PROTEASE FIBRINOLITIK DARI MIKROBA PANGAN FERMENTASI ONCOM MERAH DAN TEMPE GEMBUS DIANA NUR AFIFAH

PROTEASE FIBRINOLITIK DARI MIKROBA PANGAN FERMENTASI ONCOM MERAH DAN TEMPE GEMBUS

DIANA NUR AFIFAH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di setiap bagian akhir Bab pada disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor,

Desember 2014 Diana Nur Afifah NIM F261100071

RINGKASAN DIANA NUR AFIFAH. Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO, DAHRUL SYAH, dan YANTI. Penyakit kardiovaskuler seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi, dan stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Dasar patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan bekuan fibrin atau trombus yang melekat pada dinding pembuluh darah yang terluka. Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang terbentuk dari fibrinogen oleh trombin. Enzim fibrinolitik dari mikroba pangan telah menarik perhatian untuk diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik. Genus Bacillus dari pangan fermentasi dapat menghasilkan enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto, pangan fermentasi kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK). Beberapa genus Bacillus lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah ditemukan mampu menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B. amyloliquefaciens DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina, Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea, Bacillus sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea, dan Bacillus sp. KA38 dari jeotgal, ikan asin fermentasi dari Korea. Penelitian ini berhasil mengisolasi bakteri penghasil protease fibrinolitik dari pangan fermentasi Indonesia, oncom merah dan tempe gembus. Empat puluh tiga isolat menunjukkan aktivitas proteolitik pada media skim milk agar (SMA), dan 38 diantaranya menunjukkan aktivitas fibrinolitik baik berdasarkan uji cakram fibrin maupun zimogram dengan substrat fibrinogen. Dua isolat terbaik, yaitu RO3 dari oncom merah dan 2.g dari tempe gembus, dipilih untuk diidentifikasi menggunakan kit API 50 CHB dan analisis 16S rRNA. Hasil uji biokimia menggunakan kit API 50 CHB khusus untuk Bacillus spp, menunjukkan bahwa isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (99,9%) dan isolat 2.g sebagai B. pumilus (99,7%). Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA telah dilakukan dan isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (96%) dan isolat 2.g sebagai B. pumilus (97%). Urutan nukleotida telah didaftarkan di GenBank dengan nomor akses AB968524 untuk isolat RO3 dan AB968523 untuk isolat 2.g. Tingginya biaya produksi enzim merupakan salah satu hambatan untuk keberhasilan penerapan enzim dalam industri. Pemilihan media merupakan faktor penting untuk produksi enzim. Bacillus licheniformis RO3 ditumbuhkan pada tiga jenis media yang berbeda, yaitu Luria-Bertani broth (LB), ½ LB + susu skim 1% (b/v) (LBS), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v) (LBO). Dalam media LB, B. licheniformis RO3 mampu menghasilkan protease dengan aktivitas tertinggi 0,024 U/ml atau 0,157 U/mg pada jam ke-36. Dalam media LBS, aktivitas tertinggi 0,022 U/ml atau 0,152 U/mg tercapai pada jam ke-48. Hasil terbaik ditunjukkan pada B. licheniformis RO3 yang ditumbuhkan pada media LBO dengan aktivitas protease tertinggi 0,051 U/ml atau 0,283 U/mg setelah 48 jam fermentasi. Hasil ini menunjukkan bahwa tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media yang baik untuk produksi protease fibrinogenolitik.

Protease fibrinogenolitik kasar yang dihasilkan dari B. licheniformis RO3 dengan media produksi LBO memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 60oC. Bacillus pumilus 2.g menghasilkan beberapa fraksi protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik kuat. Enzim fibrinolitik dengan berat molekul 20 kDa telah dimurnikan dari supernatan kultur B. pumilus 2.g dengan tahapan pengendapan amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion menggunakan matriks CMSephadex C-50, dan kromatografi hidrofobik menggunakan matriks Phenyl Sepharose 6-FF. Kemurnian enzim meningkat 16 kali lipat dengan yield 25% pada tahap akhir pemurnian. Enzim fibrinolitik murni stabil antara pH 5 hingga pH 9 dan suhu kurang dari 60℃. Aktivitas fibrinolitik meningkat dengan adanya 5 mM MgCl2 dan 5 mM CaCl2 tetapi dihambat oleh 1 mM PMSF, 1 mM SDS, dan 1 mM EDTA. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g mampu menghidrolisis substrat sintetik N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, substrat untuk subtilisin dan kimotripsin, secara efisien. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g termasuk dalam golongan protease serin kelompok subtilisin. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g dapat mendegradasi rantai α dan β dari fibrinogen dengan cepat tetapi tidak dapat mendegradasi rantai γ. Bacillus licheniformis RO3 dan B. pumilus 2.g menghasilkan beberapa protease ekstraseluler. Dari tiga fraksi protease ekstraseluler B. licheniformis RO3 yang dipisahkan menggunakan elektroforesis 2D dan identifikasi menggunakan MALDI-TOF-MS, diperoleh satu fraksi dengan BM 48 kDa dan pI 4.80 yang memiliki kemiripan dengan bacillopeptidase F dari B. licheniformis DSM 13 dengan skor protein 27. Tiga fraksi dari B. pumilus 2.g yang dipisahkan menggunakan SDS-PAGE dan identifikasi menggunakan MALDI-TOF-MS, dengan BM masing-masing 23, 20, dan 15 kDa juga hanya memiliki kemiripan dengan protein database dengan skor protein ≤ 74. Kemungkinan beberapa fraksi protein tersebut adalah baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya.

Kata kunci: protease fibrinolitik, oncom merah, tempe gembus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus

SUMMARY DIANA NUR AFIFAH. Fibrinolytic protease from fermented food red oncom and tempeh gembus microorganisms. Supervised by MAGGY T. SUHARTONO, DAHRUL SYAH, and YANTI. Cardiovascular diseases such as heart disease, high blood pressure, and stroke are the leading cause of death in the world, including Indonesia. Basic pathophysiology of myocardial infarction and stroke is the formation of fibrin clot or thrombus attached to an injured blood vessel walls. Fibrin is the major protein component of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin. Fibrinolytic enzyme from food microbes has attracted attention for thrombolytic agent. The genus Bacillus from fermented food can produce a strong fibrinolytic enzyme, such as Bacillus natto from natto, a fermented soy food from Japan that produce nattokinase (NK). The other Bacillus from various fermented food are B. amyloliquefaciens DC-4 from douchi, fermented soy food from China, Bacillus sp. CK from chungkookjang, soy sauce fermentation of Korea, Bacillus sp. DJ-2 strains and DJ-4 from doenjang, Korea, and Bacillus sp. KA38 from jeotgal, fermented salted fish from Korea. This study was able to isolate bacteria producing fibrinolytic proteases from Indonesian fermented food, red oncom and tempeh gembus. Forthy-three isolates showed proteolytic activities on skim milk agar, while thirthy-eight of them showed fibrinolytic activities both on fibrin plate and fibrinogen zymography. Two isolates, i.e. RO3 from red oncom and 2.g from tempeh gembus, were selected and identified using API CHB kit and 16S rRNA. The results of biochemical tests using API 50 CHB kit specifically for Bacillus spp, revealed that isolate RO3 was identified as B. licheniformis (99.9%) and isolate 2.g as B. pumilus (99.7%). Molecular identification based on 16SrRNAs gene was performed and isolate RO3 was confirmed as B. licheniformis (96%) and isolate 2.g was confirmed as B. pumilus (97%). The nucleotide sequences were deposited at GenBank with accession number AB968524 for isolate RO3 and AB968523 for isolate 2.g. The high cost of enzyme production is one of the barriers to successful application of enzyme in the industry. Selection of media is a critical factor for the enzyme production. Bacillus licheniformis RO3 was screened from red oncom, an Indonesian fermented food. Three types of media were analyzed, i.e. Luria-bertani broth (LB), ½ LB + 1% skim milk (LBS), and ½ LB + 1% red oncom powder (LBO). In LB media, B. licheniformis RO3 was able to produce protease with activity of 0.024 U/ml or 0.157 U/mg at 36 h fermentation. In LBS media, the highest activity was 0.022 U/ml or 0.152 U/mg at 48 h fermentation. The best result was shown when B. licheniformis RO3 was grown on LBO media with the highest protease activity was 0.051 U/ml or 0.283 U/mg at 48 h. These results indicate that red oncom flour can be used as a good media for fibrinogenolytic protease production. Crude fibrinogenolytic protease enzyme from B. licheniformis RO3 had an optimum pH and temperature at 8.0 and 60°C. Bacillus pumilus 2.g secretes several proteases that have strong fibrinolytic activities. A fibrinolytic enzyme with an apparent molecular weight of 20 kDa was purified from the culture supernatant of B. pumilus 2.g by sequential

application of ammonium sulfate precipitation 80%, ion-exchange chromatography by using CM-Sephadex C-50, and hydrophobic chromatography by using Phenyl-Sepharose 6-FF. After Phenyl-Sepharose chromatography step, the final purification fold was 16.0, and the yield was 25%. The partially purified enzyme was stable between pH 5 and pH 9 and temperature of less than 60℃. Fibrinolytic activity was increased by 5 mM MgCl2 and 5 mM CaCl2 but inhibited by 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium dodecyl sulfate (SDS), and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The partially purified enzyme quickly degrades the α and β chains of fibrinogen but cannot degrade the γ chain. Bacillus licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g secretes several extracellular proteases. Three B. licheniformis RO3 extracellular protease fractions was separated by 2D electrophoresis and identified by MALDI-TOF-MS. One fraction with molecular weight of 48 kDa and pI 4.80 had similiarity to bacillopeptidase F from B. licheniformis DSM 13 in protein score, that is 27. The three fraction of B. pumilus 2.g was separated by MALDI-TOF-MS. Each fraction of it has molecule weight of 23, 20 and 15 kDa and protein score ≤ 74 compared protein database. The results showed that there are some new protein fraction found in both extracellular fibrinolytic proteases produced by Bacillus licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g. Keywords: fibrinolytic protease, red oncom, tempeh gembus, licheniformis, Bacillus pumilus

Bacillus

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PROTEASE FIBRINOLITIK DARI MIKROBA PANGAN FERMENTASI ONCOM MERAH DAN TEMPE GEMBUS

DIANA NUR AFIFAH

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

Penguji pada Ujian Tertutup: Prof Dr Ir Made Astawan, MSc (Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian IPB) Dr Harsi D. Kusumaningrum (Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian IPB) Penguji pada Ujian Terbuka: Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD (Kepala Rumah Sakit Hewan IPB) Raymond R Tjandrawinata, PhD (Scientist and Corporate Development Director at Dexa Medica)

PRAKATA Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga disertasi dengan judul “Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus” ini berhasil diselesaikan. Disertasi ini merupakan salah satu syarat untuk mencapai gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Sebagian hasil penelitian dalam disertasi ini telah diajukan sebagai artikel ilmiah pada beberapa jurnal, yaitu 1) Proteolytic and fibrinolytic activities of several microorganisms screened from red oncom and tempeh gembus, Indonesian fermented soybean cakes, abstraknya telah dipresentasikan secara oral pada 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013, sedangkan artikel lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of Microbiology, 2) The use of red oncom powder as potential production media for fibrinogenolytic protease derived from Bacillus licheniformis RO3, telah dipresentasikan secara oral pada International Symposium on Food and AgroBiodiversity di Semarang pada 16 – 17 Sepetember 2014 dan artikel lengkapnya sedang dalam proses telaah untuk diterbitkan pada Proceedia Food Science Elsevier, 3) Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus pumilus 2.g isolated from tempeh gembus, an Indonesian fermented food, telah dipublikasikan pada Preventive Nutrition and Food Science Journal (PNF) Vol 19(3): 213-219, (4) Studi proteomik protease fibrinolitik ekstraseluler dari Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari pangan fermentasi indonesia. Terima kasih kepada Ibu Prof Dr Maggy Thenawidjaja Suhartono, Bapak Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr, dan Ibu Yanti, PhD selaku pembimbing yang telah banyak memberikan motivasi, arahan, dan bimbingan hingga terselesaikannya disertasi ini. Terima kasih kepada Prof Jeong Hwan Kim selaku pembimbing penelitian di Gyeongsang National University, Jinju, Korea. Terima kasih kepada penguji pada ujian tertutup: Prof Dr Ir Made Astawan, MSc dan Dr Harsi D. Kusumaningrum, serta penguji pada ujian terbuka: Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD dan Raymond R Tjandrawinata, PhD. Terima kasih kepada DIKTI, Kemendikbud, Republik Indonesia atas bantuan beasiswa BPPS tahun 2010-2014, bantuan program Sandwich-like tahun 2013, dan bantuan penelitian melalui program Hibah Bersaing atas nama Prof. dr. Muhammad Sulchan, M.Sc, DA Nutr, SpGK. Terima kasih kepada Universitas Diponegoro yang telah memberikan bantuan pendidikan dan bantuan penelitian melalui program Hibah Doktor dana PNBP Undip 2014. Terima kasih kepada teman-teman IPN 2010, 2011, 2012, atas kebersamaannya. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga, kedua orang tua, mertua, suami, anak-anak, kakak, adek, dan semua pihak yang telah membantu baik dalam pelaksanaan kuliah, penelitian, hingga penyusunan disertasi ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat untuk pengembangan ilmu dan pengetahuan di bidang Ilmu Pangan dan bidang terkait lainnya. Bogor, Desember 2014 Diana Nur Afifah

DAFTAR ISI DAFTAR ISI 1

2

3

4

5

PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Hipotesis Penelitian Daftar Pustaka

1 1 2 3 3

METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian

6 6

Tahapan Penelitian Penelitian Tahap I Penelitian Tahap II Penelitian Tahap III Penelitian Tahap IV

6 6 6 7 7

4

4

PROTEOLYTIC AND FIBRINOLYTIC ACTIVITIES OF SEVERAL MICROORGANISMS SCREENED FROM RED ONCOM AND TEMPEH GEMBUS, INDONESIAN FERMENTED SOYBEAN CAKES Abstract Introduction Materials and Methods Results Discussion Conclusion References

10

THE USE OF RED ONCOM POWDER AS POTENTIAL PRODUCTION MEDIA FOR FIBRINOGENOLYTIC PROTEASE DERIVED FROM Bacillus licheniformis RO3 Abstract Introduction Materials and Methods Results and Discussion Conclusion References

21

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A FIBRINOLYTIC ENZYME FROM Bacillus pumilus 2.g ISOLATED FROM TEMPEH GEMBUS, AN INDONESIAN FERMENTED FOOD Abstract Introduction Materials and Methods Results and Discussion References

31

10 10 11 13 17 18 18

21 21 22 24 29 29

31 31 32 34 39

6

7

8

STUDI PROTEOMIK PROTEASE FIBRINOLITIK EKSTRASELULER DARI Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g YANG DIISOLASI DARI PANGAN FERMENTASI INDONESIA

42

Abstrak Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Simpulan Daftar Pustaka

42 42 43 45 49 49

PEMBAHASAN UMUM Isolasi dan Identifikasi Mikroba dari Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus yang dapat Memproduksi Protease Fibrinolitik Pemanfaatan Tepung Oncom Merah sebagai Media Produksi Protease Fibrinogenolitik Mikroba Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Fibrinolitik Studi Proteomik Enzim Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi Daftar Pustaka

52 52

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran

69 69 69

LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP

57 59 63 65

1 1

PENDAHULUAN Latar Belakang

Penyakit kardiovaskular yang meliputi infark miokardial akut, penyakit jantung iskemik, penyakit jantung valvular, aritmia, tekanan darah tinggi, dan stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Pada tahun 2008, sekitar 17,3 juta orang meninggal karena penyakit kardiovaskular, atau 30% dari semua penyebab kematian global. Dari jumlah ini, 7,3 juta disebabkan oleh penyakit jantung koroner dan 6,2 juta disebabkan oleh stroke. Pada tahun 2030 diperkirakan jumlahnya akan meningkat hingga 23,6 juta orang (WHO 2011). Dasar patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan trombus atau bekuan fibrin yang melekat pada dinding pembuluh darah yang terluka. Akumulasi fibrin dalam pembuluh darah dapat mengganggu aliran darah dan merusak jaringan pada jantung, menyebabkan denyut jantung tidak teratur, serangan jantung, dan kematian. Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang terbentuk dari fibrinogen oleh trombin (Voet & Voet 1990). Serat fibrin yang tidak larut dapat dihidrolisis menjadi produk degradasi fibrin oleh plasmin, yang dihasilkan dari plasminogen oleh aktivator plasminogen seperti aktivator plasminogen jaringan, aktivator plasminogen vaskular, aktivator plasminogen darah, urokinase, faktor Hageman, dan kompleks plasminogen-streptokinase (Collen & Lijnen 1991). Terapi trombolitik melalui suntikan maupun oral oleh agen trombolitik untuk mendegradasi trombus dalam darah telah banyak diteliti dan dipraktekkan (Goldhaber & Bounameaux 2001; Tough 2005). Berdasarkan mekanisme kerjanya, agen trombolitik diklasifikasikan menjadi dua jenis. Pertama adalah aktivator plasminogen, seperti aktivator plasminogen jaringan (t-PA) (Collen & Lijnen 2004) dan urokinase (Duffy 2002), yang mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin aktif untuk mendegradasi fibrin. Jenis lainnya adalah plasmin-like protein, yang langsung mendegradasi fibrin dalam pembekuan darah, sehingga dapat melarutkan trombus dengan cepat dan sempurna. Lumbrokinase dari cacing tanah dan fibrolase dari bisa ular dikenal sebagai plasmin-like protein (Chen et al. 1991; Mihara et al. 1991). Meskipun t-PA dan urokinase masih banyak digunakan dalam terapi trombolitik, harganya yang mahal (100 mg t-PA adalah $2,750) dan adanya efek samping yang tidak diinginkan, seperti risiko pendarahan dalam usus ketika dikonsumsi secara oral (Peng et al. 2005), mendorong berbagai penelitian untuk mencari sumber agen trombolitik yang lebih murah dan lebih aman. Enzim fibrinolitik atau dikenal sebagai protease fibrinolitik dari mikroba telah menarik perhatian untuk diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik. Streptokinase dari Streptococcus hemolyticus dan stafilokinase dari Staphylococcus sp. telah terbukti efektif dalam terapi trombolitik (Collen & Lijnen 1994). Streptokinase tersedia dalam jumlah banyak dengan harga lebih murah (1,5x106 unit streptokinase adalah $320), namun selama proses produksi dan pemurnian mudah terkontaminasi oleh protein lain sehingga dapat menimbulkan efek antigenik dan jika digunakan secara berulang dalam waktu yang lama dapat menetralkan antibodi dan menimbulkan reaksi alergi (Turpie et al. 2002; Banerjee et al. 2004).

2 Genus Bacillus dari pangan fermentasi ternyata juga dapat menghasilkan enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto, pangan fermentasi kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK). Pemberian natto atau enzimnya secara oral tidak hanya dapat mendegradasi trombus secara langsung namun juga dapat meningkatkan pelepasan aktivator plasminogen endogen pada hewan percobaan dan subjek manusia (Sumi et al. 1990). Beberapa genus Bacillus lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah ditemukan mampu menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B. amyloliquefaciens DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina (Peng & Zhang 2002), Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea (Kim et al. 1996), Bacillus sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea (Choi et al. 2005; Kim & Choi 2000), dan Bacillus sp. KA38 dari jeotgal, ikan asin fermentasi dari Korea (Kim et al. 1997). Yoon et al. (2002) melakukan skrining secara sistematis terhadap strain penghasil enzim fibrinolitik dari berbagai pangan fermentasi komersial maupun buatan sendiri termasuk natto, chungkook-jang, doen-jang, jeot-gal, dan tempe, pangan fermentasi dari Indonesia dan berhasil mengisolasi Enterococcus faecalis yang mampu memproduksi enzim dengan aktivitas fibrinolitik yang tinggi. Berbagai temuan menarik tersebut menyiratkan bahwa dengan mengonsumsi makanan fermentasi yang mengandung protein tinggi dapat mencegah penyakit kardiovaskular. Mikroba penghasil enzim fibrinolitik yang ditemukan pada pangan fermentasi selain Bacillus, diantaranya adalah Fusarium sp. BLB dari tempe (Sugimoto et al. 2007) dan Rhizopus chinensis 12 dari arak beras, Cina (Xiao-lan et al. 2005). Bahan pangan lain yang terbukti memiliki aktivitas fibrinolitik diantaranya adalah jamur pangan. Sejumlah peneliti telah melaporkan bahwa kandungan senyawa aktif dalam berbagai jamur pangan, Cordyceps militaris (Kim et al. 2006; Choi et al. 2011), Schizophyllum commune (Lu et al. 2010), Pleurotus eryngii (Cha et al. 2010), Volvariela volvaceae (Sajuthi et al. 2010) yang diduga dapat mempengaruhi sirkulasi darah adalah protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik. Adanya manfaat biologis yang menjanjikan dari mengonsumsi makanan sumber enzim fibrinolitik, terbuka kesempatan luas untuk mengeksplorasi sumber enzim fibrinolitik baru dari pangan fermentasi khas Indonesia. Oncom merah dan tempe gembus merupakan salah satu pangan fermentasi khas Indonesia yang banyak ditemukan di daerah Jawa Barat dan Jawa Tengah yang terbuat dari fermentasi ampas kedelai. Hingga saat ini belum ada penelitian mengenai enzim fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, baik penelitian isolasi bakteri penghasil enzim fibrinolitiknya maupun ekstraksi enzim fibrinolitik yang ada dalam oncom merah dan tempe gembus. Perumusan masalah Enzim fibrinolitik mikroba telah banyak ditemukan pada berbagai pangan fermentasi, baik pada pangan fermentasi nabati maupun hewani yang memiliki kadar protein tinggi. Penelitian mengenai enzim fibrinolitik mikroba pangan telah banyak dilakukan di luar negeri terutama Jepang, Korea, dan Cina. Penelitian di Indonesia mengenai enzim fibrinolitik mikroba masih terbatas padahal Indonesia dikenal sebagai negara yang kaya akan pangan fermentasi.

