PURIFIKASI, KARAKTERISASI DAN AKTIVITAS ANTIBIOTIKA DARI METABOLIT AKTINOMISETES TANAH ASAL KALIMANTAN TIMUR
NURLAILA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Purifikasi, Karakterisasi dan Aktivitas Antibiotik dari Metabolit Aktinomisetes Tanah Asal Kalimantan Timur adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013 Nurlaila NIM G451100021
RINGKASAN NURLAILA. Purifikasi, Karakterisasi dan Aktivitas Antibiotik dari Metabolit Aktinomisetes Tanah Asal Kalimantan Timur. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan BAMBANG MARWOTO. Penyakit infeksi seperti tuberculosis (TB), diare dan pneumonia merupakan penyakit penyebab utama kematian selain stroke, hipertensi dan kanker. Penyakit infeksi merupakan penyakit yang disebabkan oleh mikroba patogen. Obat yang sering dipakai untuk mengatasi penyakit ini adalah antibiotik. Dengan berkembangnya mikroba patogen yang resisten dan munculnya penyakit infeksi baru maka penting untuk mencari obat anti infeksi yang baru juga. Saat ini sumber mikroba yang tengah dikembangkan karena banyak menghasilkan senyawa aktif adalah mikroba dari aktinomisetes dan kapang, dari 16.500 senyawa antibiotika yang diisolasi dari mikroba, 52,7% diantaranya dari aktinomisetes. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempurifikasi dan mengkarakterisasi senyawa antimikroba dari metabolit aktinomisetes tanah asal Kalimantan Timur. Ekstrak butanol hasil dari fermentasi isolat AT 00244 asal Kalimantan Timur difraksinasi dengan kolom kromatografi. Fraksi-fraksi yang dihasilkan lalu diuji aktivitas antimikrobanya. Fraksi yang paling aktif dipurifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) preparatif selanjutnya diuji kemurniannya dengan HPLC. Senyawa hasil purifikasi dikarakterisasi menggunakan Fourier Transform Infra Red (FTIR) dan Liquid Chromatography Mass Spectrophotometer (LCMS). Fraksinasi dengan kolom kromatografi menghasilkan 8 fraksi (Fraksi F1 – F8) dan diuji aktivitasnya. Hanya fraksi F5 – F8 yang memberikan aktivitas terhadap mikroba uji Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albican, dan Aspergillus niger. Fraksi F8 menghasilkan daya hambat dengan diameter zona bening yang paling besar terhadap bakteri uji. Hasil purifikasi fraksi F8 dengan HPLC preparatif menghasilkan fraksi F8.1 – F8.8. Uji aktivitas fraksi F8.1 – F8.8 menunjukkan bahwa fraksi F8.5 memberikan daya hambat dengan diameter zona bening yang paling besar dibandingkan fraksi yang lain, yaitu 14.44 mm dan 10.41 berturut-turut terhadap B. subtilis dan S. aureus. Analisa fraksi F8.5 dengan FTIR menunjukkan bahwa senyawa tersebut mempunyai gugus fungsi karbonil (C=O) dari suatu asam karboksilat, gugus OH, gugus C–O alkohol, gugus –CH alifatik, gugus –C=C aromatik dan gugus C≡N nitril. Hasil analisa dengan LC-MS menunjukan bahwa senyawa tersebut mempunyai bobot molekul 403 Da dengan perkiraan rumus molekul C 10 H 23 N 6 O 6 .
Kata kunci: aktinomisetes tanah, Streptomyces, purifikasi, metabolit, antibiotik
SUMMARY NURLAILA. Purification, Characterization and Antibiotic Activity of Metabolite Soil Actinomycetes East Kalimantan Origin. Supervised by IRMANIDA BATUBARA and BAMBANG MARWOTO. Infectious diseases such as tuberculosis (TB), diarrhea and pneumonia are the leading causes of death other than stroke, hypertension and cancer. Infectious disease is a disease caused by pathogenic microbes. Drugs are often used to overcome this disease is antibiotics. With the development of resistant microbial pathogens and the emergence of new infectious diseases, it is important to search for new anti-infective drugs as well. Currently, the source of microbes being developed because of their ability in producing a large variety of active compounds are microbes which are grouped in actinomycetes and mold, from 16,500 antibiotic isolated from microbes, 52,7% were from actinomycetes. The purpose of this study was to purify and characterize the antimicrobial compounds from metabolite soil actinomycetes from East Kalimantan. Butanol extract of fermentation cultures were fractionated by column chromatography. The resulting fractions are tested for antimicrobial activity. The most active fraction was purified by Thin Layer Chromatography (TLC) and preparative High Performance Liquid Chromatography (HPLC), meanwhile the compound purity was analyzed using the HPLC. The result of purified compound was then characterized using Fourier Transform Infra Red (FTIR) and Liquid Chromatography Mass Spectrophotometer (LCMS). Fractionation step using column chromatography resulted in 8 fractions (fractions F1 - F8) which were then tested for their activity. Only a fraction F5 F8 which provides microbial activity against Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and Aspergillus niger. Fraction F8 produced the largest diameter of the clear zone of the bacterial test. Purification result of fraction F8 using preparative HPLC produced 8 fractions, fraction F8.1 - F8.8. Activity test of all the fractions (F8.1 – F8.8) showed that F8.5 had the largest diameter of clear zone against B. subtilis and S. aureus compared to others fractions, 14.44 mm and 10.41 respectively. F8.5 fraction analysed by FTIR showed that the compound has a carbonyl functional group (C=O) of a carboxylic acid, OH group, C–O alcohols group, aliphatic CH groups, aromatic C=C group and C≡N nitrile group. LC-MS analysis of the F8.5 fraction showed that the compound has a molecular weight of 403 Da with an approximate molecular formula C 10 H 23 N 6 O 6 .
