Penapisan, Isolasi dan Karakterisasi α-Amilase Pendegradasi Pati Kentang dari Isolat Danau Kakaban, Kalimantan Timur
SKRIPSI
Lulu Setiyabudi 10505090
PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2009
Penapisan, Isolasi dan Karakterisasi α-Amilase Pendegradasi Pati Kentang dari Isolat Danau Kakaban, Kalimantan Timur
(Screening, Isolation and Characterization of Potato Starch Degrading α-Amylase from Kakaban Lake Isolates, East Kalimantan)
SKRIPSI
Lulu Setiyabudi 10505090
PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2009
Abstract
α-Amylase, 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.1) is a biocatalyze which hydrolyses α-1,4 glycosidic linkages of starch to produce oligosaccharide and dextrin. α-Amylases from microorganism have been studied but only a few marine organism identified have an α– amylases activities. Kakaban lake is a landlocked marine lake. The purpose of this research was to screen, isolate and characterize of potato degrading α–amylase from Kakaban lake isolates, East Kalimantan. Screening of α–amylase activity from 40 Kakaban Lake isolates by red amylopectine gave 6 isolates showing starch degrading activity. Morphology and physiology analysis of 16S rDNA gene show that isolates KBU 1-6L and KBU 2-FL are Bacillus epiphytus and Pseudoalteromonas sp., respectively. Zimogram analysis also showed that they secrete α-amylases. The activity of isolate KBU 1-6L α-amilase from saturated ammonium sulphate 0-80% fraction at 50 oC, pH 7.0 was 169. 17 U/mL.
ii
Abstrak
α-Amilase, 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.1) merupakan biokatalis hidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik pada pati yang menghasilkan produk berupa dekstrin. Saat ini enzim α-amilase dari berbagai mikroorganisme telah banyak diteliti, namun masih sedikit dari mikroorganisme laut yang diketahui mempunyai aktivitas α-amilase. Danau Kakaban merupakan air laut yang terperangkap karang di sekelilingnya. Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan penapisan, isolasi dan karakterisasi α-amilase pendegradasi pati kentang dari isolat Danau Kakaban, Kalimantan Timur. Hasil penapisan aktivitas α-amilase dari 40 isolat bakteri Danau Kakaban terhadap red amylopectine diperoleh enam isolat bakteri yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi pati. Uji morfologi, fisiologi dan analisis 16S rDNA menunjukkan bahwa isolat KBU 1-6L dan KBU-2-FL merupakan Bacillus epiphytus dan Pseudoalteromonas sp. Analisis zimogram yang dilakukan membuktikan pula adanya ekspresi α-amilase. Aktivitas α-amilase hasil fraksinasi amonium sulfat 0-80% yang diukur pada 50 oC, pH 7,0 sebesar 169,17 U/mL.
iii
Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung
menerangkan bahwa Skripsi dari:
Nama : Lulu Setiyabudi NIM
: 10505090
telah disetujui sebagai persyaratan untuk mendapatkan gelar Sarjana Kimia
Bandung,
Juni 2009
Pembimbing
Dr. Dessy Natalia NIP 131 923 763
iv
Dan siapa yang tidak merasakan pahitnya menuntut ilmu sekejap pun Niscaya dia meneguk hinanya kebodohan sepanjang hidupnya... Dan siapa yang ketinggalan belajar di masa mudanya Maka ucapkanlah takbir tiga kali kepadanya karena kematiannya... -Abdul Malik bin Muhammad al-Qasim dalam Pewaris Nabi-
Kupersembahkan untuk: Mama, Bapa, Adik dan Kakak tercinta serta sahabat, kawan yang terlupakan...