3 Kacang-kacangan seperti kedelai dan hasil perikanan yang difermentasi ternyata memiliki aktivitas fibrinolitik yang kuat. Pangan fermentasi kedelai yang terkenal di Indonesia adalah tempe, oncom, dan tempe gembus. Berbeda dengan tempe, oncom dan tempe gembus merupakan pangan fermentasi ampas kedelai. Ampas kedelai atau lebih dikenal sebagai ampas tahu adalah limbah hasil pembuatan tahu. Aktivitas fibrinolitik kuat dari mikroba yang diisolasi dari tempe telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Namun penelitian mengenai enzim fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, terutama mengenai isolasi mikroba penghasil enzim fibrinolitik maupun ekstraksi enzim fibrinolitik yang ada dalam oncom merah dan tempe gembus belum pernah dilaporkan. Dalam aplikasi khusus enzim pemecah fibrin, temuan mikroba fibrinolitik lokal adalah tahap awal yang harus diikuti tahap berikutnya yaitu mencari media produksi yang efektif dan efisien. Tingginya biaya produksi enzim merupakan salah satu hambatan suksesnya aplikasi enzim di industri. Pemilihan media produksi merupakan faktor kritis untuk fermentasi enzim fibrinolitik. Karakteristik enzim fibrinolitik mikroba pangan yang sudah terbukti aman dan efektivitasnya sebagai agen trombolitik perlu diketahui dengan baik. Karakteristik ini dapat diketahui menggunakan analisis biokimia. Informasi karakter enzim fibrinolitik mikroba dari pangan fermentasi asal Indonesia sangat diperlukan dalam aplikasi sebagai pangan fungsional maupun pengembangan selanjutnya sebagai obat trombolitik yang aman. Dari latar belakang yang telah dikemukakan, dirumuskan beberapa masalah yang dikaji lebih lanjut dalam penelitian, yaitu: apakah di dalam oncom merah dan tempe gembus ditemukan adanya mikroba penghasil protease yang bersifat fibrinolitik, apakah tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media untuk menumbuhkan mikroba penghasil protease yang bersifat fibrinogenolitik, bagaimanakah karakteristik dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh mikroba terpilih setelah dilakukan pemurnian? Tujuan Penelitian Tujuan umum dari penelitian yang dilaksanakan adalah melakukan kajian terhadap protease fibrinolitik mikroba dari oncom merah dan tempe gembus. Tujuan khusus dari penelitian yang dilaksanakan adalah: (1) memilah dan mengidentifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik, (2) memperoleh media yang baik untuk produksi enzim dengan pemanfaatan tepung oncom merah, (3) melakukan pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih, (4) melakukan studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi. Manfaat Penelitian Penelitian yang dilaksanakan bermanfaat untuk memperoleh informasi keberadaan mikroba penghasil enzim fibrinolitik pada pangan fermentasi berbasis kedelai asal Indonesia, oncom merah dan tempe gembus, dan informasi karakter dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan. Informasi ini berguna untuk

4 pengembangan pangan fungsional maupun pemanfaatan enzim sebagai obat trombolitik. Hipotesis Penelitian 1. 2. 3.

4.

Di dalam oncom merah dan tempe gembus terdapat mikroba penghasil protease fibrinolitik. Tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media pertumbuhan mikroba penghasil protease fibrinogenolitik. Enzim yang dihasilkan memiliki karakteristik tertentu uang selanjutnya dapat diaplikasikan dalam pengembangan pangan fungsional maupun dimanfaatkan sebagai obat untuk terapi penyakit kardiovaskular. Terdapat beberapa fraksi protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi terpilih.

Daftar Pustaka Banerjee A, Chisti Y, Banerjee UC. Streptokinase-a clinically useful thrombolytic agent. Biotechnology Advances 22:287–307. Cha WS, Park SS, Kim SJ, Choi D. 2010. Biochemical and enzymatic properties of a fibrinolytic enzyme from Pleurotus eryngii cultivated under solid-state conditions using corn cob. Bioresource Technology 101:6475–6481. Chen HM, Guan AL, Markland FS. 1991. Immunological properties of the fibrinolytic enzyme (fibrolase) from southern copperhead (Agkistrodon contortrix contortrix) venom and its purification by immunoaffinity chromatograph. Toxicon 29(6):683–694. Choi D, Cha W, Park N, Kim H, Lee JH, Park JS, Park S. 2011. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from fruiting bodies of Korean Cordyceps militaris. Bioresource Technology 102:3279–3285. Choi NS, Yoo KH, Hahm JH, Yoon KS, Chang KT, Hyun BH, Maeng PJ, Kim SH. 2005. Purification and characterization of a new peptidase, bacillopeptidase DJ-2, having fibrinolytic activity: produced by Bacillus sp. DJ-2 from Doen-Jang. J Microbiol Biotechnol 15(1): 72–79. Collen D, Lijnen HR. 2004. Tissue-type plasminogen activator: a historical perspective and personal account. J Thromb Haemost 2(4):541–546. Collen D, Lijnen HR. 1994. Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator with therapeutic potential? Blood 84(3):680–686. Collen D, Lijnen HR. 1991. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombosis. Blood 78:3114-3124. Duffy MJ. 2002. Urokinase plasminogen activator and its inhibitor, PAI-1, as prognostic markers in breast cancer: from pilot to level 1 evidence studies. Clin Chem 48(8): 1194–1197. Goldhaber SZ, Bounameaux H. 2001. Thrombolytic therapy in pulmonary embolism. Semin Vasc Med 1(2):213–220. Kim JS, Sapkota K, Park SE, Choi BS, Kim S, Hiep NT, Kim CS, Choi HS, Kim MK, Chun HS et al. 2006. A fibrinolytic enzyme from the medicinal mushroom Cordyceps militaris. The Journal of Microbiology 44(6):622-631.

5 Kim SH, Choi NS. 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biosci Biotechnol Biochem 64:1722–1725. Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, Kong IS. 1997. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. J Ferment Bioeng 84(4): 307–312. Kim W, Choi K, Kim Y. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. En iron. Microbiol. 62:2482-2488. Lu CL, Chen S, Chen SN. 2010. Purification and Characterization of a Novel Fibrinolytic Protease from Schizophyllum commune. Journal of Food and Drug Analysis 18(2):69-76. Mihara H, Sumi H, Yoneta T, Mizumoto H, Ikedo R, Seiki M, Maruyama M. 1991. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm Lumbricus rubellus. Jpn J Physiol 41(3): 461–472 Peng Y, Yang X, Zhang Y. 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl Microbiol Biotechnol 69:126–132. Peng Y, Zhang YZ. 2002. Optimation of fermentation conditions of douchi fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. Chin J Appl Environ Biol 8:285-289. Sajuthi D, Suparto I, Yanti, Praira W. 2010. Purifikasi dan pencirian enzim protease fibrinolitik dari ekstrak jamur merang. Makara sains 14(2):145-150. Sugimoto S, Fujii T, Morimiya T, Johdo O, Nakamura T. 2007. The fibrinolytic activity of a novel protease derived from tempeh producing fungus, Fusarium sp. BLB. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(9):2184-2189. Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. 1990. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol. 84:139-143. Turpie AG, Chin BS, Lip GY. 2002. Venous thromboembolism: treatment strategies. British Medical Journal 325:948–950. Tough J. 2005. Thrombolytic therapy in acute myocardial infarction. Nurs Stand 19(37):55–64. Voet D, Voet JG. 1990. Biochemistry. Ed ke-2. New York: Wiley. hlm 1087-1095. WHO. 2011. Global status report on noncommunicable diseases 2010. World Health Organization. Geneva. Xiao-lan L, Lian-Xiang D, Fu-Ping L, Xi-Qun Z, Jing X. 2005. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12. Appl Microbiol Biotechnol 67(2): 209–214. Yoon SJ, Yu MA, Sim GS, Kwon ST, Hwang JK, Shin JK, Yeo IH, Pyun YR. 2002. creening and characterization of microorganisms with fibrinolytic activity from fermented foods. J Microbiol Biotechnol 12(4): 649–656.

2 METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2012 sampai November 2013 di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati, IPB, Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan, SEAFAST center IPB, Laboratorium Biokimia dan Teknologi Enzim, Universitas Katholik Atma Jaya Jakarta, dan Laboratorium Mikrobiologi, Gyeongsang National University, Jinju, Korea. Tahapan Penelitian Penelitian akan melalui tiga tahapan, yaitu (1) isolasi dan identifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik, (2) pemanfaatan tepung oncom merah sebagai media produksi protease fibrinogenolitik mikroba, (3) pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih, (4) studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi. Penelitian Tahap I Penelitian tahap pertama adalah isolasi mikroba penghasil protease fibrinolitik dengan menggunakan media SMA. Sampel yang digunakan adalah oncom merah segar, oncom merah yang telah dipanaskan 80oC selama 15 menit, tempe gembus segar, dan tempe gembus yang telah dipanaskan 80oC selama 15 menit. Mikroba yang mampu menghasilkan zona bening ditumbuhkan dalam media Luria Bertani broth (LB) agar dapat memproduksi protease fibrinolitik. Protease fibrinolitik yang dihasilkan diuji aktivitasnya secara kuantitatif menggunakan cakram fibrin (Hwang et al. 2007) dan kualitatif dengan teknik zimografi. Substrat yang digunakan untuk zimografi adalah fibrinogen. Mikroba terpilih adalah yang mampu menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi substrat yang ditandai dengan adanya garis bening pada gel. Pada tahap isolasi diutamakan untuk mendapatkan mikroba yang aman dan dapat memproduksi protease fibrinolitik dengan berat molekul yang relatif rendah. Mikroba terpilih kemudian disimpan dalam gliserol sebagai stok bakteri untuk pengujian selanjutnya. Mikroba yang diharapkan adalah Bacillus yang aman dikonsumsi sehingga pemilihan isolat dilakukan dengan tahapan identifikasi isolat sebagai berikut: pewarnaan Gram yang dilanjutkan dengan pewarnaan spora, uji biokimiawi dengan kit API 50CHB dan APIWEBTM software, dan identifikasi secara molekuler dengan analisis 16S-rRNA. Penelitian Tahap II Tujuan dari tahap ini adalah pemanfaatan tepung oncom merah sebagai media pertumbuhan mikroba penghasil protease fibrinogenolitik. Mikroba yang dipilih adalah B. licheniformis RO3 yang diisolasi dari oncom merah. Mikroba ditumbuhkan dalam tiga media yang berbeda, yaitu media Luria Bertani broth

7 (LB), ½ LB + susu skim 1% (b/v), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v) pada suhu 37oC dalam inkubator goyang. Optical density (OD620), aktivitas protease (Bergmeyer & Grassl 1983), aktivitas fibrinogenolitik secara kualitatif dengan zimografi, dan konsentrasi protein (Bradford 1976) diukur setiap 12 jam sekali selama 72 jam. Penelitian Tahap III Penelitian tahap ketiga merupakan tahap pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih. Mikroba yang dipilih adalah B. pumilus 2.g yang diisolasi dari tempe gembus. Sebelum dilakukan pemurnian, pemilihan media produksi dilakukan pada 4 media yang berbeda, yaitu Luria Bertani broth (LB), tryptic soy broth (TSB), nutrient broth (NB), dan brain heart infusion (BHI). Pemurnian enzim dilakukan dengan pengendapan amonium sulfat, kromatografi penukar ion, dan kromatografi interaksi hidrofobik. Karakteristik yang diamati adalah berat molekul, stabilitas pH, stabilitas suhu, pengaruh inhibitor dan aktivator, spesifisitas substrat, dan degradasi fibrinogen. Penelitian Tahap IV Penelitian tahap keempat merupakan studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi. Mikroba yang dipilih adalah B. licheniformis RO3 dengan media produksi ½ LB + tepung oncom merah 1% (LBO) dan B. pumilus 2.g dengan media produksi NB. Studi proteomik diawali dengan elektroforesis satu dimensi, kemudian elektroforesis dua dimensi dan dilanjutkan identifikasi protein dengan Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF).

9 Tahap I Isolasi dan identifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik

Sampel

Tahap II Pemanfaatan tepung oncom merah sebagai media produksi protease fibrinogenolitik mikroba

Mikroba terpilih B. licheniformis RO3

Isolasi pada media SMA Fermentasi pada 3 media yang berbeda Isolat

Produksi pada media LB

Enzim (supertnatan)

Uji aktivitas protease, konfirmasi kemampuan fibrinolitik dengan cakram fibrin dan zimografi

Enzim (supernatan)

Uji aktivitas protease, aktivitas fibrinolitik dan konsentrasi protein Pengukuran OD620

Kondisi pertumbuhan terpilih Identifikasi isolat:  Pewarnaan gram dan spora  Uji biokimiawi dengan API 50CHB  Analisis 16S-rRNA

Produksi enzim Supernatan

Freezing dry Dua mikroba terpilih

Pelet (Enzim kasar) Karakterisasi biokimia enzim

Gambar 1 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap I dan II

9

Tahap III Pemurnian dan karakterisasi enzim fibrinolitik mikroba

Mikroba terpilih B. pumilus 2.g

Tahap IV Studi proteomik protease dari mikroba pangan fermentasi

Mikroba terpilih B. licheniformis RO3

Mikroba terpilih B.pumilus 2.g

Fermentasi pada 4 media yang berbeda

Produksi enzim

Produksi enzim

Kondisi pertumbuhan terpilih

Supernatan

Enzim murni

Elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE)

Elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE)

Elektroforesis dua dimensi (2D)

MALDI-TOF

MALDI-TOF

Identifikasi

Produksi enzim

supernatan salting-out dengan amonium sulfat

pelet Identifikasi dialisis dan freeze dry

Enzim kasar Kromatografi penukar ion, dialisis, freeze dry Enzim semi murni

Kromatografi interaksi hidrofobik, dialisis, freeze dry Enzim murni Karakterisasi biokimia enzim

Gambar 2 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap III dan IV

10

PROTEOLYTIC AND FIBRINOLYTIC ACTIVITIES OF SEVERAL MICROORGANISMS SCREENED FROM RED ONCOM AND TEMPEH GEMBUS, INDONESIAN FERMENTED SOYBEAN CAKES1

3

Abstract This study was to isolate, screen, and identify microorganisms from fermented food Red Oncom and Tempeh Gembus that can produce fibrinolytic proteases. Forthy-three isolates showed proteolytic activities on skim milk agar, while thirthy-eight of them showed fibrinolytic activities both on a fibrin plate and a fibrinogen zymography. The isolates that showed activity in fibrin plate and fibrinogen zymography with lower molecular weight and considered as safe were chosen and identified as Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus by using API CHB kit and 16S rRNA. The novel fibrinolytic microorganisms were referred to as B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g. Red Oncom and Tempeh Gembus are potential sources of microbial fibrinolytic protease. This is the first time that Red Oncom and Tempeh Gembus as Indonesian fermented foods based on soybean cake were shown having fibrinolytic microorganism. Microbial fibrinolytic enzymes from these fermented foods can be used for functional food formulation to prevent thrombosis and other related diseases. Keywords: microbial fibrinolytic enzyme, red oncom, zymography, B. licheniformis, B. pumilus Introduction Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world, including in Indonesia (WHO 2011). Accumulation of fibrin in the blood vessels usually results in thrombosis, leading to myocardial infarction and other cardiovascular diseases (Peng et al. 2005). Fibrin is the major protein component of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin. Insoluble fibrin can be hydrolyzed to fibrin degradation products by plasmin, which is generated from plasminogen by plasminogen activators such as tissue plasminogen activator, vascular plasminogen activator, blood plasminogen activator, urokinase, Hageman factor and plasminogen-streptokinase complex (Collen and Lijnen 2004). Thrombolytic therapy by injection and oral thrombolytic agents to degrade the thrombus in the blood have been widely studied and practiced (Tough 2005). Based on its mechanism of action, thrombolytic agents are classified into two types. The first is a plasminogen activator, such as tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase which activates plasminogen to plasmin and further hydrolyses fibrin (Collen and Lijnen 2004). Other type for thrombolytic therapy is using plasmin-like proteins, which directly degrade fibrin in the blood clotting, thus dissolve the thrombus quickly and perfectly. Lumbrokinase of earthworms and fibrolase of snake venom are known as plasmin-like protein (Mihara et al. 1991). Although t-PA and urokinase are still widely used in thrombolytic therapy, its price and the side effects possibility of undesirable such as the risk of bleeding in the gut when taken orally (Peng et al. 2005), prevent it’s normal utilization. 1

Abstraknya telah dipresentasikan secara oral pada 4 th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013, sedangkan artikel lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of Microbiology

11 This encourages study to find the source of thrombolytic agent that is cheaper and safer. Fibrinolytic enzyme originated from microbes has attracted the attention of many researchers to be applied as a thrombolytic agent. Streptokinase from Streptococcus hemolyticus and Staphylokinase from Staphylococcus sp. are potential alternative plasminogen activator and had proven effective in thrombolytic therapy (Banarjee et al. 2004). However, Streptokinase is available in large quantities at high prices and during the production and purification is easily contaminated by other proteins that can cause antigenic effect. Furthermore, repeated use for a long time can induce allergies (Banerjee et al. 2004). Recently, many fibrinolytic enzymes have been identified from traditional fermented foods such as Japanese Natto (Fujita et al. 1993), Chinese Douchi (Peng and Zhang 2002), Korean Doen-jang (Choi et al. 2005), Korean Cheonggukjang (Jeong et al. 2007) and Korean Meju (Jo et al. 2011a). These interesting reports imply some fermented foods contain enzymes that can potentially prevent cardiovascular diseases. This fact opens opportunities to explore new sources of fibrinolytic enzyme from typical Indonesian fermented food. Red Oncom and Tempeh Gembus are two of the typical Indonesian fermented foods made from fermented soy pulp. Until now there has been no research on the fibrinolytic enzyme from Red Oncom and Tempeh Gembus, either isolation of bacteria producing enzymes or extraction of fibrinolytic enzyme present in Red Oncom and Tempeh Gembus. The purpose of this study was to isolate, screen, and identify microbes from fermented food Red Oncom and Tempeh Gembus that can produce fibrinolytic proteases. Materials and Methods Materials Red oncom was obtained from the traditional markets in Bogor, West Java, whereas Tempeh Gembus was obtained from the traditional markets in Semarang, Central Java. Growth media including skim milk agar (SMA) was purchased from Difco. Luria-Bertani broth (LB) was made from yeast extract and tryptone were purchased from Oxoid. Fibrinogen from bovine plasma was purchased from Sigma. API 50CHB kit was purchased from bioMerieux. Isolation of Proteolytic Bacterial Strain Heat pretreatment at 80oC for 15 min was applied to some of the samples to avoid possible pathogen contamination. One-tenth gram of the sample was suspended in sterile physiological saline (0.85% NaCl). The suspension was plated on sterile skim milk agar (SMA), and then incubated at 37oC for 48 h. A clear zone of skim milk hydrolysis gave an indication of protease producing organisms. At the end of incubation period, the protease colonies were picked, purified and sent for further fibrinolytic screening. Fibrinolytic protease production A loop of selected microorganisms was cultivated in 25 mL LB broth and incubated at 37oC in a shaking incubator (120 rpm) for 48 h. At the end of

12 incubation, the fermentation broth was centrifuged at 6000 g at 4oC for 15 min. The clear supernatant was collected as source of enzyme. Analysis of protease activity and protein determination Protease activity was measured according to the Bergmeyer method (Bergmeyer et al. 1983) with casein (1%) as the substrate. As much as 50 μl enzyme filtrate was mixed with 250 μl substrate and incubated at 37oC for 10 min. Trichloroacetic acid (TCA) 0.1 M was added and incubated at 37oC for 10 min, and centrifuged at 4000 g for 10 min. The supernatant was mixed with Na2CO3 0.4 M, followed by addition of Folin Ciocalteau reagent (1:2) and incubated further at 37°C for 20 min. The reaction products were measured at λ 578 nm. Substrate solution without enzyme was used as control. One unit (U) of enzyme activity was defined as enzyme which produces 1 μmol of tyrosine per min. Protein concentration was analysed by Bradford’s method (1976) using reagents consisted of 100 mg Coomassie brilliant blue (CBB) G-250 in 50 ml ethanol 95% and 100 ml phosphate acid 85% in 1 liter. Bovine serum albumin was used as the protein standard. Triplicate experiments were conducted for each measurement. Screening of Fibrinolytic Bacterial Strain Fibrinolytic bacterial strain was screened by fibrin plate and fibrinogen zymography (Hwang et al. 2007). 0.2% fibrinogen solution in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8) was mixed with 2% agarose solution along with 0.02 ml of a thrombin solution (100 NIH units). The solution was applied to a petri dish and left for 1 h at room temperature to form a fibrin clot layer. Twenty μl of the enzymes was dropped onto a fibrin plate and incubated at 37oC for 5 h. The activity of fibrinolytic enzyme was estimated by measuring the dimensions of the clear zone on the fibrin plate. Fibrinogen zymography was carried out in 12% polyacrylamide gels containing 0.1% fibrinogen. The enzymes were diluted in 5x sample buffer, which consisted of 60 mM Tris-HCl (pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, and 0.1% bromophenol blue. Electrophoresis was carried out at 70 V and 50 A for 4 h until the bromophenol blue reached the bottom of the gel. After electrophoresis, the gel was soaked in 2.5% Triton X-100, for 1 hour at room temperature for enzyme renaturation. The gel was washed with distilled water to remove Triton X-100, and then incubated with 50 mM phosphate buffer (pH 8) at 37oC for 12 hours. The gel was stained with Coomassie blue for 1 h and then destained. The clear bands, correspond to the areas where fibrinogen was digested. Identification of microorganisms Identification of microorganisms followed three steps. First is microbiology analysis i.e. Gram staining, spore staining, and morphological examination. Second is biochemical tests with API 50CHB kit for Bacillus spp. followed by identification using Apiweb™ software. Third is molecular identification for the best fibrinolytic bacterial strain. The selected microorganisms were enriched, and its 16SrRNAs were analyzed in order to identify the microorganisms at the species level. Amplification of 16SrRNA was performed with universal primers, 63F: 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ and 1387R: 5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’, using a 2720 thermal cycler (Applied Biosystems).