Keywords : soil actinomycetes, antibiotic, Streptomyces, purification
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PURIFIKASI, KARAKTERISASI DAN AKTIVITAS ANTIBIOTIKA DARI METABOLIT AKTINOMISETES TANAH ASAL KALIMANTAN TIMUR
NURLAILA
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Eti Rohaeti, MS
Judul Tesis Nama NIM
: Purifikasi, Karakterisasi dan Aktivitas Antibiotika dari Metabolit Aktinomisetes Tanah Asal Kalimantan Timur : Nurlaila : G45ll0002l
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Irmanida Batubara, SSi, MSi
Ketua
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Pascasarjana Kimia
antiningsih S, MS
Tanggal Ujian: 31 Juli 2013
Tangga1 Lu1us:
1 6 OCT 2013
Judul Tesis Nama NIM
: Purifikasi, Karakterisasi dan Aktivitas Antibiotika dari Metabolit Aktinomisetes Tanah Asal Kalimantan Timur : Nurlaila : G451100021
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr Irmanida Batubara, SSi, MSi Ketua
Dr Bambang Marwoto, Apt MEng Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Pascasarjana Kimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Dra Purwantiningsih S, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 31 Juli 2013
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2012 ini ialah Purifikasi, Karakterisasi dan Uji Aktivitas Antibiotika dari Metabolit Aktinomisetes Tanah Asal Kalimantan Timur. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Irmanida Batubara, MSi dan Dr Bambang Marwoto, Apt MEng selaku pembimbing, Dr Eti Rohaeti, MS selaku dosen penguji luar komisi. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Drs Tarwadi, MSi selaku Kepala Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT dan Dr Rer nat Anis Herliyati Mahsunah, MSc selaku Kepala Laboratorium Recovery yang telah membantu selama melakukan kegiatan penelitian di Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua Bapak Muhammad Kaslim dan Ibu Enah Rochaenah, suami tercinta Rizal Achmad Zein dan anak-anak tersayang Farrel Nurtiftazani Zein dan Fathan Nurhafidzani Zein atas keikhlasan, dukungan, dan kasih sayangnya. Teman-teman Kimia SPS IPB angkatan 2010 Pak Awan, Jaya, Pak Atep, Budi Riza dan Maiyani atas kebersamaannya. Staf Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT, Mba Linda, Inong, Diah, Koes, Lira, Taufik, Jay, Rudi, Ujang, Mba Nuni, Teh Dian, Ita, Uli dan yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu atas segala bantuan dan suportnya. Seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Serta kepada Kementerian Riset dan Teknologi atas pemberian beasiswa dan pendampingannya selama menjalankan studi di Institut Pertanian Bogor. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013 Nurlaila
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xi
DAFTAR LAMPIRAN
xi
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian
1 1 2 2 2 2
2 TINJAUAN PUSTAKA Aktinomisetes Antibiotik Kromatografi Lapis Tipis HPLC Analitik dan Preparatif Elusidasi Struktur Molekul
2 2 3 4 5 5
3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat Tahapan Penelitian
6 6 6 7
4 HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas ekstrak isolat Pemurnian dengan kromatografi kolom Aktivitas fraksi F1 - F8 Pemurnian dengan HPLC preparatif Karakterisasi senyawa aktif
8 8 9 9 11 11
5 SIMPULAN DAN SARAN
13
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
22
DAFTAR TABEL 1 Aktivitas ekstrak isolat aktinomisetes terhadap mikroba uji 2 Aktivitas fraksi F1 – F8 terhadap mikroba uji 3 Diameter zona bening fraksi F8.1 – F8. 8 terhadap mikroba uji 4 Bilangan gelombang dan gugus fungsi yang ada pada fraksi F8.5
8 10 11 12
DAFTAR GAMBAR 1 Penampakan mikroskopik spora dan rantai spora dari beberapa genus aktinomisetes 2 Kromatogram fraksi F8 3 Kromatogram (a) dan spektrum (b) fraksi F8.5 4 Spektrum FTIR fraksi F8.5 5 Spektrum massa fraksi F8.5
3 10 11 12 13
DAFTAR LAMPIRAN 1 Gambar isolat aktinomisetes hasil regenerasi 2 Aktivitas ekstrak isolat aktinomisetes 3 Kromatogram ekstrak isolat AT 00244 dengan berbagai pelarut organik 4 Nilai Rf ekstrak isolat AT 00244 dengan berbagai pelarut organik 5 Fraksi hasil fraksinasi ekstrak isolat aktinomisetes dengan kolom kromatografi 6 Bobot frisk hasil pemisahan ekstrak isolat AT 00244 dengan kromatografi kolom 7 Kromatogram fraksi F5 - F8 8 Aktivitas fraksi F8.3 - F8.8 terhadap mikroba uji 9 Bagan alir penelitian
17 17 18 18 19 19 19 21 21
1
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Penyakit infeksi merupakan penyakit yang disebabkan oleh mikroba patogen. Menurut survey Riset Kesehatan Dasar tahun 2007 penyakit infeksi seperti tuberculosis (TB), diare dan pneumonia merupakan penyakit penyebab utama kematian selain stroke, hipertensi dan kanker (Depkes 2011). Obat yang sering dipakai untuk mengatasi penyakit ini adalah antibiotik. Dengan berkembangnya mikroba patogen yang resisten dan munculnya penyakit infeksi baru maka penting untuk mencari obat anti infeksi yang baru (Abdelmohsen 2010). Antibiotik berhasil menanggulangi penyakit infeksi, tetapi penggunaan yang terus menerus dan tidak terarah menimbulkan efek samping yang dapat merugikan tubuh, terutama bila penggunaannya dengan dosis yang tidak tepat dapat mengubah kepekaan antibiotika terhadap mikroba patogen yang berakibat mikroba menjadi resisten (Jawetz 1998). Resistensi antimikroba ialah suatu sifat tidak terganggunya kehidupan sel mikroba oleh antimikroba. Sifat ini merupakan suatu mekanisme alamiah untuk bertahan hidup (Setiabudy dan Gan 2003). Sebanyak 87% Staphylococcus aureus telah resisten terhadap oksasilin, 72% terhadap eritromisin, 22% terhadap tetrasiklin, 25% terhadap ampisillin dan 22% terhadap gentamisin (Salasia et al. 2004). Berdasarkan hal itu maka perlu dicari antibiotik baru yang lebih sensitif terhadap bakteri S. aureus tersebut. Pencarian dan pembuatan derivat semisintetik secara kimiawi untuk antibiotik, anti fungal, maupun anti kanker baru yang efektif masih sangat diperlukan (Suwandi 1993). Alasan lain pentingnya pencarian dan penemuan antibiotika baru adalah bahwa Indonesia masih sangat bergantung pada pasokan antibiotika dari luar negeri sebagai bahan baku obat dengan harga yang relatif tinggi. Sampai saat ini sebagian besar perusahaan farmasi di Indonesia hanya melakukan formulasi produk akhir menjadi sediaan farmasi, sedangkan bahan bakunya 90% masih didatangkan dari luar negeri. Indonesia masih mengimpor bahan baku farmasi sebesar 1,45 triliun rupiah pada tahun 2001 dan cenderung mengalami peningkatan sebesar 23,62% per tahunnya (PMMC 2004). Sumber mikroba yang tengah dikembangkan karena banyak menghasilkan senyawa aktif adalah mikroba dari aktinomisetes dan kapang. Menurut Berdy (2005), dari 16.500 senyawa antibiotika yang diisolasi dari mikroba, 52,7% berasal dari aktinomisetes, sedangkan sisanya yaitu 29,7% dan 17,6% berturut-turut diisolasi dari kapang dan bakteri. Aktinomisetes menghasilkan metabolit sekunder yang dapat berfungsi sebagai antibiotik, antikanker, enzim untuk industri dan pestisida (Kafilzadeh et al. 2012). Salah satu penelitian yang telah dilakukan oleh Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT yaitu skrining terhadap 25 aktinomisetes tanah dari Kalimantan Timur. Diketahui semua isolat tersebut memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan beberapa mikroba uji, yaitu S. aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albican dan Aspergillus niger. Sebagai kelanjutan dari penelitian tersebut, maka pada penelitian ini dilakukan purifikasi dan karakterisasi senyawa antibiotik dari salah satu isolat tersebut. Tahap penelitian ini meliputi fermentasi isolat, ekstraksi dengan pelarut organik untuk mendapatkan senyawa antibiotik, purifikasi dan karakterisasi struktur senyawa dengan FT-IR dan LC-MS.
2
Perumusan Masalah Berdasarkan uraian latar belakang yang telah dipaparkan sebelumnya maka timbul permasalahan yaitu apakah metabolit aktinomisetes tanah asal Kalimantan Timur tersebut mampu menghasilkan senyawa yang berpotensi sebagai antibiotik. Bagaimana aktivitas senyawa antibiotik yang dihasilkan tersebut dalam menghambat mikroba uji. Serta bagaimana hasil purifikasi senyawa antibiotik yang dihasilkan dari aktinomisetes tanah asal Kalimantan Timur tersebut. Tujuan Penelitian Mendapatkan hasil isolasi metabolit dari aktinomisetes tanah Kalimantan Timur yang berpotensi sebagai antibiotik dan memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram positif (Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus), Gram negatif (Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa), dan jamur (Candida albicans dan Aspergillus niger) yang terkarakterisasi. Manfaat Penelitian Dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai metabolit dari aktinomisetes tanah asal Kalimantan Timur yang mampu menghasilkan antibiotik, juga mendapatkan hasil purifikasi senyawa antibiotik yang terkarakterisasi. Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup penelitian ini adalah uji aktivitas isolat aktinomisetes terhadap mikroba uji, proses fermentasi isolat yang aktif untuk perbanyakan kaldu fermentasi, pemisahan dan pemurnian senyawa aktif dari kaldu fermentasi yang meliputi ekstraksi menggunakan pelarut organik, pemurnian dengan kromatografi kolom dan HPLC preparatif dan identifikasi struktur molekul senyawa aktif dengan menggunakan Spektrofotometer Infra Red dan Liquid Chromatography Mass Spectrofotometer.
