn u tulipánů a narcisů (Astier a kol., 2007; Zavriev, 2008). Viry jsou přenášeny roztoči (Aceria tulipae) nebo mechanicky. Příznaky jsou obvykle mírné nebo žádné, nezpůsobuje vážná onemocnění. Dle Tidona a Darai (2011) redukuje výnos cibulí. Do rodu Allexivirus patří viry česneku (garlic virus) A, B, C, D, E, X (GarVA-E,X), Garlic mite-borne latent virus (GarMbLV), Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV), Shallot virus X (ShVX), Onion and Shallot mite-borne latent virus (Zavriev, 2008). Dovas a Vovlas (2003) zjistili Garlic virus C a Garlic virus D v 10-20 % vzorků. Infekce GarV-A v Argentině byla dle Carfune a kol. (2006) v 14-36%. Rod Fijivirus patří do čeledi Reoviridae. Typový člen je Fiji disease virus. Virové částice mají dvojitou kapsidovou strukturu, 65-70 nm v průměru, a genom fijivirů je tvořený dvouvláknovou dsRNA (Hulo a kol. 2001). GARLIC DWARF REOVIRUS (GDV), byl zatím objeven jen v jižní Francii (King a kol. 2011). Je přenášen křísy. Virus je šířen také infikovaným materiálem. Hostitelem viru je česnek. Doposud je na česneku omezená distribuce a nízký výskyt tohoto viru, ale má vysoký potenciál pro zničení úrody česneku (Diekmann, 1997). Prvotní příznaky se projevují červenáním konečků bazálních listů. Většina 34

z napadených rostlin nevykazuje normální vývoj. Rostliny mohou mít vějířovitý vzhled. Většina silně zakrslých listů se zbarvuje do tmavě zelené barvy. Na žilnatině se mohou objevovat zduřeniny, nádorky. Cibule napadených rostlin mají hruškovitý tvar, jsou svraštělé, scvrklé s houbovitou, porézní strukturou. Většina stroužků je malých (Lot a kol, 1994). Další viry, které mohou infikovat česnek Jak uvádí Diekmann (1997), mohou se na česneku vyskytnout ještě další viry, mají však pouze velice malý nebo lokální význam. Jedná se například o Cucumber mosaic cucumovirus, který byl detekován v Jugoslávii (Stefanac, 1980), Lettuce necrotic yellow rhabdovirus v Austrálii (Sward, 1990), Tobacco mosaic tobamovirus, který se vyskytl v Rusku (Vasiljeva a Mozhaeva, 1978), Tobacco rattle tobravirus, detekován v Dánsku a Německu (Kristensen a Engsbro, 1966; Graichen, 1975) a Turnip mosaic potyvirus ve Slovinsku a Izraeli. DISKUSE Česnek je napadán řadou virů, které jsou rozšířeny po celém světě a způsobují vážné ztráty na výnosu plodin a zhoršení jejich kvality (Bai a kol., 2010; Klukáčková a kol., 2004). K původcům virových chorob na česneku se řadí rody Potyvirus, Carlavirus, Allexivirus a Fijivirus. Česnek napadají také jiné viry, nemají však již významný vliv a vyskytují se převážně lokálně. Pro česnek nejškodlivější viry jsou Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus, mohou způsobovat redukci až 69% u OYDV a 54% u LYSV (Canavelli a kol., 1998; Lot a kol. 1998; Lunello a kol., 2007). Tyto viry jsou také velice rozšířeny, OYDVod 74% (Klukáčková a kol., 2007) do 100% (Dovas a kol., 2001) a LYSV od 31% (Klukáčková a kol., 2007) do 83% (Dovas a Vovlas, 2003). Dle Bai a kol. (2010) je OYDV rozšířen 52% v Evropě a 86% v Asii. Způsobují žlutou proužkovitost a chlorózy na listech, listy se kroutí, snižují celkovou odolnost rostlin a zpomalují jejich růst (Diekmann, 1997; Šutić a kol., 1999). Naproti tomu viry Garlic common latent virus a Shallot latent virus jsou většinou latentní. Jejich škodlivost spočívá především v zesílení symptomů způsobených rodem Potyvirus (Graichen, 1991). Rozšíření GCLV je od 33% (Klukáčková a kol., 2007) do 98% (Dovas a Vovlas, 2003). SLV se vyskytoval přibližně v 80% v České republice (Smékalová a kol., 2010; Klukáčková a kol., 2007), ale v jižní Itálii byl výsky pouze u několika vzorků ze 120. SLV v kombinaci s LYSV způsobuje těžké chlorózy až úhyn rostlin (Paludan, 1980). Mite-borne viruses, patřící do čeledi Allexivirus, mohou redukovat výnos cibulí (Tidona a Darai, 2001), obvykle se však nejedná o vážné poškození (Zavriev, 2008). Dovas a Vovlas (2003) zjistili Garlic virus C a Garlic virus D v 10-20 % vzorků. Infekce GarV-A v Argentině byla dle Carfune a kol. v 14-36%. Garlic dwarf reovirus byl detekován pouze v jižní Francii a jako jediný je přenášen křísy. Způsobuje zakrslost a tloustnutí listů, nádorky na žilnatině, způsobuje houbovitou strukturu cibulí (Lot a kol, 1994). 35

Studovaná literatura v této práci dokazuje závažnost virových chorob u česneku kuchyňského a upozorňuje na vysoký výskyt a rozšíření těchto onemocnění. Již existujícímu výzkumu této problematiky by proto měla být i nadále věnována pozornost. ZÁVĚR Práce zpracovává přehled virů, které se vyskytují u česneku kuchyňského. Jsou zde popsány hlavní rody a jednotlivé viry, více či méně významné pro pěstování česneku. Dle studované literatury se rod Potyvirus a jeho zástupci, Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus, řadí k nejškodlivějším. Mohou způsobit ztráty větší než 60%. Příznaky rodu Carlavirus se nemusí objevit, viry jsou často latentní, ale zesilují příznaky a vliv rodu Potyvirus. Rod Allexivirus nezpůsobuje vážná onemocnění. Jediný zástupce rodu Fijivirus, Garlic dwarf reovirus, byl zatím objeven jen v jižní Fracii, ale je zde potenciál rozšíření. LITERATURA 1. ASTIER S., ALBOUY J., MAURY Y., ROBAGLIA C., LECOQ H. (2007): Principles of Plant Virology. Genome, Pathogenicity, Virus Ecology, Science Publishers, ISBN 2-7380-0937-9. 2. BAI Y., ZHANG W., LI X., SHEN Y., GAO Y., FAN G., GENG H., MENG X. (2010): Advances in Research of Garlic Virus Diseases, Journal of Northeast Agricultural University (English Edition) Vol. 17 No. 2 85-92. 3. BOS L. (1981): Leek yellow stripe virus, AAB Description of Plant viruses, No. 240. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK. 4. BOS L. (1999): Plant viruses, unique and intriguing pathogens. Backhuys Publishers, Leiden. ISBN 90-5782-012-9. 5. CACIAGLI P. (2008): Vegetable viruses. In: MAHY B. V. J., VAN REGENMORTEL M. H. V. (2010): Desk Encyklopedia of Plant And Fungal Virology, Academic press, ISBN 978-0-12-375148-5. 6. CAFRUNE E., PEROTTO M. C., CONCI V. C. (2006): Effect of Two Allexivirus Isolates on Garlic Yield. Plant Disease / Vol. 90 No. 7, 898-904. 7. CANAVELLI A., NOME S. F., CONCI V. C. (1998). Efecto dedistintos virus en la producción de ajo (Allium sativum) Rosado Paraguayo. Fitopatología Brasilera, 23, 354–358. 8. CONCI V. C., LUNELLO P., BURASCHI D. (2002): Variations of Leek yellow stripe virus Concentration in Garlic and Its Incidence in Argentina. Plant Disease / Vol. 86 No. 10, 1085-1088. 9. DELECOLLE, B., LOT, H. (1981): Identification of three viruses infected garlic by immunoelectronmicroscopy. Agronomie, 1: 763-770.

36

10. DOVAS C. I., HATZILOUKAS E., SALOMON R., BARG E., SHIBOLETH Y., KATIS N. I. (2001): Comparison of methods for virus detection in Allium spp. Journal of Phytopathology, 149: 731-737 s. 11. GRAICHEN, K. (1975): Allium-Arten als natürliche Wirte nematodenübertragbarer Viren. Arch. Phytopath. Pflsch. Berlin 11: 399-403. In: DIEKMANN M. (1997). 12. GRAICHEN K. (1991): Gelbstreifigkeit des Porrees verursacht erhebliche Pflanzenausfalle. Gartenbau, 38: 17-19 s. 13. DIEKMANN M. (1997): Allium spp. FAO/IPGRI, no. 18, 59p. ISBN 92-9043346-9. 14. HULO C., DE CASTRO E., MASSON P., BOUGUELERET L., BAIROCH A., XENARIOS, I., LE MERCIER, P. (2001): ViralZone: A knowledge resource to understand virus diversity (2011) Nucleic Acids Research, 39 (SUPPL. 1), pp. D576-D582. Dostupné z: http://viralzone.expasy.org/all_by_species/268.html 15. CHEN J., ADAMS M. J. (2001): A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several members of the family. Archives of Virology (2001) 146: 757–766. 16. ICTVdB VIRUS DESCRIPTION [online]. 2002 [cit. 2010-03-07]. Garlic common latent virus. Dostupné z WWW: 17. KHAN J. A., DIJKSTRA J. (2002): Plant Viruses As Molecular Pathogens, 2002, Food Product Press, ISBN 1-56022-895-4. 18. KING A., LEFKOWITZ E., ADAMS M. J. (2011): Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier, 2011. ISBN 9780123846846. 19. KLUKÁČKOVÁ J., NAVRÁTIL M., VESELÁ M., HAVRÁNEK P., ŠAFÁŘOVÁ D. (2004): Occurence of Garlic Viruses in The Czech Republic, Acta fytotechnica et zootechnica, Vol. 7, 2004, Special Number, Proceedings of the XVI. Slovak and Czech Plant Protection Conference organised at Slovak Agricultural University in Nitra, Slovakia 20. KLUKÁČKOVÁ J., NAVRÁTIL M., DUCHOSLAV M. (2007): Natural infection of garlic (Allium sativum L.) by viruses in the Czech Republic. Journal of Plant Disease and Protection, 114 (3): 97-100 s 21. KRISTENSEN H. R., ENGSBRO B. (1966): Undersoegelser og forsoeg vedroerende jordbårne vira. Tiddskr. Planteavl. 70:353-379. In: DIEKMANN M. (1997). 22. LEE Y. W., YAMAZAKI S., OSAKI T., INOUYE T. (1979): Two elongated viruses in garlic, garlic latent virus and garlic mosaic virus. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 45: 727-734 s. 23. LOT H., DELECOLLE B., BOCCARDO G., MARZACHI C., MILNE R. G. (1994): Partial characterization of reovirus-like particles associated with garlic dwarf disease. Plant Pathology, 43: 537–546. 37