13 PCR products was isolated from the agarose gel and sequenced with a BidDye Terminator v3.1 cycle sequencing chemistry, genetic analyzer 3730XL (Applied Biosystems). A sequence similarity search was performed using BLAST in the NCBI database. Results Proteolytic activity of several microorganisms Isolation of microbes from Red oncom and Tempeh Gembus revealed 43 isolates, 30 isolates from Red Oncom and 13 isolates from Tempeh Gembus that produce protease enzyme characterized by their ability to produce clear zones on the SMA plate. Figure 1 showed the clearing zone observed from the best proteolytic microorganism when grown in SMA. Isolates tested were: RO3 and 2.g. RO3

2.g

Figure 1 Proteolytic activity of several microorganisms Fibrinolytic and fibrinogenolytic activity of several microorganisms Fibrinolytic activity on the fibrin plate showed that 40 isolates were able to produce a clear zone. The activity of fibrinolytic enzyme was estimated by measuring the dimensions of the clear zone on the fibrin plate (Table 1). Table 1 Fibrinolytic activities on fibrin plate Isolate Fibrinolytic Isolate Fibrinolytic activities (cm) activities (cm) RO1 0.90±0.10 RO16 0.47±0.15 RO2 0.87±0.15 RO17 0.37±0.12 RO3 1.00±0.10 RO18 0.33±0.06 RO4 None RO19 0.30±0.00 RO5 1.23±0.25 ROa 0.50±0.00 RO6 0.97±0.12 ROb 0.37±0.12 RO7 1.23±0.15 ROc 0.33±0.06 RO8 1.13±0.32 ROd 0.50±0.10 RO9 0.67±0.15 ROe 0.30±0.00 RO10 0.47±0.15 ROf 0.30±0.00 RO11 1.35±0.35 ROg 0.80±0.14 RO12 None ROh 0.30±0.00 RO13 None ROi 0.33±0.14 RO14 0.87±0.21 ROj 0.35±0.07 RO15 1.17±0.06 ROk 0.35±0.07

Isolate 1.g 2.g 3.g 4.g 5.g 6.g 7.g a.g b.g c.g d.g e.g f.g ---

Fibrinolytic activities (cm) 0.90±0.00 1.45±0.07 0.90±0.14 1.00±0.00 0.70±0.14 1.00±0.00 0.45±0.07 0.50±0.00 0.50±0.00 0.35±0.07 0.30±0.00 0.30±0.00 0.35±0.07 ---

kDa

M

1

kDa

M

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

3.g

4.g

14

15

16

17

18

19

a

b

c

d

d.g

e.g

f.g

260 140 100 70 50 40 35 25 15 10

e

f

g

h

i

j

k

1.g

2.g

5.g

6.g

7.g

a.g

b.g

c.g

260 140 100 70 50 40 35 25 15 10

Figure 2 Fibrinolytic activity analyzed by zymography M, Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); 1-19 refer to enzymes from isolates RO1-19; a-k refer to enzyme from isolates ROa-k (Red Oncom); 1.g-7.g and a.g-f.g refer to enzyme from isolates 1.g-7.g and a.g-f.g (Tempeh Gembus)

15 Table 2 Fibrinolytic fractions with various molecular weight MW kDa Isolate RO1 RO2 RO3 RO4 RO5 RO6 RO7 RO8 RO9 RO10 RO11 RO12 RO13 RO14 RO15 RO16 RO17 RO18 RO19 ROa ROb ROc ROd ROe ROf ROg ROh ROi ROj ROk 1.g 2.g 3.g 4.g 5.g 6.g 7.g a.g b.g c.g d.g e.g f.g

15-25

30-50

60-80

100-140

>160

           -

                           -

                   -

                             

                               -

16 Fibrinogenolytic activity of a protease was also analyzed in situ with zymography method. The substrate used was fibrinogen 0.02%. Protease activity and protein concentration loaded into the gel were about 0.01-0.53 mU and 0.341.59 µg. Microbial protease RO1-19 were isolated from fresh Red Oncom while ROa-k were isolated from heated Red Oncom. Isolates 1-7.g were from fresh Tempeh Gembus, while a-f.g were from heated Tempeh Gembus (Fig. 2). Of the 43 proteolytic isolates, we found that 38 isolates showed fibrinogenolytic activity and some of them have different pattern of fractions with various molecular weight (Table 2). Microorganisms identification The isolates with the best fibrinolytic activity were selected for microbial identification. Gram and spore staining identified that isolate RO1, RO2, RO3, RO16, RO17, RO18, RO19, ROa-k, 1-6.g and a-f.g, were Bacillus (gram positive and have spore). Isolates RO1, RO2, and RO3 show similar fibrinogenolytic pattern in situ. Therefore only isolate RO3 was selected for further identification. Similarly, similar fibrinogenolytic pattern was shown by isolates RO16, RO17, and RO19. Therefore for the further identification only isolate 19 was selected. Among ROa-k isolates, isolates ROg and ROj were selected for identification. Among various isolates from Tempeh Gembus, only 2.g was selected for further identification. The results of biochemical tests using API 50 CHB kit specifically for Bacillus spp, revealed that isolate RO3 was identified as B. licheniformis (99.9%), isolate RO19 as B. cereus 1 (71.7%), isolates ROg as Brevibacillus laterosporus (99.3%), isolate ROj as B. cereus 1 (40.5%), and isolate 2.g as B. pumilus (99.7%).

Figure 3 Phylogenetic tree of the strains based on 16S rRNA gene sequences

17 Target of isolation of fibrinolytic bacteria was to find safe isolates. Therefore isolate RO3 and 2.g were used for further research. Molecular identification based on 16SrRNAs gen was performed and isolate RO3 was confirmed as B. licheniformis (96%) and isolate 2.g was confirmed as B. pumilus (97%). The nucleotide sequences were deposited at GenBank with accession number AB968524 for isolate RO3 and AB968523 for isolate 2.g. The phylogenetic tree constructed on the basis of the sequences and presented in Figure 3. Fibrinolytic activity on the fibrin plate (Fig. 4) showed that isolate B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g were able to produce a clear zone. Plasmin 20 mU was used as a positive control.

Figure 4 Fibrinolytic activity on fibrin plate A. B. licheniformis RO3 on LB media; B. B. licheniformis RO3 on NB media; C. B. pumilus 2.g on LB media; D. B. pumilus 2.g on NB media; P: plasmin 20 mU Discussion The genus Bacillus from fermented foods was reported to produce strong fibrinolytic enzyme, such as Bacillus natto from Natto (Fujita et al. 1993), B. amyloliquefaciens DC-4 from Douchi (Peng and Zhang 2002), B. amyloliquefaciens MJ5-41 from Meju (Joet al. 2011a), B. amyloliquefaciens LSSE-62 from Chinese soybean paste (Wei et al. 2011), Bacillus sp. DJ-2 from Doen-jang (Choi et al. 2005), Bacillus licheniformis KJ-31 from Jeot-gal (Hwang et al. 2007), and Bacillus coagulans form Terasi, Indonesian fermented fish (Prihantono et al. 2013). In this study, Red Oncom and Tempeh Gembus samples were screened for microorganisms showing fibrinolytic and fibrinogenolytic activities. Among 43 isolates which grown on SMA, thirty-eight isolates showed fibrinolytic and fibrinogenolytic activity both on fibrin plate and fibrinogen zymography. Some of them were bacilli species, such as B. cereus, Brevibacillus laterosporus, B. licheniformis, and B. pumilus. Two isolates that showed activities in fibrin plate

18 and fibrinogen zymography with lower molecular weight and considered as safe were chosen and identified as Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus. The two novel fibrinolytic microorganisms were referred to as B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g. Research conducted by Olajuyigbe and Ajele (2008) succeeded in isolating B. licheniformis Lbbl-11 from “iru”, a traditionally fermented African locust bean condiment that can produce extracellular protease. Research conducted by Hwang et al. (2007) succeeded in isolating B. licheniformis KJ-31 from Korean traditional Jeot-gal that can produce fibrinolytic enzymes. Bacillus strains such as B. subtilis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, and B. licheniformis are the common bacilli species isolated from Cheonggukjang, a Korean soybean fermented food (Kim et al. 2003; Kwon et al. 2004; Kim et al. 2009; Joet al. 2011b). Result of fibrinogen zymography showed that all fibrinogen degrading enzymes were produced in different patterns. Particularly, B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g showed several fractions. Research on the B. licheniformis CH3-17, this microorganism secreted six fibrinolytic proteins into the culture medium which can be observed by zymography conducted with the culture supernatant (Kim et al. 2009). B. subtilis secretes several proteases into the culture medium, including alkaline protease (subtilisin, encoded by apr), neutral protease (encoded by npr), bacillo-peptidase F (encoded by bpr), Epr (extracellular protease, encoded by epr), Mpr (extracellular metalloprotease, encoded by mpr), and Vpr (extracellular serine protease, encoded by vpr. Among them, subtilisin and neutral protease are the most important enzymes and are responsible for >90% of the total extracellular protease activity (Choi et al. 2004). The genus Bacillus can easily be isolated from food and environment. Most of them are non toxic and have a good impact in human health such as B. pumilus JB-1 that was isolated from Korean Cheonggukjang is an immuno-stimulating strain (Kwon et al. 2004). Presently we are conducting media optimation for producing fibrin degrading enzyme from B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g. Conclusion Red oncom and Tempeh Gembus are potential sources of microbial fibrinolytic protease. We found 38 isolates that could produce fibrinolytic proteases. A few isolates were identified as Bacillus spp. Isolate RO3 was confirmed as B. licheniformis and isolate 2.g as B. pumilus. Acknowledgment This work was supported by Directorate General of Higher Education, Ministry of Education and Culture, Republic of Indonesia. References Banerjee A, Chisti Y, Banerjee UC. 2004. Streptokinase-a clinically useful thrombolytic agent. Biotechnology Advances 22:287–307.

19 Bergmeyer HU, Grassl M, Walter HE. 1983. Enzymes; in Methods of Enzymatic Analysis (eds) HU Bergmeyer and M Grassl. Verlag Chemie. Weinheim. Germany. pp. 1007-1009. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein dyebinding. Analytical Biochemistry 72:234-254. Choi NS, Yoo KH, Hahm JH, Yoon KS, Chang KT, Hyun BH, Maeng PJ, Kim SH. 2005. Purification and characterization of a new peptidase, bacillopeptidase DJ-2, having fibrinolytic activity: produced by Bacillus sp. DJ-2 from Doen-Jang. Journal of Microbiology and Biotechnology 15(1):72–79. Choi NS, Ju SK, Lee TY, Yoon KS, Chang KT, Maeng PJ, Kim SH. 2004. Miniscale identification and characterization of subtilisins from Bacillus sp. strains. Journal of Microbiology and Biotechnology 15:537–543. Collen D, Lijnen HR. 2004. Tissue-type plasminogen activator: a historical perspective and personal account.Journal of Thrombosis and Haemostasis 2(4):541–546. Fujita M, Nomura K, Hong K, Ito Y, Asada A, Nishimuro S. 1993. Purification and Characterization of a strong fibrinolytic enzyme (Nattokinase) in the vegetable cheese Natto, a popular soybean fermented food in Japan. Biochemical and Biophysical Research communications 197(3):1340-1347. Hwang KJ, Choi KH, Kim MJ, Park CS, Cha J. 2007. Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus licheniformis KJ31, Isolated from Korean traditional Jeot-gal. Journal of Microbiology and Biotechnology 9:1469–1476. Jeong SJ, Kwon GH, Chun J, Kim JS, Park CS, Kwon DY, Kim JH. 2007. Cloning of fibrinolytic enzyme gene from Bacillus subtilis isolated from Cheonggukjang and its expression in protease-deficient Bacillus subtilis Strains. Journal of Microbiology and Biotechnology 17(6):1018–1023. Jo HD, Lee HA, Jeong SJ, Kim JH. 2011a. Purification and characterization of a major fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 isolated from Meju. Journal of Microbiology and Biotechnology 21(11):1166–1173. Jo HD, Kwon GH, Park JY, Cha J, Song YS, Kim JH. 2011b. Cloning and over expression of aprE3-17 encoding the major fibrinolytic protease of Bacillus licheniformis CH3-17. Biotechnology and Bioprocess Engineering 16:352359. Kim YS, Jung HJ, Park YS, Yu TS. 2003. Characteristics of flavor and functionality of Bacillus subtilis K-20 Chungkukjang. Korean Journal of Food Science and Technology 35:475-478. Kim GM, Lee AR, Lee KW, Park JY, Chun J, Cha J, Song YS, Kim JH. 2009. Characterization of a 27 kDa fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens CH51 isolated from Cheonggukjang. Journal of Microbiology and Biotechnology 19:997-1004. Kwon HY, Kim YS, Kwon GS, Kwon CS, Sohn HY. 2004. Isolation of immunostimulating strain Bacillus pumilus JB-1 from Chungkukjang and fermentational characteristics of JB-1. Korean Journal of Microbiology and Biotechnology 32:291-296.

20 Mihara H, Sumi H, Yoneta T, Mizumoto H, Ikedo R, Seiki M, Maruyama M. 1991. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm Lumbricus rubellus. The Japanese Journal of Physiology 41(3):461–472. Olajuyigbe FM, Ajele JO. 2008. Some Properties of Extracellular Protease from Bacillus licheniformis Lbbl-11 Isolated from “iru”, A Traditionally Fermented African Locust Bean Condiment. Global Journal of Biotechnology & Biochemistry 3(1):42-46. Peng Y, Yang X, Zhang Y. 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo.Applied Microbiology and Biotechnology 69:126–132. Peng Y, Zhang YZ. 2002. Optimation of fermentation conditions of douchifibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology 8:285-289. Prihanto AA, Darius, Firdaus M. 2013. Proteolytic and fibrinolytic activities of halophilic lactic acid bacteria from two indonesian fermented foods. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 2(5):2291-2293. Tough J. 2005. Thrombolytic therapy in acute myocardial infarction. Nursing Standard 19(37):55–64. Wei X, Luo M, Xu L, Zhang Y, Lin X, Kong P, Liu H. 2011. Production of Fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens by fermentation of chickpeas, with the evaluation of the anticoagulant and antioxidant properties of chickpeas. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59:3957–3963. WHO 2011. Global status report on noncommunicable diseases 2010. World Health Organization. Geneva.

21

4 THE USE OF RED ONCOM POWDER AS POTENTIAL PRODUCTION MEDIA FOR FIBRINOGENOLYTIC PROTEASE DERIVED FROM Bacillus licheniformis RO32 Abstract The high cost of enzyme production is one of the barriers to successful application of enzyme in the industry. Selection of media is a critical factor for the enzyme production. Main factors for optimization of enzyme production include nutritional components and environmental conditions for growth and production of fibrinogenolytic protease. In this study, Bacillus licheniformis RO3 isolated from red oncom, an Indonesian fermented food was tested for its fibrinogenolytic protease production by using several media. Three types of media were analyzed, i.e. Luria-Bertani broth (LB), ½ LB + 1% skim milk (LBS), and ½ LB + 1% red oncom powder (LBO). Protease activity was tested by using spectrophotometric method with casein as a substrate and fibrinogenolytic activity was confirmed based on zymography assay using fibrinogen substrate. In LB media, B. licheniformis RO3 was able to produce protease with activity of 0.024 U/ml or 0.157 U/mg at 36 h fermentation. In LBS media, the highest protease activity was 0.022 U/ml or 0.152 U/mg at 48 h fermentation. The best result was shown by B. licheniformis RO3 grown in LBO media with the highest protease activity of 0.051 U/ml or 0.283 U/mg at 48 h. Zymographic profiles showed that crude enzyme from B. licheniformis RO3 consisted of six fibrinogenolytic bands with molecular weight of 20, 27, 32, 40, 70, and >140 kDa. These results indicate that red oncom powder can be used as a potential media for fibrinogenolytic protease production. Keywords: red oncom powder, fibrinogenolytic protease, production media, B. licheniformis Introduction The high cost of enzyme production is one of the barriers of the success of protease application in the industry. The selection of production media is a critical factor for fibrinogenolytic protease fermentation. Fibrinogenolytic proteaseproducing microbes have various physiological characteristics, then, the optimization of nutritional components and environmental conditions is needed for the growth and production of enzymes (Lee et al. 1999; Seo & Lee 2004). Fibrinolytic and fibrinogenolytic enzymes are protease enzyme group which are able to degrade fibrin or fibrinogen. In the body, the fibrinolytic enzyme or plasmin is produced by endothelial cells in the pancreatic duct. Along with the increasing age and the imbalance pattern of food consumption, the production of natural plasmin by body will be reduced that may cause to the disruption of fibrinolytic system. If it goes on a regular basis, it will lead to the thrombosis related-degenerative diseases, such as stroke, atherosclerosis, hypertension, and diabetes. 2

Telah dipresentasikan secara oral pada International Symposium on Food and Agro-Biodiversity di Semarang pada 16 – 17 Sepetember 2014 dan artikel lengkapnya sedang dalam proses telaah untuk diterbitkan pada Proceedia Food Science Elsevier

22

The Bacillus genus from fermented foods is one of microbes that is found to be able to produce a strong fibrinolytic enzyme, such as Bacillus natto from natto, a traditional Japanese soy fermented food that produce nattokinase (NK). The supply of natto or its enzyme orally is not only able to degrade the thrombus directly, but also able to increase the release of endogenous plasminogen activator in experimental animals and human subjects (Sumi et al. 1990). Other Bacillus genus of various fermented foods have also been found to be able for producing strong fibrinolytic enzymes, including B. amyloliquefaciens DC-4 from douchi, a fermented soy food from China (Peng et al. 2002), Bacillus sp. CK from chungkookjang, a fermented soy sauce from Korea (Kim et al. 1996), Bacillus sp. DJ-2 strains and DJ-4 from doenjang, a Korean fermented soybean paste (Choi et al. 2005; Kim et al. 2000), and Bacillus sp. KA38 from jeotgal, a fermented salted fish from Korea (Kim et al. 1997). Oncom is one of traditional Indonesian fermented food in West Java. This food is made from a fermentation process generated by several fungi. There are two types of oncom, i.e. red oncom and black oncom. The red oncom is degraded by the fungus of Neurospora sitophila or N. intermedia while the black oncom is degraded by the fungus of Rhizopus oligosporus and other types of Mucor (Sastraatmadja et al. 2002; Wood 1998). Generally, red oncom is made from tofu waste, i.e. the soy which its protein has been taken in its make, while the black oncom is generally made from the peanuts dregs mixed with cassava dregs or cassava powder, i.e. tapioca, in order to make a better texture and more tender. Although both the substrate material is a kind of waste, its nutrient is still high enough to be exploited by human. Tofu waste still contains high nutrient values, however, most of its organoleptic properties are less preferred. Tofu waste with a fermentation process, i.e. red oncom, is preferred as food product than its original waste without fermentation. Tofu waste is a processed product from tofu in which its protein nature is probably similar to tofu and soy, although it has undergone many changes because of certain treatments during the manufacturing process of tofu, such as heating. The high nutrient content of tofu and its large amounts provide a significant opportunity to be used as a growth media for enzymes-producing microbes for health. Therefore, this study was focused for selecting the optimal production media for production of fibrinogenolytic protease by fibrinogenolytic protease-producing microbe, i.e. Bacillus licheniformis RO3 isolated from red oncom, an Indonesian fermented food. Instead of commercial media of LB and skim milk, the use of red oncom powder as the alternative media for enzyme production was also tested since the microbe tested was originally isolated from fresh red oncom. Fibrinogenolytic protease with the highest activity was further characterized for its optimum pH and temperature. Materials and Methods Microorganism Microbe tested was B. licheniformis RO3 isolated from traditional fermented food of fresh red oncom (Afifah et al. 2013).

23

Production of fibrinogenolytic protease A total of 2 ose microbes was grown in 25 mL sterile Luria-Bertani broth media (LB) to obtain the optical density value (OD) of 0.8 at 620nm. LB media contained isolates that had reached a value of OD = 0.8 and then it was taken 10% to be added in three different media, LB, ½ LB + skim milk 1% (w/v), herein after referred to as LBS, and ½ LB + red oncom powder 1% (w/v), herein after referred to as LBO. Microbial incubation was performed for 72 hours at 37°C in a waterbath at 120 rpm. OD620 value was measured every 12 hours to determine the growth curve of microbes. The production media that has contained with fibrinolytic protease was taken once every 12 hours and centrifuged at 6000 g for 15 minutes at 4°C. The supernatant was taken to be calculated for its fibrinogenolytic protease activity. Analysis of protease activity Protease activity was quantitatively measured by a modification of Bergmeyer and Grassl method (Bergmeyer & Grassl 1983) using Hammarsten casein substrate (1% w/v). Three steps of analysis treatment were conducted, including the blank, standard, and samples. Enzyme solution that was heated to a certain temperature and incubation time (which produces maximum activities) was added to microtube containing 250 µL of 50 mM phosphate buffer pH 8. For treatment of blank and standard, the enzyme was replaced with distilled water and 5 mM tyrosine. The solution was incubated at 37°C for 10 minutes. The hydrolysis reaction was stopped by the addition of 500 µL of trichloroacetic acid (TCA) 0.1 M. Blank and standard were added with 50 µL of enzyme solution, while sample was added with 50 µL of distilled water, and then the solution was reincubated at 37°C for 10 minutes, followed by centrifugation at 4000 g and temperature of 4°C for 10 minutes. Briefly, a 375 µL of supernatant was added to a microtube containing 1.25 mL Na2CO3 0.4 M and the Folin Ciocalteau reagent, and then incubated again at 37°C for 20 minutes. The absorbance of the solution was measured at 578 nm. Analysis of protein concentration The protein concentration was determined by Bradford method (Bradford 1976) using bovine serum albumin (BSA) as protein standard. A total of 100 µL enzyme was added to the tube containing 1 mL distilled water and 1 mL Bradford reagent. For blank treatment, the enzyme solution was replaced with distilled water. Then, the solution was mixed using vortex and allowed to stand for 20 minutes at room temperature. Absorbance of the solution was measured at a wavelength of 595 nm. For standard, enzyme solution was replaced with BSA Fraktion V with concentration ranges of 0-250 µg/mL. The protein concentration of enzyme solution was determined by linear equation of relationship between standard concentration of protein and absorbance. Activities of fibrinogenolytic with zymography Zymography was performed to detect fibrinogenolytic activity directly

24 using fibrinogen substrate. Several steps in zymography included the preparation of separating and stacking gels, sample and loading preparation, running condition, gel staining, gel destaining, and visualization. Separating gel was made from a 12% acrylamide concentration. Enzyme was dissolved in sample buffer containing 2-mercaptoethanol with no heating treatment. Each sample was injected into a gel well with the volume range of 10-20 µL. Electophoresis was run at a voltage of 70 V, 50 A for 2-3 hours in an electophoresis buffer. Furthermore, the gel was first denatured in a solution of Triton X-100 2.5% v/v and shaked for one hour. Gel was digested in 50 mM universal buffer pH 7 and temperature of 37°C for 12 h. Gel was stained with staining solution (Coomassie Brilliant Blue R-250) for 15 minutes. Gel was destained with destaining solution repeatedly until a white fibrinogenolytic enzyme band was resulted with a blue gel background. Characterization of enzyme Characterization of fibrinogenolytic protease including optimal pH and temperature was tested quantitatively by spectrophotometric method (Bergmeyer & Grassl 1983). Optimization of enzyme pH was carried out at 37°C by means of the analysis of enzyme activities using universal buffers with pH range of 2-12. Determination of the optimum temperature was done by measuring the enzyme activity at various temperatures (30-80°C) in universal buffer of pH 7.0. Results and Discussion Media selection and growth rate were conducted to determine the optimal condition for B. licheniformis RO3 to produce high fibrinolytic protease. The use of red oncom powder as an alternative production media for microbe growth was due to the original source of the microbe that isolated from the fresh red oncom. It may be developed for enzyme production media with low cost, safe, and high enzyme activity. Also, it may be potentially used for the development of the functional foods derived from the red oncom. 3,5 3 OD620