2 TINJAUAN PUSTAKA Aktinomisetes Aktinomisetes adalah mikroba uniseluler yang dikelompokkan ke dalam bakteri Gram positif dengan DNA yang kaya kandungan guanin dan sitosin (>55%). Aktinomisetes merupakan organisme prokariot yang tersebar luas di tanah, air dan tanaman (Cwala et al. 2011). Aktinomisetes dibedakan dari bakteri lain jika dilihat dari bentuk koloninya di medium padat. Biasanya koloni aktinomisetes keras seperti tumbuh akar didalam media agar, berbeda dengan bakteri lain yang koloninya lunak diatas media agar. Bentuk koloni aktinomisetes bulat dengan elevasi timbul dan cembung, tepian rata dan tidak beraturan serta permukaan bertepung, kasar atau keriput. Keistimewaan bentuk koloni aktinomisetes yang lain adalah hifanya bersifat hidrofobik
3
tetapi miselium vegetatifnya bersifat hidrofilik. Pada umumnya aktinomisetes adalah bakteri aerob yang tidak dapat hidup pada kondisi anaerob. pH optimum pertumbuhannya adalah netral, sedangkan suhu optimum adalah 23-35 oC. Aktinomisetes diklasifikasikan dalam domain Bacteria, divisi Actinobacteria, kelas Schizomycetes dan ordo Actinomycetales (Miyado 2003). Beberapa genus dari aktinomisetes dapat dilihat pada Gambar 1.
(a) (b) (c) (d) Gambar 1 Penampakan mikroskopik spora dan rantai spora dari beberapa genus Aktinomisetes a. Streptomyces, b. Nocardia, c. Micromonospora, d. Microbiospora (Miyado et al. 2002) Beberapa penelitian yang telah dilakukan untuk mengetahui potensi aktinomisetes diantaranya adalah aktinomisetes dari sedimen laut yang mempunyai aktivitas sebagai antikanker (Ravikumar et al. 2012). Kafilzadehet et al. (2012) mengambil aktinomisetes asal sedimen hutan bakau yang mampu menghasilkan enzim amilase. Singh et al. (2012) mengambil aktinomisetes dari tanah dan Sunaryanto (2011) mengambil dari laut. Kedua aktinomisetes tersebut menghasilkan senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri. Sedangkan Goudjal et al. (2013) meneliti aktinomisetes yang berasal dari endofit akar tanaman tomat yang memiliki potensi sebagai anti jamur. Antibiotik Antibiotik merupakan senyawa yang membunuh atau menghambat bakteri penyebab penyakit pada manusia atau hewan. Beberapa antibiotika merupakan senyawa sintetis (tidak dihasilkan oleh mikroorganisme) yang juga dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri. Meskipun antibiotika memiliki banyak manfaat, tetapi penggunaannya telah berkontribusi tehadap terjadinya resistensi (Katzung et al. 2007). Berdasarkan spektrum atau kisaran kerjanya antibiotik dapat dibedakan menjadi dua. Pertama antibiotik berspektrum sempit (narrow spectrum), hanya mampu menghambat segolongan jenis bakteri saja, contohnya hanya mampu menghambat atau membunuh bakteri Gram positif atau Gram negatif saja. Kedua antibiotik berspektrum luas (broad spectrum), dapat menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram positif maupun Gram negatif (Pratiwi 2008). Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotik dapat dikelompokkan menjadi lima golongan. Pertama antibiotik yang dapat mempengaruhi dinding sel contohnya penisilin, vankomisin, sefalosporin dan basitrasin. Kedua antibiotik yang dapat menghambat fungsi membran sel contohnya nistatin. Ketiga antibiotik yang dapat menghambat sintesis protein bakteri contohnya kloramfenikol, tetrasiklin, aminoglikosida dan makrolida. Keempat antibiotik yang dapat menghambat sintesis asam nukleat contohnya quinolon dan rifampisin (Pratiwi 2008).
4
Berdasarkan daya kerjanya terhadap mikroba, antibiotik dapat digolongkan menjadi dua. Pertama zat bakterisid yaitu antibiotik yang memiliki kemampuan untuk membunuh bakteri. Kedua zat bakteriostatik, yaitu antibiotik yang memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri (Dzen et al. 2003). Menurut Katzung et al. (2007) berdasarkan gugus kimianya antibiotik digolongkan menjadi empat golongan. Pertama golongan beta-laktam, ciri khas dari antibiotik golongan ini adalah memiliki gugus β-laktam. Gugus β-laktam merupakan sebuah cincin dengan 2 atom C, 1 gugus karbonil dan 1 atom N. Mekanisme aksi antibiotika β-laktam adalah menghambat pertumbuhan bakteri melalui pengaruhnya terhadap sintesis dinding sel. Contohnya adalah golongan penisilin, sefalosporin dan sefamisin. Kedua golongan makrolida, struktur golongan ini terdiri atas cincin lakton yang besar dinamakan makrolid, gugus keton dan glikosida. Cara kerja golongan makrolid di atas antara lain dengan menghambat sintesis protein bakteri dengan cara mengikat dan mengganggu ribosom. Contohnya antara lain: eritromisin, kloramfenikol, tetrasiklin. Ketiga golongan aminoglikosida merupakan antibiotik yang mengandung amino gula yang dihubungkan dengan ikatan glikosidik, sehingga dinamakan aminoglikosida. Beberapa jenis antibiotik yang tergolong aminoglikosida yaitu streptomisin (dihasilkan oleh Streptomyces griseus), kanamisin, neomisin, gentamisin. Keempat golongan tetrasiklin, antibiotik dengan struktur yang terdiri dari cincin naftasena. Substitusi gugus dasar cincin naftasena dapat terjadi secara alami dan menghasilkan analog tetrasiklim yang baru. Kromatografi Lapisan Tipis Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan teknik pemisahan yang banyak digunakan dalam proses pemurnian dan identifikasi senyawa kimia. Analisis dengan KLT memerlukan instrumen yang relatif sederhana dan dapat memisahkan ekstrak sampel yang tidak murni dengan resolusi yang baik. Salah satu aplikasi penting dari KLT adalah untuk mendeteksi senyawa antimikroba baru atau yang belum teridentifikasi yang biasa disebut sebagai teknik bioautografi. Penggunaan KLT bioautografi didasarkan pada efek biologis senyawa anti bakteri, anti jamur dan lainlain. Keuntungan KLT bioautografi adalah cepat, mudah disiapkan, relatif murah, tidak memerlukan peralatan yang rumit, hanya diperlukan beberapa mikrogram senyawa uji dan hasilnya mudah diinterpretasikan. Kromatografi merupakan metode analisis dengan fase gerak melewati fase diam untuk memisahkan campuran senyawa. KLT dapat dilakukan dengan cepat, biaya yang relatif murah, dapat menganalisis campuran senyawa yang kompleks dengan kemurnian yang tinggi baik polar maupun non polar. Deteksi hasil pemisahan dengan KLT pada lapisan adsorbennya dilakukan melalui karakteristik serapan cahaya atau perbedaan warna yang terbentuk setelah penyemprotan dengan reagen. KLT dapat digunakan untuk senyawa bersifat nonvolatil atau volatilitas rendah, senyawa bersifat polar, semi polar, nonpolar atau ionik (Hahn dan Deinstrop 2007). Senyawa diidentifikasi berdasarkan penampakan dan jarak relatif komponen terhadap jarak pelarut (nilai R f ). Nilai Rf (Retention factor) dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut ini (Stahl 1985) : Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal penotolan Jarak garis depan dari titik awal penotolan
