RADIOIMUNOLOGICKÉ METODY (RIA, IRMA) ÚVOD Imunoradioizotopové metody se vyznačují především vysokou citlivostí a specificitou. Pomocí nich je možné stanovit teoreticky každou látku, proti které lze připravit odpovídající protilátku. Vzhledem k vysoké specificitě lze provést stanovení v prakticky jakékoliv analytické matrici. V úvahu přicházejí především vzorky krevního séra, mozkomíšního moku, moči, či dalších tělních tekutin nebo tkáňových extraktů. Citlivost metody se pohybuje v řádu nanogramů až pikogramů. Výčet výhod uvedené metody lze dále doplnit o konstatování, že potřebné množství vzorku pro analýzu je velmi malé (obvykle 10 - 100 µl) a praktické provedení je relativně jednoduché. Metoda dovoluje zpracování velkých sérií vzorku a částečnou automatizaci. K nevýhodám lze naopak uvést, že specifita za určitých podmínek nemusí být absolutní a mohou se vyskytnout konkurenční imunochemické reakce (zkřížená reaktivita) a konečně imunoreaktivita radioaktivně značené molekuly nemusí být identická s molekulou neznačenou. V úvahu je nutné vzít i fakt, že se v případě protilátek jedná o molekuly s biologickou aktivitou, která klesá v přítomnosti zdroje ionizujícího záření především v důsledku radiolytických procesů, které vedou k destrukci či modifikaci původně použitého skeletu. Vlastní inkorporace radioaktivní značky může rovněž snížit biologickou aktivitu a imunoreaktivitu molekuly, ať už přítomností nově vázaného atomu či skupiny atomů nebo, což je častější případ, může být snížení bioaktivity způsobeno interakcí chemických činidel použitých pro zavedení atomu radionuklidu do biosubstrátu. Vlastní stanovení vychází ze specifické vazby mezi látkou (antigenem) a protilátkou (imunochemický princip) a z následující úvahy: Proti stanovované látce X máme připravenu specifickou protilátku A a zároveň máme připravenu radioaktivně značenou látku X (X*). Při smíchání roztoků obsahujících látku X a protilátku A vznikne specificky komplex A-X, v případě značené látky analogicky komplex A-X*, přičemž rovnovážné konstanty pro oba děje jsou shodné. Pokud tedy připravíme komplex A-X* a k němu přidáme roztok obsahující stanovovanou látku X dojde k vytěsnění části molekul X* a tím pádem vznikne z původního A-X* komplex A-X (neznačený). Čím vyšší bude koncentrace přidané látky X, tím menší hodnota radioaktivity bude obsažena v komponentách obsahujících protilátku, které nakonec slouží k vlastnímu vyhodnocení. Vlastní analytický systém je založen na konstrukci kalibrační závislosti, která sleduje závislost množství radioaktivity v komplexu s protilátkou na množství přidané stanovované látky. Kromě protilátky A a značené látky X* je tedy třeba mít sadu standardů látky X o definované koncentraci. Při praktickém provedení se potom postupuje tak, že do sady zkumavek se vnese vždy stejné množství značené látky (aktivita) a protilátky A (koncentrace) tak, aby se ca. 70 - 80 % X* mohlo vázat s protilátkou A. Do takto připravených zkumavek se přidají jednak roztoky o známé koncentraci látky X a jednak roztoky, kde se koncentrace látky X má stanovit. Po ustavení rovnováhy se oddělí směs komplexů A-X* a A-X (v principu stačí oddělit A-X*, což je však od A-X nerozlišitelné) a stanoví se množství radioaktivity (cpm). Samotné oddělení imunochemického komplexu je pro zdárné provedení zásadní a lze ho dosáhnout buď fyzikálněchemickými či imunochemickými metodami. Fyzikálně-chemické metody zahrnují např. ionexovou (separace na základě iontové výměny) či gelově permeační chromatografii (dělení podle molekulové hmotnosti), elektroforetické metody či adsorpci nízkomolekulárních složek na sorbentech. Častější a výhodnější je použití imunochemické separace, kdy se přídavkem další protilátky (As) specifické pro určitou vazebnou oblast protilátky A (jiná než se využívá pro vlastní ligand-vazebné stanovení), sráží nerozpustný komplex As-A-X*, který lze ze vzorku - roztoku snadno separovat centrifugací. Existuje řada modifikovaných postupů, kdy je sekundární protilátka vázána na sorbent a vzniká tzv
imunosorbent, který lze lépe separovat, ať už centrifugací nebo prostou filtrací či odsátím mikrofritou. Výrazný pokrok byl dosažen zavedením polystyrenových zkumavek potažených protilátkou (A), kdy výsledný komplex A-X* je imobilizován na stěnách zkumavky a přebytečné reaktanty stačí pouze ze zkumavky odsát, případně prázdnou zkumavku promýt vhodným roztokem (tzv. RIA na pevné fázi, solid-phase radioimmunoassay). Přestože stanovení metodou RIA je v současné době založeno na použití komerčně dodávaných souprav obsahující kompletní sadu reagencií a protilátkou potažených zkumavek, je vhodné poukázat na některé teoretické aspekty vlastní konstrukce RIA stanovení. a) Příprava protilátek Živé organismy reagují na řadu xenobiotických podnětů tvorbou protilátek. Tento jev je součástí biologického informačního systému živých organismů. Látky, které navozují takovou imunitní odpověď se nazývají antigeny a jejich funkční formy imunogeny. Obecně se imunogen skládá z makromolekulárního nosiče, ať už umělého, nebo syntetického původu, nízkomolekulárních sloučenin nazývaných hapteny a antigenních determinant. Nízkomolekulární sloučeniny (hapteny) v tomto smyslu často působí ve funkci antigenního determinantu. Z uvedeného vyplývá, že ke konstrukci imunogenu je nutné připravit makromolekulární (polymerní nosič) a na něj kovalentně vázat nízkomolekulární látku. Metodika tohoto postupu přesahuje rámec zjednodušeného výkladu, nicméně je třeba si uvědomit, že použitou nízkomolekulární látkou je právě taková molekula, proti které chceme připravit protilátky. Vlastní proces imunizace spočívá v jednorázové či opakované injekci imunogenu ve vhodném adjuvans do živého organismu (myš, králík, slepice) a po určité době (většinou měsíce) se izolují protilátky. Získaná surová protilátka se čistí a její imunoreaktivita se stanoví na základě její afinity k výchozímu imunogenu či haptenu. Na uvedených principech jsou založeny i další modifikace RIA metody, jako např. použití značené protilátky ke kompetitivnímu stanovení definované sloučeniny v biomatrici, jako je např. stanovení trijodtyroninu popsané v návodu 2 (Free T3-RIA). b) Zavedení radioaktivního atomu do molekuly I když principielně je možné pro značení stanovované molekuly použít jakýkoli radionuklid, v praxi a komerčních soupravách se používá především 125I, v některých případech i 3H. Zavedení 3H do molekuly znamená buďto izotopovou výměnu nebo syntézu z tritiovaného prekursoru, zavedení 125I do molekuly bývá podstatně jednodušší v případech, kdy značená molekula obsahuje aromatické jádro. Pro jodace takových molekul byla vypracována řada postupů, které jsou jednoduché a zahrnují v principu dva kroky, první jodační a druhý separační, kdy je z jodační směsi izolována potřebná jodovaná látka. Jodační krok pro zavedení halogenového atomu na aromatické jádro spočívá v in situ generování elektrofilu I+ z komerčně dodávaného Na125I a provádí se několika způsoby. Prvním je tzv. chloraminová metoda, kdy je oxidační schopnost chloraminu využita k oxidaci I- na I+. Reakce se provádí v alkalickém pufru, přičemž hodnota pH pro optimální výtěžek se liší v závislosti na typu aromátu resp. zbytku značené molekuly. Obdobnou reakcí je proces využívající komerčně dodávaný Iodogen, který je ve vodě a pufrech nerozpustný, před reakcí se sorbuje na stěny reakční nádoby a ukončení reakce lze provést přenesením reakční směsi do jiné Iodogenem neimpregnované nádoby. Jemnou metodou je použití laktoperoxidasy. V souvislosti s oxidačním prostředím je nutné vzít v úvahu i fakt, že mnohé biomolekuly mohou být v průběhu reakce oxidačně poškozeny a ztrácet imunoreaktivitu. Řešením je poměrně krátký čas jodační reakce (řádově v sekundách), či použití jemnější metody např. s enzymem laktoperoxidasou. Separace značené látky se provádí chromatografickými metodami (LC, HPLC) na vhodných sorbentech (u velkých molekul gelová filtrace, u malých molekul chromatografie na C-18 sorbentu). c) Měření radioaktivity
Vyhodnocení radioaktivity se provádí běžnými detekčními metodami. Pro β-zářiče je nejvýhodnější kapalinová scintilace (LSC), pro γ-zářiče se nejčastěji používá detektor NaI(Tl) ve studnovém uspořádání. Na principu těchto metod jsou založeny i jednoúčelové přístroje pro RIA stanovení vybavené automatickými vyhodnocovacími systémy. d) Vyhodnocení kalibrační závislosti Přestože existuje řada počítačových programů pro konstrukci kalibrační křivky a vlastní vyhodnocení, lze poměrně jednoduše výsledky vyhodnotit na základě manuální konstrukce uvedené závislosti. Lze rovněž použít běžně dostupné programy pro konstrukci křivek ze zadaných bodů jako např. Origin nebo Excel. Nejjednodušší vyhodnocení je pomocí lin-lin závislosti, kdy na osách se v lineárním měřítku vynáší koncentrace a naměřený počet impulsů (x = koncentrace, y = imp/min). Pro odečítání v okrajových oblastech je však křivka příliš strmá (hyperbola) a tak další transformace vedou k částečné linearizaci vztahu koncentrace x naměřený počet impulsů. Lepších výsledků lze dosáhnout v log-lin závislosti (koncentrace v logaritmickém měřítku na ose x). Hodnota počtu impulsů se vynáší buďto jako taková, nebo se transformuje poměrem B/B0, (B-N)/(B0-N), ((B-N)/(B0-N))*100, resp B/T, kde B je aktivita vázaná na protilátku (vazebnost), B0 vazebnost při nulové koncentraci látky (eliminuje nespecifické vazby na protilátku), N nespecifická vazba a konečně T je celková aktivita v přidaná do každé testovací zkumavky. Ve všech případech je výsledkem je křivka sigmoidního charakteru. Složitější transformací je konstrukce křivky logit-log, která vede prakticky k linearizaci kalibračního vztahu. Y-osa je potom definována vztahem logit B/B0 = log e (B/B0)/(1-B/B0)) Poměr B/B0 se mění v intervalu 0 - 1,0. Protože však logit1 = ∞ a logit0 = -∞, vynáší se hodnota B0 = 1 jako 0,99. Existuje řada dalších linearizačních transformací, které se však používají ve vyhodnocovacích programech a pro manuální vyhodnocení jsou příliš složité. Uvedené transformace postačují pro běžná vyhodnocení. Pro vlastní přesnost, správnost a reprodukovatelnost výsledku jsou význačnější parametry vlastního zpracování vzorku při provádění analýzy. Rovněž je vhodné připomenout, že při sériových rutinních stanoveních se stejně do souboru měřených vzorků přidávají kontrolní, uměle připravené vzorky se známou koncentrací (quality control), které umožňují vyhodnotit míru správnosti stanovení v průběhu analýzy velké série vzorků. e) Imunoradiometrické stanovení (IRMA, immunoradiometric assay) Kromě klasické RIA metody existuje i řada modifikací založených na obdobném principu. Jednou z častějších