2,5 2 LB

1,5 1

LBS

0,5

LBO

0 0

12

24

36

48

60

72

Time (h)

Figure 1 The growth curve of B. licheniformis RO3 on different media: LuriaBertani broth (LB), ½ LB + 1% skim milk (LBS), and ½ LB + 1% red oncom powder (LBO)

25

A

Protease activities (U/ml)*100

Fig. 1 showed that the B. licheniformis RO3 in LB media grew exponentially until 36 hour incubation and continued to stationary phase until 60 hour of growth rate. At 72 hour incubation, the microbial growth has not decreased yet. This result was not linear with the microbial growth in LBS media. B. licheniformis RO3 grew exponentially up to 12 hour incubation and entered the stationary phase after 24 hour incubation. In contrast, in the LBO media, B. licheniformis RO3 grew rapidly until the 48 hour incubation and constantly continued in the stationary phase until the 72 hour incubation. 6 5 4 3

LB

2

LBS

1

LBO

0 0

12

24

36

48

60

72

B

Specific activities (U/mg)*10

Time (h) 3 2,5 2 1,5

LB

1

LBS

0,5

LBO

0 0

12

24

36

48

60

72

Time (h)

Figure 2 Protease activities (A) and specific activities (B) of B. licheniformis RO3 on different media: Luria-Bertani broth (LB), ½ LB + 1% skim milk (LBS), and ½ LB + 1% red oncom powder (LBO) Fig. 2 showed protease activities (A) and specific activities (B) of B. licheniformis RO3 in various production media. In the In LB media, B. licheniformis RO3 was able to produce protease enzyme with the highest activity of 0.024 U/ml or 0.157 U/mg after 36 hours incubation. Meanwhile, in LBS media, B. licheniformis RO3 produced protease enzyme with the highest activity of 0.022 U/ml or 0.152 U/mg at 48 hours incubation. These results indicate that the reduction of composition of LB media and the addition of skim milk to the production media may be not significant to increase the protease activities, but

26 only extend the production rate. It seems that skim milk is not suitable for induction of B. licheniformis RO3 in producing protease enzyme. B. licheniformis RO3 LBO grown in LBO media was potentially to produce enzyme with highest protease activity (0.051 U/ml or 0.283 U/mg) at 48 hours incubation. It is noted that the enzyme activity produced by microbes in the LBO media significantly increased twice compared to those of LB and LBS media. These results indicate that the microbes grown in original media may be more adaptable to produce extracellular enzymes with high activity and optimum characters. B

A M

0

12

24

36

48

60 72

0

12

24

48

60

72

36

48

60

C M

0

12

24

36

Figure 3 Activity of fibrinogenolytic with 0.1% fibrinogen substrate in LB media (A), LBS (B), and LBO (C) starting from 0-72 hours incubation. Enzyme digestion was run for 12 h incubation at 37oC. The relationship between the growth patterns of microbial cells and protease activities showed that the optimum protease activities of B. licheniformis RO3 were achieved when entering the stationary phase during growth production in LB, LBS, or LBO media. In LBO media, B. licheniformis RO3 grew rapidly after

72

27

48 hours incubation, then the growth was tend to be constant until 72 hours incubation. Compared to other study, B. licheniformis Lbbl-11 isolated from iru produced maximum extracellular protease at 48 hours incubation or at the stationary phase when grown in nutrient broth media (Olajuyigbe & Ajele 2008). Activities of fibrinogenolytic from B. licheniformis RO3 were determined qualitatively by conducting zymographic method using fibrinogen substrate. Fig. 3 showed that in LB media, fibrinogenolytic fractions with molecular weight (MW) of <35 kDa from B. licheniformis RO3 crude were clearly visible starting from 36 hours incubation. While in LBS media, at 12 hours incubation, fibrinogenolytic fractions with MW of <35 kDa from B. licheniformis RO3 crude had been visually seen. Fibrinogenolytic fractions of B. licheniformis RO3 grown in LBO media was clearly visible after 24 hours incubation and increasing steadily up to the 72 hours incubation. Zymographic results demonstrated that crude enzyme from B. licheniformis RO3 had six fibrinogenolytic bands with molecular weight of 20, 27, 32, 40, 70, and > 140 kDa. Study on fibrinolytic enzyme isolated from B. licheniformis KJ-31 from Hwang et al. (2007) represented a high enzyme activity (12.8 U/mg) when it was grown in LB media for 72 hours incubation. Fibrinolytic enzyme from B. polymaxa NRC-A also exerted a high activities after being grown for 3 days (Mahmoud et al. 2011). Interestingly, study of Kim et al. (2009) demonstrated the use of 4 different production media, including triptic soy broth (TSB), Luria-Bertani broth (LB), nutrient broth (NB), and brain heart infusion (BHI) for growing B. amyloliquefaciens CH51. Among all media, the microbe growth in TSB media showed the highest fibrinolytic activity (>2.5 U/ml) after 48 hours incubation. Some starches and dextrin have been reported as the best carbon sources for B. amyloliquefaciens DC-4 in producing the fibrinolytic enzyme (Peng et al. 2002). Other study from Agrebi et al. (2009) reported that B. subtilis A26 exerted potential fibrinolytic enzyme in the medium containing 40.0 g/L wheat, 3.53 g/L casein peptone, 4.0 g/L CaCl 2, 3.99 g/L NaCl, 0.01 g/L MgSO 4, and 0.01 g/L KH2PO4, pH 7.78. Optimization of media significantly affected the increase of fibrinolytic enzyme production up to 4.2 times (269.36 U/ml) compared with those obtained with the initial media (63.45 U/ml). B. subtilis Natto B-12 produced the highest nattokinase activities when maltose was used in the production media (Wang et al. 2009). Conversely, the enzyme production was very low when using sucrose as carbon source. High concentration of sucrose inhibited microbial action to produce protease, whereas the use of maltose lowered catabolite repression and induced the production of enzymes. Carbamide and ammonium sulfate decreased the production of nattokinase. Carbon source such wheat bran was also chosen to increase the enzyme yield. Bran is composed of starch (12-18%), protein (15-18%), dietary fiber (35-50%), fat (3-5%), and ash (4-6%). Wheat bran can enrich aminophenol, vitamins, minerals, and enzymes (Wang et al. 2009). Therefore, the optimal media composition for producing nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12 was maltose 2%, 3% wheat bran, 0.5% NaCl, 0.1% KH2PO4, 0.4% K2HPO4, and MgSO4.7H2O 0.05%, pH 7.0 (Wang et al. 2009). In this study, the red oncom powder as the alternative medium for enzyme production from B. licheniformis RO3 contained 23.2% protein, 3.5% fat, 62.3% carbohydrate, and 4.95% ash. Our results (Fig. 2 demonstrated that among all 3

28 production media, the LBO media containing red oncom powder significantly increased fibrinogenolytic protease activities due to its high contents of protein and fiber. Fiber component is known as the main contributor to the high carbohydrate content in the red oncom powder. Meanwhile, high protein content in the red oncom powder can be used as a substrate for microbial B. licheniformis RO3 to produce the fibrinolytic protease with high acitivity and optimal characters.

Relative activity (%)

100

A

80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

12

14

pH

Relative activity (%)

100

B

80 60 40 20 0 0

20

40

60

80

100

Temperature (oC)

Figure 4 The effect of pH (A) and temperature (B) of the fibrinogenolytic protease from B. licheniformis RO3 grown in LBO media for 48 h incubation Fibrinogenolytic protease produced from B. licheniformis RO3 in LBO media had an optimum pH of 8 and optimum temperature of 60°C (Fig. 4). Enzyme action is strongly influenced by its optimal pH and temperature. Protease characteristics from B. licheniformis have been widely reported. For example, B. licheniformis Lbbl-11 isolated from iru, a fermented food from Africa, was able to produce extracellular proteases that had optimum temperature of 60°C and optimum pH of 8 (Olajuyigbe & Ajele 2008). It is also reported that most fibrinolytic enzymes grouped in serine protease were generally active at neutral and alkaline pHs, with the optimum pH 8 and 10 (Kim et al. 2000; Ko et al. 2004). The optimum temperature of enzymes showed a wide range working

29

temperatures from 30°C to 70°C (Kim et al. 1996; Kim et al. 2000), but mostly at 50°C (Peng et al. 2003; Paik et al. 2004). Conclusion Original source of isolated microbes can be used as the alternative production media to produce specific enzymes. B. licheniformis RO3 isolated from traditional fermented food of fresh red oncom was successfully grown in production media containing red oncom powder (LBO media) with potential fibrinogenolytic protease activities compared to other commercial media. Crude fibrinogenolytic protease enzyme from B. licheniformis RO3 had an optimum pH and temperature at 8.0 and 60°C. Acknowledgment This work was supported by Directorate General of Higher Education, Ministry of Education and Culture, Republic of Indonesia. References Afifah DN, Sulchan M, Syah D, Yanti, Suhartono MT. 2013. Proteolytic and fibrinolytic activities of several microorganisms screened from Red Oncom and Tempeh Gembus, Indonesian fermented soybean cakes. Abstract presented at 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition. Yogyakarta, Indonesia. Agrebi R, Haddar A, Hajji M, Frikha F, Manni L, Jellouli K, Nasria M. 2009. Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization. Canadian Journal of Microbiology 55(9): 1049-1061. Bergmeyer HU, Grassl M. 1983. Methods of Enzymatic Analysis. Vol ke-2. Weinheim: Verlag Chemie. pp 1007-1009. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein dyebinding. Anal Biochem 72:234-254. Choi NS, Yoo KH, Hahm JH, Yoon KS, Chang KT, Hyun BH, Maeng PJ, Kim SH. 2005. Purification and characterization of a new peptidase, bacillopeptidase DJ-2, having fibrinolytic activity: produced by Bacillus sp. DJ-2 from Doen-Jang. J Microbiol Biotechnol 15(1): 72–79. Hwang KJ, Choi KH, Kim MJ, Park CS, Cha J. 2007. Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus licheniformis KJ31, Isolated from Korean traditional Jeotgal. J Microbiol Biotechnol 9:1469–1476. Kim W, Choi K, Kim Y. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from Chungkookjang. Appl Environ Microbiol 62:2482-2488. Kim SH, Choi NS. 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biosci Biotechnol Biochem 64:1722–1725.

30 Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, Kong IS. 1997. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. J Ferment Bioeng 84(4): 307–312. Kim GM, Lee AR, Lee KW, Park JY, Lee MR, Chun J, Cha J, Song YS, Kim JH. 2009. Characterization of a 27kDa fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens CH51 isolated from Cheonggukjang. J Microbiol Biotechnol 19(9): 997-1004. Ko JH, Yan JP, Zhu L, Qi YP. 2004. Identification of two novel fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis QK02. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 137:65–74. Lee J, Park S, Choi WA, Lee KH, Jeong YK, Kong IS, Park S. 1999. Production of a fibrinolytic enzyme in bioreactor culture by Bacillus subtilis BK-17. J Microbiol Biotechnol 9(4):443-449. Mahmoud MG, Ghazy IA, Ibrahim GS, Fahmy AF, El-Badry MO, Abdel-Aty AM. 2011. Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus polymaxa NRC-A. International journal of academic research 3(4): 542-547. Olajuyigbe FM, Ajele JO. 2008. Some Properties of Extracellular Protease from Bacillus licheniformis Lbbl-11 Isolated from “iru”, A Traditionally Fermented African Locust Bean Condiment. Global J Biotech & Biochem 3(1):42-46. Paik HD, Lee SK, Heo S, Kim SY, Lee H, Kwon TJ. 2004. Purification and characterization of the fibrinolytic enzyme produced by Bacillus subtilis KCK-7 from Chungkookjang. J Microbiol Biotechnol 14(4): 829–835. Peng Y, Huang Q, Zhang R, Zhang Y. 2003. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus emyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food. Biochem Mol Biol 134:4552. Peng Y, Zhang YZ. 2002. Optimation of fermentation conditions of douchi fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. Chin J Appl Environ Biol 8:285-289. Sastraatmadja DD, Tomita F, Kasai T. 2002. Production of high-quality oncom, a traditional Indonesian fermented food, by the inoculation with selected mold strains in the form of pure culture and solid inoculum. J Grad Sch Agr Hokkaido Univ 70:111-127. Seo JH, Lee SP. 2004. Production of fibrinolytic enzyme from soybean grifts fermented by Bacillus firmus NA-1. J Med Food 7(4):442-449. Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. 1990. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol 84:139-143. Wang C, Du M, Zheng D, Kong F, Zu G, Feng Y. 2009. Purification and Characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12. J Agric Food Chem 57:9722-9729. Wood BJB. (ed). 1998. Microbiology of Fermented Foods Vol. 2. 2nd ed. Blackie Academic and Professional. pp 498.

31

5 PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A FIBRINOLYTIC ENZYME FROM Bacillus pumilus 2.g ISOLATED FROM TEMPEH GEMBUS, AN INDONESIAN FERMENTED FOOD3 Abstract Bacillus pumilus 2.g isolated from Tempeh Gembus, an Indonesian fermented soybean cake, secretes several proteases that have strong fibrinolytic activities. A fibrinolytic enzyme with an apparent molecular weight of 20 kDa was purified from the culture supernatant of B. pumilus 2.g by sequential application of ammonium sulfate precipitation, ion-exchange chromatography, and hydrophobic chromatography. The partially purified enzyme was stable between pH 5 and pH 9 and temperature of less than 60℃. Fibrinolytic activity was increased by 5 mM MgCl2 and 5 mM CaCl2 but inhibited by 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium dodecyl sulfate (SDS), and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The partially purified enzyme quickly degrades the α and β chains of fibrinogen but cannot degrade the γ chain. Keywords: fibrinolytic enzyme, Bacillus pumilus, fermented food, Tempeh Gembus Introduction Cardiovascular diseases are the number one cause of death globally. According to a report published by the World Health Organization (WHO) in 2011, an estimated 17.3 million people died from cardiovascular diseases in 2008, representing 30% of all global deaths (WHO 2011). The number of people who die from cardiovascular diseases is expected to increase to 23.3 million people by 2030. Heart disease and stroke are projected to remain the leading causes of death throughout this period (Mathers & Loncar 2006). Intravascular thrombosis (i.e., the clotting of blood in blood vessels), is one of the major causes of cardiovascular diseases. Clots formed from insoluble fibrin restrict the smooth flow of blood in blood vessels, leading to thrombosis and heart attacks. Insoluble fibrin is the major protein component of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin (Voet & Voet 1990). This insoluble fibrin could be hydrolyzed into fibrin degradation products by plasmin, which is generated from plasminogen by plasminogen activators (Dobrovolsky & Titaeva 2002). The basis of fibrinolytic therapy is intravenous administration of an exogenous plasminogen activator, that lyses the thrombus and restores blood flow to the area of ischemia. The three fibrinolytic agents that are currently being used for this purpose are urokinase, streptokinase, and genetically engineered tissue plasminogen activator (t-PA). However, these enzymes are expensive, thermolabile and can produce undesirable side effects such as gastrointestinal bleeding, allergic reactions, and resistance to repercussion (Blann et al. 2002; Turpie et al. 2002).

3

Telah dipublikasikan pada Preventive Nutrition and Food Science Journal (PNF) Vol 19(3): 213219

32 Recently, potent fibrinolytic enzymes were discovered in various fermented food products, including Japanese Natto (Sumi et al. 1987; Fujita et al. 1993; Wang et al. 2009), Korean Cheonggukjang (Kim et al. 1996; Kim et al. 2009; Jo et al. 2011b), skipjack Shiokara (Sumi et al. 1995), Korean Doenjang (Kim et al. 2000), a traditional Asian fermented shrimp paste seasoning (Wong et al. 2004), and a traditional Chinese soybean food, Douchi (Peng et al. 2003). Nattokinase, an extracellular fibrinolysin produced by Bacillus subtilis natto, can directly hydrolyze fibrin in blood clots and promote the production of t-PA, which activates plasminogen into active plasmin to hydrolyze fibrin. Oral administration of natto or nattokinase effectively enhances the release of an endogenous plasminogen activator in animal models and in human subjects (Sumi et al. 1990). Microbial fibrinolytic enzymes from food-grade microorganisms have the potential to be developed as additives for functional foods and as drugs to prevent or cure cardiovascular diseases. Tempeh is an Indonesian fermented soybean food that can be made from a variety of raw materials. Tempeh Gembus is a variety of tempeh. Tempeh Gembus is different from Tempeh in that it is made from the solid soybean waste of tofu (Kuswanto 2004). Previous work indicates that Bacillus pumilus 2.g can be isolated from Tempeh Gembus and has high proteolytic and fibrinolytic activities (Afifah et al. 2013). In this paper, a fibrinolytic enzyme was purified from the supernatant of a B. pumilus 2.g culture, and the properties of the partially purified enzyme were studied. Materials and Methods Bacterial strains and culture conditions To compare media, B. pumilus 2.g was grown in Luria-Bertani broth (LB, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA), tryptic soy broth (TSB), nutrient broth (NB), and brain heart infusion (BHI) at 37℃ with vigorous shaking. Assay of fibrinolytic activity The fibrinolytic activities of the supernatants of B. pumilus 2.g cultures was determined using the fibrin plate method (Jeong et al. 2007). Briefly, 7 ml of 0.3% (w/v) fibrinogen (MP Biomedicals, Santa Ana, California, USA) solution in 1 M phosphate-buffered saline (PBS) was mixed with an equal volume of 2% (w/v) agarose solution and 0.1 ml of thrombin solution (100 NIH units/ml; MP Biomedicals) in a petri dish. The petri dish was left at room temperature for 1 h to allow a fibrin clot layer to form, a glass capillary tube was used to make a hole in the fibrin plate. Next, 20 µl of sample was dropped into the hole, and the plate was incubated at 37℃ for 8 h. The size of the clear zone that formed was converted into plasmin units (U) by comparison to zones formed by known quantities of plasmin. Protein concentration was determined by the Bradford method (Bradford 1976) using bovine serum albumin (BSA) as the standard. All measurements were performed in triplicate and the average values are shown. Partial purification of fibrinolytic enzymes Fibrinolytic enzymes secreted by B. pumilus 2.g were purified from NB cultures that had been incubated for 72 h. The supernatant was isolated by centrifugation (12,000 x g, 10 min, 4℃), filtered through a disposable filter unit

33 (0.45 µm, Sarstedt, Germany) and subjected to ammonium sulfate precipitation (80% saturation, w/v) overnight at 4℃. The precipitate was resuspended in buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7.0) and then dialyzed against 20 volumes of the same buffer for 24 h at 4℃ with four buffer changes. After dialysis, the sample was freeze-dried and resuspended in buffer A. The resuspended sample was loaded onto a 2.5 × 8 cm CM-Sephadex column (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), and proteins were eluted by sequential application of 6 × 100 mL of buffer A containing increasing concentration of NaCl; NaCL concentrations increased from 0 M to 1 M, in a stepwise manner (0.2 M increments). The fibrinolytic activity of each fraction was measured with the fibrin plate method and fractions with fibrinolytic activity were pooled. Pooled samples were dialyzed against buffer A, lyophilized, and then resuspended in 20 mL of buffer A. Hydrophobic interaction chromatography with Phenyl Sepharose 6 Fast Flow resin (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) was used for further purification of fibrinolytic enzymes. Briefly, each sample was loaded onto a column (2.5 × 12 cm) that had been pre-equilibrated with buffer A containing 1 M (NH4)2SO4. Proteins were eluted by sequential application of 50 mL of buffer A containing decreasing concentration of (NH4)2SO4; (NH4)2SO4 concentrations decreased from 1 M to 0 M in a stepwise manner (0.2 M increments). The protein content and fibrinolytic activity of each fraction were measured. Fractions with activity were pooled, dialyzed against buffer A, and lyophilized. Sodium dedocyl sulfate (SDS)-PAGE was conducted by Laemmli’s method (Laemmli 1970), and the fibrin zymography was done as previously described (Jeong et al. 2007). For fibrin zymography, the separating gel solution (12%, w/v) was prepared in the presence of fibrinogen (0.02%, w/v) and 100 µL of thrombin (10 NIH units/mL). Properties of the partially purified fibrinolytic enzyme To determine the effect of pH on the fibrinolytic enzyme activity, a 0.02 µg sample of partially purified fibrinolytic enzyme was incubated in either 50 mM citrate-NaOH buffer (pH 3.04.0), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 5.06.0), 50 mM Tris-HCl (pH 7.08.0), or 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.010.0) for 2 h at 37oC. Following incubation, the fibrinolytic enzyme activity of each mixture was measured by the fibrin plate method. For thermal stability measurements, 0.02 µg of partially purified fibrinolytic enzymes were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) and incubated in a water bath for 30 min at varying temperatures (3780℃). After incubation at each temperature, the fibrinolytic enzyme activity of each mixture was measured by the fibrin plate method. To determine the effect of metal ions and inhibitors on the activity of the partially purified fibrinolytic enzyme, 0.02 µg samples were incubated in TrisHCl buffers (pH 7.0) containing 5 mM metal ions (i.e., KCl, MgCl2, CaCl2, CuSO4, MnCl2, or ZnCl2) or 1 mM inhibitors (i.e., phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF], SDS, ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], cantharidic acid, pepstatin A, bestatin hydrochloride, or E64) for 30 min at 37℃. The hydrolysis of fibrinogen by the partially purified fibrinolytic enzyme was measured. A total of 2 mg of fibrinogen was mixed with 0.02 µg of partially purified fibrinolytic enzyme in 500 µL of 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), and the mixture was incubated at 37°C for up to 12 h. At each interval, 20 µl of sample

34 was removed, mixed with 5 X SDS sample buffer, boiled for 5 min, and then analyzed by SDS-PAGE using a 15% acrylamide gel. Amidolytic activities Amidolytic activity was determined according to the method of Jo et al. (2011a). Briefly, a 500 µl mixture containing 50 µl of 10 mM substrate, 10 µl of enzyme (10 µg), and 440 µl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) was incubated at 37℃ for 10 min. Then, 500 µl of citrate-NaOH buffer (pH 3.0) was added to stop the reaction. The resulting mixture was immedietely placed on ice and the centrifuged at 12,000 xg for 5 min. The OD410nm of the supernatant was measured, and the degree of hydrolysis was calculated from the absorbance values and the molar extinction coefficient value of p-nitroanilide (8.800M-1cm-1). Results and Discussion Fibrinolytic activity of Bacillus pumilus 2.g Previously, bacilli strains with fibrinolytic activities were isolated from Tempeh Gembus prepared by traditional methods in Semarang, Central Java, Indonesia (Kuswanto 2004; Afifah et al. 2013). Among the isolated strains, the 2.g strain had the highest fibrinolytic activity. The strain was identified as Bacillus pumilus by 16S rRNA gene sequencing (97% homology), and confirmed by API 50CHB kit with ApiwebTM software (99.7% identity). Among the microorganisms that produce fibrinolytic enzymes, bacilli from Asian traditional fermented foods are the most important (Wang et al. 2009; Kim et al. 1996; Kim et al. 2009; Jo et al. 2011b, Kim et al. 2000). B. subtilis, B. amyloliquefaciens, and B. licheniformis are the most common bacilli species isolated from fermented foods, and the fibrinolytic enzymes found in these species have been reported (Wang et al. 2009; Kim et al. 2009; Jo et al. 2011b). However, to the best of our knowledge, the fibrinolytic enzyme present in B. pumilus has not been reported. The isolation of diverse bacilli species and the characterization of their fibrinolytic enzymes are important for understanding the fibrinolytic capacities of these organisms and for developing functional foods and therapeutic agents for the prevention of cardiovascular diseases. A B 2,0

250 LB BHI NB TSB

1,8 1,6

Fibrinolytic activity (U/mg)

200

1,4

OD600

1,2 1,0 0,8 0,6 LB BHI NB TSB

0,4 0,2

150

100

50

0,0

0 0

6

12

18

24

30

36

42

48

54

Time (h)

60

66

72

78

84

90

96

0

6

12

18

24

30

36

42

48

54

60

66

72

78

84

Time (h)

Figure 1 Changes in the growth (A) and fibrinolytic activities (B) of Bacillus pumilus 2.g cultured in different growth media.