5
HPLC Analitik dan Preparatif Perbedaan antara kromatografi preparatif dan analitik biasanya berdasarkan pada ukuran kolom, ukuran partikel dan jumlah sampel yang diinjeksikan. Sedangkan perbedaan antara cara kerja HPLC analitik dan HPLC preparatif ditentukan berdasarkan keberhasilan dari proses pemisahan. Jika informasinya berupa keberhasilan proses pemisahan maka metodenya berupa kromatografi analitik dan jika tujuannya untuk mengumpulkan produk maka pemisahannya merupakan metode preparatif. Pada HPLC analitik sampel dapat diproses, dikendalikan dan dimodifikasi dengan cara apa saja yang sesuai untuk memperoleh informasi yang diperlukan, sedangkan dalam HPLC preparatif sampel dapat digunakan kembali sebelum menjalani pemisahan berikutnya (Ditz 2005). HPLC preparatif digunakan untuk purifikasi atau isolasi senyawa murni atau senyawa utama dari fraksi-fraksi sebelumnya yang diperoleh dari metode kromatografi kolom lainnya. Dengan kromatografi preparatif diharapkan dapat diisolasi sejumlah besar molekul organik yang diinginkan, dengan cara memperbesar konsentrasi sampel, volume injeksi atau kombinasi keduanya (Piecha et al. 2007). Elusidasi Struktur Molekul Elusidasi struktur merupakan suatu proses yang dilakukan untuk menentukan rumus struktur dari suatu senyawa yang dilakukan dengan teknik spektroskopi. Teknik ini memanfaatkan jejak suatu molekul yang dikonversi menjadi sinyallistrik dan dicatat oleh suatu pencatat (rekorder). Dalam mengelusidasi struktur diperlukan data spektrum dari suatu sampel, baik berupa spektrum UV-Vis, IR, MS dan NMR (Panji 2002). Spektroskopi UV Untuk keperluan penentuan struktur, spektroskopi UV memiliki kemampuan untuk mengukur jumlah ikatan rangkap atau konjugasi aromatik dalam suatu molekul. Daerah panjang gelombang dari spektrum UV berkisar 200 - 400 nm. Penyerapan sinar ultra violet oleh suatu molekul akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik molekul tersebut. Transisi tersebut terjadi pada orbital ikatan atau pasangan elektron bebas dengan orbital anti ikatan. Sistem (gugus atom) yang menyebabkan terjadinya absorbsi cahaya disebut kromofor (Pavia et al. 2009). Spektroskopi IR Spektrum IR dapat memberikan informasi mengenai gugus fungsi yang terdapat pada suatu molekul. Hal ini disebabkan oleh perbedaan frekuensi vibrasi setiap jenis ikatan kimia. Frekuensi vibrasi juga berbeda pada jenis ikatan yang sama pada molekul yang berlainan akibat dari perbedaan lingkungan yang dimiliki oleh ikatan tersebut. Perbedaan ini menyebabkan spektrum IR disebut sebagai spektrum sidik jari, dengan daerah sidik jari (finger print region) pada frekuensi 1300-900 cm-1. Setiap struktur molekul memiliki spektrum yang spesifik. Meski spektrum IR spesifik untuk setiap molekul, tetapi gugus fungsi yang berbeda memberikan pita-pita absorbsi di frekuensi yang sangat dekat. Hal ini berakibat spektrum IR tidak dapat digunakan sebagai satusatunya cara identifikasi struktur molekul. Spektrum IR lebih sering digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan gugus fungsi yang memiliki pita spesifik yaitu : C=O, O-H, N-H, C-O, C=C, C≡ N dan NO 2 . Saat ini ada dua macam instrumen yaitu
6
spektrofotometer IR dan FTIR (Fourier Transform Infrared). FTIR lebih sensitif dan akurat, misalkan dapat membedakan bentuk cis dan trans, ikatan rangkap terkonjugasi dan terisolasi dan lain-lain yang dalam spektrofotometer IR tidak dapat dibedakan (Sitorus 2009). Spektroskopi massa Spektrometer massa bekerja dengan memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai dengan rasio fragmentasi (m/z). Komponen utama dari alat ini adalah sumber ion (ion source) yang menghasilkan ion dan penganalisis massa (mass analyzer) yang menseleksi ion. Sistem LC-MS umumnya menggunakan beberapa jenis ion source dan mass analyzer yang dapat disesuaikan dengan kepolaran senyawa yang akan dianalisis. Spektroskopi massa (MS) akan melengkapi pelacakan struktur untuk suatu molekul yang belum diketahui bobot molekulnya. Spektroskopi massa akan memberikan informasi harga bobot molekul (g/mol) dan bagaimana pola pemecahan (fragmentasi) dari suatu molekul organik. Rekonstruksi terhadap fragmen dan dipandu dengan interpretasi data spektra IR dan 1H-NMR akan dapat mengelusidasi struktur molekul organik unknown (Sitorus 2009).
3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan dari bulan April 2012 – Maret 2013 di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Kimia Analitik dan Laboratorium Recovery Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Kawasan Puspiptek Serpong Gd. 630, Kota Tangerang Selatan – Provinsi Banten. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : Isolat aktinomisetes AT 00244, AT 00246, AT 00260, AT 00403 koleksi Balai Bioteknologi, BPPT. Standar antibiotik rifampisin dan nystatin (Phyto Technology Laboratories), etil asetat, nbutanol, (JT Baker), metanol HPLC (Merck), kloroform (Merck), asetonitril (Merck), plat KLT silika F 254 (Merck), silika gel 60 (0,063-0,200 mm). Mikroba uji yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus subtilis ATCC 66923, Candida albicans BIOMCC 00122 dan Aspergillus niger BIOMCC 00134. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi peralatan gelas, kertas cakram 6 mm (Whatman), neraca analitik (Denver), pH meter (Beckman), autoklaf, alat sentrifugasi Beckman J2-HS, Sonikator (Ultrasonic Processor XL 2020), konsentrator sentrifuge (TOMY CC-105), Fourier Transform Infra Red/FTIR (Bruker), High Performance Liquid Chromatography/HPLC (Waters 2695), incubator shaker (Takasaki Scientific Instrument), rotavapor (Buchi 461), mikrosentrifuge (Tomy/MX301), Liquid Chromatography-Mass Spectrometer/LC-MS (Premier-XE Waters).