Daftar Isi
Abstract .................................................................................................................................... ii Abstrak .................................................................................................................................... iii Ucapan Terima Kasih .............................................................................................................. x 1
Pendahuluan ...................................................................................................................... 1
1.1
Latar Belakang ............................................................................................................... 1
1.2
Rumusan Masalah .......................................................................................................... 1
1.3
Tujuan ............................................................................................................................ 2
2
Tinjauan Pustaka ............................................................................................................... 3
2.1
Pati Kentang ................................................................................................................... 3
2.2
Metabolisme Pati pada Tumbuhan ................................................................................. 4
2.3
Amilase .......................................................................................................................... 6
2.4
Mekanisme Katalitik ...................................................................................................... 7
2.5
Bakteri Laut Penghasil α-Amilase ................................................................................. 8
2.6
α-Amilase Pendegradasi Pati Kentang ........................................................................... 8
2.7
Danau Kakaban .............................................................................................................. 9
2.8
Penapisan Aktivitas α-Amilase .................................................................................... 10
2.8.1.
Teknik pembentukan kompleks pati-iodin................................................................ 10
2.8.2.
Teknik degradasi pati-remazol brilliant blue ............................................................ 11
2.8.3.
Teknik degradasi red amylopectine .......................................................................... 12
2.9 2.9.1.
Aktivitas α-Amilase ..................................................................................................... 12 Metode Fuwa ............................................................................................................ 13
2.9.2. 3
Metode DNS ............................................................................................................. 13
Metode Penelitian ............................................................................................................ 14
3.1
Alat................................................................................................................................ 14
3.2
Zat kimia ....................................................................................................................... 15
3.3
Bakteri dan media pertumbuhan .................................................................................. 15
3.4
Pembuatan Red Amylopectine ....................................................................................... 15
3.5
Penapisan Aktivitas α–Amilase .................................................................................... 16
3.6
Penapisan Aktivitas α–Amilase Pendegradasi Pati Kentang ........................................ 16
3.7
Sterilisasi Pati............................................................................................................... 16
3.8
Penentuan Jenis Pati Penginduksi α–Amilase.............................................................. 16
3.9
Isolasi dan Produksi α–Amilase ................................................................................... 17
3.10
Fraksinasi Amonium Sulfat dan Dialisis .................................................................... 17
3.11
SDS-PAGE dan Analisis Zimogram .......................................................................... 17
3.12
Uji Aktivitas α–Amilase Pendegradasi Pati Kentang ................................................. 18
3.13
Penentuan pH Optimum .............................................................................................. 18
3.14
Pengaruh Konsentrasi Garam terhadap Aktivitas α–Amilase ..................................... 19
3.15
Identifikasi Isolat Bakteri Danau Kakaban ................................................................. 19
3.15.1
Isolasi DNA kromosom ........................................................................................... 19
3.15.2
Amplifikasi gen 16s rDNA ...................................................................................... 20
3.15.3
Pemurnian GFX dan penentuan urutan nukleotida .................................................. 20
3.15.4
Penentuan hubungan kekerabatan ............................................................................ 20
4
Hasil dan Pembahasan ..................................................................................................... 22
4.1
Penapisan Aktivitas α-Amilase dengan Red Amylopectine .......................................... 22
4.2
Penapisan Aktivitas α-Amilase Pendegradasi Pati Kentang ........................................ 24