90

96

35

Growth and fibrinolytic activity of B. pumilus 2.g The effects of four different media on the growth and fibrinolytic activity of B. pumilus 2.g were compared (Fig. 1). Each medium was inoculated with an overnight culture (2%, v/v) and incubated for up to 96 h at 37℃ with shaking. SDS-PAGE and zymography revealed that the culture in NB had the highest fibrinolytic activity (187 U/mg protein) at 72 h, and the fibrinolytic activity of this culture was stable until 96 h (Fig. 2). The highest fibrinolytic activity values were observed in the stationary phase culture. Cultures in LB, BHI, and TSB had much lower fibrinolytic activities, i.e., 29 U/mg protein for the culture in LB (96 h), 11 U/mg protein for the culture in BHI (96 h), and 74 U/mg protein for the culture in TSB (96 h). Previous work indicates that TSB is the best medium and NB is the second best medium for a 50 h incubation of B. amyloliquefaciens CH51 (Kim et al. 2009). In addition, LB is the best medium for the incubation of B. licheniformis CH3-17 (Jo et al. 2011b). As these results indicate, the best medium for the measurement of fibrinolytic activity is variable, depending upon the specific organism of interest. In addition, growth environment greatly affecs the fibrinolytic enzyme yield of a given organism. M 1 2

3

4

5 6

7

8

M 1

2 3

4

5

6

7 8

Figure 2 SDS-PAGE (A) and fibrin zymography (B) of culture supernatant from B. pumilus 2.g incubated in NB medium. Lane M, broad-range size marker (Dokdo-MarkTM, ElpisBiotech, Daejon, Korea); lanes 1-8: culture supernatant from 12 h (1), 24 h (2), 36 h (3), 48 h (4), 60 h (5), 72 h (6), 84 h (7), and 96 h (8) of incubation. Partial purification of a fibrinolytic enzyme A fibrinolytic enzyme produced by B. pumilus 2.g was partially purified from 3 L of culture supernatant. The results are summarized in Table 1. After the Phenyl-Sepharose column chromatography step, the final purification fold was 16.0, and the yield was 25%. The partially purified enzyme was analyzed by SDS-PAGE and zymography. The results of these analyses confirmed that most (Fig. 3), but not all (Fig. 4A), of the other proteins were removed by the purification process.

36 Table 1 Summary of the steps performed to partially purify a fibrinolytic enzyme from B. pumilus 2.g Total Total Specific activity protein activity Fold Yield (U) (mg) (U/mg) (%) Supernatant 13,873.0 153.5 90.4 1 100 Ammonium sulfate precipitation 11,936.4 59.7 200.1 2.2 86 CM-Sephadex C-50 8,252.7 16.1 512.2 5.7 59 Phenyl-Sepharose 6-FF 3,421.4 2.4 1,442.3 16.0 25 CM-sephadex C-50 2,5

1200

A

OD280 1000

800

OD280

1,5 600 1,0 400 0,5

Fibrinolytic activity (U/mg)

Active fraction 2,0

200

0,0

0 0

10

20

30

40

Fraction number

Phenyl Sepharos 6FF 1,0

B

1400 OD280 Active fraction

1200

1000 0,6

OD280

800

600

0,4

400

Fibrinolytic activity (U/mg)

0,8

0,2 200

0,0

0 0

20

40

60

80

100

120

Fraction number

Figure 3 Elution profile of a fibrinolytic enzyme from B. pumilus 2.g through a CMSephadex column (A) and a Phenyl Sepharose 6-FF column (B). Fibrin zymography of the purified sample revealed a single band with a molecular mass of 20 kDa. Previous studies have reported different molecular masses for different fibrinolytic enzymes: 29 kDa for B. subtilis natto B-12 (Wang et al. 2009), 28.2 kDa for Bacillus sp CK 11-4 (Kim et al. 1996), 27 kDa for B. licheniformis CH3-17 (Jo et al. 2011b), 28 kDa for B. amyloliquefaciens DC-4 (Peng et al. 2003), 37 kDa for B. licheniformis KJ-31 (Hwang et al. 2007), 41 kDa for Bacillus sp. KA38 (Kim et al. 1997), and 35 kDa for Streptomyces sp. CS684 (Simkhada et al. 2010).

37 M

1

2

3

1

2

3

B

A

A

M

Figure 4 SDS-PAGE (A) and fibrin zymography (B) of protein samples at different purification stages. Lane M, size marker (Dokdo-MarkTM); lanes 1-3: sample after 80% ammonium sulfate precipitation(1), sample after CM-Sephadex purification (2), sample after Phenyl Sepharose 6FF purification (3). B

100

Relative stability (%)

Relative activity (%)

A

80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH

100 80 60 40 20 0 0

20

40

60

80

Temperature (oC)

Figure 5 Effect of pH (A) and temperature (B) on the stability of a partially purified fibrinolytic enzyme from Bacillus pumilus 2.g. Properties of a partially purified enzyme The activity of partially purified fibrinolytic enzyme from B. pumilus 2.g was highest at pH 7.0 (Fig. 5A). The enzyme was not stable under acidic conditions but was relatively stable at basic pHs (pH 7.09.0). No fibrinolytic activity was detected at pH 10. At pH 7.0, the purified enzyme was stable at temperature up to 50℃, but fibrinolytic activity rapidly decreased at temperatures greater than or equal to 60℃ (Fig. 5B). The results of this study indicate that the partially purified enzyme is not thermotolerant. Thus, products containing this enzyme should not be subjected to heat treatment above 55℃. The activity of the partially purified enzyme from B. pumilus 2.g was reduced with exposure to K+ (87.39%), Mn2+ (80.64%), and Zn2+ (89.77%) but slightly increased with exposure to Mg2+ (105.70%) and Ca2+ (102.85%). Cu2+ caused the strongest inhibition (100% inhibition) (Table 2). Copper (Cu) is one of the heavy

100

38 metals that has a high affinity for organic compounds, including serine, glycine and cycloserine. Cu can bind with sulfhydryl groups, which causes the enzymes containing this group to become inactive. The effect of metal ions on the fibrinolytic activity depends on the origin of the enzyme. For example, the activity of AprE5-41 from B. amyloliquefaciens MJ5-41, a strain isolated from Meju, is sligthly reduced by K+ and Mg2+ but is increased by Ca2+ (Jo et al. 2011a). In addition, Nattokinase from B. subtilis YJ1 is completely inactivated by Zn2+ and severely inhibited by Cu2+ (Yin et al. 2010). Table 2 Effect of metal ions and inhibitors on the activity of a partially purified fibrinolytic enzyme from B. pumilus 2.g Metal ions (5 mM)/Inhibitors (1 mM) Relative activity (%) None 100 KCl 87.39 ± 3.40 MgCl2 105.70 ± 4.03 CaCl2 102.85 ± 4.03 CuSO4 0 MnCl2 80.64 ± 3.03 ZnCl2 89.77 ± 3.42 PMSF 30.72 ± 1.17 SDS 0 EDTA 0 Cantharidic acid 47.91 ± 1.83 Pepstatin A 78.45 ± 0.07 Bestatin hydrochloric 76.44 ± 2.91 E-64 89.77 ± 3.42 In this study, the partially purified enzyme from B. pumilus 2.g was completely inhibited by 1 mM PMSF and 1 mM EDTA. PMSF is known to sulphonate the essential serine residue in the active site of a protease, resulting in a total loss of enzyme activity (Gold & Fahrney 1964). Several different types of inhibitors were examined in this study, including cantharidic acid (an inhibitor of protein phosphatases), pepstatin A (an inhibitor of acid proteases), bestatin hydrochloride (an inhibitor of aminopeptidases), and E64 (an inhibitor of cysteine proteases). All of the inhibitors tested inhibited the partially purified enzyme from B. pumilus 2.g to some degree. These results suggest that the purified enzyme is a serine protease. Amidolytic activities Among the synthetic substrates tested, N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, a substrate for subtilisin and chymotrypsin, was the most efficient (Table 3). The fibrinogen hydrolysis assay revealed that the partially purified enzyme from B. pumilus 2.g degraded the α chain of fibrinogen in 10 min and the β chain of fibrinogen in 4 h but could not degrade the  chain of fibrinogen, even after 12 h (Fig. 6). This degradation pattern is similar to that of AprE3-17, the major fibrinolytic protease of B. licheniformis CH3-17 (Jo et al. 2011b), and AprE5-41,

39 the major fibrinolytic protease of B. amyloliquefaciens MJ5-41 (Jo et al. 2011a), but different from that of a fibrinolytic enzyme from B. subtilis, which degrades the β chain first (Kim et al. 2006). The degradation pattern of fibrinogen could vary by fibrinolytic enzyme, and thus each enzyme should be individually checked. Table 3 Amidolytic activity of a partially purified fibrinolytic enzyme from B. pumilus 2.g Synthetic protease substrate (10 mM) Substrate hydrolysis (mM/min/mg) a N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 61.34 N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-pNA hydrochloride 4.41 N-Benzoyl-Pro-Val-Arg-pNA hydrochloride 0.24 N-(p-tosyl)-Gly-Pro-Lys4-NA acetate salt 0.88 a pNA: p-nitroanilide

M

1

2

3 4

5

6

7

8

9

Figure 6 Fibrinogen hydrolysis by a partially purified enzyme from Bacillus pumilus 2.g. Lane M, size marker (Dokdo-MarkTM); lane 1: control (no enzyme treatment); lanes 2-9: fibrinogen after treatment with purified enzyme for 0 min (2), 10 min (3), 30 min (4), 1 h (5), 2 h (6),4 h (7), 8 h (8), and 12 h (9). Bacillus strains with desirable properties, especially for the pH stability and temperature stability, could be used for the production of functional foods or medicines to treat cardiovascular diseases in the near future. The results of this study demonstrate that B. pumilus 2.g may be used as a novel fibrinolytic enzyme source. Acknowledgments This work was supported by the Directorate General of Higher Education, Ministry of Education and Culture, Republic of Indonesia and Diponegoro University.

40 References Afifah DN, Sulchan M, Syah D, Yanti, Suhartono MT. 2013. Proteolytic and fibrinolytic activities of several microorganisms screened from Red Oncom and Tempeh Gembus, Indonesian fermented soybean cakes. Abstract presented at 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition. Yogyakarta, Indonesia. Blann AD, Landray MJ, Lip GY. 2002. An overview of antithrombotic therapy. Brit. Med. J. 325: 762-765. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein dyebinding. Anal. Biochem. 72: 234-254. Dobrovolsky AB, Titaeva EV. 2002. The fibrinolysis system: Regulation of activity and physiologic functions of its main components. Biochemistry 67: 99-108. Fujita M, Nomura K, Hong K, Ito Y, Asada A, Nishimuro S. 1993. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto, a popular soybean fermented food in Japan. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197: 1340-1347. Gold AM, Fahrney D. 1964. Sulfonyl fuorides as inhibitors of esterases. II. Formation and reactions of phenylmethanesulfonyl alpha-chymotrypsin. Biochemistry 3: 783-791. Hwang KJ, Choi KH, Kim MJ, Park CS, Cha J. 2007. Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus licheniformis KJ31, isolated from Korean traditional Jeot-gal. J. Microbial. Biotechnol. 17: 1469-1476. Jeong SJ, Kwon GH, Chun J, Kim JS, Park CS, Kwon DY, Kim JH. 2007. Cloning of fibrinolytic enzyme gene from Bacillus subtilis isolated from Cheonggukjang and its expression in protease-deficient Bacillus subtilis Strains. J. Microbiol. Biotechnol. 17: 1018–1023. Jo HD, Lee HA, Jeong SJ, Kim JH. 2011a. Purification and characterization of a major fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 isolated from Meju. J. Microbiol. Biotechnol. 21: 1166–1173. Jo HD, Kwon GH, Park JY, Cha J, Song YS, Kim JH. 2011b. Cloning and overexpression of aprE3-17 encoding the major fibrinolytic protease of Bacillus licheniformis CH3-17. Biotechnol. Bioprocess Eng. 16: 352-359. Kim SB, Kim DW, Cheigh CI, Choe EA, Lee SJ, Hong YH, Choi HJ, Pyun YR. 2006. Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisin-like protease of Bacillus subtilis TP-6 from an Indonesian fermented soybeand, Tempeh. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33: 436-444. Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, Kong IS. 1997. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. Journal of Fermentation and Bioengineering 84: 307-312. Kim W, Choi K, Kim Y. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. En iron. Microbiol. 62: 2482-2488.

41 Kim GM, Lee AR, Lee KW, Park JY, Chun J, Cha J, Song YS, Kim JH. 2009. Characterization of a 27 kDa fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens CH51 isolated from Cheonggukjang. J. Microbiol. Biotechnol. 19: 997–1004. Kim SH, Choi NS. 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang.Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 1722–1725. Kuswanto KR. 2004. Industrialization of Tempe production. In Industrialization of Indigenous Fermented Foods, Revised and Expanded. Steinkraus KH, eds. Marcel Dekker, NY, USA. p 587-635. Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Mathers CD, Loncar D. 2006. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS Med 3: e442. Peng Y, Huang Q, Zhang R, Zhang Y. 2003. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus emyloliquefaciens DC-4 screened from Douchi, a traditional Chinese soybean food. Biochem Mol Biol 134: 45-52. Simkhada JR, Mander P, Cho SS, Yoo JC. 2010. A novel fibrinolytic protease from Streptomyces sp. CS684. Process Biochemistry 45: 88–93. Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. 1990. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol. 84: 139-143. Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H. 1987. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experientia 15: 1110-1111. Sumi H, Nakajima N, Yatagai C. 1995. A unique strong fibrinolytic enzyme (datsuwokinase) in skipjack “Shiokara; a Japanese traditional fermented food. Comp. Biochem. Physiol. 112B: 543-547. Turpie AG, Chin BS, Lip GY. 2002. Venous thromboembolism: treatment strategies. Brit. Med. J. 325: 947-950. Voet D, Voet JG. 1990. Biochemistry. 2nd ed. Wiley, NY, USA. p 1087-1095. Wang C, Du M, Zheng D, Kong F, Zu G, Feng Y. 2009. Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12. J. Agric. Food Chem. 57: 9722-9729. WHO. 2011. Global status report on noncommunicable diseases 2010. Geneva, World Health Organization. Wong AHK, Mine Y. 2004. Novel fibrinolytic enzyme in fermented shrimp paste, a traditional Asian fermented seasoning. J. Agric. Food Chem. 52: 980−986. Yin LJ, Lin HH, Jiang ST. 2010. Bioproperties of potent nattokinase from Bacillus subtilis YJ1. J. Agric. Food Chem. 58: 5737-5742.

42

6 STUDI PROTEOMIK PROTEASE FIBRINOLITIK EKSTRASELULER DARI Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g YANG DIISOLASI DARI PANGAN FERMENTASI INDONESIA Abstrak Studi proteomik meliputi pemisahan, identifikasi dan karakterisasi protein. Pada penelitian ini dilakukan studi pada protease fibrinolitik ekstraseluler dari Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari oncom merah dan tempe gembus, pangan fermentasi Indonesia. Kombinasi analisis elektroforesis satu dimensi dan dua dimensi yang dilanjutkan dengan analisis spektrometri massa menggunakan MALDI-TOF-MS dan penelusuran menggunakan database protein, menunjukkan bahwa terdapat dua fraksi protein dari B. licheniformis RO3 dan 3 fraksi dari B. pumilus 2.g. yang baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya. Keywords: proteomik, protease fibrinolitik, elektroforesis 2D, MALDI-TOF-MS Pendahuluan Proteomik didefinisikan sebagai analisis protein secara menyeluruh terhadap suatu sel atau organisme tertentu. Studi ini meliputi pemisahan, identifikasi dan karakterisasi protein. Salah satu cara yang paling efektif untuk memisahkan protein yang terdapat dalam campuran kompleks adalah dengan menggunakan elektroforesis gel dua dimensi (2D) (Phillips & Bogyo 2005). Dengan menggunakan metode ini, protein dipisahkan berdasarkan titik isoelektrik (pI) dalam dimensi pertama (IEF, isoelectric focusing) dan berat molekul (BM) pada dimensi kedua (SDS-PAGE, sodium dedocyl sulfate polyacrilamide gel) (Gravel 2002). Elektroforesis 2D memiliki kemampuan untuk memisahkan sejumlah besar protein termasuk modifikasi pasca-translasi yang sering menyebabkan perubahan pada muatan ataupun berat molekul serta bentuk-bentuk unik dari protein hasil proteolisis (Anderson & Anderson 1998; Cordwell et al. 2001). Teknik ini menggunakan Immobilized pH Gradient (IPG) strip yang dibuat dari kopolimerisasi dari turunan asam dan basa akrilamid dengan konsentrasi yang berbeda dalam matriks poliakrilamid (Gianazza 2002). Elektroforesis 2D dapat digunakan untuk pemisahan kompleks protein menjadi komponen tunggal polipeptida yang merupakan analisis utama dalam studi proteomik. Sampai saat ini, teknik elektroforesis 2D merupakan satu-satunya metode pemisahan ribuan protein dalam satu tahapan pemisahan. Sampel yang digunakan dapat berupa biofluid, jaringan, sel, dan organel. Beberapa analisis yang dapat dilakukan adalah membandingkan ekspresi protein dari sampel yang berpasangan, misalnya membandingkan sel normal dengan sel yang telah mengalami transformasi atau membandingkan beberapa sel pada tahapan pertumbuhan yang berbeda (Gravel 2002). Dengan membandingkan sampel secara bersamaan maka teknik ini dapat digunakan untuk studi proteomik penyakit kanker dan berbagai analisis ekspresi gen tertentu dari komunitas campuran mikroorganisme prokariot di lingkungan (Wilmes & Bond 2004).

43

Dengan metode ini dan dilanjutkan dengan analisis spektrometri massa Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF), dapat dideteksi dua protease serin ekstraselular dari Bacillus subtilis 168, yaitu WprA (52 kDa) dan Vpr (68 kDa) yang memiliki aktivitas fibrinolitik (Park et al. 2002). Bacillus subtilis memproduksi beberapa protease ekstraseluler pada akhir fase pertumbuhan eksponensial (Priest 1997). Enzim proteolitik ekstraseluler yang utama adalah subtilisin dan protease netral yang diberi kode gen apr dan npr (Kawamura & Doi 1984). Protease ekstraseluler lainnya yaitu bacillopeptidase F, Epr, dan Mpr. Bacillopeptidase F (Roitsch & Hageman 1983) dan protein Epr, yang diberi kode gen bpr dan epr (Sloma et al. 1988), keduanya adalah protease serin, sedangkan Mpr, yang diberi kode gen mpr, termasuk metaloprotease (Rufo et al. 1990). Pada penelitian ini dilakukan studi proteomik pada enzim ekstraseluler dari Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari pangan fermentasi Indonesia, oncom merah dan tempe gembus. Bahan dan Metode Mikroorganisme Bacillus licheniformis RO3 (AB968524) telah diisolasi dari pangan fermentasi oncom merah sedangkan B. pumilus 2.g (AB968523) diisolasi dari tempe gembus (Afifah et al. 2013). Persiapan sampel B. licheniformis RO3 ditumbuhkan dalam media ½ Luria-bertani broth (LB) + tepung oncom 1% (b/v), selanjutnya disebut media LBO, selama 0, 12, 24, 36, 48, 60, dan 72 jam pada inkubator goyang 120 rpm pada suhu 37oC. Enzim ekstraseluler didapat dengan sentrifugasi 6000 g selama 15 menit pada 4oC. Enzim selanjutnya dikeringbekukan untuk meningkatkan konsentrasi protein. Konsentrasi protein pada sampel dihitung dengan metode Bradford (1976). Aktivitas protease dihitung dengan metode (Bergmeyer et al. 1983) dengan substrat kasein. Sebelum dilakukan analisis spektometri massa menggunakan MALDI-TOF-MS, enzim ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 ini dianalisis fraksi proteinnya dengan elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) dan elektroforesis dua dimensi (2D). B. pumilus 2.g ditumbuhkan dalam media (nutrient broth) (NB) selama 72 jam pada inkubator goyang 120 rpm pada suhu 37oC. Enzim ekstraseluler didapat dengan sentrifugasi 12.000 g selama 10 menit pada 4oC. Enzim selanjutnya dimurnikan dengan pengendapan amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion dengan CM-Sephadex C-50 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), dan kromatografi interaksi hidrofobik dengan Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Pada setiap tahapan dilakukan dialisis. Enzim murni selanjutnya dikeringbekukan dan siap untuk analisis selanjutnya. Konsentrasi protein pada sampel dihitung dengan metode Bradford (1976). Aktivitas fibrinolitik dihitung dengan metode Jeong et al. (2007) dengan substrat fibrin. Sebelum dilakukan analisis spektometri massa menggunakan MALDI-TOF MS, enzim murni hanya dianalisis fraksi proteinnya dengan elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE).