24. LOT H., CHOVELON V. SAUCHE, S. DELECOLLE, B. (1998): Effect of onion yellow dwarf virus and leek yellow stripe virus on symptomatology and yield loss of three French garlic cultivars. Plant Disease, 82: 1381-1385 s 25. LUNELLO P., DI RIENZO J., CONCI V. C. (2007): Yield loss in garlic caused by Leek yellow stripe virus Argentinean isolate. Plant Disease, 91: 153-158 s. 26. LUNELLO P., DUCASSE D. A., HELGUERA M., NOME S. F., CONCI C. C. (2004): An Argentinean Isolate of Leek yellow stripe viruses from leek can be transmitted to garlic. Journal of Plant Pathology (2002), 84 (1), 11-17. 27. MAHY B. V. J., VAN REGENMORTEL M. H. V. (2010): Desk Encyklopedia of Plant And Fungal Virology, Academic press, ISBN 978-0-12-375148-5. 28. PALUDAN N. (1980): Virus attack on leek survey, diagnosis, tolerance of varieties and winter hardiness. Tidsskrift Planteav, 84: 371-385 s. 29. ROD J., HLUCHÝ M., ZAVADIL K., PRÁŠIL J., SOMSSICH I., ZACHARDA M. (2005): Obrazový atlas chorob a škůdců zeleniny střední Evropy. Ochrana zeleniny v integrované produkci včetně prostředků biologické ochrany rostlin, Biocont Laboratory, spol. s. r. o., Brno, ISBN 80-901874-3-9. 30. SALOMON R. (2002): Virus Diseases in Garlic and the Propagation of Virusfree plants. CAB International 2002. Allium Crop Sience: Recent Advances in RABINOWITCH H. D., CURRAH L. (2002): CAB International, Wallingford, ISBN 0-85199-510-1. 31. SENULA A., KELLER E. R. J., LESEMAN D. E. (2000): Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment of an in vitro collection of garlic (Allium sativum), Acta Horticulturae 530: 121-128. 32. SMÉKALOVÁ K., STAVĚLÍKOVÁ H., DUŠEK K. (2010): Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic, Journal of Plant Pathology (2010), 92 (1), 273-274. 33. STEFANAC Z. (1980): Cucumber mosaic virus in garlic. Acta botanica Croatica 39:21-26. 34. SWARD, R. J. (1990): Lettuce necrotic yellows rhabdovirus and other viruses infecting garlic. Australasian Plant Pathol. 19:46-51. 35. ŠUTIC´ D. D., FORD R. E., TOŠIC´ M. T. (1999): Handbook Of Plant Viruses Diseases, CRC Press LLC, ISBN 0-8493-2302-9. 36. TIDONA CH., DARAI G. (2011): The Springer Index of Viruses. Second Edition. Springer Science+ Business media, New York. ISBN-978-0-38795919-1. 37. TSUNEYOSHI T., MATSUMI T., DENG T. C., SAKO I., SUMI S. (1998): Differentiation of Allium carlaviruses isolated from different parts of the world based on the viral coat protein sequence. Archives of Virology, 143: 1093-1107. 38. VAN DIJK P. (1993): Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses. Plant Pathology, 99: 233-257 s. 39. VASILJEVA, T. Y., MOZHAEVA K. A. (1978): Properties of a TMV strain isolated from plants of the genus Allium. Pp. 75-77 in Plant Virus Strains (V. G. 38

Reifman et al., eds.) Proc. Inst. Biol. Pedol., Vladivostok, Russia. In: DIEKMANN M. (1997). 40. ZAVRIEV S. K. (2008): Allexivirus, In: Editors-in-Chief: B.W.J. Mahy and M.H.V. van Regenmortel, Editor(s)-in-Chief, Desk Encyklopedia of Plant And Fungal Virology, Academic Press, Oxford, 2010, ISBN ISBN 978-0-12-3751485 41. ZHAO X., TAN Z., FENG H., YANG R., LI M., JIANG J., SHEN G., YU R. (2011): Microsatellites in different Potyvirus genomes: Survey and analysis, Gene, Volume 488, Issues 1–2, 2011, Pages 52-56, ISSN 0378-1119 KONTAKT Ing. Martina Kudělková; Mendeleum – ústav genetiky, Valtická 337, 691 44 Lednice; [email protected];

PODĚKOVÁNÍ Výsledky projektu QH71228 jsou prezentovány díky finanční pomoci projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043.

39

7. VIROVÉ CHOROBY U GENETICKÝCH ZDROJŮ ČESNEKU – NAZV QH71228 SMÉKALOVÁ KATEŘINA, DUŠEK KAREL Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Olomouc ABSTRAKT Česká národní kolekce genetických zdrojů dlouhodenního vegetativně množeného česneku byla v letech 2007 – 2009 metodou DAS-ELISA testována na přítomnost virových chorob OYDV, LYSV, GCLV a SLV. Nezávisle bylo vždy testováno 10 rostlin od každého z 648 genotypů česneku. Bylo zjištěno, že každý z těchto virů se v kolekci vyskytuje velmi často, a sice u 65 – 83% genotypů a 39 – 61% testovaných rostlin. U většiny rostlin byly současně detekovány dvě i více testované virové choroby. Zjištěný zdravotní stav kolekce je alarmující, ale ve skutečnosti lze předpokládat, že skutečný výskyt testovaných virů je ještě vyšší. KLÍČOVÁ SLOVA Česnek; virové choroby; ELISA; OYDV; LYSV; GCLV; SLV ÚVOD Česnek kuchyňský (Allium sativum L.) je pro svou charakteristickou vůni a chuť v ČR oblíbenou zeleninou. Při polním pěstování je však bohužel často napadán virovými chorobami, a protože se česnek kuchyňský rozmnožuje výhradně vegetativně, přecházejí tyto viry se sadbovým materiálem do dalších generací. Takto vzniká chronická infekce, kterou při běžném pěstování nelze žádnými mechanickými postupy ani chemickými přípravky eliminovat. Virové choroby česneku nemají většinou za následek úhyn hostitelské rostliny, ale způsobují producentům významné hospodářské ztráty, které – v závislosti na konkrétní chorobě a odrůdě česneku – mohou dosáhnout až 60% (Lot et al., 1998; Conci et al., 2002). Geografické rozšíření některých česnekových virů je kosmopolitní, a proto způsobují problémy nejen v ČR, ale na celém světě. Bohužel, virové choroby nejsou problémem pouze pro komerčně pěstované kultivary česneku, ale vyskytují se i v evropských kolekcích genetických zdrojů této plodiny (Keller a Senula, 2001). Vizuální hodnocení a výsledky testování několika náhodně vybraných rostlin (Klukáčková et al., 2004) prokázaly, že virové choroby se vyskytují i v české národní kolekci genetických zdrojů (GZ) dlouhodenního vegetativně množeného česneku. V průběhu řešení projektu NAZV QH71228 byla celá kolekce testována podrobněji a cílem tohoto příspěvku je prezentace získaných výsledků. 40

MATERIÁL A METODY Testování české národní kolekce genetických zdrojů česneku probíhalo v letech 2007 až 2009. Rostlinný materiál byl postupně odebírán v obdobích od dubna do června tak, aby měly testované rostliny vždy alespoň 3 plně vyvinuté listy a přitom teplota vzduchu v Olomouci nepřesahovala 28°C. Tato podmínka souvisí s termolabilitou testovaných virů – při vyšších teplotách nelze česnekové viry ani v prokazatelně napadených pletivech detekovat a jsou získávány falešně negativní výsledky. Každý jednotlivý genotyp je v kolekci česneku reprezentován devatenácti rostlinami. Testování na přítomnost virů bylo prováděno odděleně u deseti rostlin od každého genotypu. Četnost vzorků měla za úkol eliminovat případné chybné závěry způsobené kolísáním koncentrace virů v pletivech s ohledem na různé vývojové fáze rostlin, aktuální klimatické podmínky, denní dobu apod., které by opět mohly způsobit falešně negativní výsledky. Čerstvé česnekové listy (5 - 10 g ze střední části plně vyvinutého listu) byly v plastovém sáčku ručním homogenizérem (Bioreba) rozdrceny v 5 ml extrakčního pufru a po nejméně hodinové extrakci na substrátu při pokojové teplotě byla získaná suspenze použita k testování. Přítomnost virů OYDV (Onion yellow dwarf virus), LYSV (Leek yellow stripe virus), GCLV (Garlic common latent virus) a SLV (Shallot latent virus) byla zjišťována pomocí běžných chemikálií a reakčních setů firmy Bioreba dle instrukcí výrobce. Barevná reakce finální reakční směsi byla analyzována ELISA readerem (BIO-TEK EL800-PC) při vlnové délce λ = 405 nm. Každý vzorek odpovídající jedné rostlině byl analyzován pouze v jednom opakování (jedna jamka) a pozitivní výsledek (prokázaná nákaza) byl uznán, když naměřená absorbance přesáhla hodnotu 0,1. Všech 6480 testovaných rostlin, reprezentujících 648 genotypů česneku, bylo testováno identickým způsobem. Genotyp byl hodnocen jako „zcela infikovaný“ pokud bylo konkrétním virem shledáno virózními všech 10 testovaných rostlin. Pokud byla hodnoceným virem infikována alespoň jedna z 10 testovaných rostlin, byl genotyp hodnocen jako „částečně infikovaný“. „Nevirózní“ genotyp označuje situaci, kdy testovaný virus nebyl prokázán u žádné z 10 testovaných rostlin daného genotypu. Toto hodnocení bylo prováděno pro každý ze čtyř testovaných virů odděleně. Označení „nevirózní“ však nemusí nutně znamenat, že rostlina nebo celý genotyp je skutečně viruprostý. Rostlina může být infikována jiným než testovaným virem, nebo byla v době analýzy koncentrace testovaného viru v rostlině tak nízká, že nedosáhla detekčního limitu imunoenzymatické metody ELISA. VÝSLEDKY A DISKUZE Výsledky testování výskytu virových chorob v olomoucké kolekci genetických zdrojů česneku zcela potvrdily domněnku o špatném zdravotním stavu kolekce. Jak dokumentuje tabulka 1, u 647 ze 648 testovaných genotypů (99,8%) byla zjištěna alespoň jedna rostlina s pozitivní reakcí na alespoň jeden ze čtyř testovaných virů. Pouze u jednoho genotypu nebyla ani u jedné z 10 testovaných rostlin zjištěna 41

přítomnost žádného z těchto virů a naopak u 117 genotypů byly všechny testované rostliny infikovány všemi hodnocenými viry. Tab. 1: Výskyt virových chorob v olomoucké kolekci genetických zdrojů česneku Výskyt virových chorob Všech 10 testovaných rostlin s negativní ELISA reakcí na všechny 4 hodnocené viry Nejméně jedna rostlina infikována jedním z hodnocených virů U 10 testovaných rostlin se nejméně jednou vyskytly 2 z hodnocených virů U 10 testovaných rostlin se nejméně jednou vyskytly 3 z hodnocených virů U 10 testovaných rostlin se nejméně jednou vyskytly všechny 4 hodnocené viry Všech 10 testovaných rostlin s pozitivní ELISA reakcí na všechny 4 hodnocené viry Celkem

Počet genotypů Podíl v kolekci (%) 1

0,2

35

5,4

130

20,1

222

34,3

143

22,1

117

18,1

648

100

Bylo zjištěno, že rozšíření jednotlivých virů v kolekci není zcela vyrovnané. Nejčastěji byly detekovány GCLV a SLV, které se vyskytovaly u 82 resp. 83% genotypů (alespoň u jedné rostliny z genotypu). Rozšíření ostatních sledovaných virů však není výrazně nižší (Tab. 2).

Tab. 2: Zastoupení jednotlivých virů v kolekci Virus OYDV LYSV GCLV SLV Počet Počet Počet Počet Počet Genotyp infikovaných % % % % genotypů genotypů genotypů genotypů rostlin Nevirózní 0 132 20,4 225 34,7 115 17,7 113 17,4 Částečně 1-10 172 26,5 104 16,0 40 6,2 92 14,2 infikovaný Zcela 10 344 53,1 319 49,2 493 76,1 443 68,4 infikovaný ∑ 1-10 516 79,6 423 65,3 533 82,3 535 82,6

GCLV a SLV představují také nejrozšířenější (70%) kombinaci virů detekovaných současně v jedné rostlině. Jiné kombinace hodnocených virů se v česnekové kolekci vyskytovaly méně často (54 – 65%). Také výskyt trojnásobné infekce byl pochopitelně zjištěn nižší, a to mezi 49 a 54% (Tab. 3). 42

Tab. 3: Vícenásobné infekce virů v kolekci Dvojnásobné infekce: OYDV + LYSV OYDV + GCLV OYDV + SLV LYSV + GCLV LYSV + SLV GCLV + SLV Trojnásobné infekce: OYDV + LYSV + GCLV OYDV + LYSV + SLV OYDV + GCLV + SLV LYSV + GCLV + SLV