metodik je tzv. imunoradiometrické stanovení, které rovněž patří ke skupině stanovení označované jako RIA na pevné fázi. Na rozdíl od klasické RIA metody, kde se používá radioaktivně značená stanovovaná látka se v případě IRMA se používají dvě protilátky, z nichž jedna je značená (125I). Postup stanovení tedy používá dvě protilátky, kdy protilátka 1 je neznačená a je imobilizována na stěně zkumavky, protilátka 2 je radioaktivně označena. Po přídavku analytu (sérum, plasma se stanovovanou substancí) se stanovovaná látka váže na protilátku na stěnách zkumavky ve formě komplexu látka-protilátka. Systém je nastaven tak, že veškerá stanovovaná látka se imobilizuje v komplexu s protilátkou vázanou na stěny zkumavky. V této fázi se analyt odsaje a do zkumavky se přidá roztok značené protilátky 2. Tato reaguje s vázanou stanovovanou látkou a množství vázané protilátky 2 je úměrné koncentraci stanovované látky v analytu. Po odsátí přebytečného radioaktivního reagens a následném promytí vhodným roztokem je množství radioaktivně značených molekul a tedy i radioaktivita naměřená ve zkumavce měřítkem množství stanovované látky v analytu. Výhoda metody IRMA spočívá především v tom, že odstraňuje některé interakce ve vlastní fázi zavedení značené molekuly do analytického systému protože po primární
imobilizaci stanovované látky se analyt odsaje a přítomné enzymy či jiné proteinové struktury nemohou narušit interakci látka-protilátka ve druhé fázi stanovení. Teoreticky lze dosáhnout i nižšího detekčního limitu než při RIA stanovení, stanovení může být selektivnější (využití dvou různých epitopů na protilátkách 1 a 2). Nevýhodou je použití dvou protilátek, neznačené a značené protilátky, jejichž izolace a příprava je poměrně obtížná. Vzhledem k možnostem radioaktivního značení protilátek se používá značení 125I. Přestože jsou známy relativně šetrné postupy ke značení biomolekul, vede často značení protilátky ke snížení imunoreaktivity což je v největší míře způsobeno reaktanty nutnými pro zavedení radiojodu do molekuly (viz kap. b). Pro některá stanovení však byly vypracovány šetrné a reprodukovatelné postupy pro značení protilátek, které mají využití v komerčních soupravách pro RIA stanovení. f) Následující úlohy vycházejí z komerčních souprav firmy Immunotech a byly vybrány tak, aby metodicky pokrývaly většinu souprav uvedené firmy a návody lze tedy jednoduše modifikovat pro další soupravy. Rovněž je vhodné poznamenat, že veškeré návody k soupravám jsou k dispozici v elektronické formě a přiložené pracovní postupy z nich vycházejí. Příslušné návody lze rovněž použít jako pracovní protokoly a doplnit je pouze naměřenými hodnotami a vyhodnocením.
Návod 1:
Souprava pro radioimunostanovení lidského choriogonadotropinu (hCG-screening RIA kit) 1. ÚVOD Souprava hCG screening RIA kit (Immunotech, kat. č. 2235) je určena pro přímé kvantitativní stanovení vysokých (10-250 kIU/L) koncentrací hCG v neředěných vzorcích séra nebo plazmy při prenatálním screeningu vrozených vývojových vad ve druhém trimestru těhotenství. Lidský choriogonadotropin (hCG), spolu s lutropinem (LH), follitropinem (FSH) a thyreotropinem (TSH) patří ke skupině glykoproteinových hormonů. Na rozdíl od ostatních glykoproteinových hormonů vznikajících v adenohypofýze, tvoří se hCG v trofoblastických buňkách placenty v průběhu těhotenství a stimuluje růst žlutého tělíska. Všechny uvedené hormony se vyznačují podobnou strukturou. Jsou tvořeny dvěma nekovalentně spojenými podjednotkami α a β, přičemž α-podjednotky všech glykoproteinových hormonů jsou identické. Biologickou specifitu těchto hormonů určují β-podjednotky, které se navzájem více či méně liší, i když vykazují značnou míru homologie (např. u β-hCG a β-LH se sekvence aminokyselin liší pouze z 18%). Imunochemické stanovení koncentrace hCG v krvi se uplatňuje především v diagnostice těhotenství a sledování jeho průběhu. Již několik dní po oplodnění dochází ke zvýšení koncentrace hCG v krvi matky natolik, že toto zvýšení lze stanovit. HCG je nezbytný pro zadržení žlutého tělíska v prvních 4 až 6 týdnech těhotenství a tedy i pro úspěšný průběh těhotenství. Zvýšené hodnoty koncentrace hCG signalizují vícečetné těhotenství a rovněž umožňují (společně se stanovením koncentrace α-fetoproteinu - AFP a nekonjugovaného estriolu - uE3) včasnou diagnózu trisomie 21 - Downova syndromu.
2. PRINCIP METODY Radioimunoanalytické stanovení hCG je kompetitivní stanovení. Neznámé vzorky a kalibrátory se spolu s 125I-hCG inkubují ve zkumavkách potažených monoklonální protilátkou. Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a navázaná aktivita se změří gamačítačem. Koncentrace hCG v neznámých vzorcích se odečtou z kalibrační křivky sestrojené pomocí kalibrátorů.
3. REAGENCIE Zkumavky potažené monoklonální protilátkou: Radioindikátor hCG značený 125I: 1 lahvička. Lahvička obsahuje ke dni výroby méně než 325 kBq značeného hCG v tlumivém roztoku s ochrannými proteiny, s azidem sodným (<0,1%,) a barvivem. Kalibrátory: 6 lahviček (po 0,5 ml); připraveny k použití. Obsahují od 0 do 250 kIU hCG/l v lidském séru s přídavkem azidu sodného (<0,1). Přesné hodnoty koncentrací hCG jsou uvedeny na štítcích lahviček. Kalibrace byla provedena pomocí mezinárodního standardu 4th IS WHO 75/589.
Neznámý vzorek: 1 lahvička. Vzorek obsahuje lidské sérum.