44

Elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) dan zimogram Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dilakukan dengan konsentrasi gel pemisah sebesar 12% dan gel penahan sebesar 4% (Laemmli 1970). Zimogram dilakukan dengan konsentrasi gel pemisah sebesar 12% yang mengandung fibrinogen atau fibrin 0,02%. Elektroforesis dua dimensi (2D) Metode elektroforesis yang dilakukan pada penelitian ini dilakukan menurut Protean IEF Cell Instruction Manual dari BioRad. Rehidrasi Immobilized pH Gradient (IPG) strip. Sebanyak 50 µl sampel dengan konsentrasi protein sampai dengan 1 mg dicampurkan dengan 150 µl buffer rehidrasi (8 M Urea, 2 % CHAPS, 0,2% Bio-Lytes, dan 50 mM DTT). Selanjutnya, campuran sampel tersebut dimasukkan ke dalam focusing tray. Pelindung pada permukaan lembaran IPG strip dibuka dengan pinset lalu dimasukkan ke dalam larutan campuran sampel, letak kutub positif dan negatif pada IPG strip dan focusing tray disesuaikan, dan permukaan IPG strip menghadap ke bawah. Peletakkan IPG strip pada focusing tray harus seimbang. IPG strip kemudian dilapisi dengan minyak mineral sebanyak 2,5 ml. Selanjutnya wicks paper yang dibasahi dengan ddH2O disisipkan pada permukaan elektroda focusing tray. Setelah dipastikan tidak ada gelembung, focusing tray ditutup rapat dan IPG strip diinkubasi selama 16 jam dalam Protean IEF cell. Isoelectric Focusing (IEF). Setelah 16 jam, dilakukan running IEF dengan pengaturan sebagai berikut: Voltase I: 250 V, 30 menit; Voltase II: 4000 V, 1 jam; Voltase III: 4000 V, 3 jam dengan suhu 10oC. Setelah running IEF selama 4,5 jam, IPG strip diangkat dan dilakukan preparasi sebelum elektroforesis dimensi kedua. Preparasi sebelum elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE). IPG strip diinkubasi dalam 2,5 ml buffer equilibrasi I (6 M Urea, 0,375 M Tris-HCl, 2% SDS, 20% gliserol, 2% DTT) selama 15 menit dan dilanjutkan dengan inkubasi dalam 2,5 ml buffer equilibrasi II (6 M Urea, 0,375 M Tris-HCl, 2% SDS, 20% gliserol, 2,5% iodoacetamida) selama 15 menit. Selama proses inkubasi dalam buffer equilibrasi, disiapkan terlebih dahulu gel pemisah poliakrilamida untuk SDS-PAGE tanpa menggunakan gel penahan. Selanjutnya, buffer equilibrasi dibuang dan IPG strip siap untuk di-running pada dimensi kedua dengan elektroforesis SDS-PAGE pada tegangan 100 volt selama 2 jam dalam buffer elektroforesis. Setelah elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan pewarna Coomassie Brilliant Blue R-250. Analisis spektrometri MALDI-TOF-MS Digesti dalam gel dari titik protein hasil elektoforesis 2D atau pita protein hasil SDS-PAGE dilakukan menggunakan metode Lee et al. (2012). Semua analisis spektrometri massa dilakukan dengan MALDI-TOF-MS Voyager Biospectrometry Workstation (PE Biosystem, Foster City, CA, USA). Spektra dianalisis dengan data Explorer software (PE Biosystems) dan dibandingkan dengan semua database dari National Center of Biotechnology Information (NCBI) menggunakan program MASCOT peptide mass fingerprinting (http://www.matrixscience.com). Skor protein lebih dari 74 dinyatakan identik dengan protein tertentu (p<0,05).

45

Estimasi berat molekul (BM) dan titik isoelektrik (pI) Berat molekul fraksi protein dihitung berdasarkan rumus persamaan kurva standar berat molekul protein sedangkan titik isoelektrik fraksi protein dihitung berdasarkan pada rumus persamaan kurva standar titik isoelektrik. BM dan pI hasil perhitungan digunakan untuk konfirmasi hasil MALDI-TOF-MS, yaitu dengan cara memasukkan BM dan pI hasil perhitungan ke dalam program ExPASy-TagIdent (http://web.expasy.org/tagident/). Hasil dan Pembahasan Pada studi elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) protease ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 dengan media produksi LBO, terlihat bahwa pada fermentasi 0 jam tidak terlihat adanya pita fraksi protein. Pada jam ke 12 mulai terlihat beberapa pita, dan semakin bertambah jam fermentasi maka pita fraksi protein semakin banyak. Namun mulai jam ke-36 hingga jam ke-72 tidak ada lagi penambahan pita fraksi protein. Terlihat pada jam ke-36 hingga 72 jumlah pita protein tetap (Gambar 1).

M

0

12

24

36

48

60

72

Z

260 140 100 70 50 40 35 25

15 10

Gambar 1 Hasil elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) protease ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 dengan media LBO M marker fermentas, Z hasil zimogram dengan substrat fibrinogen Parameter kritis yang menentukan keberhasilan atau kegagalan dalam studi proteomik adalah kemampuan untuk mendapatkan protein tunggal dalam campuran kompleks. Salah satu cara yang paling efektif untuk memisahkan protein dalam campuran kompleks adalah dengan menggunakan elektroforesis dua dimensi. Pada penelitian ini, elektroforesis dua dimensi dilakukan pada protease ekstraseluler yang difermentasi pada media LBO selama 48 jam, yaitu pada saat tercapai aktivitas enzim tertinggi, 0,283 U/mg dan terbentuk beberapa

46

enzim protease ekstraseluler yang bersifat fibrinogenolitik (Gambar 1). Identifikasi menggunakan MALDI-TOF hasil elektroforesis dua dimensi hanya dilakukan pada tiga titik protein A, B, dan C (Gambar 2).

260 70

A

50

B

40

C

35 25

15

10

Gambar 2

Hasil elektroforesis dua dimensi protease ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 dengan media LBO

Tabel 1 Analisa hasil perbandingan m/z protein dari protease B. licheniformis RO3 dengan database Kode

A

BM (kDa)

pI

48

4.80

Kode akses A4IQG0

Skor protein 31

G4NXJ1

29

Q65JX1

27

B

37

5.38

Q65EB8

120

C

33

5.99

C8WV29

43

L0BRU6

29

* NCBI Reference Sequence

Kemiripan Nama Superoxide dismutase [Geobacillus thermodenitrificans NG80-2] YP_001126309.1* Response regulator aspartate phosphatase F [Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10] YP_004879327.1* Bacillopeptidase F [Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580] YP_006713127.1* Flagellin [Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580] YP_006715058.1* Short-chain dehydrogenase/reductase SDR [Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldarius DSM 446] YP_003184407.1* Hypothetical protein B938_15200 [Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AS43.3] YP_007187718.1*

BM (kDa) 52

pI 4.96

46

5.34

155

5.18

33

5.41

29

6.02

13

5.08

47

Hasil MALDI-TOF-MS yang dilanjutkan dengan identifikasi protein menunjukkan bahwa dari tiga titik yang diuji, hanya satu titik yang memiliki skor protein lebih dari 74, yaitu titik B dengan skor protein 120 dan identik dengan flagellin dari Bacillus licheniformis DSM 13. Flagellin adalah protein globular yang mengatur dirinya dalam silinder berongga untuk membentuk filamen pada flagela bakteri. Flagellin memiliki berat molekul sekitar 30.000 sampai 60.000 dalton. Flagellin adalah substituen utama flagela bakteri, dan ada dalam jumlah yang besar di hampir semua bakteri berflagela (Veith et al. 2004). Titik A dan C hasil elektroforesis 2D memiliki kemiripan dengan protein tertentu, dengan skor protein kurang dari 74. Titik A yang selanjutnya disebut sebagai fraksi A kemungkinan adalah bacillopeptidase F karena memiliki kemiripan dengan bacillopeptidase F dari B. licheniformis DSM 13 dengan skor protein 27. Hasil perhitungan berat molekul (BM) dan pI dengan kurva standar, fraksi A memiliki BM 48 kDa dan pI 4.80. Sedangkan bacillopeptidase F dari B. licheniformis DSM 13 memiliki BM 155 kDa dan pI 5.18. Bacillopeptidase F pertama kali ditemukan oleh Roitsch & Hageman (1983) yang merupakan endopeptidase serin yang diekskresikan oleh Bacillus subtilis 168 setelah berakhirnya pertumbuhan secara eksponensial. Enzim tersebut aktif pada pH 10 dan dihambat oleh inhibitor PMSF. Terdapat dua enzim bacillopeptidase F yang berhasil diisolasi, salah satu memiliki berat molekul 33 kDa, dan yang lain memiliki berat molekul 50 kDa. Kedua bentuk enzim adalah glikoprotein, yang lebih kecil memiliki pI 4.4, sedangkan yang lebih besar memiliki pI 5.4. Bacillopeptidase F yang berhasil diisolasi oleh Roitsch & Hageman (1983) berbeda dari semua protease lain dari B. subtilis. Bacillopeptidase F dari B. licheniformis KJ-31 yang bersifat fibrinolitik telah diidentifikasi oleh Hwang et al. (2007) dan memiliki BM 37 kDa. Bacillopeptidase F dari B. subtilis natto yang bersifat fibrinolitik juga telah diidentifikasi oleh Hitosugi et al. (2007) dan memiliki BM 34,1 kDa. Titik C yang selanjutnya disebut sebagai fraksi C kemungkinan adalah protein yang belum terkarakterisasi karena mirip dengan hypothetical protein dari B. amyloliquefaciens subs. plantarum AS43.3 dengan skor protein 29. Fraksi C memiliki BM 33 kDa dan pI 5.99. Hasil identifikasi menggunakan MALDI-TOFMS juga dikonfirmasi dengan membandingkan hasil perhitungan berat molekul (BM) dan pI dengan menggunakan program ExPASy-TagIdent (http://web.expasy.org/tagident/). Ternyata fraksi A dan C tidak memiliki kemiripan dengan protein yang ada dalam database UniProtKB/Swiss-Prot. Hasil ini menunjukkan bahwa kedua fraksi protein dalam protease ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 adalah baru atau berbeda dari yang sudah dilaporkan. Pada studi elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) protease ekstraseluler dari B. pumilus RO3 dengan media produksi NB, terlihat beberapa fraksi protein yang ditandai dengan adanya beberapa pita. Namun hanya tiga fraksi yang dilanjutkan untuk diidentifikasi. Aktivitas protease fibrinolitik yang terukur pada enzim ini adalah 1,442.3 U/mg.

48

M

Sampel

Z

D E F

Gambar 3 Protease fibrinolitik ekstraseluler dari B. pumilus 2.g M marker, Z zimogram dengan substrat fibrin Tabel 2 Analisa hasil perbandingan m/z protein dari protease dari B. pumilus 2.g dengan database Kode

D

E

F

BM (kDa) 23

20

15

Skor protein 52

Kode akses C8WXL1

42

M4HMH2

41

F8IDH7

40

G4NRL1

49

Q65117

43

K0G197

25

F2F9E3

Kemiripan Nama Septum site-determining protein MinD [Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldarius DSM 446] YP_003185221.1* Hypothetical protein BCK_26788 [Bacillus cereus FRI-35] YP_006599369.1* Septum site-determining protein MinD [Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldarius Tc-4-1] YP_005518349.1* Hypothetical protein GYO_1184 [Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10] YP_004876473.1* Zn-finger protein [Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580] YP_079408.1* CTP synthase [Bacillus thuringiensis MC28] YP_006831249.1* Permease [Solibacillus silvestris StLB046] YP_006462816.1*

BM (kDa) 29

pI 6.02

21

8.80

29

6.85

25

7.58

19

4.83

47

6.24

94

9.48

* NCBI Reference Sequence Hasil identifikasi menunjukkan bahwa dari ketiga pita yang diuji tidak ada yang memiliki skor protein lebih dari 74. Sehingga tidak ada satupun pita yang

49

memiliki kemiripan dengan protein database yang ada. Hal ini sejalan dengan hasil karakterisasi enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh B. pumilus 2.g (Afifah et al. 2014). Enzim fibrinolitik ini merupakan serin protease namun memiliki BM 20 kDa. Umumnya serin protease yang bersifat fibrinolitik memiliki BM 27 kDa (Jo et al. 2011a; Jo et al. 2011b). Sebuah penelitian genomik terhadap Bacillus subtilis yang melibatkan banyak peneliti, ditemukan 11 protease ekstraseluler yang berbeda dan telah diidentifikasi (Kunst et al. 1997). Penelitian yang dilakukan oleh Park et al. (2002) dapat mendeteksi dua protease serin ekstraselular yang memiliki aktivitas fibrinolitik dari Bacillus subtilis 168, yaitu WprA (52 kDa) dan Vpr (68 kDa). Pada penelitian ini hanya ada satu fraksi protein yang teridentifikasi, yaitu flagellin. Namun flagellin bukan merupakan protease ekstraseluler. Sehingga kemungkinan protein lain yang diuji adalah fraksi protein baru yang belum pernah dilaporkan dan memiliki aktivitas protease fibrinolitik. Fraksi protein baru ini bisa merupakan bacillopeptidase F maupun protease ekstraseluler lainnya. Seperti telah disampaikan sebelumnya bahwa keberhasilan dari studi proteomik adalah pada proses pemisahan protein kompleks menjadi fraksi protein tunggal. Mengacu pada penelitian yang telah dilakukan maka penelitian yang lebih mendalam sangat diperlukan untuk memastikan beberapa fraksi protein baru tersebut terutama pada tahapan pemisahan protein. Simpulan Bacillus licheniformis RO3 dan B. pumilus 2.g dapat menghasilkan beberapa protease ekstraseluler. Hasil identifikasi menggunakan MALDI-TOFMS menunjukkan bahwa terdapat lima fraksi protein baru yang terdapat pada protease fibrinolitik ekstraseluler yang dihasilkan oleh Bacillus licheniformis RO3 (2 fraksi) maupun B. pumilus 2.g (3 fraksi). Daftar Pustaka Afifah DN, Sulchan M, Syah D, Yanti, Suhartono MT. 2013. Proteolytic and fibrinolytic activities of several microorganisms screened from Red Oncom and Tempeh Gembus, Indonesian fermented soybean cakes. [Abstract]. 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition. Yogyakarta, Indonesia. Afifah DN, Sulchan M, Syah D, Yanti, Suhartono MT. Kim JH. 2014. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus pumilus 2.g isolated from Tempeh Gembus, an Indonesian fermented food. Preventive Nutrition and Food Science 19(3):213-219. Anderson NL, Anderson NG. 1998. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words. Electrophoresis 19:1853–1861. Bergmeyer HU, Grassl M. 1983. Methods of Enzymatic Analysis. Vol ke-2. Weinheim: Verlag Chemie. hlm 1007-1009. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein dyebinding. Anal Biochem 72:234-254. Cordwell SJ, Nouwens AS, Walsh BJ. 2001. Comparative proteomics of bacterial pathogens. Proteomics 1:461–472.

50

Gianazza E. 2002. Casting Immobilized pH Gradients (IPGs). Di dalam: Walker JM, editor. The Protein Protocols Handbook. Ed ke-2. Totowa, NJ: Humana Press. hlm 169-180. Gravel P. 2002. Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins Using Carrier Ampholyte pH Gradients in the First Dimension. Di dalam: Walker JM, editor. The Protein Protocols Handbook. Ed ke-2. Totowa, NJ: Humana Press. hlm 163-168. Hitosugi M, Ikeda M, Zhu X, Kato H, Omura K, Nagai T, Tokudome S. 2007. Anticoagulant and fibrinolytic effects of functional food materials produced by Bacillus subtilis natto. Journal of Japanese Society of Biorheology 21(1): 35-40. Hwang KJ, Choi KH, Kim MJ, Park CS, Cha J. 2007. Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus licheniformis KJ31, Isolated from Korean traditional Jeot-gal. Journal of Microbiology and Biotechnology 9:1469–1476. Jeong SJ, Kwon GH, Chun J, Kim JS, Park CS, Kwon DY, Kim JH. 2007. Cloning of fibrinolytic enzyme gene from Bacillus subtilis isolated from Cheonggukjang and its expression in protease-deficient Bacillus subtilis Strains. J. Microbiol. Biotechnol. 17: 1018–1023. Jo HD, Lee HA, Jeong SJ, Kim JH. 2011a. Purification and characterization of a major fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 isolated from Meju. J Microbiol Biotechnol. 21: 1166–1173. Jo HD, Kwon GH, Park JY, Cha J, Song YS, Kim JH. 2011b. Cloning and overexpression of aprE3-17 encoding the major fibrinolytic protease of Bacillus licheniformis CH3-17. Biotechnol Bioprocess Eng. 16: 352-359. Kawamura F, Doi RH. 1984. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases. J. Bacteriol. 160: 442–444. Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, et al. 1997. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390: 249–256. Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Lee SG, Lee KW, Park TH, Park JY, Han NS, Kim JH. 2012. Proteomic analysis of proteins increased or reduced by ethanol of Lactobacillus plantarum ST4 isolated from Makgeolli, traditional Korean rice wine. J. Microbiol. Biotechnol. 22: 516-525. Park SG, Kho CW, Cho S, Lee DH, Kim SH, Park BC. 2002. A functional proteomic analysis of secreted fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis 168 using a combined method of two-dimensional gel electrophoresis and zymography. Proteomics 2:206-211. Philips CI, Bogyo M. 2005. Micro review proteomic meets microbiology technical advance in the global mapping of protein expression and function. Cell microb 8:1061-1076. Priest FG. 1997. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriol. Rev. 41: 711–753. Roitsch CA, Hageman JH. 1983. Bacillopeptidase F: two forms of a glycoprotein serine protease from Bacillus subtilis 168. J. Bacteriol. 155: 145–152.

51

Rufo GA, Sullivan BJ, Sloma A, Pero J. 1990. Isolation and characterization of a novel extracellular metalloprotease from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 172: 1019–1023. Sloma A, Ally A, Ally D, Pero J. 1988. Gene encoding a minor extracellular protease in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 170: 5556–5557. Veith B, Herzberg C, Steckel S, Feesche J, Maurer KH, Ehrenreich P, Bäumer S, Henne A, Liesegang H, Merkl R, Ehrenreich A, Gottschalk G. 2004. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7(4): 204-11. Wilmes P, Bond PL. 2004. The application of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and downstream analyses to a mixed community of prokaryotic microorganisms. Env Mikrobiol 6:911-920.

52 7

PEMBAHASAN UMUM

Sebagaimana tersaji pada Bab-bab sebelumnya, fokus penelitian ini adalah melakukan kajian terhadap protease fibrinolitik mikroba dari oncom merah dan tempe gembus dengan tahapan penelitian (1) mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik, (2) melakukan pemanfaatan tepung oncom merah sebagai media produksi protease fibrinolitik mikroba, (3) melakukan pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih, dan (4) melakukan studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi. Jawaban terhadap tujuan penelitian telah dipublikasi dalam beberapa artikel ilmiah berikut: 1) Proteolytic and fibrinolytic activities of several microorganisms screened from Red Oncom and Tempeh Gembus, Indonesian fermented soybean cakes, abstraknya telah dipresentasikan secara oral pada 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013, sedangkan artikel lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of Microbiology, 2) The use of red oncom powder as potential production media for fibrinogenolytic protease derived from Bacillus licheniformis RO3, telah dipresentasikan secara oral pada International Symposium on Food and Agro-Biodiversity di Semarang pada 16 – 17 Sepetember 2014 dan artikel lengkapnya sedang dalam proses telaah untuk diterbitkan pada Proceedia Food Science Elsevier, 3) Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus pumilus 2.g isolated from Tempeh Gembus, an Indonesian fermented food, telah diterima untuk dipublikasikan pada Preventive Nutrition and Food Science Journal (PNF) Vol 19(3): 213-219, (4) Studi proteomik protease fibrinolitik ekstraseluler dari Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari pangan fermentasi indonesia, berupa manuskrip yang siap didaftarkan pada jurnal nasional terakreditasi Dikti. Pembahasan umum terhadap masing-masing tujuan penelitian akan dikupas lebih mendalam dalam bab ini. Isolasi dan Identifikasi Mikroba dari Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus yang dapat Memproduksi Protease Fibrinolitik Proses fermentasi merupakan suatu proses yang mendayagunakan aktivitas metabolisme suatu mikroba tertentu atau campuran dari beberapa spesies mikroba untuk menghasilkan senyawa tertentu. Salah satu pemanfaatan teknologi fermentasi adalah dalam industri pangan. Masyarakat di Indonesia tidak asing dengan pangan fermentasi karena banyak pangan fermentasi yang menjadi makanan sehari-hari, diantaranya adalah oncom merah dan tempe gembus. Oncom adalah makanan asal Indonesia yang populer di daerah Jawa Barat. Makanan ini adalah produk fermentasi yang dilakukan oleh beberapa jenis kapang. Ada dua jenis oncom, yaitu oncom merah dan oncom hitam. Oncom merah didegradasi oleh kapang oncom Neurospora sitophila (Sastraatmadja et al. 2002) atau N. intermedia (Wood 1998) sedangkan oncom hitam didegradasi oleh kapang

53 tempe Rhizopus oligosporus dan/atau jenis-jenis Mucor (Sastraatmadja et al. 2002). Oncom merah umumnya dibuat dari ampas tahu, yaitu kedelai yang telah diambil proteinnya dalam pembuatan tahu, sedangkan oncom hitam umumnya dibuat dari ampas kacang tanah yang dicampur ampas singkong atau tepung singkong (tapioka), agar mempunyai tekstur yang lebih baik dan lebih lunak. Walaupun kedua bahan substrat tersebut berupa limbah, kandungan gizinya masih cukup tinggi untuk dapat dimanfaatkan manusia. Tempe gembus merupakan pangan fermentasi yang sangat populer dikonsumsi masyarakat lapisan bawah secara luas, terutama di Jawa Tengah. Tempe gembus dibuat dari bahan dasar ampas tahu melalui proses fermentasi oleh mikroorganisme yang sama yang digunakan pada pembuatan tempe kedele, yaitu Rhizopus sp. Komposisi zat gizi tempe gembus mirip dengan tempe kedele meskipun kadarnya lebih kecil (Sulchan & Endang 2007). Seperti halnya tempe kedele, tempe gembus diketahui mengandung zat-zat yang dapat mempengaruhi kadar lipid darah (Sulchan & Rukmi 2007). Efek hipokolesterolemik pada tempe gembus terhadap hewan coba tikus menunjukkan hasil yang nyaris sama dengan tempe kedele (Sabudi et al. 1997). Aktivitas fibrinolitik dari tempe yang difermentasi dengan Fusarium sp. BLB telah diteliti oleh Sugimoto et al. (2007), namun aktivitas fibrinolitik dari tempe gembus belum pernah diteliti.