Počet genotypů: 364 408 420 348 376 456 Počet genotypů: 291 321 347 317

% 56,2 63,0 64,8 53,7 58,0 70,4 % 44,9 49,5 53,5 48,9

Ačkoli jsou výše uvedené výsledky již samy o sobě alarmující, skutečné rozšíření virových chorob v olomoucké kolekci genetických zdrojů dlouhodenního vegetativně množeného česneku je s největší pravděpodobností ještě vyšší. Jak již bylo řečeno, imunosérologická metoda ELISA je schopna detekovat virus pouze pokud je již v rostlině dostatečně namnožen, resp. rostlina v obraně proti němu tvoří dostatečné množství protilátek. Kontrolní analýza vybraných vzorků, která byla v roce 2009 prováděna paralelně metodami ELISA a SYBR Green real-time RT-PCR, prokázala, že některé z rostlin, u kterých ELISA přítomnost virů nezaznamenala, ve skutečnosti již infikovány jsou (Liesova-Svobodova a Karlova-Smekalova, 2011). Metodou SYBR Green real-time RT-PCR bylo také v roce 2010 zjištěno, že v kolekci se velmi často (92% vzorků) vyskytuje Mite-borne filamentous virus (MbFV), který nelze metodou ELISA detekovat. Každoročně opakované vegetativní množení cenných genotypů navíc způsobuje přenos virů v sadbovém materiálu do dalších generací a také přirozené vektory přenosu virů (hmyz, půdní háďátka atd.) stejně jako mechanická manipulace s výsadbovým materiálem (sklizeň, čistění, krátkodobé skladování, moření, nová výsadba) současnou situaci rok od roku zhoršují. Genetické zdroje česneku neslouží primárně k produkci sadbového materiálu pro komerční pěstování této zeleniny, a proto nejsou hospodářské ztráty, které viry při pěstování způsobují, zdánlivě zásadním problémem. Národní kolekce genetických zdrojů kulturních plodin, česnek nevyjímaje, však slouží jako bezpečnostní zásobárna cenných šlechtitelských materiálů a z tohoto pohledu silná virová infekce vzácné materiály značně znehodnocuje. Ozdravení jednotlivých genotypů je sice možné, ale velmi časově a finančně náročné. Metodika ozdravování je založena na izolaci apikálního meristému a jeho následném pěstování v in vitro prostředí. Po dopěstování každé jednotlivé ozdravené rostliny a jejím přesazení zpět do polních podmínek by však dříve či později nutně následovala opětovná infikace viry a proto je tento postup 43

zbytečný. Jiná je ale situace v případě, kdy se ozdravené materiály uchovají v takovém prostředí, které možnost reinfekce vylučuje, např. kryoprezervace. ZÁVĚR Při testování české národní kolekce genetických zdrojů dlouhodenního vegetativně množeného česneku metodou ELISA bylo zjištěno, že virové choroby OYDV, LYSV, GCLV a SLV se v kolekci vyskytují velmi často, a sice u 65 – 83% genotypů a 39 – 61% testovaných rostlin. U většiny rostlin byly současně detekovány dvě i více testované virové choroby. Zjištěný zdravotní stav kolekce je alarmující, ale lze důvodně předpokládat, že skutečný výskyt testovaných virů je ještě vyšší. Ozdravení kolekce cenných šlechtitelských materiálů je žádoucí pouze za předpokladu, že ozdravený materiál bude uchován při podmínkách, které vyloučí možnost opětovné reinfekce.

LITERATURA Conci, V.C., Lunello, P. & Buraschi, D. (2002). Variations of Leek yellow stripe virus concentration in garlic and its incidence in Argentina. Plant Disease, 86: 1085-1088. Keller, E.R.J. & Senula, A. (2001). Progress in structuring and maintaining the garlic (Allium sativum) diversity for the European GenRes project. Acta Horticulture 555: 189-193. Liesova-Svobodova, L. & Karlova-Smekalova, K. (2011). Detection of Garlic Viruses Using SYBR Green Real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. Journal of Phytopathology 159: 429-434. Lot, H., Chovelon, V., Souche, S. & Delecolle, B. (1998). Effects of Onion yellow dwarf and Leek yellow stripe viruses on symptomatology and yield loss of three French garlic cultivars. Plant Disease, 82: 1381-1385. KONTAKT Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc; [email protected]


44

8. DETEKCE VIRŮ ČESNEKU POMOCÍ SYBR Green Real-Time RT PCR LEIŠOVÁ-SVOBODOVÁ LEONA 1, SMÉKALOVÁ KATEŘINA 2 1

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Oddělení molekulární biologie, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně; 2Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Oddělení genetických zdrojů zelenin, léčivých rostlin a speciálních plodin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Šlechtitelů 11, 783 11 Olomouc

ABSTRAKT Pro detekci virů česneku Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek yellow stripe virus (LYSV), Garlic common latent virus (GCLV), Shallot latent virus (SLV) a Miteborne filamentous virus (MbFV) byly navrženy primery na základě sekvencí genu pro plášťový protein a byla optimalizována metoda SYBR Green real-time RT PCR. Touto metodou bylo provedeno stanovení obsahu pěti uvedených druhů virů u 50 genotypů česneku (Allium sativum L.) pocházejícího z různých zemí světa a u 24 genotypů česneku po odvirování. Účinnosti reakcí byly 97 % (OYDV), 93 % (LYSV), 99 % (SVL), 98 % (GCLV) a 87 % (MbFV). Detekční limit pro OYDV, LYSV a GCLV je 5 kopií, u SLV 15 kopií a u MbFV 130 kopií genu pro plášťový protein. Ve srovnání s ELISA byla přítomnost virů prokázána u většího procenta studovaných genotypů. Nejvíce byly vzorky napadeny virem OYDV a GCLV. KLÍČOVÁ SLOVA: OYDV, LYSV, GCLV, SLV, MbFV ÚVOD Česnek (Allium sativum L.) je vegetativně množenou plodinou, a proto v jeho pletivech dochází často k akumulaci virů, které způsobují značné hospodářské škody (Lot et al., 1998). U česneku dochází často k simultánní infekci několika různými druhy virů (Van Dijk, 1993a; Van Dijk, 1993b). Mezi nejdůležitější a nejrozšířenější patří potyviry Onion yellow dwarf virus (OYDV) a Leek yellow stripe virus (LYSV), carlaviry Garlic common latent virus (GCLV) a Shallot latent virus (SLV) a Mite-borne filamentous virus (MbFV) patřící mezi Allexiviry (Takaichi et al., 1998; Sumi et al., 1999; Fajardo et al., 2001). OYDV, LYSV, GCLV, SLV a MbFV jsou i nejdůležitějšími druhy virů česneku pěstovaného v České republice a kolekce genotypů česneku v Genové bance Olomouc (Klukáčková et al., 2004; Karlová et al., 2009; Smékalová et al., 2010). V posledních letech se intenzivně pracuje na metodách ozdravování česneku od přítomných virů (Wang et al., 2008). Během procesu ozdravování je nutné rostliny 45

testovat a vyloučit i ty, které jsou napadeny jen několika málo částicemi viru. Proto byla zvolena molekulárně-biologická metoda SYBR Green real-time RT PCR. Jedná se o reverzní transkripci a následnou polymerázovou řetězovou reakci prováděnou v reálném čase s detekcí pomocí flourescenčního barviva SYBR Green. Tato metoda se ukazuje být citlivější než běžně používaná a relativně levná ELISA a zároveň je více robustní než TaqMan real-time RT PCR, což je v podstatě stejná metoda s tím rozdílem, že místo detekčního barviva se používá fluorescenčně značená oligonukleotidová sonda, která zvyšuje přesnost, ale snižuje robustnost stanovení. Hlavním cílem této práce bylo vyvinout spolehlivou metodiku detekce pěti uvedených druhů virů česneku a využít jí pro ověření nepřítomnosti virů v ozdravených rostlinách česneku. MATERIÁL A METODY Padesát genotypů česneku z genové banky Olomouc bylo použito pro detekci přítomnosti virů. Na jaře 2009 a 2010 bylo sbíráno po třech listech ze tří rostlin od každého genotypu. Přítomnost virů OYDV, LYSV, GCLV a SLV byla detekována nejprve pomocí ELISA. 0,5 g čerstvých listů bylo použito pro každé stanovení prováděné dle optimalizovaného protokolu. Dále bylo analyzováno 24 genotypů česneku po odvirování (poskytnuty Ing. Zámečníkem). Byly odebírány celé rostlinky z in-vitro kultur, průměrně bylo analyzováno 7 rostlin od jednoho genotypu. Celková RNA byla extrahována z napadených listových pletiv či celých rostlin pomocí komerční soupravy High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche, Mannheim, Germany) dle optimalizovaného protokolu (Leisova-Svobodova, Karlova-Smekalova, 2011). Kvalita a koncentrace RNA byla určena spektrofotometricky pomocí spektrofotometru Gene Quant (Amersham Pharmacia, Upsala, Sweden). RNA testovaných vzorků byla nejprve přepsána na cDNA pomocí TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems, Foster City, USA). Reakce byly prováděny v reakčním objemu 50 μl obsahujícím 1x RT pufru, 5.5 mM MgCl2, 500 μM každého z dNTP, 1 μM oligo dT, 20 U RNAse Inhibitor, 62.5 U reverzní transkriptázy a 500 ng vzorku RNA v 5 μl. Reverzní transkripce byly prováděny v cykleru Senso Quest lab cycler (Biomedizinische Elektronik, Goettingen, Germany) za reakčních podmínek: 10 min při 25 °C, 30 min při 48 °C a 5 min při 95 °C. Real-time PCR byly prováděny v reakčním objemu 25 μl obsahujícím 1x SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, USA), 0.3 μM každého z primerů specifických pro daný druh viru (Leisova-Svobodova, Karlova-Smekalova, 2011) a 20 ng transkribované cDNA. Real-time kvantitativní PCR byly prováděny v cykleru ABI PRISM 7900 v MicroAmp optických 96-jamkových destičkách (Applied Biosystems, Foster City, USA). Reakční podmínky sestávaly z počáteční denaturace 10 min při 95 °C, ze 40 cyklů: 15 sec. při 95 °C a 1 min. při 60 °C a ze závěrečné 46

disociační fáze: 15 sec. při 95 °C, 15 sec. při 60 °C a pomalé stoupání teploty až do 95 °C. Součástí každé analýzy byly pozitivní plasmidové (Leisova-Svobodova, Karlova-Smekalova, 2011) a negativní kontroly. Každý vzorek byl analyzován ve třech opakováních. Data byla vyhodnocována pomocí programu Sequence Detection Software (Applied Biosystems, Foster City, USA). Jestliže hodnoty Ct dosahovaly hodnoty větší než 40, byl vzorek považován za negativní na přítomnost stanovovaného druhu viru. VÝSLEDKY A DISKUSE Pro detekci virů česneku již bylo publikováno několik diagnostických PCR primerů (Dovas et al. 2001; Shiboleth et al. 2001). OYDV a LYSV je možno rovněž stanovit i velmi citlivou TaqMan real-time RT PCR metodou (Lunello et al., 2004). Avšak vzhledem ke značné variabilitě sekvence cílového genu stále hrozí získání falešně negativních výsledků. To se týká zvláště virů česneku a dalších RNA virů (Anderson et al., 2003), které jsou charakteristické vyšší sekvenční variabilitou než DNA viry a je velmi obtížné najít konzervativní oblast genomu pro umístění primerů a sondy. Proto TaqMan real-time PCR není dostatečně robustní pro detekci virů česneku. Na základě sekvencí genu pro plášťový protein studovaných druhů virů byly navrženy primery a byla optimalizována SYBR Green real-time RT PCR reakce (Leisova-Svobodova, Karlova-Smekalova, 2011). S připravenými plasmidovými standardy byly připraveny ředící řady od koncentrace 5 x 101 kopií plasmidu v 1μl vzorku do koncentrace 5 x 109 kopií plasmidu v 1 μl vzorku. Takto připravené vzorky byly analyzovány pomocí SYBR Green real-time PCR každý ve čtyřech opakováních. Průměrné Ct hodnoty byly vyneseny oproti počtu kopií standardu ve vzorku do grafu (Obr. 1). Výsledná lineární závislost naznačuje, že je možné získat spolehlivé výsledky v rozmezí počtu kopií plasmidových standardů 10 až 108 (interval kvantifikace). Korelace mezi hodnotami Ct a log N, kde N je počet kopií plasmidu byla vysoká pro všechny detekované druhy virů (R2 = 0.99 pro OYDV, LYSV, GCLV, MbFV a R2 = 0.97 pro SLV – Obr. 1). Detekční limit pro OYDV, LYSV a GCLV byl 5 kopií, pro SLV 15 kopií a pro MbFV 130 kopií. Tyto hodnoty byly zjištěny extrapolací z kalibračních křivek pro hodnoty Ct(y) = 40.