4. ZAŘÍZENÍ A POTŘEBNÝ MATERIÁL Kromě obvyklého laboratorního zařízení je pro analýzu potřebné následující vybavení: přesná mikropipeta 50 µl dávkovače na objem 200 µl a 2 ml horizontální třepačka s frekvencí alespoň 280 kmitů/min vibrační míchadlo gama-čítač
5. POSTUP STANOVENÍ Schéma postupu stanovení Krok 1
Krok 2
Krok 3
Pipetování
Inkubace
Měření
Do zkumavek pokrytých
Inkubujte 1 hodinu
Pečlivě odsajte obsah
protilátkou přidejte
při 18 - 25 °C
zkumavek
v tomto pořadí:
za stálého třepání.
(kromě těch na stanovení
50 µl kalibrátoru nebo
celkové aktivity T).
vzorku,
Měřte četnosti (cpm).
200 µL radioindikátoru. Promíchejte.
Pracovní postup a protokol: 1. Do stojánku umístěte 9 zkumavek potažených protilátkou a označte dle tabulky. zkumavka koncentrace testosteronu
T
T
0
0
1
2
3
4
5
6
C1(2) ?
(2 zkumavky bez protilátky, označené T, 6 zkumavek s protilátkou na kalibraci (označeno 1 – 6), 1 zkumavku s protilátkou na neznámý vzorek (označeno C1 )) 2) Do zkumavek 1, 2, 3, 4, 5, 6, napipetujte 50 µl příslušných standardů a do zkumavky C 50 µl neznámého vzorku . 3) Do všech zkumavek napipetujte 200 µl radioindikátoru a promíchejte na vibračním míchadle. 4) Zkumavky uzavřete folií a umístěte na třepačku, inkubujte 1 hod.
5) Po ukončení inkubace odsajte ze zkumavek 1 – 6 (kalibrační) a z neznámého vzorku kapalinu. (obsah odsávací pipety vystříkněte do připravené kádinky a po ukončení práce přelijte do lahve s odpadními roztoky 125I ) Radioindikátor v zkumavce označené T (total) musí zůstat, hodnota aktivity v této zkumavce slouží k výpočtu. 6) Na měřící soupravě stanovte hodnotu pozadí (3x 10 min, přepočtěte na průměrnou hodnotu za 1 min.) 7) U všech zkumavek změřte aktivitu (1 min), třikrát (A1, A2, A3, vyhodnoťte průměr), odečtěte hodnotu pozadí. Pozadí (imp/min) 8) Podle následující tabulky změřte aktivitu jednotlivých zkumavek a vypočtěte zbylé hodnoty. Ze získaných dat vypočtěte/doplňte hodnoty v druhé tabulce. zkumavka
T
T
1
2
3
4
2
3
4
5
6
C1
Aktivita 1 (imp/min) Aktivita 2 (imp/min) Aktivita 3 (imp/min) Průměr Průměr - pozadí
zkumavka
T
T
Koncentrace KIU/L
------
-----
Průměr aktivit (B0)
(imp/min) Vazebnost (B/B0, %)
5
6
-------- -------- ------- -------- -------- ------
(imp/min) Průměr aktivit
1
C1
-------
-------- -------------- -------
9. Sestrojte kalibrační křivku jako závislost B/B0 v % (osa y) na koncentraci kalibrátorů v kIU/l (osa x) v semilogaritmickém zobrazení (koncentrace v log zobrazení); B0 je vazebnost nulového kalibrátoru (aktivita vázaná na zkumavku).
Příklad kalibračního grafu (nepoužívejte pro vyhodnocení)
10. Z kalibračního grafu, resp. odpovídajícího kalibračního vztahu vypočtěte koncentraci neznámého vzorku.
Koncentrace hCG
KIU/l
Návod 2
Souprava pro stanovení volného trijodtyroninu (T3) (FREE T3 RIA ) 1. ÚVOD Souprava IMMUNOTECH Free T3 (kat. # 1579; 3320) je určena pro kvantitativní stanovení volného trijodtyroninu v lidském séru nebo plazmě. Trijodtyronin (T3) je hlavní biologicky aktivní hormon štítné žlázy. Je zapojen do regulace bazálního metabolizmu. T3 je vylučován štítnou žlázou a vzniká hlavně dejodací tyroxinu (T4) v periferním oběhu. Syntéza a uvolňování hormonů štítné žlázy jsou kontrolovány tyreotropním hormonem (TSH), produkovaným tyreotropními buňkami předního laloku hypofýzy. TSH je také regulován, a to tripeptidem hypotalamického původu nazývaným „tyreotropin uvolňující hormon“ (TRH). Hormony štítné žlázy T3 a T4 řídí sekreci TSH negativní zpětnou vazbou (1). Podobně jako T4, T3 cirkuluje v krvi vázán na vazebné proteiny, tyroxin binding globulin (TBG), tyroxin binding prealbumin (TBPA) a albumin. Koncentrace volného T3, reprezentující okolo 0,3 % celkové koncentrace cirkulujícího hormonu, je udržována nezávisle na změnách hladin vazebních proteinů. Určení koncentrace volného T3 je skutečným měřítkem stavu štítné žlázy a stavu buněčného metabolizmu (2). Koncentrace volného T3 je normální u eutyreoidních pacientů s abnormálními hladinami vazebných proteinů. Změny hladin vazebných proteinů nacházíme u jistých vrozených abnormalit a během těhotenství, při užívání androgenů, orálních estrogenů nebo antikoncepčních prostředků. Hypertyreóza je obecně spojena se vzestupem koncentrace volného T3. Určení této hodnoty je velmi důležité v některých případech T3 tyreotoxikózy, kdy koncentrace volného T4 a TSH v séru mohou být v normálním rozmezí (3). Snížená koncentrace volného T3 indikuje hypotyreózu. Snížené hladiny mohou být nalezeny také u některých vážných chorob nesouvisících s onemocněním štítné žlázy (syndrom nízkého T3) (4). Určení koncentrace volného T3 dovoluje sledování pacientů při substituční nebo supresívní terapii užívající T3.