A

B

Gambar 1 Oncom merah (A) dan tempe gembus (B) Pada penelitian ini, ditemukan 43 isolat yang dapat tumbuh dalam media skim milk agar (SMA) dan memiliki potensi menghasilkan protease yang ditandai dengan kemampuannya dalam menghasilkan zona bening pada media SMA. Enam belas isolat (RO1-19) berasal dari oncom merah segar, 11 isolat (ROa-k) berasal dari oncom merah yang telah mengalami perlakuan pemanasan 80oC selama 15 menit, 7 isolat (1-7.g) dari tempe gembus segar, dan 6 isolat (a-f.g) dari yang telah mengalami perlakuan pemanasan 80oC selama 15 menit. Media SMA sering digunakan untuk isolasi mikroba penghasil protease karena praktis dan murah. Kemampuan mikroba mendegradasi susu skim yang terdapat dalam media yang ditujukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni menandakan bahwa isolat tersebut berpotensi sebagai mikroba penghasil enzim protease. Uji aktivitas fibrinolitik dengan metode cakram fibrin bertujuan untuk mencari isolat yang mampu menghasilkan enzim fibrinolitik. Fibrin merupakan komponen protein utama dalam pembekuan darah, yang terbentuk dari fibrinogen oleh thrombin (Voet  Voet 1990). Enzim yang dihasilkan oleh 43 isolat yang

54 berpotensi menghasilkan protease diuji dengan modifikasi metode cakram fibrin (Hwang et al. 2007). Cakram fibrin dibuat dengan mereaksikan fibrinogen dengan thrombin sehingga terbentuk benang-benang fibrin. Hasil dari skrining menggunakan cakram fibrin menunjukkan bahwa dari ke-43 isolat yang dapat membentuk zona bening pada media SMA, terdapat 3 isolat yang tidak dapat membentuk zona bening pada cakram fibrin, yaitu isolat RO4, RO12, dan RO13 . Zona bening terbesar dihasilkan oleh isolat 2.g. Hasil ini menunjukkan bahwa tidak semua mikroba yang mampu mendegradasi protein susu skim juga dapat mendegradasi protein fibrin. Seperti enzim fibrinolitik yang dihasilkan dari Bacillus licheniformis KJ-31 yang diisolasi dari Jeotgal, pangan fermentasi Korea, hanya mampu mendegradasi fibrin dan fibrinogen dengan baik, namun tidak mampu mendegradasi bovine serum albumin, kasein, dan susu skim (Hwang et al. 2007). Aktifitas fibrinolitik suatu protease juga dapat dilakukan secara in situ dengan metode zimografi. Substrat yang digunakan adalah fibrinogen 0,1% (b/v). Aktivitas enzim dan konsentrasi protein yang dimasukkan dalam gel sekitar 0,010,53 mU dan 0,34-1,59 µg. Dari 43 isolat, hanya 39 isolat yang menunjukkan aktivitas fibrinogenolitik. Empat isolat yang tidak mampu mendegradasi fibrinogen adalah isolat RO12, RO13, a.g, dan c.g. Pada uji aktivitas fibrinolitik menggunakan cakram fibrin, isolat RO12 dan RO13 tidak mampu mendegradasi fibrin. Sehingga dapat dipastikan bahwa isolat RO12 dan RO13 mampu mendegradasi susu skim dalam media SMA, namun tidak mampu mendegradasi fibrin maupun fibrinogen. Sedangkan isolat RO4 mampu mendegradasi susu skim pada media SMA, tidak mampu mendegradasi fibrin pada uji menggunakan cakram fibrin, namun mampu mendegradasi fibrinogen pada uji menggunakan zimografi. Sehingga dapat dikatakan bahwa Isolat RO4 memiliki aktivitas spesifik pada fibrinogen. Pada Bab 3 Gambar 2 menunjukkan bahwa beberapa isolat mampu menghasilkan enzim protease fibrinolitik dengan pola fraksi yang hampir sama dan hanya beberapa isolat yang memiliki fraksi protein dengan berat molekul (BM) yang rendah. Pola fraksi yang hampir sama kemungkinan besar menunjukkan bahwa beberapa isolat berasal dari jenis yang sama. Pola fraksi protein dari berbagai protease fibrinolitik dirangkum pada Bab 3 Tabel 2. Isolat yang mengasilkan enzim fibrinolitik dengan fraksi berberat molekul rendah atau <50 kDa adalah RO1, RO2, RO3, RO4, RO8, RO10, RO11, RO14, RO16, RO17, RO18, RO19, ROa, ROb, ROc, ROd, ROe, ROf, ROg, ROh, ROi, ROk, 1.g, 2.g, 3.g, 4.g, 5.g, 6.g, dan 7.g. Beberapa enzim fibrinolitik dari mikroba yang telah diteliti dan dikarakterisasi menunjukkan bahwa enzim tersebut memiliki berat molekul yang relatif rendah. Nattokinase dari B. natto memiliki BM 27,7 kDa (Fujita et al. 1993; Sumi et al. 1987), subtilisin DFE dari B. amyloliquefaciens DC-4 memiliki BM 28 kDa (Peng et al. 2003), CK dari Bacillus sp. CK memiliki BM 28,2 kDa (Kim et al. 1996), subtilisin DJ-4 dari Bacillus sp. DJ-4 memiliki BM 29 kDa (Kim & Choi 2000), enzim jeotgal dari Bacillus sp. KA38 (Kim et al. 1997). Tahap identifikasi mikroba dimulai dengan pewarnaan gram dan spora yang dilakukan pada semua isolat yang mampu menghasilkan enzim fibrinolitik. Dari 28 isolat, yang teridentifikasi sebagai Bacillus, yang ditandai dengan bentuk basil, gram positif, dan menghasilkan spora adalah isolat RO1, RO2, RO3, RO16, RO17,

55 RO18, RO19, semua isolat dari oncom merah yang telah dipanaskan, yaitu isolat ROa, ROb, ROc, ROd, ROe, ROf, ROg, ROh, ROi, ROj, dan ROk, isolat dari tempe gembus segar yaitu 1.g, 2.g, 3.g, 4.g, 5.g, 6.g, dan semua isolat dari tempe gembus yang telah dipanaskan, yaitu isolat a.g, b.g, c.g, d.g, e.g, dan f.g. Tahap identifikasi selanjutnya tidak dilakukan pada semua isolat karena beberapa isolat menghasilkan protease fibrinolitik dengan pola fibrinolitik yang hampir sama dan isolat yang dipilih adalah isolat yang kemungkinan aman. Isolat RO1, RO2, dan RO3 terlihat memiliki pola fibrinolitik yang sama, sehingga dipilih isolat RO3 untuk identifikasi selanjutnya. Begitu pula pada isolat RO16, RO17, dan RO19 hanya dipilih isolat RO19. Di antara isolat ROa-k, dipilih isolat ROg dan ROj. Sebelum masuk pada uji biokimiawi menggunakan kit API 50CHB, dilakukan uji katalase pada isolat yang dipilih yaitu isolat RO3, RO19, ROg, ROj, dan 2.g untuk memastikan bahwa isolat tersebut adalah Bacillus. Hasil uji biokimia menunjukkan bahwa isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (99,9%), isolat RO19 sebagai B. cereus 1 (71,7%), isolat ROg sebagai Brevibacillus laterosporus (99,3%), isolat ROj sebagai B. cereus 1 (40,5%), dan isolat 2.g sebagai B. pumilus (99,7%). Target isolasi adalah mikroba penghasil protease fibrinolitik yang aman sehingga hanya isolat RO3 dan 2.g yang dipilih untuk penelitian tahap berikutnya. Identifikasi molekuler dengan analisis 16s-rRNA menunjukkan bahwa isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (96%) dan isolat 2.g sebagai B. pumilus (97%). Genus Bacillus telah diketahui banyak ditemukan pada makanan fermentasi. Penelitian yang dilakukan oleh Ogbadu dan Okagbuet (1988) berhasil mengidentifikasi tiga Bacillus yang berperan utama dalam fermentasi kacangkacangan (Parkia biglobosa) makanan khas Afrika, yaitu B. subtilis, B. pumilus, dan B. licheniformis. Sedangkan penelitian yang dilakukan oleh Ouoba et al. (2003) hanya menemukan dua Bacillus yang berperan utama dalam pangan fermentasi kacang-kacangan Afrika, soumbala, yaitu Bacillus subtilis dan B. pumilus. Bacillus subtilis dan B. licheniformis juga merupakan strain yang banyak ditemukan pada makanan fermentasi Korea, chungkookjang (Joo et al. 2007). Genus Bacillus yang berhasil diisolasi dari pangan fermentasi di berbagai negara memiliki manfaat yang beragam. Penelitian yang dilakukan oleh Olajuyigbe dan Ajele (2008) berhasil mengisolasi B. licheniformis Lbbl-11 dari “iru”, pangan fermentasi dari Afrika, yang mampu memproduksi protease ekstraseluler. Kwon et al. (2004) berhasil mengisolasi B. pumilus JB-1 yang mampu meningkatkan sistem imun dari pangan fermentasi Korea, chungkookjang. Bacillus pumilus yang mampu mendegradasi bisphenol A (BPA) berhasil diisolasi oleh Yamanaka et al. (2007) dari makanan fermentasi Korea, Kimchi. Bacillus subtilis dan B. pumilus yang diisolasi dari pangan fermentasi kacang-kacangan Afrika, soumbala, mempunyai aktivitas antimikroba (Ouoba et al. 2007). Genus Bacillus penghasil enzim fibrinolitik juga telah banyak dilaporkan, terutama strain B. subtilis, Bacillus sp, B. amyloliquefaciens, dan B. licheniformis. Hwang et al. (2007) berhasil mengisolasi B. licheniformis KJ-31 dari jeotgal, pangan fermentasi dari Korea, yang mampu memproduksi enzim fibrinolitik dengan berat molekul 37 kDa. Bacillus amyloliquefaciens DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina (Peng & Zhang 2002), Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea (Kim et al. 1996), Bacillus sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea (Choi et al. 2005; Kim & Choi 2000),

56 dan Bacillus sp. KA38 dari jeotgal, ikan asin fermentasi dari Korea (Kim et al. 1997) telah berhasil diisolasi dan mampu menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Bacillus natto yang merupakan Bacillus subtilis yang diisolasi dari natto, pangan fermentasi kedele dari Jepang adalah strain yang telah banyak diteliti manfaatnya dan telah banyak diaplikasikan. Tabel 1 Bacillus dari pangan fermentasi Mikroba Pangan Deskrisi Nama Enzim B. natto Natto, Kedelai Nattokinase Jepang fermentasi (NK) B. amyloliquefaciens Douchi, Kedelai Subtilisin DC-4 Cina fermentasi DFE Bacillus sp. CK Chungkook- Saus CK jang, Korea kedelai fermentasi Bacillus sp. DJ-4 Doen-jang, Saus Subtilisin Korea kedelai DJ-4 fermentasi Bacillus sp. DJ-2 Doen-jang, Saus bpDJ-2 Korea kedelai fermentasi Bacillus sp. KA38 Jeot-gal, Ikan asin Jeot-gal Korea fermentasi enzyme B. subtilis QK02 Kedelai Kedelai QK-1 dan fermentasi fermentasi QK-2 Bacillus firmus NA-1 Natto Kedelai -fermentasi B. subtilis IMR-NK1 Natto Kedelai -fermentasi Bacillus sp. KDO-13 Soybean Pasta -paste, kedelai Korea Bacillus sp. Kimchi, Sayuran -Korea fermentasi B. licheniformis RO3 Oncom Fermentasi -merah, ampas tahu Indonesia B. pumilus 2.g Tempe Fermentasi -gembus, ampas tahu Indonesia

Referensi Fujita et al. 1993 Peng et al. 2003 Kim et al. 1996 Kim & Choi 2000 Choi et al. 2005 Kim et al. 1997 Ko et al. 2004 Seo & Lee 2004 Chang et al. 2000 Lee et al. 2001 Noh et al. 1999 Penelitian ini

Penelitian ini

Nilai gizi dan manfaat lain bagi kesehatan dari oncom merah dan tempe tempe gembus telah banyak dilaporkan (Depkes 1993; Sulchan & Endang 2007). Tempe gembus dapat menurunkan kadar kolesterol total, kolesterol LDL (low density lipoprotein), dan menaikkan rasio HDL/LDL (Sulchan & Rukmi 2007). Namun penelitian mengenai mikroba apa saja yang terlibat dalam proses fermentasi oncom merah dan tempe gembus masih sangat terbatas.

57 Penelitian ini adalah yang pertama kalinya melaporkan mikroba penghasil protease fibrinolitik yang berhasil diisolasi dari oncom merah dan tempe gembus. Walaupun mikroba utama yang berperan dalam fermentasi ampas tahu pada pembuatan oncom merah dan tempe gembus adalah kapang, namun beberapa bakteri dapat tumbuh dan ikut berperan dalam fermentasi hingga dapat dihasilkan oncom merah dan tempe gembus yang layak untuk dikonsumsi. Pemanfaatan Tepung Oncom Merah sebagai Media Produksi Protease Fibrinogenolitik Mikroba Protease fibrinogenolitik maupun fibrinolitik yang diperoleh dari mikroba mempunyai kelebihan, yaitu dapat diproduksi dalam jumlah besar, produktifitasnya mudah ditingkatkan dan mutunya lebih seragam dan harganya lebih murah. Hal ini menyebabkan meluasnya penggunaan mikroba sebagai penghasil enzim. Kacang-kacangan seperti kedelai dan hasil perikanan yang difermentasi ternyata memiliki aktivitas fibrinolitik yang kuat. Pangan fermentasi kedelai yang terkenal di Indonesia adalah tempe, oncom, dan tempe gembus. Berbeda dengan tempe, oncom dan tempe gembus merupakan pangan fermentasi ampas kedelai. Ampas kedelai atau lebih dikenal sebagai ampas tahu adalah limbah hasil pembuatan tahu. Tabel 2 Komposisi gizi ampas tahu per 100 g bahan (Depkes RI 1993) Energi dan zat gizi Kandungan Energi (kkal) 414 Protein (g) 26,60 Lemak (g) 18,30 Karbohidrat (g) 41,30 Kalsium (mg) 19,0 Fosfor (mg) 29 Besi (mg) 4,00 Ampas tahu sebenarnya masih mempunyai nilai gizi yang cukup tinggi, tetapi kebanyakan sifat organoleptiknya kurang disukai. Ampas tahu dengan proses fermentasi (oncom merah) lebih disukai sebagai makanan daripada tanpa fermentasi. Ampas tahu merupakan produk olahan dari tahu yang kemungkinan sifat proteinnya hampir sama dengan tahu dan kedelai, walaupun telah mengalami banyak perubahan karena perlakuan tertentu selama proses pembuatan tahu, seperti pemanasan. Disebutkan dalam Daftar Komposisi Bahan Makanan, kandungan zat gizi ampas tahu sebenarnya cukup tinggi yaitu mengandung 26,6% protein, 18,3% lemak, dan 41,3 % karbohidrat dalam 100 g. Kandungan zat gizi ampas tahu yang masih cukup tinggi dan terdapat dalam jumlah yang banyak memberikan peluang yang sangat besar untuk dimanfaatkan sebagai media pertumbuhan mikroba penghasil enzim untuk kesehatan. Ampas tahu juga masih mengandung mineral walaupun dengan kadar yang cukup rendah (Tabel 2). Tingginya biaya produksi enzim merupakan salah satu hambatan suksesnya aplikasi protease di industri. Pemilihan media produksi merupakan faktor kritis untuk fermentasi enzim fibrinolitik. Mikroba penghasil enzim fibrinolitik

58 memiliki karakteristik fisiologis yang beragam sehingga perlu dilakukan optimasi komponen nutrisi dan kondisi lingkungan untuk pertumbuhannya dan untuk produksi enzim fibrinolitik. Isolat yang dipilih untuk dilakukan optimasi pertumbuhan dengan media tepung oncom merah adalah isolat yang didapat dari oncom merah segar, yaitu B. licheniformis RO3. Pemilihan ini didasarkan pada aktivitas fibrinolitik dari B. licheniformis RO3 yang lebih rendah dari B. pumilus 2.g, isolat dari tempe gembus. Dengan optimasi media pertumbuhan diharapkan dapat meningkatkan aktivitas enzim yang dihasilkan. B. licheniformis RO3 telah dicoba ditumbuhkan pada 3 media yang berbeda, yaitu Luria-bertani broth (LB), ½ LB + susu skim 1% (b/v) (LBS), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v) (LBO). Di dalam media LB, B. licheniformis RO3 dapat memproduksi protease dengan aktivitas tertinggi 0,024 U/ml atau 0,157 U/mg setelah 36 jam fermentasi. Pada media LBS, aktivitas tertinggi yaitu 0,022 U/ml atau 0,152 U/mg setelah 48 jam fermentasi. Hasil terbaik ditunjukkan saat B. licheniformis RO3 ditumbuhkan pada media LBO media dengan aktivitas tertinggi 0,051 U/ml atau 0.283 U/mg setelah 48 jam fermentasi. B. licheniformis RO3 yang berhasil diisolasi dari oncom merah segar dapat ditumbuhkan pada media yang mengandung tepung oncom merah dan menghasilkan aktivitas protease fibrinogenolitik yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan media komersil. Hasil ini disebabkan oleh adanya kemampuan adaptasi B. licheniformis RO3 pada media asilnya. Protease fibrinogenolitik yang dihasilkan dari B. licheniformis RO3 dengan media produksi LBO memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 60oC. Beberapa pati dan dekstrin merupakan sumber karbon terbaik untuk Bacillus amyloliquefaciens DC-4 dalam menghasilkan enzim fibrinolitik karena memiliki aktivitas amilase tinggi (Peng & Zhang 2002). Agrebi et al. (2009) melaporkan bahwa Bacillus subtilis A26 mampu menghasilkan enzim fibrinolitik optimum pada media yang mengandung 40,0 g/L gandum, 3,53 g/L kasein pepton, 4,0 g/L CaCl2, 3,99 g/L NaCl, 0,01 g/L MgSO4, dan 0,01 g/L KH2PO4, pH 7,78. Optimasi media mengakibatkan produksi fibrinolitik meningkat 4,2 kali lipat (269,36 U/mL) dibandingkan dengan yang diperoleh dengan media awal (63,45 U/mL). Bacillus subtilis Natto B-12 menghasilkan aktivitas nattokinase, salah satu enzim fibrinolitik, tertinggi ketika maltosa digunakan dalam media produksi. Sebaliknya, produsi enzim sangat rendah ketika sukrosa digunakan sebagai sumber karbon. Konsentrasi tinggi sukrosa dapat menghambat bakteri memproduksi protease, sedangkan maltosa dapat menurunkan represi katabolit dan menginduksi produksi enzim. Karbamid dan amonium sulfat dapat menurunkan produksi nattokinase. Dedak gandum membantu meningkatkan rendemen enzim. Dedak tersusun dari pati (12-18%), protein (15-18%), serat makanan (35-50%), lemak (3-5%), dan abu (4-6%). Dampak positif dari dedak gandum disebabkan karena memperkaya aminofenol, vitamin, mineral, dan enzim. Komposisi media terbaik agar Bacillus subtilis Natto B-12 dapat menghasilkan nattokinase dengan aktivitas tinggi adalah maltosa 2%, dedak gandum 3%, NaCl 0,5%, KH2PO4 0,1%, K2HPO4 0,4%, dan MgSO4.7H2O 0,05%, pH 7,0 (Wang et al. 2009). Tepung oncom merah mengandung protein 23,2 %, lemak 3,5 %, karbohidrat 62,3 %, dan abu 4,95 %. Penambahan tepung oncom merah pada

59 media produksi dapat meningkatkan aktivitas protease fibrinolitik kemungkinan disebabkan karena kandungan protein, serat, maupun komponen vitamin dan mineralnya. Komponen serat diperkirakan sebagai penyumbang terbesar kandungan karbohidrat yang terukur tinggi pada tepung oncom merah. Kandungan protein yang tinggi pada tepung oncom merah dapat digunakan sebagai substrat bagi mikroba B. licheniformis RO3 dalam menghasilkan protease fibrinogenolitik. Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Fibrinolitik Pemurnian dan karakteristik enzim fibrinolitik mikroba pangan yang sudah terbukti aman dan efektivitasnya sebagai agen trombolitik perlu lebih banyak diteliti. Karakteristik enzim fibrinolitik mikroba dari pangan fermentasi asal Indonesia sangat diperlukan dalam pengembangan selanjutnya sebagai obat trombolitik yang aman ataupun aplikasinya sebagai pangan fungsional. Isolat yang dipilih adalah B. pumilus 2.g. Pengaruh empat media yang berbeda terhadap kurva pertumbuhan dan aktivitas fibrinolitik B. pumilus 2.g dilakukan untuk mengetahui media komersil terbaik bagi B. pumilus 2.g dalam menghasilkan enzim fibrinolitik. Aktivitas fibrinolitik tertinggi (187 U/mg protein) teramati pada fase stasioner di dalam media NB, yaitu pada jam ke-72 dan stabil hingga jam ke-96. Aktivitas fibrinolitik dalam media LB, BHI, dan TSB jauh lebih rendah, yaitu 29 U/mg protein pada LB (96 jam), 11 U/mg protein pada BHI (96 jam), dan 74 U/mg protein pada TSB (96 jam). Penelitian lain melaporkan bahwa media TSB adalah media terbaik untuk pertumbuhan B. amyloliquefaciens CH51 dalam menghasilkan enzim fibrinolitik setelah 50 jam inkubasi dan NB adalah media terbaik kedua (Kim et al. 2009). Sedangkan LB adalah media terbaik bagi B. licheniformis CH3-17 (Jo et al. 2011b). Hasil ini menjelaskan bahwa media terbaik bagi pertumbuhan mikroba penghasil enzim fibrinolitik sangat bervariasi tergantung pada organismenya. Lingkungan pertumbuhan sangat mempengaruhi aktivitas fibrinolitik yang dihasilkan. Bacillus pumilus 2.g menghasilkan beberapa fraksi protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik kuat. Enzim fibrinolitik dengan berat molekul 20 kDa telah dimurnikan dari 3 L supernatan kultur B. pumilus 2.g dengan tahapan pengendapan amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion menggunakan matriks CM-Sephadex C-50, dan kromatografi hidrofobik menggunakan matriks Phenyl Sepharose 6-FF. Tahapan pemurnian menggunakan Phenyl-Sepharose column chromatography, memberikan tingkat kemurnian hingga 16 kali dengan yield sebesar 25%. Beberapa kajian tentang pemurnian enzim fibrinolitik telah banyak dilakukan. Enzim fibrinolitik dari B. licheniformis KJ-31 berhasil dimurnikan dengan tahapan pengendapan amonium sulfat 75%, kromatografi penukar ion menggunakan matriks DEAE-Sepharose FF, dan filtrasi gel menggunakan Sepharyl S-200 menghasilkan peningkatan aktivitas spesifik hingga 19 kali dengan yield 0,2% (Hwang et al. 2007). Penelitian lain yaitu enzim fibrinolitik dari B. amyloliquefaciens CH51 berhasil dimurnikan dengan tahapan pengendapan amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion menggunakan matriks CM-Sephadex C-50, dan kromatografi hidrofobik menggunakan matriks Phenyl Sepharose 6-FF.