47

45

OYDV LYSV GCLV MbFV SLV linear (OYDV) linear (LYSV) linear (GCLV) linear (MbFV) linear (SLV)

y(OYDV) = -3.5806x + 41.383 R2 = 0.9901

40

y(LYSV) = -3.5056x + 41.642 R2 = 0.9951

35

30

Ct

25

20

y(SLV) = -3.3328x + 43.768 R2 = 0.9762

15

10

5

y(GCLV) = -3.3611x + 41.962 R2 = 0.9965

y(MbFV) = -3.6698x + 47.726 R2 = 0.9961

0 0

2

4

6

8

10

12

log (number of plasmid copies)

Obr. 1:

Kalibrační křivky pro kvantifikaci virů česneku OYDV, LYSV, GCLV, SLV a MbFV

Účinnosti reakcí byly vysoké: 97 % u OYDV, 93 % u LYSV, 99 % u SLV, 98 % u GCLV a 87 % u MbFV standardů. Metoda byla použita nejprve pro detekci virů u genotypů česneku, které jsou součástí kolekce genetických zdrojů česneku udržovaných v Olomouci. Vzorky byly analyzovány ve dvou letech 2009 a 2010 a výsledky byly porovnávány s výsledky provedenými metodou ELISA. V roce 2009 bylo nalezeno více vzorků pozitivních pomocí ELISA metody (Tab. 1). Tento rozdíl byl dán dobou odběru vzorků. Zatímco pro stanovení ELISA byly listy odrůd česneku odebírány v polovině března, pro realtime RT PCR diagnostiku byly vzorky odebírány až na počátku dubna po periodě teplého počasí, kdy teplota přesahovala 20 °C. Bylo zjištěno, že teplota má velký vliv na přítomnost a koncentraci virů česneku (Dovas et al., 2002). Proto byly vzorky pro obě stanovení v roce 2010 odebrány týž den v polovině dubna, kdy teplota toho roku dosud nepřesáhla 20 °C. V tomto roce bylo detekováno více pozitivních vzorků pomocí realtime RT PCR než pomocí ELISA. Toto zjištění potvrzuje již publikované zjištění, že jsou PCR metody 102 – 106 -krát citlivější než ELISA (Dovas et al., 2001; Lunello et al., 2004). Výsledky analýz jsou shrnuty v Tab. 1. Všechny testované genotypy vykazovaly vyšší výskyt studovaných druhů virů v roce 2010 než v roce 2009 (Obr. 2). Většina genotypů byla napadena více druhy virů zároveň. Nejčastější infekcí v roce 2009 byl virus OYDV (100 %) a nejmenší SLV (44 %). V roce 2010 byl nalezen nejvyšší výskyt OYDV (100 %) a nejnižší LYSV (86 %).

48

Přehled výskytu jednotlivých druhů virů detekovaných pomocí ELISA a SYBR Green real-time RT PCR u 50 genotypů česneku

Tab. 1:

Genotypy česneku pozitivní na daný virus (%) ELISA

RT PCR

2009

2010

2009

2010

OYDV

54

100

100

100

LYSV

42

56

62

86

GCLV

84

90

78

94

SLV

72

90

44

90

-

-

88

92

MbFV

120

2009 2010

Number of infected genotypes

100 80

60 40 20 0 OYDV

Obr. 2:

LYSV

GCLV

SLV

MbFV

Četnost výskytu jednotlivých druhů virů detekovaných pomocí SYBR Green real-time RT PCR u 50 genotypů česneku v letech 2009 a 2010

49

Dle optimalizovaného protokolu byla testována přítomnost virů OYDV, LYSV, GCLV, SLV a MbFV rovněž u 24 genotypů česneku pěstovaných in vitro v procesu odvirování. U genotypů po ozdravování byla detekována podstatně nižší frekvence výskytu uvedených pěti druhů virů (Obr. 3). Vyšší výskyt viru MbFV je dán zřejmě biologií tohoto druhu a je předmětem dalšího zkoumání.

Počet pozitivních vzorků

60

před odvirováním

50

po odvirování 40 30 20

10 0 OYDV

LYSV

GCLV

SLV

MbFV

Viry

Obr. 3:

Četnost výskytu virů v 24 genotypech česneku před a po odvirování

ZÁVĚR Metoda SYBR Green real-time RT PCR se ukázala jako vhodná pro detekci značně variabilních druhů virů, jakými jsou viry česneku (OYDV, LYSV, GCLV, SLV a MbFV). Tato metoda se osvědčila jak pro skríning výskytu virů, tak i pro citlivou detekci virů v rostlinách česneku v průběhu procesu odvirování.

LITERATURA ANDERSON T. P., WERNO A. M., BEYNON K. A., MURDOCH D. R. (2003). Failure to genotype herpes simplex virus by real-time PCR assay and melting curve analysis due to sequence variation within probe binding sites. J. Clin. Microbiol., 41, 2135-2137.

50

DOVAS C.I., HATZILOUKAS E., SALOMON R., BARG E., SHIBOLETH Y., KATIS N. I. (2001). Comparison of methods for virus detection in Allium spp. J. Phytopathol., 149, 731-737. DOVAS C. I., MAMOLOS A.P., KATIS N. I. (2002). Fluctuations in concentration of two potyviruses in garlic during the growing period and sampling conditions for reliable detection by ELISA. Ann. Appl. Biol., 140, 21-28. FAJARDO T. V. M., NISHIJIMA M., BUSO J. A., TORRES A. C., AVILA A. C., RESENDE R. O. (2001). Garlic complex: Identification of Potyviruses and Carlaviruses in Central Brazil. Fitopatol. Bras., 26(3), 619-626. KARLOVÁ K., DUŠEK K., STAVĚLÍKOVÁ H. (2009). Virus diseases in collection of genetic resources of garlic in the Czech Republic. Agriculture, 55, 58-60. KLUKÁČKOVÁ J., NAVRÁTIL M., VESELÁ M., HAVRÁNEK P., ŠAFÁŘOVÁ D. (2004). Occurrence of garlic viruses in the Czech Republic. Acta Fytotech Zootech, 7, 126-128. LEIŠOVÁ-SVOBODOVÁ L., KARLOVÁ-SMÉKALOVÁ K. (2011). Detection of garlic viruses using SYBR Green real-time reverse transcription polymerase chain reaction. J. Phytopathol., 159, 429-434. LOT H., CHOVELON V., SOUCHE S., DELECOLLE B. (1998). Effects of onion yellow dwarf and Leek yellow stripe viruses on symptomatology and yield loss of three french garlic cultivars. Plant Dis., 82(12), 1381-1385. LUNELLO P., MANSILA C., CONCI V., PONZ F. (2004). Ultra-sensitive detection of two garlic potyviruses using a real-time fluorescent (Taqman) RT-PCR assay. J. Virol. Met., 118, 15-21. SHIBOLETH Y. M., GAL-ON A., KOCH M., RABINOWITCH H. D., SALOMON R. (2001). Molecular characterisation of Onion yellow dwarf virus (OYDV) infecting garlic (Allium sativum L.) in Israel: Thermotherapy inhibits virus elimination by meristem tip culture. Ann. Appl. Biol., 138, 187-195. SMÉKALOVÁ K., STAVĚLÍKOVÁ H., DUŠEK K. (2010). Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. J. Plant Pathol., 91, 273-274. SUMI S., MATSUMI T., TSUNEYOSHI T. (1999). Complete nucleotide sequences of garlic viruses A and C, members of the newly ratified genus Allexivirus. Arch. Virol., 144, 1819-1826. TAKAICHI M., YAMAMOTO M., NAGAKUBO T., OEDA K. (1998). Four garlic viruses identified by reverse transcription polymerase chain reaction and their regional distribution in Northern Japan. Plant Dis., 82(6), 694-698. 51

VAN DIJK P. (1993a). Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses. Neth. J. Plant Pathol., 99, 233-257. VAN DIJK P. (1993b). Survey and characterization of Potyviruses and their strains of Allium species. Neth. J. Plant Pathol., 99, 1-48. WANG Q., CUELLAR W. J., RAJAMAKI M. L., HIRATA, Y., VALKONEN, J. P. T. (2008). Combined thermotherapy and cryotherapy for efficient virus eradication: relation of virus distribution, subcellular changes, cell survival and viral RNA degradation in shoot tips. Mol. Plant Pathol., 9, 237-250.

PODĚKOVÁNÍ Autorky děkují Ing. Jiřímu Zámečníkovi a Mgr. Martinovi Grospietschovi za poskytnutí rostlin česneku po odvirování. Výsledky projektu QH71228 a MZe0002700604 jsou prezentovány díky finanční pomoci projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043.

52

9. OZDRAVOVÁNÍ ČESNEKU KRAJÍČKOVÁ JANA Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. ABSTRAKT V této práci jsme se zabývali ozdravováním česneku od základních virů metodou izolace apikálního meristému a kombinací chemoterapie a izolace apikálního meristému. Cílem bylo zhodnotit účinnost ozdravení a porovnání obou metod. V pokusu bylo použito 10 genotypů česneku původem z Československa, nebo jeho nástupnických států, které jsou významné z hlediska originality, zachování biodiverzity a šlechtitelství. Výborných výsledků při eliminaci virů bylo dosaženo oběma zkoušenými metodami. Při porovnání metod byla pro ozdravení od GCLV a SLV účinnější kombinovaná metoda, pro ozdravení od LYSV byla vhodnější metoda prosté izolace meristému. Závěrem lze konstatovat, že pro ozdravení česneku od kompletního souboru virů lze s úspěchem použít jak prostou izolaci apikálního meristému, tak kombinovanou metodu chemoterapie a izolace apikálního meristému. Při ozdravení od konkrétního viru je výhodné použít metodu, která je pro daný virus účinnější. KLÍČOVÁ SLOVA: česnek, viróza, ozdravení, izolace meristému, chemoterapie ÚVOD Šlechtěný česnek Allium sativum L. je sexuálně sterilní plodina a rozmnožuje se výhradně vegetativně. Tento způsob rozmnožování je problematický z hlediska přenosu chorob, zvláště těch virových. V evropských podmínkách česnek napadají nejčastěji viry OYDV, GCLV, LYSV, SLV a MbFV. Virózami trpí již množitelský materiál a v současnosti je infikována většina česnekové sadby na celém světě. Infekce jednotlivými viry či jejich kombinací různou měrou negativně ovlivňuje výnos. Bezvirózní množitelský materiál lze získat ozdravením infikovaného česneku. Existuje několik obecných principů, které se používají k ozdravení různých rostlinných druhů, v případě česneku se osvědčila izolace apikálního meristému, případně kombinace chemoterapie a izolace apikálního meristému. Principem izolace apikálního meristému je fakt, že viry nejsou v rostlině rozloženy rovnoměrně (Morel, Martin 1952), ale jejich koncentrace klesá směrem ke kořenové špičce stejně jako směrem k vegetačnímu vrcholu, protože intenzivní dělení buněk v meristému znemožňuje množení a transport virů. Apikální meristém je tedy teoreticky bezvirózní část rostliny, která je navíc schopná regenerovat v celou rostlinu. Úspěšnost ozdravení je závislá na charakteru patogena, jeho vzdálenosti od meristematického dómu a s tím spojenou velikostí odebíraného explantátu (Quak 1977). Podmínkou úspěšné regenerace je zachování minimální velikosti vypreparovaného explantátu (Conchi, Nome 1991; Senula a kol.. 53