7
Tahapan Penelitian Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan, yaitu persiapan kaldu fermentasi, ekstraksi dengan pelarut organik, uji aktivitas antimikroba, kromatografi lapis tipis, pemisahan dan pemurnian senyawa aktif dan identifikasi struktur kimia senyawa aktif. Persiapan Kaldu Fermentasi Peremajaan isolat menggunakan media agar ISP-2 (International Streptomyces Project 2) yang dilarutkan dalam akuades dengan dibantu proses pemanasan dan dihomogenkan menggunakan magnetik stirrer. Kemudian larutan dipipet sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi. Setelah itu media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C, 15 psi selama 15 menit. Tabung diletakkan dalam posisi miring dan dibiarkan hingga memadat selama semalam. Selanjutnya dilakukan inokulasi sebanyak 1 ose stok kultur ke dalam media miring tersebut dan diinkubasi pada suhu 25-28 °C selama 5-7 hari. Proses pembuatan kultur vegetatif dengan cara menuangkan 2 ml air steril ke dalam kultur agar miring, lalu dikocok hingga mikroba larut dalam suspensi. Selanjutnya dari suspensi tersebut diambil 0,2 ml (1% dari volume media) dan diinokulasikan ke dalam 20 ml medium YEME (Yeast Extract Malt Extract). Kultur diinkubasi pada suhu kamar selama 2 hari di dalam shaker di dalam ruang thermostatik. Tahap fermentasi dilakukan dengan cara mengambil 20 ml (20% dari volume media) kultur vegetatif dan diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer 500 ml yang berisi 100 ml medium BY (Bactopeptone Yeat Extract). Fermentasi dilakukan pada suhu kamar pada rotary shaker selama 5 hari. Dilakukan pengukuran pH, OD (Optical Density) dan PMV (Packed Micellium Volume) pada media sebelum disterilisasi, setelah penambahan inokulum dan setelah fermentasi selesai. Ekstraksi dengan Pelarut Organik Proses pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan mengikuti metode Atta et al. (2009) yang dimodifikasi. Proses ekstraksi dilakukan dengan menambahkan pelarut butanol untuk kaldu fermentasi dari isolat AT 00244 dan pelarut etil asetat untuk isolat AT 00246, AT 00260 dan AT 00403. Volume pelarut ditambahkan dengan perbandingan 1:1, kocok selama 1 jam dengan shaker lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Supernatan yang diperoleh selanjutnya dipisahkan dari filtrat dan dimasukkan ke dalam labu rotavapor yang telah diketahui berat konstannya. Pemekatan dilakukan menggunakan rotary vacuum evaporator dan ditimbang berat ekstrak kering yang diperoleh. Selanjutnya ekstrak kasar dilarutkan dengan metanol pada volume tertentu hingga menghasilkan suspensi ekstrak 20.000 ppm untuk keperluan uji aktivitas, purifikasi dan karakterisasi. Uji Aktivitas Antimikroba Uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar dengan menggunakan kertas cakram diameter 6 mm. Mikroba uji E. coli, S. aureus, P. aeruginosa dan B. subtilis ditumbuhkan pada medium NA (Nutrient Agar) sedangkan C. albicans dan A. niger ditumbuhkan pada PDA (Potato Dextrose Agar). Sebanyak 15 μl ekstrak sampel diteteskan dalam kertas cakram, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Selanjutnya diletakkan pada permukaan agar yang telah diinokulasikan 15 μl (106 sel/ml) mikroba uji per cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 °C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk diukur diameter zonanya (Prescott et al. 2002).
8
Penentuan Eluen Terbaik Pemisahan dengan kromatografi lapis tipis dilakukan menggunakan aluminium silika gel 60 F 254 (Merck). Ekstrak kasar dikembangkan dengan pelarut organik non polar sampai polar (benzena, dietil eter, kloroform, etil asetat, metilen klorida, butanol, iso propanol, n-propanol, aseton, metanol, etanol). Noda hasil pemisahan diamati dibawah UV 254 dan 366 nm. Pelarut yang dapat memisahkan komponen paling baik dan banyak maka digunakan sebagai eluen pada kromatografi kolom. Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Aktif Ekstrak yang sudah dipekatkan selanjutnya difraksinasi menggunakan kromatografi kolom (φ20 x 320 mm), dengan fasa diam silika gel 60 (0,063-0,200 mm) dan fasa gerak butanol, iso-propanol dan metanol dengan sistem gradien. Tiap kelompok fraksi diuji aktivitas antimikrobanya untuk mendapatkan kelompok fraksi yang aktif. Kelompok fraksi aktif yang terpilih kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan menggunakan metoda HPLC preparatif, hingga diperoleh senyawa tunggal yang murni dan aktif. Purifikasi menggunakan HPLC preparatif Waters 2695, dengan detektor Photo Diode Array (PDA) dan jenis kolom Sperisorb 5μ C18 4,6x150 mm. Volume injeksi sebesar 100 μl per injeksi dan kecepatan alir 1 ml/menit dengan fasa gerak 5 100% campuran asetonitril–air selama 25 menit (Kazakevich dan Lobrutto 2007). Identifikasi Struktur Kimia Senyawa Aktif Gugus fungsional senyawa aktif diidentifikasi menggunakan FTIR (Bruker) dan bobot molekul senyawa aktif ditentukan dengan LC-MS (Premier-XE Waters).
4 HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas ekstrak isolat Senyawa aktif dari aktinomisetes yang telah diregenerasi (Lampiran 1) diekstraksi dengan butanol. Hasil uji aktivitas ekstrak isolat aktinomisetes tanah asal Kalimantan Timur menunjukkan bahwa isolat AT 00244 memiliki kemampuan menghambat bakteri Gram positif S. aureus dan B. subtilis serta jamur C. albican dan A. niger (Lampiran 2). Isolat AT 00246 dan AT 00260 memberikan aktivitas hanya terhadap bakteri Gram positif tapi tidak aktif terhadap jamur. Sedangkan isolat AT 00403 tidak memiliki kemampuan menghambat semua mikroba uji tersebut. Isolat AT 00244 menghasilkan diameter zona bening yang paling besar terhadap mikroba uji S. aureus tetapi paling kecil terhadap mikroba uji B. subtilis. Untuk mikroba uji B. subtilis isolat yang menghasilkan diameter zona bening paling tinggi adalah AT 00246 (Tabel 1). Aktinomisetes AT 00244 memiliki sekuens yang 99% homolog dengan Streptomyces demainii (Nugrahini 2011). Tabel 1 Aktivitas ekstrak isolat aktinomisetes terhadap mikroba uji Kode Diameter zona bening ekstrak (mm) No. S. aureus B. subtilis E. coli P.aeruginosa C. albican isolat 1 AT 00244 18,17 18,16 18,01 2 AT 00246 17,74 18,66 3 AT 00260 17,82 18,51 4 AT 00403 -
A. niger
10,05 -
9
Pemilihan ekstrak potensial didasarkan pada diameter zona hambat, spektrum penghambatan dan stabilitas aktivitas penghambatannya terhadap beberapa mikroba uji. Berdasarkan hasil uji aktivitas maka isolat AT 00244 dipilih untuk dilanjutkan ke tahap purifikasi. Karena selain memberikan diameter zona bening yang lebih besar untuk mikroba uji S.aureus juga bersifat spektrum luas (aktif terhadap bakteri Gram positif dan jamur). Perbanyakan aktinomisetes penghasil antimikroba dilakukan dengan fermentasi isolat terpilih. pH media sebelum ditambahkan inokulum sebesar 6,67, setelah penambahan inokulum turun menjadi 6,20. Konsumsi gula oleh mikroba mengakibatkan terbentuknya asam-asam organik hasil hidrolisis gula yang dapat menurunkan derajat keasaman medium (Sanchez et al. 2010). Setelah proses fermentasi selesai pH meningkat menjadi 7,85. Artinya dengan bertambahnya waktu fermentasi maka nilai pH medium fermentasi aktinomisetes AT 00244 juga cenderung mengalami peningkatan. pH larutan semakin meningkat karena adanya tambahan nitrogen terlarut dari sel yang mati dan terjadinya deaminasi asam amino yang dapat menyebabkan kondisi kaldu fermentasi menjadi lebih basa ( Purwakusumah 1992; Wang et al. 1979). Sel disusun oleh beberapa protein organik, apabila terjadi kerusakan sel maka terjadi deaminasi asam amino yang mengakibatkan naiknya pH kaldu fermentasi. Pemanenan aktinomisetes AT 00244 dilakukan pada jam ke 120 yaitu pada saat nilai pH mencapai 7,85. Nilai pH ini sesuai untuk produksi antibiotik karena pada umumnya antibiotik akan diproduksi pada kisaran pH 7 sampai 8 (Sri et al. 2010). Pengukuran Packed Mycelial Volume (PMV) pada saat panen diperoleh 4,5%. Sedangkan nilai optical density (OD) yang dihasilkan sebelum penambahan inokulum 0,601 dan setelah penambahan inokulum 0,668. Kenaikan nilai OD ini menunjukkan adanya pertumbuhan mikroba. Rendemen yang diperoleh dari isolat AT 00244 sebesar 3, 897 g. Pemurnian dengan kromatografi kolom Tahap pemisahan dan pemurnian bertujuan untuk mendapatkan senyawa aktif tunggal yang murni dari ekstrak kasar. Ekstrak kasar difraksinasi melalui kolom kromatografi dengan menggunakan pelarut organik sesuai hasil yang diperoleh pada KLT. Tahap awal purifikasi adalah melakukan KLT terhadap ekstrak isolat AT 00244 dengan menggunakan beberapa pelarut organik dari non polar sampai polar seperti benzena, dietil eter, kloroform, etil asetat, metilen klorida, butanol, iso-propanol, npropanol, aseton, metanol, etanol (Lampiran 3). Hasil KLT ini merupakan dasar untuk menentukan pelarut organik yang dipakai pada kromatografi kolom (Lampiran 4). Berdasarkan hasil KLT ini dipilih pelarut organik butanol, isopropanol dan metanol. Pelarut ini menghasilkan spot lebih banyak dan terpisah dibandingkan yang lain. Sistem gradien dengan perbandingan 100:0:0 sampai 0:0:100 diaplikasikan pada kromatografi kolom. Hasil elusi gradien terhadap 1,5 g ekstrak kasar isolat AT 00244 diperoleh sebanyak 8 fraksi yaitu fraksi F1 – F8 (Lampiran 5). Fraksi F1 – F8 dikeringkan lalu ditimbang bobot masing-masing fraksi (Lampiran 6). Aktivitas fraksi F1 – F8 Uji aktivitas fraksi F1 – F8 dilakukan terhadap empat mikroba uji, yaitu B. subtilis, S. aureus, A. niger dan C. albicans. Terhadap bakteri Gram negatif tidak dilakukan pengujian lagi karena pada uji aktivitas ekstrak sebelumnya isolat AT 00244 memberikan hasil negatif. Hasil uji aktivitas fraksi F1 – F8 dapat dilihat pada Tabel 2.