2. PRINCIP STANOVENÍ Metoda stanovení volného T3 je založena na použití značené monoklonální protilátky. Monoklonální protilátka, specifická pro trijodtyronin, je značena 125I. Vzorek je společně s touto protilátkou inkubován ve zkumavce potažená analogem T3 (ligand). Dochází ke kompetici mezi volným trijodtyroninem ve vzorku a ligandem. Množství radioaktivity navázané na zkumavku po inkubaci je nepřímo úměrné množství volného trijodtyroninu ve vzorku.
3. REAGENCIE Ligandem potažené zkumavky. Monoklonální protilátka značená 125I (1 lahvička ,45 ml); připravena k použití. Lahvička obsahuje ke dni výroby méně než 225 kBq značeného imunoglobulinu v kapalné formě s proteiny, azidem sodným (<0,1) a barvivem. Standardy: 5 lahviček (po 1 ml); připraveny k použití.
Lahvičky standardů obsahují volné T3 v lidském séru. Přesné koncentrace T3 jsou vyznačeny na štítku každé lahvičky Neznámý vzorek: 1 lahvička (1 ml); připraven k použití. Lahvička obsahuje volný T3 v lidském séru. Standardy a kontrola obsahují materiál lidského původu. Pracujte s těmito reagenciemi jako s potenciálně infekčními. Všechny reagencie v soupravě jsou stabilní při 2-8 °C do data exspirace soupravy.
4. ZAŘÍZENÍ A POTŘEBNÝ MATERIÁL Kromě obvyklého laboratorního zařízení je pro zpracování soupravy potřebné následující vybavení: Přesná mikropipeta (100 µl) Přesná mikropipeta (400 µl) Horizontální třepačka Gama-čítač kalibrovaný pro měření 125I Vibrační míchadlo typu Vortex
5. POSTUP STANOVENÍ Příprava reagencií Před použitím nechte všechny reagencie skladované při 2-8 °C vytemperovat na laboratorní teplotu. Schéma postupu stanovení Krok 1
Krok 2
Krok 3
Pipetace
Inkubace
Měření
Do potažených zkumavek
Inkubujte
Opatrně odsajte obsah
postupně přidejte:
120 minut
každé zkumavky
při 18-25 °C
-100 µl standardu nebo
(s výjimkou 2 zkumavek
za stálého třepání.
vzorku
T).
-400 µl radioindikátoru.
Měřte vázanou aktivitu (B)
Promíchejte.
a celkovou aktivitu (T).
Pracovní postup a protokol: 1. Do stojánku si připravte 8 zkumavek potažených protilátkou a označte podle schematu v tabulce. Do zkumavek 1, 2, 3, 4, 5, napipetujte 100 µl příslušných standardů a do zkumavky C 100 µl neznámého vzorku . zkumavka
T
T
konc. T3
0
0
1
2
3
4
5
C1(2) ?
2. Do všech zkumavek napipetujte 400 µl radioindikátoru a promíchejte na vibračním míchadle. 3. Zkumavky uzavřete folií a umístěte na třepačku, inkubujte 2 hod. 4. Po ukončení inkubace odsajte Pasteurovou pipetou nebo injekční stříkačkou s dlouhou tupou jehlou ze zkumavek 1 – 6 (kalibrační) a z neznámého vzorku kapalinu. (obsah odsávací pipety vystříkněte do připravené kádinky a po ukončení práce přelijte do lahve s odpadními roztoky 125I ) Radioindikátor v zkumavce označené T (total) musí zůstat, hodnota aktivity v této zkumavce slouží k výpočtu. 5. Na měřící soupravě stanovte hodnotu pozadí (3x 10 min, přepočtěte na průměrnou hodnotu za 1 min.) Pozadí (imp/min) 6. U všech zkumavek změřte aktivitu ( 1 min, třikrát (A1, A2, A3, vyhodnoťte průměr), odečtěte hodnotu pozadí. Naměřené, vypočtené a vstupní údaje koncentrace zaneste do následujících tabulek
zkumavka Aktivita 1 (imp/min) Aktivita 2 (imp/min) Aktivita 3 (imp/min) Průměr Průměr - pozadí
T
T
1
2
3
4
5
C1
zkumavka
T
T
1
2
3
4
5
C1
Koncentrace pM/l Průměr aktivit (T)
--------- --------- ------- --------- --------- -------
(imp/min) Průměr aktivit B (imp/min) (B/T, %)
-------- -------------- -------
7. Výsledky se získají interpolací z kalibrační křivky. Kalibrační křivku konstruujte v semilogaritmických souřadnicích.. Na vertikální osu bylo vyneste B/T (%) a na horizontální osu(logaritmická) koncentrace volného T3 standardu v pM. Pro neznámý vzorek vyznačte na vertikální ose hodnotu B/T (%) a na horizontální ose odečtěte odpovídající koncentraci volného trijodtyroninu v pM, Pokud používáte grafický program, lze vyhodnocení provést elektronicky. Pro zajímavost si můžete zkusit vynést i poměry B/T kalibrátorů a posoudit chybu stanovení .
6. VÝSLEDEK Koncentrace T3 v kontrolním vzorku =
pmol/l
7. ANALYTICKÉ PARAMETRY STANOVENÍ Citlivost Citlivost je definována jako taková koncentrace volného T3, pM které je B/T rovno B0 minus dvojnásobek hodnoty standardní odchylky. Citlivost byla zjištěna z 20 stanovení nulového standardu a 2,1 pM standardu a její hodnota je 0,5 pM. Specifita monoklonální protilátky Specifita monoklonální protilátky byla stanovena pomocí kompetitivní RIA použitím značeného T3 a následujících sloučenin: Analog L-3,3´,5-Trijodtyronin (T3) L-3,3´,5-Trijodthyroacetátová kyselina L-3,3´,5´-Trijodtyronin (T3r) L-Thyroxin D-Thyroxin
Zkřížená reaktivita (%) 100 100 0,03 0,15 0,07
Interference různých analogů se stanovením volného T3 Normální lidské sérum (stanoveno 3,7 pM volného T3) bylo rozděleno a doplněno fyziologickými nebo terapeutickými koncentracemi potenciálních interferujících molekul. Koncentrace volného T3 byla stanovena pomocí soupravy Immunotech a interferující
příspěvek jednotlivých látek byl vypočítán odečtením koncentrace T3 získané v nepřítomnosti interferující molekuly. Analog
Přidáno
L-3,3´,5´-Trijodtyronin (T3r) L-3,3´,5-Trijodthyroacetátová kyselina Mono-jodtyrosin Dijodtyrosin Salicylát sodný
0,62 nM 0,089 nM 0,23 nM 0,17 nM 1,25 mM
Ekvivalent volného T3 (pM) <0,1 0,2 <0,1 0,2 0,4
Přesnost Hodnoty intra-assay a inter-assay byly určeny stanovením tří sér v duplikátech.