4.3
Produksi α-Amilase ...................................................................................................... 25
4.4
Pengaruh pH terhadap Aktivitas α-Amilase ................................................................. 27
vii
4.5
Pengaruh Konsentrasi Garam terhadap Aktivitas α-Amilase ....................................... 28
4.6
Identifikasi Isolat Danau Kakaban ............................................................................... 29
5
Simpulan dan Saran ......................................................................................................... 28
5.1
Simpulan ...................................................................................................................... 28
5.2
Saran............................................................................................................................. 28
Daftar Pustaka ........................................................................................................................ 31 Lampiran ................................................................................................................................ 35
viii
Daftar Gambar
Gambar 2. 1 Pola difraksi sinar X butir pati kompleks amilosa .............................................. 4 Gambar 2. 2 Skema biosintesis pati ......................................................................................... 5 Gambar 2. 3 Stereokimia dari struktur α-amilase .................................................................... 6 Gambar 2. 4 Mekanisme katalitik α-amilase ........................................................................... 7 Gambar 2. 5 Peta lokasi Danau Kakaban ................................................................................. 9 Gambar 2. 6 Struktur pati-iodin ............................................................................................. 10 Gambar 2. 7 Struktur pati-remazol brilliant blue .................................................................. 11 Gambar 2. 8 Struktur cibacron brilliant red 3b-a .................................................................. 12 Gambar 2. 9 Struktur DNS..................................................................................................... 13 Gambar 4. 1 Hasil penapisan aktivitas α-amilase dengan red amylopectin ........................... 23 Gambar 4. 2 Aktivitas α-amilase selama tiga hari masa pertumbuhan .................................. 23 Gambar 4. 3 Hasil penapisan α-amilase pendegradasi pati kentang ...................................... 24 Gambar 4. 4 Hasil penapisan aktivitas α-amilase pendegradasi butir pati kentang ............... 25 Gambar 4. 5 SDS-PAGE dan zimograf ................................................................................. 26 Gambar 4. 6 Kurva aktivitas α-amilase terhadap variasi pH ................................................ 27 Gambar 4. 7 Kurva aktivitas α-amilase terhadap variasi konsentrasi garam ........................ 28
ix
Daftar Tabel
Tabel 4.1 Hasil penentuan kekerabatan dari isolat KBU 1-6L .............................................. 29 Tabel 4.2 Analisis morfologi dan fisiologi dari isolat KBU 1-6L ......................................... 30
x
Ucapan Terima Kasih
Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala yang telah melimpahkan rahmat, kasih serta karunia-Nya, sehingga penulis mampu menyelesaikan tugas akhir dengan lancar. Penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Dr. Dessy Natalia atas bimbingan yang diberikan selama penelitian tugas akhir serta kesabaran dalam menghadapi anak bimbingannya. 2. Dr. I Made Arcana atas bimbingannya sejak tingkat pertama hingga tingkat tiga. 3. Dr. Rukman Hertadi, yangtelah memberikan inspirasi pada penulis untuk menekuni bidang keahlian biokimia. 4. Dr. Aminudin Sulaeman, Dr. Didin Mujahidin, dan Dr. Irma Mulyani selaku dosen penguji dalam ujian sidang sarjana. 5. Segenap dosen dan staf karyawan Program Studi Kimia ITB. 6. LPKM-ITB atas segala usaha dan bantuan beasiswa yang telah diberikan kepada penulis selama perkuliahan di ITB. 7. Mama, Bapa, Adik serta Kakak tercinta atas sumbangan moril dan matriil, sehingga penulis mampu menjalani masa perkuliahan di ITB dengan penuh makna. 8. Al Ustadz Abu Hamzah Yusuf Al Atsary atas bimbingan yang telah diberikan selama penulis berada di Bandung. 9. Pak Yayat, Pak Edi, Pak Dadan, Ibu Esyar atas bantuannya selama penulis bekerja di laboratorium. 10. Senior laboratorium penelitian tugas akhir: Bu Fe, Mas Fe, Kang Iman P, Kang Keni, Teh Ana, Teh Ogi, Kang Edu, Kang Edo atas diskusi, curhat serta canda tawa selama di laboratorium penelitian tugas akhir. Kang Iman N., Bu Iis, Kang Pasjan, Bu Harti, Teh Ferra, serta Teh Inda atas bantuan, kesan, pesan yang telah diberikan. 11. Teman satu bimbingan: Irfan, Liza dan Marcel atas semua kesan unik yang telah diberikan di tahun terakhir.
xi
12. Sahabat: Khatta, Azis, Dedi, Jalal, Fillian, Wawi, Icha, Mayang, Dedi, Tina, Rifty, Karim, Eca, Zakky, Koyim, Athiya atas kebersamaannya selama ini. 13. Teman satu laboratorium penelitian bikimia: Mia, Nia, Kusniar, Wafaa, Ecu, Gestria, Citra, Kiki, Werdi, Solihin, Wiwit atas diskusi, curhat serta kebersamaan selama penelitian tugas akhir. 14. Seluruh teman-teman Kimia ITB angkatan 2005 serta semua pihak yang turut membantu yang tidak dapat disebutkan satu-persatu. Saran serta kritik sangat penulis harapkan. Semoga hasil pekerjaan ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Bandung, Juni 2009
Penulis
xii