10
Tabel 2 Aktivitas fraksi F1 – F8 terhadap mikroba uji Fraksi F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 Metanol Rifampisin 500 ppm Nystatin 500 ppm
S. aureus 17,38 17,31 17,80 17,65 17,45 17,82 19,55
Diameter zona bening (mm) B. subtilis A. niger C. albicans 17,53 17,46 17,71 18,40 17,69 17,56 18,02 17,79 17,66 17,69 17,68 17,48 19,22 18,70 18,47
Berdasarkan Tabel 2 fraksi F2 dan F3 tidak mempunyai aktivitas baik terhadap bakteri dan juga jamur . Fraksi F1 dan F4 hanya aktif terhadap mikroba uji S. aureus. Sedangkan fraksi F5, F6, F7 dan F8 mempunyai aktivitas terhadap semua mikroba uji. Diameter zona bening yang dihasilkan juga tidak jauh berbeda antara ke-empat fraksi yang aktif tersebut yaitu antara 17,45 – 18,20 mm. Jika dibandingkan terhadap kontrol antibiotik dan antifungi, diameter zona bening yang dihasilkan fraksi F5, F6, F7 dan F8 lebih kecil terhadap semua mikroba uji. Fraksi F5 – F8 dianalisis dengan HPLC untuk mengetahui profil senyawa yang ada pada masing-masing fraksi (Lampiran 7). Fase diam yang digunakan pada kolom HPLC adalah senyawa C18 yang bersifat non-polar, sehingga yang akan terelusikan terlebih dahulu dan muncul pada menit-menit pertama elusi adalah senyawa-senyawa polar karena senyawa-senyawa non-polar akan terikat pada fase diam dan muncul pada menitmenit terakhir elusi. Fraksi F5 – F8 memiliki profil (kromatogram) yang hampir sama. Hanya saja untuk fraksi F8 menghasilkan jumlah puncak yang lebih banyak dibandingkan dengan fraksi F5, F6 dan F7 (Gambar 2). Oleh karena itu fraksi F8 dipilih untuk tahap selanjutnya yaitu pemurnian dengan HPLC preparatif.
Gambar 2 Kromatogram fraksi F8 menggunakan kolom Sperisorb 5μ C18 4,6x150 mm, dengan detektor PDA, laju alir 1 ml/menit, fasa gerak gradien asetonitril 5-100% selama 0 –25 menit, volume injeksi 20 μl
11
Pemurnian dengan HPLC preparatif Pemurnian fraksi F8 dilakukan dengan HPLC preparatif menghasilkan 8 fraksi yaitu fraksi F8.1 – F8.8. Berdasarkan Tabel 3 fraksi F8.1, fraksi F8.2 dan fraksi F8.6 tidak mempunyai aktivitas terhadap mikroba uji. Sedangkan fraksi F8.3, F8.4, F8.5, F8.7 dan F8.8 memberikan hasil positif terhadap uji aktivitas (Lampiran 8). Berdasarkan hasil uji aktivitas, fraksi F8.5 dilanjutkan ke tahap selanjutnya. Fraksi ini dipilih karena menghasilkan diameter zona bening yang paling tinggi dibandingkan dengan fraksi lainnya. Tabel 3 Diameter zona bening fraksi F8.1 - F8.8 terhadap mikroba uji Fraksi
S. aureus
Diameter zona bening (mm) B. subtilis A. niger C. albicans
F8.1 F8.2
-
-
-
-
F8.3 F8.4 F8.5 F8.6 F8.7 F8.8 kontrol negatif Rifampisin 1000 Nystatin 1000
10,60 12,11 14,44 7,66 12,46 29,26
11,68 7,13 10,41 10,64 26,93
21,44
19,77
(a)
(b) Absorban Unit (AU)
Absorban Unit (AU)
Karakterisasi senyawa aktif fraksi F8.5 Hasil analisis fraksi F8.5 dengan HPLC menunjukkan bahwa senyawa aktif ini dicirikan dengan waktu retensi 11,95 menit (Gambar 3a) dan memiliki spektrum UV dengan serapan maksimum pada panjang gelombang 282 nm (Gambar 3b). Tahap selanjutnya adalah menganalisis fraksi F8.5 dengan FTIR untuk mengetahui gugus fungsi dari senyawa yang dihasilkan dan LC-MS untuk mengetahui perkiraan bobot molekulnya.
Waktu (menit)
282 nm
Panjang gelombang (nm)
Gambar 3 Kromatogram (a) dan spektrum (b) fraksi F8.5
12
Data spektrum inframerah isolat aktinomisetes fraksi F8.5 menunjukkan adanya gugus karbonil (C=O) dari suatu asam karboksilat pada daerah bilangan gelombang 1733 cm-1 yang puncaknya tajam dan sangat karakteristik. Pita serapan melebar dengan intensitas kuat pada daerah bilangan gelombang 3434 cm-1 yang diduga serapan dari gugus –OH terikat. Adanya gugus –OH ini didukung dengan munculnya serapan kuat pada bilangan gelombang 1257 cm-1 dari C–O alkohol. Pita serapan yang tajam dengan intensitas kuat pada bilangan gelombang 2925 cm-1 dan 2855 cm-1 diduga terdapat gugus –CH alifatik stretching. Dugaan ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah bilangan gelombang 1446 cm-1 dan 1387 cm-1 yang merupakan serapan dari –CH 2 dan –CH 3 bending. Sedangkan munculnya pita serapan tajam dengan intensitas kuat pada daerah bilangan gelombang 1593 cm-1 menunjukkan adanya gugus fungsi –C=C aromatik. Terdapat juga pita serapan C≡N nitril (Gambar 4 dan Tabel 4) (Sitorus 2009).
2223 2267
Gambar 4 Spektrum FTIR fraksi F8.5 Tabel 4 Bilangan gelombang dan gugus fungsi yang ada pada fraksi F8.5 Bilangan gelombang (cm-1) 1 3434 2 2925; 2855 3 2267; 2223 4 1733 5 1593 6 1446; 1387 *Sumber: (Sitorus 2009) No.