Počet stanovení Průměrná hodnota (pM) Standardní odchylka (pM) Variační koeficient ( %)
Intra-assay Inter-assay Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 15 15 15 10 10 10 2,91
4,85
12,3
2,71
4,54
11,3
0,15
0,26
0,79
0,15
0,25
0,41
5,15
5,36
6,4
5,53
5,50
3,62
Návod 3
Imunoradiometrické stanovení ACTH 1. ÚVOD Kortikotropní hormon (ACTH, adrenokortikotropin) je polypeptid sestávající z 39 aminokyselin (mol. hm. 4500 Da). Sekvence aminokyselin 1 – 24 je postačující pro biologickou aktivitu hormonu. ACTH je syntetizován z prekursoru propiomelanocortinu. Uvolňován íACTH , stejně jako dalších polypeptidů (α-melanotropinu, β-lipotropinu a β−endorfinu) katalyzuje příslušná endopeptidasa. Hlavní úloha ACTH je ve stimulaci steroidogenese , specielně při syntéze kortizolu. Syntéza ACTH samotného je stimulována sekrecí hypothalamického hormonu (kortikotropin uvolňující hormon, CRH). Stanovení plasmatické hladiny ACTH se používá ke studiu abnormalit hypothalamo-pituitárně-adrenální osy. Toto stanovení dovoluje určit příčinu přebytečné produkce kortizolu, která vede ke Cushingovu syndromu., rovněž je použitelné při ACTH stimulačních či inhibičních testech
2. PRINCIP STANOVENÍ: Imunoradiochemické stanovení (immunoradiometric assay, IRMA) ACTH je sendvičového typu, kdy ACTH je nejprve chemicky modifikován za vzniku sukcinylACTH (sACTH). ACTH je nestabilní látka a v biologických strukturách je vysoce chráněn. Z těchto důvodů je velmi obtížné imunizovat zvířata proti tomuto lidskému hormonu za účelem produkce protilátek s dostatečně vysokou afinitou pro použití v imunoradiometrickém stanovení. Chemická modifikace lidského ACTH umožňuje tento rozlišit od endogenního ACTH imunizovaných zvířat a zvyšuje jeho stabilitu. Specificita monoklonální protilátky použité ke stanovení vyžaduje stejnou chemickou modifikaci ACTH ve vzorcích. Toto lze snadno a s vysokou účinností zajistit pomocí acylačního činidla, které je dodáváno přímo v soupravě. Kromě toho chemická modifikace stabilizuje ACTH ve vzorku a zjednodušuje nakládání se vzorkem. V soupravě jsou použity tři navzájem nekompetující myší monoklonální protilátky specifické proti třem epitopům molekuly acylovaného ACTH. Modifikovaný vzorek a standardy se nejdříve inkubují ve zkumavkách potažených dvěma monoklonálními protilátkami. Po první inkubaci se vzorek ze zkumavky opatrně odsaje a přidá se roztok třetí protilátky značené 125I. Po následné inkubaci se obsah zkumavky opět odsaje, dvakrát promyje a měří se radioaktivita vázaná na povrch zkumavky. Z výsledků měření standardů se zkonstruuje kalibrační křivka, hodnoty neznámých vzorků se vypočtou interpolací. Vázaná radioaktivita je přímo úměrná koncentraci ACTH ve vzorku.
3. REAGENCIE Monoklonální protilátka proti sACTH, značená 125I, radioindikátor: Lahvička obsahuje ke dni výroby 814 kBq 125I znaиeného imunoglobulinu v kapalné formě, proteiny, barvivo a azid sodný Zkumavky potažené monoklonálními protilátkami proti sACTH Standardy ACTH- 6 lahviček: Standardy obsahují lidské sérum modifikované sukcinylanhydridem Takto jsou připraveny k použití a nesmí být dále upravovány.
Neznámý vzorek: Neznámý vzorek obsahuje syntetický sACTH v koncentračním rozmezí od 0 do 1500 pg/ml. Vzorek je kalibrován na standardní roztok syntetického ACTH, jehož koncentrace byla přesně stanovena aminokyselinovou analýzou. Alkalický roztok: Tlumivý roztok obsahuje azid sodný Acylační činidlo: ;. Činidlo obsahuje 600 mg succinyl anhydridu lyofilizovaného v přítomnosti fenolové červeni. Rozpouští se v dimethylsulfoxidu. Činidlo je stabilní do data exspirace soupravy, je-li skladováno při 2-8°C. Případné lehké zhnědnutí roztoku během skladování nemá žádný vliv na výsledky stanovení. Promývací roztok: Zředěný roztok je při 2-8°C stabilní do data exspirace soupravy.
4. ZAŘÍZENÍ A POTŘEBNÝ MATERIÁL Kromě obvyklého laboratorního zařízení je pro zpracování soupravy potřebné následující vybavení: Přesné mikropipety (30, 150 a 300 µl a 500 µl) Pasteurova pipeta (PE) 2 ml Horizontální třepačka Gama-čítač nastavený na 125I.