2000). Chemoterapie je založena na aplikaci látek s virostatickými účinky do kultivačního média. Virostatické preparáty ovlivňují metabolismus buňky v neprospěch vytváření viru bez současného poškození hostitele. Senula a kol. (2000) ve své práci zjistil, že chemoterapeutikum Ribavirin u rostlin způsobuje deformace a hyperhydrataci. Sidaros a kol. (2004) publikoval ve své právi, že Ribavirin celkově podporuje eliminaci virů, ale redukuje vývoj rostlin. MATERIÁL A METODY Výchozím materiálem pro ozdravování byly úspěšně in vitro převedené stroužky česneku (postup dezinfekce zahrnoval kroky: 20% Sava 20 minut, ořezání stroužků, 10% Sava 15 minut, 70% etanolu 1 minuta). Po cca 14ti denní kultivaci stroužků na MS médiu bez fytohormonů (MS 4,4 g/l, agar 7 g/l, sacharóza 20 g/l, pH 5,8) nebo v případě chemoterapie na tomtéž mediu obsahujícím Ribavirin (50 mg/l) byl dvěma podélnými řezy mimo osu pochev obnažen a vypreparován apikální meristém o velikosti cca 0,5mm a přenesen na MS médium obohacené o fytohormony (NAA 0,1 mg/l, BAP 0,5 mg/l, GA3 0,5 mg/l). V měsíčních intervalech byly životaschopné meristémy přenášeny na čersvé kultivační médium MS s fytohormony. Po vytvoření prvních kořínků byly meristémové rostlinky přepasážovány na MS médium bez fytohormonů a bylo pokračováno v kultivaci a pasážování v měsíčních intervalech. Po cca 6 měsících byly rostlinky schopné kontrolního ELISA testu pro ověření úspěšnosti ozdravení. VÝSLEDKY A DISKUZE Převodem in vitro a ozdravovacím procesem byl získán soubor 465 meristemových rostlin, jenž byl podroben kontrolnímu ELISA testu. Výsledky testu a jejich grafické znázornění jsou uvedeny v Tab. 1 a Grafu 1. Varianta 1 představuje skupinu rostlin, která byla podrobena prosté izolaci apikálního meristému, varianta 2 skupinu rostlin, u které izolaci meristému předcházela chemoterapie. Tab. 2 zachycuje procentuální výskyt jednotlivých virů v meristémových rostlinách u obou variant. Z Tab. 2 vyplývá, že prostá izolace apikálního meristému (varianta 1) je úspěšná metoda, nejproblematičtěji eliminovatelný byl GCLV, který byl detekován u 14,7 % meristémových rostlin. Ostatní viry se u této varianty vyskytly ve velmi malé míře (OYDV 1,9 %, LYSV 0,3 %, SLV 2,8 %). Tato zjištění je ve shodě s výsledky Senula a kol. (2000). U varianty 2, zahrnující navíc chemoterapii, došlo k úspěšnému ozdravení od všech virů, nejhůře ozdravitelný byl LYSV s výskytem 8,6 %, občasný výskyt ostatních virů byl zanedbatelný (OYDV 1 %, GCLV 2,9 %, SLV 0 %). Při porovnání varianty 1 a 2 jsme došli ke zjištění, že chemoterapie předcházející izolaci meristému byla účinnější při ozdravování česneku od GCLV s výskytem 2,9 % (vs. 14,7 % prostá izolace meristému) a SLV s výskytem 0 % (vs. 2,8 % prostá izolace meristému). Se stejným závěrem přišel ve své práci i Senula a kol. (2000). Naopak prostá izolace apikálního meristému byla výhodnější při ozdravování od LYSV s výskytem 0,3 % (vs. 8,6 % kombinace s chemoterapií). 54

Tab.1: Výsledky testování ELISA meristémových rostlin (varianta 1 - prostá izolace apikálního meristému, varianta 2 - chemoterapie s následnou izolací apikálního meristému)

do květu

Nepaličák

SKS-polovybíhající

Varianta

Genotyp

Počet Počet pozitivních reakcí testovaných OYDV GCLV LYSV SLV rostlin

1

44

0

0

0

0

2

11

1

1

0

0

1

47

1

0

0

0

2

10

0

0

0

0

1

70

2

29

1

0

2

26

0

2

7

0

1

18

0

3

0

0

2

15

0

0

0

0

1

34

0

4

0

0

2

8

0

0

2

0

1

28

1

6

0

2

2

11

0

0

0

0

1

13

0

0

0

1

2

-

-

-

-

-

1

45

0

6

0

1

2

12

0

0

0

0

1

30

0

0

0

2

2

10

0

0

0

0

1

31

3

5

0

4

2

2

0

0

0

0

Celkem

1

360

7

53

1

10

Celkem

2

105

1

3

9

0

ALAN-1063

L.ROZHANOVCE-1416

PRIM-1065

LUKAN-2808

MORAVAN-1057

Paličák

ROPAL-1058

L.ROUSÍNOV-1228

L.DUBOVÝ VRCH-2655

L.PROSTĚJOVSKO-2804

L.KAREL-2817

55

400 350 300 250

celkem analýz

200

OYDV

150

GCLV

100

LYSV SLV

50

0 var.1 var.2

Graf 1: Grafické porovnání variant 1 a 2 (varianta 1 - prostá izolace apikálního meristému, varianta 2 - chemoterapie s následnou izolací apikálního meristému)

Tab.2: Výskyt jednotlivých virů v meristémových rostlinách v procentech (varianta 1 - prostá izolace apikálního meristému, varianta 2 - chemoterapie s následnou izolací apikálního meristému)

var.1 var.2

OYDV 1,9 % 1%

GCLV 14,7 % 2,9 %

LYSV 0,3 % 8,6 %

SLV 2,8 % 0%

ZÁVĚR Na základě získaných výsledků lze shrnout, že ozdravení česneku od virových chorob metodou prosté izolace apikálního meristému i kombinací chemoterapie a izolace apikálního meristému je vhodným a účinným prostředkem pro získání viruprostého materiálu česneku. Při cílené eliminaci GCLV nebo SLV je výhodnější použít kombinovanou metodu, pro eliminaci LYSV je účinnější prostá izolace apikálního meristému. Takto získaný ozdravený materiál může být využit pro potřeby uchování česneku v kryo bance VÚRV, v.v.i. pro potřeby šlechtitelů nebo pěstitelů, jako základ pro produkci kvalitní sadby česneku.

56

LITERATURA CONCHI V. C., NOME S. F. (1991). Virus free garlic (Allium sativum L.) plants obtained by thermothetapy and meristem tip culture. Journal of phytopathology, 132(3): 186-192. MOREL G., MARTIN C. (1952). Guérison de dahlias ttaints d´une maladie à virus. C.R. Acad. Sci., Paris, 235:301-305. QUAK F. (1977) Meristem culture and virus-free plants. In: Reinert, J; Bajaj, Y.P.S. (eds).: Applied and Fundamentals Aspects of Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Springer Verlag, Berlin, p. 598-615. SENULA A., KELLER E. R. J., LESEMAN D. E. (2000). Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for establishment of an in vitrocollection of garlic (Allium sativum). Acta Horticulturae, 530: 121-128. SIDAROS S. A., OMAR R. A., EL-KEWEY S. A., EL-KHALIK S. A. (2004): Virus elimination from infected garlic plants using different techniques. Egyptian J. Virol. 1, 333-341. KONTAKT [email protected]


57

10. KRYOKONZERVACE ZDROJŮ ČESNEKU

OZDRAVENÝCH

GENETICKÝCH

KOTKOVÁ RENATA, GROSPIETSCH MARTIN, ZÁMEČNÍK JIŘÍ Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně

ABSTRAKT Cílem této práce bylo otestovat vliv odvirování rostlin vybraných genotypů česneku na jejich regeneraci po kryoprezervaci v tekutém dusíku. Hypotéza vycházela z pozorování větší vitality odvirovaných rostlin v polních podmínkách a předpokládalo se, že odvirované rostliny budou mít také vyšší regenerační schopnost po působení kryogenních teplot. Odvirované rostliny Allium byly získány z MENDELU ZF Lednice a VÚB, s.r.o. v Havlíčkově Brodě. Odvirované rostliny byly testovány pomocí ELISA testu. Kryoprezervace probíhala podle standardního kryoprotokolu s pomocí vitrifikačního roztoku (PVS3). Získané výsledky nepotvrdily hypotézu, průměr regenerace u odvirovaných genotypů byl o 7 % vyšší než u neodvirovaných, ale vzhledem k vysokému rozptylu nebyl tento rozdíl statisticky významný. Na základě hodnocení růstu, regenerace a množitelského koeficientu kontrolních rostlin bylo patrné, že některé genotypy měly i po odvirování nižší regenerační schopnost a množitelský koeficient než kontrolní neodvirované rostliny stejného genotypu. Na základě výsledků lze konstatovat, že odvirování rostlin Allium nemá významný vliv na regenerační schopnost rostlin po kryoprezervaci. Přínosem této práce je potvrzení možnosti bezpečného skladování genofondu odvirovaných i neodvirovaných rostlin Allium pomocí metod kryoprezervace v ultranízkých teplotách. KLÍČOVÁ SLOVA: kryoprezervace, Allium, uchování genofondu, odvirování ÚVOD Česká republika má největší sbírku dlouhodenních rostlin česneků na světě, čítající více jak 640 položek. Tato sbírka je uchovávaná na pracovišti Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i., v Centru aplikovaného výzkumu zelenin a speciálních plodin v Olomouci. Sbírka je vedena jako polní kolekce a s velkým rizikem je vystavena abiotickým a biotickým stresům prostředí. Příkladem abiotických stresů může být zaplavení vodou jako při povodni v roce 2002 a příkladem biotických stresů je zamoření polní kolekce čtyřmi nejvýznamnějšími viry (OYDV, GCLV, SLV A LYSV) (Klukáčková et al. 2004, Smékalová et al. 2010). Od roku 2003 se uchovává genofond Allium pomocí kryoprezervačních metod v kryobance vegetativně množených rostlin (Zámečník a Stavělíková 2005, Faltus et al. 2005). Při řešení projektu NAZV QH71228

58

byly hledány způsoby odvirování vybraných genotypů Allium a způsob uchování těchto odvirovaných rostlin. Cílem této práce bylo otestovat vliv odvirování rostlin vybraných genotypů Allium na jejich regeneraci po kryoprezervaci v tekutém dusíku. Hypotéza vycházela z pozorování větší vitality odvirovaných rostlin v polních podmínkách, předpokládalo se, že odvirované rostliny budou mít také vyšší regenerační schopnost po vlivu kryogenních teplot. MATERIÁL A METODY Výchozím materiálem pro zamrazování byly vzrostné vrcholy česneku kuchyňského (Allium sativum), které byly extirpovány z rostlin pěstovaných v in vitro podmínkách. V in vitro podmínkách byly rostliny pěstovány na agarovém médiu podle Murashige a Skooga se sníženým obsahem dusíku (25 % NH4NO3, 50 % KNO3) a bez rostlinných fytohormonů se 30 g l-1 sacharózy a 7 g l-1 agaru. Rostliny byly na tomto médiu množeny dělením bazálních částí, vždy s částí podpučí. Rostliny byly pěstovány v kultivačním boxu za teploty 22±1°C, hustoty světelného toku 80 µmol m-2 s-1 a fotoperiodě 16/8 h. Odvirované výchozí rostliny byly odvirovány týmem B. Křižana ze zahradnické fakulty MENDELU a týmem J. Krajíčkové z VÚB, s.r.o. Havlíčkův Brod. Po napěstování příslušného počtu rostlin (přibližně 200 rostlin, vyrovnaných ve vzrůstu) se před kryoprezervací pěstovaly minimálně 6–8 týdnů na médiu MS (Murashige a Skoog, 1962) doplněného hormony v koncentraci 2,0 mg l-1 BAP a 0,02 mg l-1 NAA, při teplotě 22±1 °C a 16 hodinové světelné periodě. Předkultivace vzrostných vrcholů probíhala v Petriho miskách uzavřených Parafilmem na tuhém médiu (složení viz výše) obsahující 10 % hmotnostních dílů sacharózy po dobu 20–24 hodin při teplotě 22±1 ° C ve tmě. Extirpované vzrostné vrcholy (Obr. 1) se pak přenesly do kádinky s 2 ml roztoku LS (Loading Solution), který tvořila 0,4M sacharóza a 2M glycerol a ponechaly se v něm po dobu 20 minut. Pak byly přeneseny do 20 ml kryoprotektivního roztoku PVS3 (Plant Vitrification Solution č. 3), který obsahoval 50 g sacharózy a 50 g glycerolu ve 100 ml roztoku (Kotková et al. 2010, Zámečník et al. 2012). Nízký osmotický potenciál roztoku PVS3 způsobil postupnou dehydrataci vzrostných vrcholů (Zámečník et al. 2011, Zámečník a Šesták 2011). Po 2 hodinách v PVS3 byly jednotlivé vzrostné vrcholy přeneseny, vyndaly se pinzetou na hliníkový plíšek po 10 kusech, který se ponořil do tekutého dusíku. Po odtání byly vzrostné vrcholy přeneseny na regenerační médium do Petriho misek s pevným regeneračním médiem obsahujícím 3 % sacharózy s fytohormony 2,0 mg l-1 BAP a 0,02 mg l-1 NAA. Po 14 dnech kultivace rostlin v Petriho miskách ve tmě při 22±1 °C, bylo provedeno hodnocení jejich životaschopnosti a byly přemístěny na světlo, za teploty 22±1 °C, hustoty světelného toku 80 µmol m -2 s1 a fotoperiodě 16/8 h. Za dalších 6 až 8 týdnů kultivace byla hodnocena regenerace rostlin. Mezi regenerované rostliny byly zahrnuty rostliny tvořící de novo listy a kořeny 59

bez tvorby kalusu. Rostliny, u nichž byla patrná hyperhydratace, nebyly považovány jako regenerující.