Gugus fungsi –OH –CH alifatik stretching C≡N nitril C=O karbonil asam karboksilat –C=C aromatik –CH 2 dan –CH 3 bending
Rujukan bilangan gelombang* 3500-3300 3000-2700 2250 1820-1600 1600 1500-1350
Analisis fraksi F8.5 dengan kromatografi cair yang ditandem dengan MS memberikan satu puncak dengan waktu retensi (t R ) 10,89 menit. Hasil LC-MS menunjukkan bahwa senyawa ini memiliki 16 atom karbon, 30 atom hidrogen, 6 atom nitrogen dan 6 atom oksigen, dengan rumus molekul C 16 H 30 N 6 O 6 dan berat molekul 402 Da dengan menunjukkan ion molekul pada 403,2282 [M+H]+ (Gambar 5).
13
Absorban Unit (AU)
403.2282
Gambar 5 Spektrum massa fraksi F8.5 Cara penentuan bobot molekul (BM) didasarkan pada softwareMS dimana alat mempunyai fungsi untuk menganalisis BM hanya pada puncak senyawa target, alat juga mempunyai resolusi tinggi (20000 Da) dan memiliki kemampuan membaca hingga 4 desimal. Selain itu alat dikalibrasi dengan NaF (untuk BM 50-2000 Da) dan NaI (untuk BM >2000 Da) sebagai senyawa pembanding ketika penentuan BM. Penetapan bobot molekul sebesar 403 Da berdasarkan bahwa BM ini merupakan molekul yang aktif dan bukan pecahan senyawa yang lebih besar dan alat bisa membedakan m/z (massa/muatan) sampai 0,001 Da. Penganalisis massa yang dipakai pada LC MS ini adalah TOF (Time of Flight). Dimana gaya elektromagnetik diberikan pada semua ion pada waktu yang sama sehingga menyebabkan ion akan dipercepat menyusuri flight tube. Ion yang lebih ringan akan berjalan lebih cepat dan akan terbaca di detektor terlebih dahulu. Sehingga rasio fragmentasi ion m/z ditentukan oleh waktu kedatangan ketika sampai detektor. Analisis massa TOF memiliki kisaran massa yang luas dan sangat akurat pada pengukuran massa suatu senyawa (Prasain 2012).
5 SIMPULAN DAN SARAN Isolat aktinomisetes asal Kalimantan Timur AT 00244 setelah dipurifikasi dan dikarakterisasi dengan LC MS ESI-TOF menghasilkan senyawa aktif dengan diameter zona bening terhadap Bacillus subtilis 14,44 mm dan Staphilococus aureus 10,41 mm. Analisis dengan FTIR menunjukkan hasil bahwa senyawa tersebut mempunyai gugus fungsi karbonil (C=O) dari suatu asam karboksilat, gugus OH, gugus C–O alkohol, gugus –CH alifatik, gugus –CH 2 dan –CH 3, gugus fungsi –C=C aromatik dan gugus C≡N nitril. Senyawa aktif ini memiliki bobot molekul 402 Da yang diperkirakan mempunyai rumus molekul C 16 H 30 N 6 O 6 . Untuk mengetahui struktur pasti pada senyawa aktif tersebut perlu dilakukan karakterisasi dengan Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
14
DAFTAR PUSTAKA Abdelmohsen UR. 2010. Antimicrobial activities from plant cell cultures and marine sponge-associated actinomycetes [dissertation]. Würzburg: Infection and Immunity Graduate School of Life Sciences Julius-Maximilians-University Würzburg; 14-15. Alcamo E. 1996.Fundamental of microbiology.Ed ke-4. California: Addison Wesley Longman, Inc. Atta HM, Dabour SMdan Desoukey SG. 2009. Sparsomycin Antibiotic Production by Streptomyces Sp. AZ-NIOFD1:Taxonomy, Fermentation, Purification and Biological Activities. American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 5 (3): 368-377. Berdy. 2005. Bioactive Microbial Metabolites. J. Anatibiotics.58.1-26. Cwala Z, Igbinosa EO, Okoh AI. 2011. Assessment of antibiotics production potentials in four actinomycetes isolated from aquatic environments of the Eastern Cape Province of South Africa. African J Pharm and Pharmacology. 5(2): 118-124. Depkes.2011. Buletin Jendela Data dan Informasi Kesehatan Pusat Data dan Informasi Kementrian Kesehatan RI.Vol 2.Triwulan 2.Halaman 3. Ditz R. 2005. Introduction of Liquid Chromatography-its History. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA. Weinheim. Dzen MS, Roekistiningsih, Santoso S, Winarsih S. 2003. Bakteriologi Medik. Edisi Pertama. Malang: Bayu Media Publishing. Hal. 224. Hahn E, Deinstrop. 2007. Applied Thin Layer Chromatography. R.G. Leach, Editor. Germany: Willey-VCH Verlag Gmbh & Co. KGaA. Hlm 59-131. H.M. Atta, S.M. Dabour and S.G. Desoukey. 2009. Sparsomycin Antibiotic Production by Streptomyces Sp. AZ-NIOFD1:Taxonomy, Fermentation, Purification and Biological Activities. American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 5 (3): 368-377. Jawetz E.1998. Prinsip kerja obat antimikroba in Katzung B, eds Farmakologi dasar dan klinik, EGC, Jakarta. 699-751 Jawetz E, Melnick J L, Adelberg E A. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika. Jakarta. Kafilzadeh F, Dehdari F, Kadivar E and Shiraz OB. 2012.Isolation of amylase producing aquatic actinomycetes rom the sediments of mangrove forests in south of Iran.African Journal of Microbiology Research.6281-85. Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. 2007.Basic and Clinical Pharmacology, 11ed. USA: Lange-Mc Graw Hill Co. Kavanagh F. Analitical microbiology. Vol II. Newyork and London: Academic Press. 1972. p. 190-1 Kazakevich Y, Lobrutto R. 2007. HPLC for pharmaceutical scientists. New Jersey: A John Wiley & Sons Inc. Miyado S, Tsuchizaki N, Ishikawa J & Hotta K. 2002.Digital Atlas of Actinomycetes.Edited by Asakura Publishing Co., Tokyo, Japan. Nugrahini NIP. 2011. Isolasi, uji aktivitas, dan purifikasi parsial senyawa antibiotik dari isolat jamur dan aktinomisetes tanah Kalimantan Timur. [Tesis]. Universitas Brawijaya. Malang. Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS, dan Vyvyan JR. 2009.Introduction to Spectroscopy.Fourth Edition. Belmont. USA Pelaez F. 2006. The historical delivery of antibiotic from microbial natural products.J Biochem Phar 71: 981-990.