5. POSTUP STANOVENÍ Schema postupu stanovení Acylace Imunologický krok 1 Do propylénových Do protilátkou zkumavek postupně potažených zkumavek přidejte: přidejte: 500 µl vzorku nebo 300 µl standardu nebo kontrolního séra acylovaného vzorku 250 µl alkalického nebo acylovaného roztoku kontrolního séra. 50 µlacylačního činidla Inkubujte 1 hod Okamžitě promíchejte. při 18-25° C za třepání. Inkubujte 5 min Odsajte pečlivě obsah při 18-25° C. všech zkumavek.
Imunologický krok 2 Do každé zkumavky přidejte: 100 µl radioindikátoru.
Měření Odsajte pečlivě obsah všech zkumavek (kromě 2 zkumavek T). Dvakrát promyjte.
Inkubujte 2 hod při 18-25° C za třepání.
Měřte vázanou (B) a celkovou (T) aktivitu.
1. Acylace neznámého vzorku (příprava sukcinylACTH) (1 až 2 vzorky dle pokynů asistenta) Do PP zkumavky napipetujeme 300 µl kontrolního séra, 150 µl alkalického roztoku a 30 µl acylačního činidla, promícháme na Vortexu a ponecháme stát 5 min při 18 – 25° C. Acylační činidlo obsahuje barevný indikátor (modrá) – směs se zabarví do žluta což indikuje správný průběh reakce, nesprávný průběh reakce je indikován přetrvávajícím modrým zabarvením.
2. Immunologický krok 1 zkumavka
T1
T2
konc. ACTH
0
0
0
1
2
3
4
5
6 ?
.Do zkumavek potažených protilátkami označených podle tabulky a umístěných ve stojánku napipetujte 300 µl standardů (zkumavky 0 – 5) nebo acylovaného neznámého vzorku – tj. zkumavky 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, (6 je neznámý vzorek) a inkubujte za třepání 1 hod. Poté opatrně, ale důkladně (příliš se nedotýkat vnitřního povrchu zkumavky) odsajte kapalný obsah zkumavek. 3. Immunologický krok 2 Do všech zkumavek (včetně T1 a T2) zkumavek z kroku 1 napipetujte 100 µl značené protilátky a inkubujte 2 h za třepání. Ze zkumavek 0 - 6 poté odsajte kapalinu, promyjte 2 x 2 ml promývacího roztoku. U zkumavek označených T1 a T2 kapalinu neodsávat, slouží ke stanovení celkové vnesené aktivity. 4. Měření Na měřící soupravě se scintilační sondou stanovte hodnotu pozadí (3x 10 min, přepočtěte na průměrnou hodnotu za 1 min.). Pozadí (imp/min) Připravené zkumavky měřte jednotlivě 2 x 1 min výsledky zaneste do tabulek, vypočtěte zbylé parametry. zkumavka Aktivita 1 (imp/min) Aktivita 2 (imp/min) Průměr Průměr - pozadí
T1
T2
0
1
2
3
4
5
6
zkumavka
T1
T2
0
1
2
3
4
5
Koncentrace pM/l
-------
Průměr aktivit (T)
--------- --------- ------- --------- --------- -------
(imp/min) Průměr aktivit B (imp/min) (B/T, %)
6
-------- -------------- -------
Pro hodnoty ze zkumavek 0 – 5 sestrojíme kalibrační graf ( B/T na vertikální osu, koncentrace standardů na horizontální osu). Ze získané závislosti odečteme hodnoty koncentrace ACTH v neznámém vzorku 6.
Návod 4
LH IRMA 1. ÚVOD Luteinizační hormon (LH) je glykoprotein o relativní molekulové hmotnosti asi 28 kDa. Je vylučován specializovanými buňkami předního laloku hypofýzy a skládá se ze dvou nekovalentně vázaných podjednotek α a β. Podjednotka α se vyskytuje i u ostatních glykoproteinových hormonů, tj. folikulostimulačního hormonu (FSH), thyreotropinu (TSH) a choriového gonadotropinu (hCG), který je produkován především placentou. β-podjednotka je pro daný hormon specifická, určuje jeho biologickou a imunologickou specifitu a umožňuje rozlišení LH od ostatních glykoproteinových hormonů. Účinek LH se liší u mužů a u žen. U žen: LH a FSH se vzájemně doplňují při kontrole gonadálních funkcí. Spouštějí ovulaci a přispívají k vývoji žlutého tělíska. Hladiny LH se cyklicky mění. V průběhu první části cyklu silně vzrůstá sekrece steroidních hormonů díky zrání folikulu, který je zodpovědný za sekreční pík a následnou ovulaci. Pulsující sekrece LH podporuje rozvoj žlutého tělíska a toto pak vylučuje vzrůstající množství progesteronu a estradiolu. Jestliže nedojde k oplodnění, vysoké hladiny steroidních hormonů blokují sekreci LH a FSH (negativní zpětná vazba). V těhotenství hCG přebírá úlohu LH a udržuje produkci progesteronu a estrogenu žlutým tělískem. U mužů: LH společně s FSH a testosteronem stimulují spermatogenezi. Během prepubertálního vývoje indukuje FSH odpověď Leydigových buněk na LH. Sekrece Lh a FSH je stimulována hypotalamickým dekapeptidem (hormon uvolňující gonadotropin-GnRH), proto stanovení GnRH poskytuje informaci o gonadální a hypofyzární funkci. Stanovení FSH v plazmě a bazálních hladin LH nebo po stimulaci exogenním GnRH jsou indikována pro vyšetření abnormalit v pubertě u obou pohlaví. Kromě toho tyto testy umožňují vyšetření abnormalit hypotalamo-hypofyzárně-gonadální osy.
2. PRINCIP STANOVENÍ V soupravě jsou použity myší monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům LH. Ve zkumavkách potažených první monoklonální protilátkou jsou inkubovány vzorky nebo standardy s druhou monoklonální protilátkou značenou 125I. Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a zkumavky se promyjí, aby se odstranila nenavázaná protilátka značená 125 I. Pomocí gama-čítače jsou odečteny hodnoty impulsů. Koncentrace LH ve vzorcích je vypočtena z kalibrační křivky.