Obr. 1: a) rostliny napěstované v in vitro podmínkách před kryoprezervací; b) extirpovaný vzrostný vrchol před ponořením do tekutého dusíku, úsečka 1mm; c) přežití rostlin po odtání; d) regenerace rostlin po odtání z ultranízkých teplot.

VÝSLEDKY A DISKUZE Na základě hodnocení regenerace rostlin po kryoprezervaci u 20 odvirovaných genotypů byla regenerace vyšší než u neodvirovaných (Tab. 1).

60

Z Tab. 1 plyne, že rozdíl v regeneraci neodvirovaných a odvirovaných rostlin nebyl statisticky významný, to znamená, že nebyl shledán průkazný vliv odvirování rostlin na jejich lepší regenerační schopnost v in vitro podmínkách.

Tab. 1:

Vliv odvirování na úroveň regenerace po kryoprezervaci u 20 genotypů rostlin rodu Allium Regenerace po odtání z tekutého dusíku průměr směrodatná odchylka % neodvirované

36,2

19,48

odvirované

43,7

13,72

rozdíl není významný na p ≤ 0,05

Odvirování rostlin Allium lze provádět několika způsoby. Je to jednak pomocí izolace a kultivace izolovaných meristémů (Havránek, 1972), tj. meristémů, u kterých se předpokládá, že vzhledem k jejich rychlosti růstu nejsou zasaženy pomaleji šířícími se viry. Druhou metodou je chemoterapie, tj. metoda, kdy na rostliny jsou aplikována tzv. virostatika, nejčastěji Ribavirin, to znamená takové látky, které brání množení virů v rostlině. Třetí metodou je termoterapie, je to metoda, při které se využívá krátkodobě vysoké teploty (37- 40 °C) po dobu 20 - 60 dní. Vysoká teplota brání rychlému množení viru. Poslední čtvrtou metodou je kryoterapie. Metoda doznala v poslední době velkého rozmachu (Wang a Valkonen 2008a). Při této metodě jsou zavirované starší buňky zničeny ultranízkou teplotou a mladé meristematické buňky, které zpravidla přežívají v meristémech bez viróz, jsou schopné po odtání regenerace v nové rostliny. V praxi se ukazuje, že různé metody jsou vhodné pro různé viry a genotypy (Naušová et al. 2008). Vyšší účinnosti odvirování se dosahuje kombinací těchto metod (Senula et al. 2000, Wang et al. 2008; Wang a Valkonen 2008b). Problematické je uchování bezvirózního materiálu. Odvirované rostliny Allium v polních podmínkách jsou velmi brzy reinfikovány a prakticky se jejich stav po roce až dvou letech navrací do původního stavu s celým spektrem virů. Druhou, bezpečnější možností je uchovávání odvirovaných rostlin v technických izolátorech. Snaha je rostliny izolovat od vnějších přenašečů virů a tím získat bezvirózní sadbu. Třetí možností je pěstovat rostliny v aseptických podmínkách in vitro. Pěstování rostlin v in vitro podmínkách dává možnost uchovat rostliny bez virů i bez dalších patogenů. Tato metoda je poměrně pracná, přibližně každého půlroku až roku se musí rostliny 61

přesazovat na čerstvá média. Při tomto způsobu hrozí nebezpečí somaklonální variace, to znamená ohrožení původního genetického potenciálu genotypu. Další metoda pro uchování bezvirózních rostlin je kryoprezervace – uchování zárodečné plasmy rostlin v ultranízkých teplotách. Tato metoda je náročná na přípravu rostlin, ale náklady na skladování jsou po zamrazení nízké. Pomocí metody kryoprezervace, lze skladovat odvirované i neodvirované rostliny (Tab. 1). Výhodou této metody podobně jako metody uchování v in vitro podmínkách je, že rostliny se uchovávají také bez dalších patogenů. Metoda kryoprezervace je vhodná pro dlouhodobé skladování genofondu rostlin bez rizika reinfekce skladovaných rostlin. Česká kryobanka vegetativně množených rostlin (Zámečník et al. 2005) uchovává bezpečně část základní kolekce Allium (Stavělíková a Zámečník 2005, Zámečník a Stavělíková 2005) a uchovává část evropské core kolekce česneků (Zanke et al. 2011). Na obrázku Obr. 2 jsou schematicky vyjádřeny postupy odvirování a možnosti uchování a způsoby skladování odvirovaných rostlin Allium.

způsob ozdravení rostlin Allium od virů extirpace vrcholů

chemoterapie

termoterapie

kryoterapie

způsob uchování ozdravených rostlin Allium polní kolekce

technické izolátory

in vitro

kryoprezervace

reinfekce • viry • bakteriemi • houbami

reinfekce • bakteriemi • houbami

druhotná reinfekce • bakteriemi • houbami

bez hrozby reinfekce

krátkodobý

Obr. 2:

střednědobý

dlouhodobý

Schéma způsobů odvirování rostlin Allium a jejich vhodnosti a doby uchování.

62

ZÁVĚR Závěrem lze konstatovat, že odvirování rostlin Allium nemělo významný vliv na jejich regenerační schopnost po kryoprezervaci. Přínosem této práce je potvrzení možnosti bezpečného skladování genofondu odvirovaných i neodvirovaných rostlin Allium v ultranízkých teplotách pomocí metod kryoprezervace.

LITERATURA FALTUS M., BILAVČÍK A., ZÁMEČNÍK J. (2005). Kryoprezervace a kryobanka zemědělských plodin Úroda, 53, (7), 44-45. HAVRÁNEK P. (1972). Viruprosté klony česneku kuchyňského z meristematických kultur, Sborník UVTI-Ochrana rostlin, 8, 291-298.

získané

KLUKÁČKOVÁ J., Navrátil M., Veselá M., Havránek P., Šafářová D. (2004). Occurence of garlic virues in The Czech Republic Acta fytotechnica et zootechnica, Vol. 7, Special Number, Proceedings of the XVI. Slovak and CzechPlant Protection Conference organised at Slovak Agricultural University in Nitra, Slovakia, 126-128. KOTKOVÁ R., ZÁMEČNÍK J., FALTUS M., HEJNÁK V. (2010). Termická analýza meristematického pletiva česneku 32. Mezinárodní český a slovenský kalorimetrický seminář Univerzita Pardubice, Pardubice, 135-138. NAUŠOVÁ O., KUČEROVÁ Z., ONDRUŠIKOVÁ O., KŘIŽAN B., WASSERBAUEROVÁ L., SOUKUPOVÁ J., KARLOVÁ K., STAVĚLÍKOVÁ H., DUŠEK K. (2008). Zhodnocení účinnosti metody izolace meristému při ozdravování 20 odrůd česneku. Biotechnology, 1, 193-195. SENULA A., KELLER E. R. J., LESEMAN D. E. (2000). Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment of an in vitro collection of garlic (Allium sativum). Acta Horticulturae 530, 121-128. SMÉKALOVÁ K., STAVĚLÍKOVÁ H., DUŠEK K. (2010). Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. Journal of Plant Patology, 96, (1) 273-274. STAVĚLÍKOVÁ H., ZÁMEČNÍK J. (2005). Current status of the long-day Allium collection in the Czech Republic Report of a Vegetables Network International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy, 22-24. WANG Q. C., VALKONEN J. P. T. (2008a). Efficient elimination of sweetpotato little leaf phytoplasma from sweetpotato by cryotherapy of shoot tips. Plant Pathology 57, (2), 338-347. 63

WANG Q. C., VALKONEN J. P. T. (2008b). Elimination of two viruses which interact synergistically from sweetpotato by shoot tip culture and cryotherapy. Journal of Virological Methods, 154, (1-2), 135-145. WANG Q. C., CUELLAR W. J., RAJAMAKI ML., HIRATA Y., VALKONEN J. T. (2008). Combined thermotherapy and cryotherapy for efficient virus eradication: relation of virus distribution, subcellular changes, cell survival and viral RNA degradation in shoot tips. Molecular Plant Pathology 9, (2), 237-250. ZÁMEČNÍK J., BILAVČÍK A., FALTUS M., SKLÁDAL V. (2005). Provoz kryobanky In: Faberová, I. (ed.) Konzervace a regenerace genetických zdrojů vegetativně množených druhů rostlin a Dostupnost a využívání genetických zdrojů rostlin a podpora biodiversity Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha, Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha, 41-45. ZÁMEČNÍK J., FALTUS M., BILAVČÍK A. (2007). Cryoprotocols used for cryopreservation of vegetatively propagated plants in the Czech cryobank. Advances in Horticultural Science, 21,(4), 247-250. ZÁMEČNÍK J., FALTUS M., BILAVČÍK A., KOTKOVÁ R. (2012). Comparison of Cryopreservation Methods of Vegetatively Propagated Crops Based on Thermal Analysis. In: I. Katkov (ed.) Current Frontiers in Cryopreservation, 333-358. ZÁMEČNÍK J., FALTUS M., KOTKOVÁ R., HEJNÁK V. (2011). Glass Transition Determination in Allium Shoot Tips after Dehydration. Acta Horticulturae, 7777, (908), 33-38. ZÁMEČNÍK J., STAVĚLÍKOVÁ H. (2005). Možnosti kryokonzervace zelenin rodu Allium In: Faberová, I. (ed.) Konzervace a regenerace genetických zdrojů vegetativně množených druhů rostlin a Dostupnost a využívání genetických zdrojů rostlin a podpora biodiversity Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha, Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha, 64-69. ZÁMEČNÍK J., ŠESTÁK J. (2011). Constrained states occuring in plants cryoprocessing and the role of biological glasses In: Šesták, J., Mareš, J. J., Hubík, P. (ed.) Glassy, amorphous and nano-crystalline materials: thermal physics, analysis, structure, and properties. Springer Science Business Media B.V., Dordrecht, 291-310. ZANKE C., ZÁMEČNÍK J., KOTLINSKA T., OLAS M., KELLER J. E. (2011). Cryopreservation of Garlic for the Establishment of a European Core Collection. Acta Horticulturae, 7777, (908), 431-438.

64

KONTAKT e-mail: [email protected]

PODĚKOVÁNÍ Výsledky projektu QH71228 a MZE 00027006 jsou prezentovány díky finanční pomoci projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043.

65

11. CO NÁM DNES MOHOU POTRAVINOVÉ DOPLŇKY?

NABÍDNOUT

ČESNEKOVÉ

BŘEZINOVÁ JANKA , MUDr., Internista a praktický lékař SOUHRN Již po staletí byl česnek důležitou součástí každodenního života mnoha kultur, nejen jako koření, ale i pro své širokospektré preventivně-léčebné účinky. Dietní faktory hrají klíčovou roli ve vývoji různých lidských onemocnění včetně kardiovaskulárních onemocnění. Po více než 5000 let používání česneku v tradiční medicíně přináší současná věda důkazy, že česnek je úžasný zdroj fytochemikálií, které prospívají zdraví a patří mezi nejlevnější způsoby prevence kardiovaskulárních onemocnění. Vyzrálý česnekový extrakt dosavadním výzkumem prokazuje, že je hodnotnějším zdrojem nutrientů než syrový česnek, aniž by způsoboval dyspeptické potíže a minimalizuje vedlejší efekt ve formě „česnekového dechu“. Cílem sdělení je podat co nejucelenější přehled užívaných forem česnekových doplňků stravy s prezentací účinných látek a odkrýt jejich nepříliš známý mechanismus účinku. KLÍČOVÁ SLOVA: česnek, vyzrálý česnekový extrakt, organosirné sloučeniny, prevence kardiovaskulárních onemocnění HISTORICKÉ OHLÉDNUTÍ ZA POUŽITÍM ČESNEKU NEBOLI MEDICÍNA ZALOŽENÁ NA ZKUŠENOSTECH Když jsem dokončovala tento článek, udělala jsem si přestávku k posilnění. Hned při vstupu do hypermarketu jsem zkoprněla, byl tam hluk jak na fotbalovém stadionu. Po chvilce jsem zjistila, že to není množstvím lidí, ale pouze dva chlapíci na sebe halekali, co zakoupí k posilnění. Jeden z nich, pěkně zarostlý, pravil: „hele česnek, životabudič…ten mi stačí…“ Česnek je obdivuhodná rostlina, která doprovází lidstvo od dávných dob. Je fascinující sledovat, jak kultury, které nikdy nepřišly do kontaktu, došly ke stejným závěrům o roli česneku jako léčivé rostlině, která dovede předcházet nemocem a léčit mnoho neduhů. Neohrnujme nos nad lidovou moudrostí, může nám poskytnout cennou lekci, která z pohledu současné medicíny může odkrýt starou, dříve nepostřehnutelnou funkční souvislost spolu podmiňující úspešnost léčby a stát se dobrým společníkem v prevenci onemocnění. Nejčasnější odkazy na tuto léčivou rostlinu jsou k dispozici na hliněných sumerských tabulkách z roku 2600–2100 před naším letopočtem. Nejstarší česneková tradice v oblasti Středozemního moře je egyptská, kde byl hojně používán v boji proti střevním nemocem, ale i jako stimulans a mobilizátor energie při těžké manuální práci. Řecký historik Herodotos popisuje ve světě první zaznamenanou stávku, když dělníci na stavbě největší pyramidy v Gize nedostali svůj příděl česneku, protože Nil zaplavil česneková pole. Hippokrates, Galén, Plínius starší a Dioscorides zmiňují jeho použití pro mnoho účelů včetně 66