15
Pelczar M J & Chan E C S. 1988. Penerjemah: Hadioetomo R S dkk. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jilid 2. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Pharma Materials Management Clubs.2004. The Market for Pharmaceutical Products and Materials in Indonesia, PT Data Consult, Jakarta. Piecha T, Steiner F dan Schiell. 2007. Improving Productivity of Preparative LC Systems with Advanced Samples Injection Procedures. PITTCON 2007 Presentation Prasain JK. 2012. Tandem mass spectrometry – Application and Principles. InTech. Pratiwi ST. 2008.Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga. Hal.111-117. Prescott, Harley, Klein. 2002. Microbiology. Fifth Edition. New York: The McGraw−Hill Companies. Purwakusumah ED. 1992. Perbandingan fermentasi antibiotik oleh Streptomyces sp. S34 dan dua rekombinasinya pada beberapa medium. Buletin Kimia. IPB. Ravikumar S, Fredimoses M, Gnanadesigan M. 2012. Anticancer property of sediment actinomycetes against MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines.Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 92-96. Sunaryanto R. 2011. Isolasi, purifikasi, identifikasi dan optimasi medium fermentasi antibiotik yang dihasilkan oleh aktinomisetes laut. [disertasi]. Sekolah Pascasarjana IPB. Salasia, SIO, Khusnan Z, Lammler C and Zschöck M. 2004. Comparative studies on phenotypic and genotypic properties of Staphylococcus aureus, isolated from bovine subclinical mastitis in Central Java in Indonesia and Hesse in Germany. J. Vet. Sci. 5 (2), 103-109. Setiabudy, R. dan V.H.S. Gan. 2003. Farmakologi dan Terapi. Edisi 4.Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta. 571-583. Sanchez S et al. 2010. Carbon source regulation of antibiotic production. J Antibiot 63: 442-459. Shindo K, Michiko M, Hiroyuki K. 1995. Studies on cochleamycins, novel antitumor antibiotics. J Antibiot 49(3): 249-253. Sitorus M. 2009. Spektroskopi Elusidasi Struktur Molekul Organik. Graha Ilmu.Yogyakarta. Smriti Singh, Pramod Kumar, N Gopalan, Bhuvnesh Shrivastava, RC Kuhad, Hotam Singh Chaudhary.2012. Isolation and partial characterization of actinomycetes with antimicrobial activity against multidrug resistant bacteriaAsian Pacific Journal of Tropical Biomedicine S1147-S1150. Sri DG, Udin LZ, Ika GK, Viena S. 2010. Studi Biosintesis Antibiotikadan Aktivitas Antibiotika dari Jamur Penicillium chrysogenum padaBerbagai Kondisi Proses Fermentasi. Pusat Penelitian KimiaLIPI. Bandung. Stahl E. 1985.Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, ITB : Bandung. Suwandi U. 1993. Skrining Mikroorganisme Penghasil Antibiotik. Cermin Dunia Kedokteran No. 89 Hal: 46-48. Panji T. 2012. Teknik Spektroskopi Untuk Elusidasi Struktur Molekul. Graha Ilmu. Yogyakarta. Tristiyanto. 2009. Studi Aktivitas Antibakteri dan Identifikasi Golongan Senyawa Ekstrak Aktif Antibakteri Buah Gambas (Luffa acutangula Roxb). Skripsi FMIPA UNS. Surakarta. Wang DIC, Cooney CL, Demain AL, Dunhill P, Humprey AE, Lily MM. 1979. Fermentation and Enzym Technology. London: Willey Interscience.
16
Yacine Goudjal, Omrane Toumatiaa, Amine Yekkoura, Nasserdine Sabaoua,Florence Mathieuc, Abdelghani Zitouni. 2013. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off and promotion of tomatoplant growthby endophytic actinomycetes isolated from nativeplants of Algerian Sahara. Microbiological Research.
17
Lampiran 1 Gambar isolat aktinomisetes hasil regenerasi
AT 00244
AT 00246
AT 00260
AT 00403
Lampiran 2 Aktivitas ekstrak isolat aktinomisetes
B. subtilis
P.aeruginosa
Keterangan:
1)
S. aureus
C. albican
AT 00244 2) AT 00246 3) AT 00260
E. coli
A. niger
18
Lampiran 3 Kromatogram ekstrak isolat AT 00244 dengan beberapa pelarut organik tunggal dan campuran
Lampiran 4 Nilai Rf ekstrak isolat AT 00244 dengan berbagai pelarut organik
0,2 0,2; 1,2 0,2 0,2; 2,5 0,2 0,2; 1,2; 2,7; 5,5 0,5; 1,4; 4,3 1; 4,4 0,3 5,4; 5,9 1,4; 3; 5,8 1; 1,5; 5,4 1,75; 4; 5,5; 7 3,2; 6
Jarak tempuh eluen (cm) 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
0,03 0,03; 0,15 0,03 0,03; 0,31 0,03 0,03; 0,15; 0,34; 0,69 0,06; 0,18; 0,54 0,13; 0,55 0,04 0,68; 0,74 0,18; 0,38; 0,73 0,13; 0,19; 0,68 0,22; 0,50; 0,69; 0,88 0,40; 0,75
3
0,5; 1,8; 4,6
8
0,06; 0,23; 0,58
4
0,7; 2; 3; 4,4
8
0,09; 0,25; 0,38; 0,55
3
4,7; 5,9; 7,3
8
0,59; 0,74; 0,91
4
1,4; 3,1; 4,1; 5,5
8
0,18; 0,39; 0,51; 0,69
Eluen
Jumlah noda
Jarak komponen (cm)
Benzena Dietil eter Kloroform Etil asetat Metilen klorida Butanol Iso propanol n-propanol Aseton Metanol Etanol Butanol : Iso-propanol (1:1) Iso-propanol : metanol (1:1) Metanol : butanol (1:1)
1 2 1 2 1 4 3 2 1 2 3 3 4 2
Butanol : iso-propanol : metanol (66:17:17) Butanol : iso-propanol : metanol (17:66:17) Butanol : iso-propanol : metanol (17:17:66) Butanol : iso-propanol : metanol (1:1:1)
Rf
19
Lampiran 5 Fraksi hasil fraksinasi ekstrak isolat aktinomisetes dengan kolom kromatografi
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
Lampiran 6 Bobot fraksi hasil pemisahan ekstrak isolat AT 00244 dengan kromatografi kolom Fraksi
Eluen Butanol:isopropanol:metanol
Bobot (g)
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
100:0:0 - 90:10:0 - 80:20:0 70:30:0 - 60:40:0 - 50:50:0 40:60:0 - 30:70:0 - 20:80:0 10:90:0 - 0:100:0 0:90:10 - 0:80:20 0:70:30 - 0:60:40 - 0:50:50 0:40:60 - 0:30:70 0:20:80 - 0:10:90 - 0:0:100
0,4550 0,1023 0,0993 0,0172 0,0737 0,0866 0,0388 0,0782
Lampiran 7 Kromatogram fraksi F5 – F8 Fraksi F5
31,649
1,40
1,20
1,00
29,026
17,027
15,013
10,037
7,452
33,300
0,20
4,466
2,108 2,358
0,40
3,167
0,60
6,342
AU
0,80
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00 Minutes
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
20
31,641
Fraksi F6 1,40
1,20
1,00
AU
17,367
0,80
33,283
6,401
10,211
0,20
7,531
4,493
2,369 3,153
2,064
0,40
15,700
0,60
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00 Minutes
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
Fraksi F7
31,650
1,40
1,20
17,517
AU
0,80
2,389
1,00
10,079
7,953
6,360
33,267
0,20
4,501
2,062
0,40
2,813 3,179
0,60
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00 Minutes
12,00
14,00
16,00
18,00 Minutes
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
Fraksi F8 31,655
1,40
1,20
33,267 10,00
17,014
10,055
8,00
10,972
8,012
7,084
6,209
0,20
4,494
0,40
2,210 2,808 3,195
0,60
17,833
AU
0,80
2,399
1,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
32,00
34,00
21
Lampiran 8 Aktivitas fraksi F8.3 – F8.8 terhadap mikroba uji
Keterangan: 1)F8.3 2)F8.4 3)F8.5 4)F8.6 5)F8.7 6)F8.8 K)Kontrol antimikroba M)Metanol E)Fraksi F8
Lampiran 9 Bagan alir penelitian
22
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Juli 1974 dari Ayah Muhamad Kaslim dan Ibu Enah Rochaenah. Penulis merupakan anak ke-empat dari lima bersaudara. Tahun 1994 penulis lulus dari Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor dan pada tahun yang sama penulis diterima sebagai tenaga honorer di PPP-Biotek BPPT. Pada tahun 1996 penulis diterima sebagai PNS di BPPT dan ditempatkan di Balai Pengkajian Bioteknologi Serpong. Tahun 1999 penulis melanjutkan pendidikan di Universitas Nusa Bangsa Bogor Jurusan Kimia dan lulus pada tahun 2003. Pada tahun 2010 penulis berkesempatan mendapatkan beasiswa dari Kementerian Riset dan Teknologi untuk menempuh program Magister di Institut Pertanian Bogor.