3. REAGENCIE Zkumavky pokryté monoklonální protilátkou proti LH Monoklonální protilátka proti LH, značená 125I: Lahvička obsahuje ke dni výroby méně než 370 kBq značeného imunoglobulinu v pufru s ochranými proteiny, azidem sodným a barvivem.
Standardy: 6 lahviček; Standardy obsahují LH v rozmezí koncentrací cca 0-200 IU/l. Přesné hodnoty koncentrací jsou uvedeny na štítcích lahviček. Sérové standardy LH jsou konzervovány merthiolátem sodným a jsou kalibrovány pomocí mezinárodního standardu 2nd IS 80/552. Standardy obsahují složky lidského původu . Promývací roztok. Neznámý vzorek:. . Vzorek obsahuje lidské sérum..
4. ZAŘÍZENÍ A POTŘEBNÝ MATERIÁL mikropipeta 50, 100 a 1000 µl Pasteurova pipeta (PE, 2 ml) pro odsávání kapaliny třepačka γ-detekční souprava nastavená na 125I
5. POSTUP STANOVENÍ Schema postupu stanovení Krok 1 Pipetování Do zkumavek potažených protilátkou postupně přidejte: -100 µl standardu nebo vzorku a -50 µl radioindikátoru. Zamíchejte.
Krok 2 Inkubace Inkubujte 90 minut při 18-25 °C za stálého třepání.
Krok 3 Měření Odsajte pečlivě obsah zkumavek s výjimkou těch na stanovení celkové aktivity. Promyjte dvakrát. Změřte vázanou aktivitu (B) a celkovou aktivitu (T).
Do stojánku umístěte ( v uvedeném pořadí):2 zkumavky označené T, 6 zkumavek s protilátkou na kalibraci (označeno 1 – 6) a 1 zkumavku s protilátkou na neznámý vzorek (označeno C1 nebo C2 podle pokynů asistenta) zkumavka
T1
T2
konc. LH (UI/L)
0
0
1
2
3
4
5
6
CX ?
1. Do zkumavek 1, 2, 3, 4, 5, 6, napipetujte 100 µl příslušných standardů a do zkumavky C 100 µl neznámého vzorku . 2. Do všech zkumavek napipetujte 50 µl radioindikátoru. 3. Zkumavky umístěte na třepačku, inkubujte 90 min. 4. Po ukončení inkubace odsajte ze zkumavek 1 – 6 (kalibrační) a z neznámého vzorku kapalinu. (Obsah odsávací pipety vystříkněte do připravené kádinky a po ukončení práce přelijte do lahve s odpadními roztoky 125I ) a promyjte 2 ml promývacího roztoku (do zkumavek 1-6 a zkumavky s neznámým vzorkem po odsátí radioindikátoru přidejte 2 ml promývacího roztoku a kapalinu ihned odsajte)
5. Na měřící soupravě stanovte hodnotu pozadí (3x 10 min, přepočtěte na průměrnou hodnotu za 1 min.) Pozadí (imp/min) 6. U všech zkumavek změřte aktivitu ( 1 min, dvakrát, vyhodnoťte průměr), odečtěte hodnotu pozadí (příslušné úkony učiníte vyplněním následující tabulky). zkumavka
T
T
1
2
3
4
5
6
C1(2)
parametr
T
T
B1
B2
B3
B4
B5
B6
BC
měření 1 měření 2 měření 1 – pozadí měření 2 – pozadí průměr 7. Sestrojte graf závislosti cpm na koncentraci LH v kalibračních standardech, získané body proložte přímkou. Z kalibračního grafu odečtěte hodnotu koncentrace LH (IU/L). Kalibrační graf přiložte k protokolu. Stanovená hodnota pro neznámý vzorek
IU/L
UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Obecné poznámky Nedoporučuje se míchat reagencie ze souprav různých šarží. Reagencie temperujte na teplotu místnosti. Základní pravidla radiační bezpečnosti Soupravy obsahují méně než 225 kBq 125I ke dni výroby. Tento radioaktivní materiál mohou přijímat, skladovat a používat pouze pracoviště, která splňují zákon 18/1997 Sb a Vyhlášku SÚJB č. 184/97. Při práci s radioaktivními látkami dodržujte následující pravidla: všechny radioaktivní látky musí být skladovány v původním balení a jen na místech k tomu určených, příjem a spotřeba radioaktivních látek musí být evidována, práce s radioaktivními látkami musí být prováděny pouze ve vyhrazených prostorách, pipetování nesmí být prováděno ústy, v laboratořích určených k práci s radioaktivními látkami je zakázáno jíst, pít, kouřit a pod., zabraňte přímému styku radioaktivních látek s pokožkou a používejte ochranných rukavic. Po skončení práce s těmito látkami si vždy umyjte ruce, obalový materiál, který není kontaminován, je možno odložit do běžného odpadu pouze po odstranění varovných nápisů a značek, povrch pracovních stolů, který by mohl být kontaminován, je třeba pravidelně kontrolovat, všechno laboratorní sklo, které bylo použito pro práci s radioaktivními látkami, musí být řádně dekontaminováno a proměřeno před dalším použitím. Veškerý neaktivní odpad je třeba likvidovat v souladu se zákonem č. 125/1997 Sb Azid sodný Některé substance jsou konzervovány azidem sodným. Azid sodný může reagovat s olovem, mědí nebo mosazí za vzniku příslušných výbušných azidů. Proto likvidované reagencie splachujte velkým množstvím vody. Lidské sérum U všech reagencií obsahujících lidské sérum nebyla zjištěna přítomnost viru hepatitidy B a C a HIV I a II. Žádná z dostupných metod nemůže dát stoprocentní jistotu neinfekčnosti. Je tedy nutné pracovat s těmito reagenciemi jako s potenciálně infekčními. Se všemi krevními vzorky by mělo být zacházeno jako se schopnými přenosu nemoci. Časová rezerva Prodleva půl hodiny mezi ukončením třepání (konec inkubace) a odsátím zkumavek neovlivní výsledky stanovení.