antiparazitárních a diuretických účinků. Dokonce Galén velebí česnek jako „všelék“ a když se dostanete při čtení tohoto článku k odstavci „Dokáže česnek ovlivnit ..“, uznáte, že pojem, který použil, není nadhodnocen. Je známo, že během prvních olympijských her v Řecku sportovci pro zvýšení vytrvalosti používali česnek. Talmud, svaté písmo Izraelitů, o česneku říká: „sytí, zahřívá tělo, vyhání červy, množí sperma, obličej po něm září.“ Pro jeho rozmanitou účinnost se mu přikládaly i magické účinky, nosily se na těle, zavěšoval se na dveře, taktéž se potíral na komíny i na klíčové dírky. Indický starověký lékařský text Charaka-Samhita doporučuje česnek pro léčbu onemocnění srdce a pro artritické potíže. V hinduismu je česnek považován za jakýsi elixír mládí a nástroj pro zvýšení touhy. V Evropě mnoho kultur používalo česnek jakou bílou magii, snad kvůli jeho reputaci jako účinného prostředku na různé zdravotní peripetie. Nejstarší evropské nálezy hliněných nádob s česnekem byly právě u nás, v blízkosti Kyjova. V polovině 19. století zkoumal jeho antibakteriální účinky Louis Pasteur a vojenští lékaři česnekem léčili poranění způsobená na válečném poli. Na začátku 20. století byl někdy používán i v léčbě plicní tuberkulózy. Ale až v roce 1944 byla objevena italským vědcem Cavallitem žijícím ve Spojených státech sloučenina, kterou pojmenoval allicin, a která je zodpovědná za antibiotické působení česneku. Česnek a stejně tak i přípravky z něj vyrobené jsou stále předmětem výzkumu, který potvrzuje jeho další a další pozitivní účinky na naše tělo a utvrzuje nás v tom, že příroda nám poskytla jeden z nejúčinnějších přírodních prostředků v boji s civilizačními nemocemi. K dnešnímu dni máme k dispozici řadu příznivých experimentálních a klinických prací, které dokládají, že složky česneku mohou poskytovat podporu pro lepší kardiovaskulární funkce, také disponují nezanedbatelným imunomodulačním efektem, antioxidační a antikancerogenní aktivitou, ale taktéž je cenný jejich účinek hepatoprotektivní a neuroprotektivní. Pro vysvětlení takto širokospektrých účinků česnekových složek je nutno osvětlit, že zasahují do iniciálních fází rozvoje zánětlivých změn. NENÍ ČESNEK JAKO ČESNEK, NEBO-LI PRO ZAČÁTEK PÁR FAKTŮ K SAMOTNÉ SUROVINĚ A ZPRACOVÁNÍ Rod Allium zahrnuje asi 600 botanických druhů, které kromě podobných morfologických znaků mají společnou tvorbu éterických olejů, jejichž podstatou jsou složité sirné vazby. Česnek je tvořen 65 % z vody, přičemž sušinu tvoří sloučeniny síry, proteiny, vláknina, interna fruktóza a volné aminokyseliny. Kromě toho je zde obsaženo i velké množství saponinů, fosforu, draslíku, síry, zinku, selenu, taktéž vitaminů, zejména ze skupiny B. Naprostá většina obsažených látek je hydrofilní povahy (97%). Česnek obsahuje nejméně čtyřikrát více síry než cibule, brokolice a květák. Obsah účinných látek ve stroužcích česneku kolísá při změně teploty, délky dne, vodního režimu, atd. Jako zásadní faktor účinnosti je jeho genetická „výbava“ a půdní podmínky, ve kterých se česnek pěstuje. Zkušenosti ukazují, že při nešetrném sušení a 67

nevhodném uskladnění sušený česnek rychle ztrácí svoji účinnost. Lze jednoduše konstatovat, že není česnek jako česnek. Pro zachování zdravotních účinků je důležité brát ohled také na šetrnou přípravu. Česnek ztrácí účinnost, jestliže je vysokou teplotou deaktivován enzym alliináza. Tím se zabrání vzniku allicinu, který je hlavní účinnou sirnou sloučeninou. Allicin je sloučenina, která se rychle rozpadá při zahřívání, takže příznivé účinky se snižují. Vaření urychluje jeho degradaci a mikrovlnky ničí allicin úplně. Je nutno také připomenout, že spořádání česneku ve velkém množství může být spojeno se značnými dyspeptickými potížemi, dlouhotrvajícím zápachem česneku z dechu a potu, což jsou hlavní limitující faktory pro jeho konzumaci. Pro zachování účinnosti se česnek často uchovává v tucích, česnekové máslo je dávno známým způsobem úpravy v jižních zemích, v těchto oblastech není česnek tolik štiplavý pro svůj rychlý růst. U nás bylo oblíbené nakládání česneku do octa nebo vmíchání do mléka s medem. Dokonce existuje patentovaná receptura česnekového chleba. Ovšem komu by se chtělo v dnešní době každý den oloupat pár stroužků česneku, rozkousat a několik hodin být „sociálně nepoužitelný“. Cílem současné farmacie je na přirozené úrovni poskytnout produkt se stabilizovaným účinkem a potlačením vzpomínaného vedlejšího efektu na minimum. Přirozenou úrovní mám tady na mysli nepřidávání synteticky vyrobených určitých složek, které někteří výrobci pro usnadnění výroby používají. K dispozici máme několik forem česnekových potravinových doplňků, které se mohou výrazně lišit v obsažených sloučeninách prospěšných pro zdraví. Opět upozorňuji na fakt, že u česnekových potravinových doplňků je zcela zásadní původ suroviny a způsob přípravy. Tablety jsou zhotovovány ze suché česnekové moučky nebo sušených extraktů s různými přísadami. Jsou slisovány a obalovány povlaky, které mají vzdorovat žaludečním šťávám, aby byl obsah uvolňován až v tenkém střevě. Jako přísady bývají voleny extrakty jiných rostlin (hloh, jmelí, chmel, třezalka, aj.), které často limitují účinky česneku. Kapsle jsou zpravidla želatinové, obsahují pouze lipofilní organosirné sloučeniny. V olejových přípravcích nejsou obsaženy sloučeniny rozpustné ve vodě, proto při objasnění mechanism účinku těchto důležitých sloučenin pochopíme, že tyto formy potravinových doplňků jsou „ochuzeny“ o zdraví prospěšné účinky. Pro farmaceutické zpracování je nutné česnek dokonale zbavit slupek, což je značně nákladné a tato část procesu zpracování je velmi náročná na čistotu. Tímto procesem zpracování prochází také výroba další formy, tinktury, která bývá připravována z čerstvého nebo sušeného česneku vodní nebo alkoholickou macerací. Výroba tinktur (macerace) umožňuje nejvyšší možnost zachování obsahu účinných látek. Výsledkem macerace česneku po několika týdnech je vyzrálý česnekový extrakt, který se stal slibným předmětem současného experimentálního i klinického zkoušení. Pozitivním efektem přidání lihu je inaktivace allinázy, tím si lihové tinktury zpravidla déle uchovávají aktivitu. 68

Obsah biologicky aktivních organosirných sloučenin (jak ve vodě rozpustných, tak v lipidech rozpustných) je relativně vysoký, protože jsou „vyráběny v procesu zrání“. Proces „zrání“ v některých případech, i když se jedná vlastně o potravinu, může přinést léčivé vlastnosti a tímto postupem můžeme poskytnout tělu více prospěšných látek než u syrového česneku a dalších forem česnekových doplňků. Během „zrání“ se sirné sloučeniny totiž dále transformují, takže jejich skladba a obsah jsou odlišné než v syrovém česneku. Transformací vznikají sirné sloučeniny: gamma-glutamyl cystein, Sallyl cystein (SAC), S-allyl mercaptocysteine a S-methyl cystein, které nejsou přítomny v syrovém česneku ani v česnekových olejích, tabletách a želatinových kapslích. Rozdíl nespočívá jen v účinnosti dané obsahem účinných látek, ale jistě také ve vstřebatelnosti účinných látek do krevního oběhu (umocněna lihem) a lepší adherenci, díky rychlejší vstřebatelnosti, potažmo rychlejšímu ústupu odéru z dutiny ústní. DOKÁŽE ČESNEK OVLIVNIT VZNIK KARDIOVASKULÁRNÍCH ONEMOCNĚNÍ? POTVRZENO! Řada in vitro studií prokazuje, že česnek může modulovat faktory spojené s kardiovaskulárními nemocemi, tj. inhibuje klíčové enzymy zapojené do syntézy cholesterolu, snižuje shlukování krevních destiček a formaci trombů, zvyšuje fibrinolýzu, pomáhá regulovat cévní tonus a navyšovat antioxidační aktivitu. Ochranný účinek česneku proti ateroskleróze byl přičítán jeho schopnosti snižovat obsah tuků v cévní stěně. V řadě preklinických studií (studie s lidskými HepG2 buňkami či tkáňovými kulturami potkaních hepatocytů) bylo prokázáno, že látky obsažené v česneku jsou schopny poměrně výrazné inhibice klíčových enzymů důležitých v syntéze endogenního cholesterolu a mastných kyselin. Přímým měřením tak bylo možno pozorovat negativní účinek na squalen monooxygenázu či 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA, který dokáže SAC, obsažen pouze ve vyzrálém česnekovém extraktu, deaktivovat až o 41 %. Po požití česneku bylo zaznamenáno také zvýšené vylučování cholesterolu, projevující se zvýšeným vylučováním kyselých a neutrálních steroidů. Jedním z podstatných antiaterogenních účinků česneku je potlačení oxidační modifikace LDL (ox-LDL), tento nález byl publikován již v 1999 v časopisu Atherosclerosis. Srovnával denní příjem 6 g syrového česneku nebo 2,4 g vyzrálého česnekového extraktu po dobu jednoho týdne. Účinek byl následně potvrzen Benjaminem, který in vitro pozoroval větší míru potlačení ox-LDL při užívání interna 181 182 vyzrálého česnekového extraktu než při užívání syrového česneku, Journal of Nutrition, 2002. Tento nález byl natolik zajímavý, že v červnu 2008 kolektiv autorů z Taiwanské univezity pronikl hlouběji pod povrch a zkoumal, jakým mechanismem může česnek ovlivňovat tento krok, který hraje důležitou roli v iniciaci a progresi aterosklerózy. V této studii deklarovali, že allyl sulfidy, zejména DADS (diallyl disulfide) a DAT (diallyl trisulfide) účinně potlačují ox-LDL, a že by to mohlo být přičítáno jejich downregulaci cytoadhezinů. Adhezivní molekuly včetně VCAM-1 a E-selektinu jsou rozhodující v interakcích mezi monocyty a vaskulárními endoteliálními buňkami, vedou k nakupení 69

cirkulujících monocytů na vaskulární endoteliální buňky, tj. iniciační krok v kaskádě aterosklerotických změn. Navíc tento efekt, tady zmíněno poprvé, je zprostředkován přes intracelulární signální dráhy PI3K/PKB a PKA/CREB, které regulují množství apoptotických proteinů, transkripčních faktorů a podílejí se na regulaci buněčného cyklu, diferenciaci či migraci buněk. Pokud jsou vaskulární endoteliální buňky vystaveny ox-LDL, dochází ke zvýšení apoptózy. Tyto nálezy poskytují náhled na molekulární mechanismus působení DADS a DAT na ochranu cév před ox-LDL, která spouští aterosklerózu a následně vyústí v aterotrombotické cévní komplikace. Přikládám ještě dva neméně zajímavé nálezy na molekulární úrovni, které prezentují antioxidační aktivitu vyzrálého česnekového extraktu. První, SAC zvyšuje intracelulární antioxidanty, zejména glutathion peroxidázu, a tím zabraňuje uvolňování peroxidu z endoteliálních buňek při indukovanémpoškození oxidačním stresem. Druhý, organosirné sloučeniny, zejména SAC, má schopnost potlačovat aktivaci nukleárního faktoru κB (NF-κB), jehož úkolem je ovlivňovat expresi genů důležitých pro imunitu, zánětlivou odpověď, buněčný růst a buněčnou smrt. Aktivace NF-κB je přísně regulována a dochází k ní především pomocí receptorů pro cytokiny TNF-α či IL-1. Je experimentálně prokázáno, že organosirné sloučeniny dokáží měnit poměr těchto cytokinů. Po navázání zmíněných cytokinů se spouští signalizační cesta, která způsobí rozklad inhibitoru I-κB. To umožní oxidačněredukčním transkripčním faktorům vstoupit do jádra a regulovat přepis určitých genů. Experimentální důkazy ukazují schopnost ochrany proti radiační a chemické expozici a dlouhodobému toxickému poškození. Za antioxidační účinky česneku, podle některých autorů, mohou být zodpovědné také flavonoidy, zejména allixin, jehož fenolické hydroxylové skupiny poskytují antioxidační aktivitu, N-fruktosyl glutamát, Nfruktosyl arginin a taktéž selen, který je v česneku bohatě zastoupen. S nadsázkou by se dalo říct, že česnek obsahuje bohatý „antioxidační koktejl“. Systematické review z roku 2003, zabývající se vlivem česneku na hladinu plazmatických lipidů, hodnotilo celkem 10 studií, v 6 zjištěn pozitivní vliv na pokles celkového cholesterolu plazmy. Průměrný zjištěný pokles celkového cholesterolu i triacylglycerolů se pohyboval kolem 9,9 % a pokles LDL o 11,4 %. Analogického účinku bylo dosaženo i v předchozí metaanalýze, od roku 1975 bylo z Medline databáze zahrnuto 46 většinou randomizovaných, dvojitě zaslepených, placebem kontrolovaných studií u hyperlipidemických subjektů po dobu 4–16 týdnů. Většina z těchto studií ukázala významné snížení hladiny cholesterolu a triglyceridů v séru a u jedné třetiny byly zaznamenány významné příznivé změny v LDL-cholesterolu, 11–26 % snížení. Několik studií s použitím sušeného česneku neprokázalo žádné hypolipidemické účinky. Rozpor mezi klinickými studiemi může být způsoben různými formami česneku (česnekový prášek, vyzrálý česnekový extrakt nebo česnekový olej), obsahem účinných látek a jejich biologickou dostupností, nedostatečnou randomizací, použitím různých metod analýzy dyslipidemie, životním stylem, dietou, atd. Nabízí se prostor pro 70

sestavení sofistikovanějšího klinického zkoušení včetně mortalitní studie, kde by byly česnekové přípravky standardizované. Nicméně, i když dosavadní výsledky neposkytují čísla, jak jsme zvyklí očekávat od používané dyslipidemické farmakoterapie, při dnešním trendu kombinační terapie na poli kardiovaskulárních a cerebrovaskulárních onemocnění by měl být další pozitivní přínos s minimálními nežádoucími účinky jedině vítán. Gama-glutamyl cysteiny jsou hydrofilní sloučeniny česneku, které mohou snižovat krevní tlak díky jejich schopnosti inhibovat angiotensin I-konvertující enzym in vitro. Dalším „spolupracujícím“ efektem, zjištěným v experimentálních modelech, bylo zvýšení produkce oxidu dusnatého (NO) uvolňovaného endotelem za přispění argininu, který je součástí bez-sirných složek česneku. 2,86 g/kg česneku dočasně zvýšilo produkci NO o 30–40 % od 15 do 60 minut po podání p.o. K antihypertenznímu efektu přispívá ještě zvýšení cyklického guaninmonofosfátu (cGMP), který u hladkých svalů cév vede k jejich relaxaci. Na zvířecích modelech bylo demonstrováno snížení krevní tlaku o 10 až 50 mmHg v dávce 2,5 mg až 25 mg/kg vyzrálého česnekového extraktu. Metaanalýzy zveřejněné v roce 1994 prezentovaly slibné výsledky u pacientů s mírnou hypertenzí, ale nestačilo to k tomu, aby se česnekové doplňky dostaly doporučení pro klinickou praxi léčby hypertenze. Rostoucí využívání doplňků stravy vedlo k sestavení v pořadí druhé metaanalýzy, která vycházela z Medline, Embase a Cochrane databáze ze studií publikovaných mezi lety 1955 až 2007. Jedenáct z 25 studií splňovalo kritéria pro zařazení do metaanalýzy pro zhodnocení vlivu česneku na krevní tlak, kde česnekové přípravky byly podávány nejméně 4 týdny. Metaanalýza všech studií ukázala průměrný pokles o 4,6 ± 2,8 mmHg pro systolický krevní tlak ve skupině s česnekovými přípravky, zatímco průměrný pokles v hypertenzní podskupině byl 8,4 ± 2,8 mmHg pro systolický krevní tlak a 7,3 ± 1,5 mmHg pro diastolický krevní tlak. Výsledky naznačily, že aplikace česnekových doplňků může být nápomocna u subjektů s mírnou hypertenzí a postavily závěry, že pro EBM je nutno sestavit důslednější design a analýzu klinických studií. Že česnek může mít protidestičkovou aktivitu bylo reportováno již v roce 1981 v Lancetu. Protidestičkový mechanismus česneku je zprostředkován interna několika organosirnými sloučeninami, které vstupují v různých fázích do procesu agregace destiček. Usuzuje se, že česnek inhibuje agregaci krevních destiček různými mechanismy. Na aktivaci agregace krevních destiček se podílí přechodné zvýšení volného vápníku v cytoplasmě Ca2+, tromboxanA2 a aktivace receptoru fibrinogenu GPIIb/IIIa. Ostatní modulátory se také podílejí na shlukování krevních destiček a zahrnují lipoxygenázy metabolitů, protein kinázu C, cyklický adenosin monofosfát (cAMP), guanin cyklický monofosfát (cGMP) a oxid dusnatý (NO). In vitro studie naznačují, že česnek brání inhibici agregace krevních destiček potlačením cyklooxygenázy a lipoxygenázy, čímž dochází k inhibici syntézy tromboxanu A2 a 12HETE. Ajoene se zdá být hlavní organosirnou antiagregační sloučeninou, silně inhibuje metabolismus kyseliny arachidonové potlačením cyklooxygenázy a lipoxygenázy. Dále potlačuje mobilizaci vnitrodestičkového Ca2+ a zvýšením hladiny cAMP a cGMP 71

přispívá dalším mechanismem k inhibici destiček. Česnek také díky aktivaci NOsynthasy (NOS) může komunikovat přímo s GPIIb/IIIa receptory, čímž se snižuje schopnost krevních destiček se vázat na fibrinogen. Nejvíce konzistentních výsledků účinků s česnekovými přípravky bylo dosaženo v antiagregačních studiích, kde snížení agregace trombocytů bylo v 7 ze 7 klinických studií.

ZAMYŠLENÍ NA ZÁVĚR Dle dat z ESC (Evropského kardiologického kongresu) 2011 z Paříže, kde zazněla varovná čísla, více než 2 miliony obyvatel Evropské unie zemře v důsledku kardiovaskulárních onemocnění a odhad je, že celkově stojí KVO ekonomiku EU 192 miliard eur ročně. Je načase se nejen teoreticky a akademicky zajímat o primární prevenci KVO! Sekundární prevence je finančně náročná, životní styl populace se spíše zhoršuje, než zlepšuje, takže je na nás povzbuzovat své klienty v každodenní praxi, aby již nyní pozitivně ovlivňovali farmakologickým či nefarmakologickým přístupem svůj zdravotní stav (optimální by byl stav s větší podporou pojišťoven). Když jsem u těch pojišťoven, tak jsem si vzpomněla, kde ten příběh s mojí pravidelnou aplikací vyzrálého česnekového extraktu začal. Můj bratr, s anamnézou Gilbertova syndromu, žádal o prodloužení zdravotní komerční pojistky v zahraničí a bylo mu sděleno, že předložené laboratorní výsledky nemohou být jeho. Byl požádán, aby se na kontrolu dostavil do laboratoře doporučené pojišťovnou, která potvrdila normalizaci jaterních funkcí. Učinil, při svém rychlém životním tempu, pouze jednu nepatrnou změnu, pravidelně aplikoval vyzrálý česnekový extrakt ALLIVICTUS českého původu. Sdělením jsem chtěla poodkrýt, pro nás lékaře, prozatím ne moc známou paletu možností některých potravinových doplňků. Za odmítavým postojem k této intervenci je častokrát naše neznalost. Je dobré si uvědomit, že i dříve používané prostředky našich předků nám mohou nabídnout pomocnou ruku, pokud budeme vybírat pouze potravinové doplňky se znalostí účinku, který je potvrzen vědeckým výzkumem. I v ČR je na trhu dostupný vyzrálý česnekový extrakt, jediný, který analýzami ze státních akreditovaných laboratoří deklaruje komplexní obsah blahodárně působících organosirných sloučenin. Jeho bonusem je, že i při pravidelné aplikaci nebudete cítit česnekem z dechu ani z potu. LITERATURA BANERJEE S. et al. (2004): Effect of garlic on cardiovascular disorders: a review. J. Nutr.; 1: 4. BOREK C. (2001): Antioxidant Health Effects of Aged Garlic Extract. J. Nutr.; 131: 1010; S–1015S. KEISS H-P. et al. (2003): Garlic (Allium sativum L.) modulates cytokine expression in lipopolysaccharide-activated human blood thereby inhibiting NF-κB Activity. J. Nutr.; 133:2171–2175. 72

IDE N. et al. (2001): Garlic compounds minimize intracellular oxidative stress and inhibit nuclear factor-kappa b activation. J. Nutr.; 131 (3s): 1020S–6S. LIU L, YEH YY. (2002): S-alk(en)yl cysteines of garlic inhibit cholesterol synthesis by deactivating HMG-CoA reductase in cultured rat hepatocytes. J. Nutr.; 132: 1129–34. MORIHARA N. et al. (2002): Aged garlic extract enhances production of nitric oxide, Life Sci.; 2002 Jun 21; 71 (5): 509–17. RAHMAN K. (2000): Effects of garlic on platelet biochemistry and physiology. Mol. Nutr. Food Res. 2000–Nov; 51 (11): 1335–44. RIED K. et al. (2008): Effect of garlic on blood pressure: A systematic review and meta--analysis, BMC Cardiovasc Disord.; 8:13. YEN-PING LEI et al. (2008): Diallyl Disulfide and Diallyl Trisulfide Suppress Oxidized LDL–Induced Vascular Cell Adhesion Molecule and E-Selectin Expression through Protein Kinase A– and B–Dependent Signaling Pathways, J. Nutr. 138: 996– 1003.

73

12. METEOROLOGICKÝ ZÁZNAM POČASÍ ČESKÝ HYDROMETEOROLOGICKÝ ÚSTAV ČHMÚ, POBOČKA OSTRAVA

OBDOBÍ: prosinec 2010 (Tab. 1; Tab. 7) leden 2011 (Tab. 2; Tab. 7) únor 2011 (Tab. 3; Tab. 8)

prosinec 2011 (Tab. 4; Tab. 9) leden 2012 (Tab. 5; Tab. 9) únor 2012 (Tab. 6; Tab. 10)

74

Partnerská síť v oblasti speciálních plodin, registrační číslo projektu CZ.1.07/2.4.00/12.0043 Tato akce je spolufinancována z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky.

75

Regionální centrum Olomouc

Recommend Documents