60 Tabel 3 Karakteristik berbagai enzim fibrinolitik mikroba Enzim BM, pI, Stabilitas pH Keterangan pH dan suhu dan suhu optimum Nattokinase 27,7 kDa, Stabil pada pH Protease serin pI 8,6 7-12 dan di kelompok bawah 50oC subtilisin Subtilisin 28 kDa, Stabil pada pH Protease serin DFE pI 8,0, pH 10, 6-10 dan di kelompok 48oC bawah 50oC subtilisin selama 60 menit CK 28,2 kDa, Stabil pada pH Protease serin o pH 10, 70 C 7-10,5 dan di alkali termofilik bawah 50oC selama 60 menit Subtilisin DJ- 29 kDa, Stabil pada pH Protease serin o 4 pH 10, 40 C 4-11 pada suhu serupa plasmin ruang selama 48 jam Subtilisin 28 kDa, Stabil pada pH Protease serin o QK-2 pH 8,5, 55 C 3-12, 40oC kelompok selama 30 subtilisin menit Enzim Jeot41 kDa, Stabil hingga Metaloprotease, gal pH 7,0, 40oC 70oC, pH 7-9 Zn2+ pada sisi aktif Dari Bacillus 45 kDa, Stabil pada pH Metaloprotease, sp.KDO-13 pH 7,0, 60oC 7-9, 50oC Co2+ dan Hg2+ meningkatkan aktivitas Dari R. 18 kDa, Stabil pada pH Pusat aktivitas chinensis 12 pI 8,5, pH 6,8-8,8 pada memiliki 10,5, 45oC 37oC selama hidrosulfuril dan 24 jam logam Dari B. 20 kDa, Stabil pada pH Protease serin pumilus 2.g pH 7, 5-9 pada 37oC kelompok o 50 C selama 30 subtilisin menit, stabil hingga suhu kurang dari o 60 C

Referensi

Fujita et al. 1993; Sumi et al. 1987 Peng et al. 2003

Kim et al. 1996

Kim & Choi 2000

Ko et al. 2004

Kim et al. 1997 Lee et al. 2001

Xiao-lan et al. 1999

Penelitian ini

Pemurnian yang dilakukan dapat meningkatkan aktivitas spesifik hingga 20,4 kali dengan yield sebesar 15% (Kim et al. 2009). Enzim fibrinolitik dari B. cereus NS-2 juga berhasil dimurnikan dengan tahapan pemurnian pengendapan amonium sulfat 90% dan kromatografi hidrofobik menggunakan DEAE-sepharose

61 menghasilkan peningkatan aktivitas spesifik hingga 2,53 kali dengan yield 58,27% (Bajaj et al. 2013). Hasil pemurnian enzim sangat tergantung dari mikroba penghasil enzim dan tahapan pemurnian yang dilakukan. Aktivitas tertinggi enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g tercapai pada pH 7,0. Enzim tidak stabil pada kondisi asam namun relatif stabil pada kondisi basa (pH 7,0 – 9,0). Aktivitas fibrinolitik tidak terdeteksi pada pH 10. Pada pH 7,0, enzim murni stabil pada suhu 40 - 55℃. Hasil ini menjelaskan bahwa enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g tidak tahan dengan perlakuan suhu tinggi. Sehingga produk pangan fungsional yang mengandung enzim ini tidak boleh diberi perlakuan panas lebih dari 55℃. Aktivitas enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g menurun dengan adanya ion K+ (87,39%), Mn2+ (80,64%), dan Zn2+ (89,77%) tetapi meningkat dengan adanya Mg2+ (105,70%) dan Ca2+ (102,85%). Cu2+ menghambat aktivitas fibrinolitik (100% penghambatan). Copper (Cu) adalah salah satu logam berat yang memiliki afinitas tinggi pada senyawa organik serin, glisin, dan sikloserin. Cu dapat membentuk ikatan dengan gugus sulfhidril, yang menyebabkan enzim yang mengandung gugus ini menjadi inaktif. Pengaruh ion logam pada enzsim fibrinolitik sangat tergantung dari organisme penghasil enzim. Sebagai contoh, aktivitas enzim fibrinolitik AprE5-41 dari B. amyloliquefaciens MJ5-41 yang diisolasi dari meju, menurun karena adanya K+ dan Mg2+ namun meningkat dengan adanya Ca2+ (Jo et al. 2011a). Nattokinase dari B. subtilis YJ1 menjadi inaktif dengan adanya Zn2+ dan Cu2+ (Yin et al. 2010). Pada penelitian ini, enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g dihambat oleh 1 mM PMSF. PMSF merupakan senyawa inhibitor protease serin yang spesifik. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g termasuk dalam golongan protease serin. Protease serin merupakan kelompok enzim proteolitik yang mempunyai sisi gugus aktif (OH) dari asam amino serin. PMSF (gugus sulfonil) akan menghambat secara kompetitif irreversible terhadap enzim ini dengan bereaksi pada gugus OH serin pada sisi aktifnya (Hedstrom 2002). Beberapa tipe inhibitor juga diuji pada penelitian ini, termasuk cantharidic acid (inhibitor protein fosfatase), pepstatin A (inhibitor protease asam), bestatin hydrochloride (inhibitor aminopeptidase), dan E64 (inhibitor protease sistein). Semua inhibitor yang diujikan menurunkan aktivitas enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g dengan beragam nilai. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g juga dihambat sempurna oleh 1 mM EDTA. Enzim yang dihambat sempurna oleh EDTA kemungkinan masuk dalam golongan metaloprotease. Namun aktivitas enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g tidak terlalu dipengaruhi oleh penambahan ion logam yang diujikan. Perlu dilakukan pengujian lebih lanjut tentang pengaruh ion logam untuk memastikan apakah enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g merupakan serin protease ataukah serin metaloprotease. Beberapa enzim mikroba fibrinolitik yang telah ditemukan sudah dimurnikan dan dikarakterisasi. Karakteristik biokimia seperti berat molekul, pH dan suhu optimum, stabilitas, dan spesifisitas substrat terangkum dalam Tabel 4. Berdasarkan mekanisme katalitiknya, enzim-enzim tersebut termasuk dalam protease serin (NK, subtilisin DFE, dan CK) dan metaloprotease (enzim jeotgal), kecuali R. chinensis 12 dan Streptomyces sp. Y405 yang termasuk dalam protease serin dan metaloprotease (Liu et al. 2005; Wang et al. 1999). Selain masuk dalam

62 kelompok serin protease, metaloprotease, ataupun serin metaloprotease, ternyata ada enzim fibrinolitik yang diisolasi dari pangan fermentasi yang tidak termasuk dalam semua klasifikasi enzim. Penelitian yang dilakukan oleh Wong & Mine (2004) menyatakan bahwa enzim yang telah dimurnikan dari fermented shrimp paste, pangan tradisional Asia, aktivitasnya tidak dihambat oleh semua logam maupun inhibitor yang diujikan. Enzim fibrinolitik yang termasuk dalam protease serin secara umum aktif pada pH netral dan alkali, dengan pH optimum 8,0 dan 10. Kisaran berat molekulnya adalah 27,7 dan 44 kDa, dan titik isoelektrik sekitar 8,0 (Kim & Choi 2000; Ko et al. 2004), kecuali bpDJ-2 memiliki titik isoelektrik 3,5-3,7 (Choi et al. 2005). Suhu optimal memiliki kisaran yang luas, antara 30 hingga 70oC (Kim et al. 1996; Kim & Choi 2000), namun kebanyakan pada 50oC (Peng et al. 2003; Paik et al. 2004). Hampir semua enzim yang termasuk dalam golongan ini memiliki sisi katalitik yang sama, yaitu Ser221, His64, dan Asp32, dan tidak memiliki ikatan disulfida intramolekuler (Peng et al. 2005). Enzim fibrinolitik yang termasuk dalam metaloprotease membutuhkan ion logam divalen untuk aktivitasnya, seperti Zn2+ untuk jeot-gal (Kim et al. 1997), Ca2+ dan Mg2+ untuk AMMP (Lee et al. 2005), dan Co2+ dan Hg2+ untuk enzim dari Bacillus sp. KDO-13 (Lee et al. 2001), sehingga aktivitasnya dapat dihambat oleh agen pengkelat seperti EDTA. Enzim ini memiliki pH optimum antara 6,0 dan 7,0, kecuali enzim dari R. chinensis 12 yang memiliki pH optimum 10,5 (Xiao-lan et al. 2005). Di antara substrat sintetik yang diuji, N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, substrat untuk subtilisin dan kimotripsin, adalah yang paling efisien. Uji hidrolisis fibrinogen mengungkapkan bahwa enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g berhasil mendegradasi rantai α fibrinogen dalam waktu 10 menit dan rantai β fibrinogen dalam waktu 4 jam tetapi tidak mampu mendegradasi rantai γ fibrinogen, bahkan setelah 12 jam. Pola degradasi ini mirip dengan AprE5-41, protease fibrinolitik utama B. amyloliquefaciens MJ5-41 (Jo et al. 2011a), dan AprE3-17, protease fibrinolitik utama B. licheniformis CH3-17 (Jo et al. 2011b), tetapi berbeda dari enzim fibrinolitik B. subtilis, yang mendegradasi rantai β terlebih dahulu (Kim et al. 2006). Pola degradasi fibrinogen oleh enzim fibrinolitik bisa bervariasi, sehingga pengujian harus dilakukan untuk masingmasing enzim. Strain Bacillus penghasil enzim fibrinolitik dengan karakteristik tertentu dapat digunakan untuk produksi pangan fungsional maupun obat untuk terapi penyakit jantung. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa B. pumilus 2.g sangat potensial digunakan sebagai sumber enzim fibrinolitik baru. Enzim fibrinolitik baru yang berasal dari pangan tradisional terutama pangan fermentasi Indonesia berguna untuk terapi trombolitik seperti enzim fibrinolitik kuat lainnya, nattokinase (NK) dan lumbrokinase (enzim dari cacing tanah). Ini akan memberikan alternatif atau pilihan lain dari penggunaan enzim fibrinolitik mahal yang saat ini digunakan dalam mengelola penyakit jantung, karena enzim mikroba dapat diproduksi dalam jumlah besar, mudah, dan efisien. Saat ini NK telah dikembangkan sebagai obat dan telah dipasarkan dengan merek dagang Nattokinase NSKSD, Jarrow NattoMax JR-154, dan Natto-K. Enzim fibrinolitik mikroba memiliki potensi signifikan untuk fortifikasi pangan dan aplikasi nutraceutical, sehingga penggunaannya bisa efektif

63 mencegah penyakit kardiovaskular. Berbagai temuan menarik tentang enzim fibrinolitik mikroba dari pangan fermentasi menyiratkan bahwa dengan mengonsumsi makanan fermentasi dapat mencegah penyakit kardiovaskular. Namun hambatan utama untuk efek aktivitas fibrinolitik dari berbagai pangan fermentasi adalah bahwa enzim fibrinolitik tidak stabil di bawah kondisi asam lambung dan kondisi pemanasan selama proses pengolahan pangan (Kim et al. 1996). Umumnya pangan fermentasi tidak langsung dikonsumsi dalam keadaan mentah namun diolah terlebih dahulu dalam air mendidih (direbus) maupun digoreng. Ko et al. (2008) telah mencoba untuk mengatasi permasalahan ini dengan mengaplikasikan teknik mikroenkapsulasi pada pangan fermentasi kedelai chungkook-jang (CGJ), Korea. Mikroenkapsulasi telah berhasil digunakan untuk membuktikan kelangsungan hidup mikroorganisme dalam produk susu, melindungi komponen makanan yang sensitif, dan mencegah kehilangan zat gizi selama proses pengolahan pangan (Desai & Park 2005; Lee et al. 2004). Mikropartikel alginat telah banyak digunakan untuk imobilisasi bahan target karena kemudahan penanganan, sifat beracun dan biaya rendah (Albarghouthi et al. 2000; Hari et al. 1996, Park & Chang 2000). Dalam studi yang dilakukan oleh Ko et al. (2008), menunjukkan bahwa mikropartikel alginat yang digunakan dapat melindungi aktivitas fibrinolitik ekstrak CGJ dari kondisi ekstrim, seperti kondisi lambung dan proses pemanasan. Aktivitas fibrinolitik dari ekstrak CGJ terenkapsulasi secara signifikan lebih tinggi dari ekstrak CGJ yang tidak terenkapsulasi. Oleh karena itu, mikroenkapsulasi ekstrak CGJ dengan alginat dapat menjaga aktivitas fibrinolitik selama administrasi oral dan proses pengolahan pangan. Studi Proteomik Enzim Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi Proteomik didefinisikan sebagai analisis protein secara menyeluruh terhadap suatu sel atau organisme tertentu. Studi ini meliputi pemisahan, identifikasi, dan karakterisasi protein. Proteomik adalah studi protein skala besar. Proteomik sendiri berasal dari kata protein dan genomik yang berarti kelompok gen mengungkap protein lengkap. Bidang proteomik telah dilakukan lebih dari satu dekade yang lalu seiiring dengan perkembangan metode sekuensing protein menggunakan spektrometri massa ditambah dengan metode untuk memisahkan campuran protein menggunakan metode berbasis gel dan teknik kromatografi. Parameter kritis yang menentukan keberhasilan atau kegagalan bidang ini adalah kemampuan untuk mendapatkan protein tunggal dalam campuran kompleks. Salah satu cara yang paling efektif untuk memisahkan protein dalam campuran kompleks adalah dengan menggunakan elektroforesis dua dimensi (2D) (Pandey & Mann 2000). Menggunakan metode ini, protein dipisahkan berdasarkan muatan total pada dimensi pertama menggunakan isoelectric focusing (IEF) dan berat molekul pada dimensi kedua (SDS-PAGE). Elektroforesis 2D memiliki kemampuan untuk memisahkan sejumlah besar protein termasuk yang mengalami modifikasi pascatranslasi serta bentuk-bentuk yang unik dari protein hasil dari splicing mRNA atau proteolisis (Anderson & Anderson 1998; Cordwell et al. 2001). Pada

64 gel hasil elektroforesis 2D, protein dapat diwarnai untuk visualisasi, dipotong, dan selanjutnya dicerna dengan tripsin. Peptida yang dihasilkan kemudian dapat diekstrak dari irisan gel dan dilakukan sekuensing menggunakan spektrometri massa diikuti oleh identifikasi protein dengan pencarian database. Secara umum, metode elektoforesis 2D-MS digunakan untuk dua tujuan utama, yaitu pemetaan referensi dan profiling ekspresi protein (Cordwell et al. 2001). Sebuah penelitian genomik terhadap Bacillus subtilis yang melibatkan banyak peneliti, menemukan 11 protease ekstraseluler yang berbeda dan telah diidentifikasi (Kunst et al. 1997). B. subtilis dapat mensekresikan beberapa protease ke dalam media kultur, yaitu protease alkalin (subtilisin, diberi kode apr), protease netral (diberi kode npr), bacillopeptidase F (diberi kode bpr), Epr (protease ekstraseluler, diberi kode epr), Mpr (metaloprotease ekstraseluler, diberi kode mpr), dan Vpr (protease serin ekstraseluler, diberi kode vpr). Di antara beberapa protease tersebut subtilisin dan protease netral yang sangat mempengaruhi aktivitas protease ekstraseluler total (Choi et al. 2004). Penelitian yang dilakukan oleh Park et al. (2002) dapat mendeteksi dua protease serin ekstraselular yang memiliki aktivitas fibrinolitik dari Bacillus subtilis 168, yaitu WprA (52 kDa) dan Vpr (68 kDa). Bacillopeptidase F dari B. licheniformis KJ-31 yang bersifat fibrinolitik diidentifikasi oleh Hwang et al. (2007) dan memiliki BM 37 kDa. Bacillopeptidase F dari B. subtilis natto yang bersifat fibrinolitik juga diidentifikasi oleh Hitosugi et al. (2007) dan memiliki BM 34,1 kDa. AprE3-17 dari B. licheniformis CH3-17 berhasil dimurnikan dan memiliki aktivitas fibrinolitik dengan berat molekul 27 kDa (Jo et al. 2011b), begitu pula dengan AprE5-41 dari B. amyloliquefaciens MJ5-41 (Jo et al. 2011a). Pada penelitian ini dilakukan studi pada protease fibrinolitik ekstraseluler dari Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari oncom merah dan tempe gembus, pangan fermentasi Indonesia. Kombinasi analisis elektroforesis satu dimensi dan dua dimensi yang dilanjutkan dengan analisis spektrometri massa menggunakan MALDI-TOF-MS dan penelusuran menggunakan database protein, menunjukkan bahwa terdapat dua fraksi protein dari B. licheniformis RO3 dan 3 fraksi dari B. pumilus 2.g. yang baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya. Pada penelitian ini hanya ada satu fraksi protein yang teridentifikasi, yaitu flagellin. Namun flagellin bukan merupakan protease ekstraseluler. Sehingga kemungkinan protein lain yang diuji adalah fraksi protein baru yang belum pernah dilaporkan dan memiliki aktivitas protease fibrinolitik. Fraksi protein baru ini bisa merupakan bacillopeptidase F maupun protease ekstraseluler lainnya. Penelitian yang lebih mendalam sangat diperlukan untuk memastikan beberapa fraksi protein baru tersebut. Tahapan paling kritis dalam studi proteomik adalah pemisahan protein karena memisahkan protein tunggal dari protein kompleks sangat sulit dilakukan. Penelitian yang telah dilakukan merupakan langkah awal untuk melakukan kajian proteomik yang lebih lengkap sehingga dapat mengidentifikasi dan mengkarakterisasi protease fibrinolitik ekstraseluler apa saja yang dihasilkan oleh B. licheniformis RO3 maupun B. pumilus 2.g.

65 Daftar Pustaka Agrebi R, Haddar A, Hajji M, Frikha F, Manni L, Jellouli K, Nasria M. 2009. Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization. Canadian Journal of Microbiology 55(9): 1049-1061. Anderson NL, Anderson NG. 1998. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words. Electrophoresis 19:1853–1861. Bajaj BK, Sharma N, Singh S. 2013. Enhanced production of fibrinolytic protease from Bacillus cereus NS-2 using cooton seed cake as nitrogen source. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 2: 204-2009. Chang CT, Fan MH, Kuo FC, Sung HY. 2000. Potent fibrinolytic enzyme from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1. J Agric Food Chem 48(8):3210–3216. Choi NS, Yoo KH, Hahm JH, Yoon KS, Chang KT, Hyun BH, Maeng PJ, Kim SH. 2005. Purification and characterization of a new peptidase, bacillopeptidase DJ-2, having fibrinolytic activity: produced by Bacillus sp. DJ-2 from Doen-Jang. J Microbiol Biotechnol 15(1): 72–79. Choi NS, Ju SK, Lee TY, Yoon KS, Chang KT, Maeng PJ, Kim SH. 2004. Miniscale identification and characterization of subtilisins from Bacillus sp. strains. J Microbiol Biotechnol 15:537–543. Cordwell SJ, Nouwens AS, Walsh BJ. 2001. Comparative proteomics of bacterial pathogens. Proteomics 1:461–472. Depkes RI. 1993. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Fujita M, Nomura K, Hong K, Ito Y, Asada A, Nishimuro S. 1993. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese NATTO, a popular soybean fermented food in Japan. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197: 1340-1347. Hedstrom L. 2002. Serine Protease Mechanism and Specificity. Chemical Reviews. 102:4501−4523. Hwang KJ, Choi KH, Kim MJ, Park CS, Cha J. 2007. Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus licheniformis KJ31, Isolated from Korean traditional Jeotgal. Journal of Microbiology and Biotechnology 9:1469–1476. Jo HD, Lee HA, Jeong SJ, Kim JH. 2011a. Purification and characterization of a major fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 isolated from Meju. Journal of Microbiology and Biotechnology 21(11):1166–1173. Jo HD, Kwon GH, Park JY, Cha J, Song YS, Kim JH. 2011b. Cloning and overexpression of aprE3-17 encoding the major fibrinolytic protease of Bacillus licheniformis CH3-17. Biotechnol. Bioprocess Eng. 16: 352-359. Joo MH, Hur SH, Han YS, Kim JY. 2007. Isolation, Identification, and Characterization of Bacillus strains from the Traditional Korean Soybeanfermented Food, Chungkookjang. J. Appl. Biol. Chem. 50(4):202-210. Kaino S, Furui T, Hatano S, Kaino M, Okita K, Nakamura K. 1998. Twodimensional zymography for analysis of proteolytic enzymes in human pure pancreatic juice. Electrophoresis 19(5):782–787.

66 Kim JS, Sapkota K, Park SE, Choi BS, Kim S, Hiep NT, Kim CS, Choi HS, Kim MK, Chun HS et al. 2006. A fibrinolytic enzyme from the medicinal mushroom Cordyceps militaris. The Journal of Microbiology 44(6):622-631. Kim SH, Choi NS. 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biosci Biotechnol Biochem 64:1722–1725. Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, Kong IS. 1997. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. J Ferment Bioeng 84(4): 307–312. Kim W, Choi K, Kim Y. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. En iron. Microbiol. 62:2482-2488. Ko JH, Yan JP, Zhu L, Qi YP. 2004. Identification of two novel fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis QK02. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 137:65–74. Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, et al. 1997. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390: 249–256. Kwon HY, Kim YS, Kwon GS, Kwon CS, Sohn HY. 2004. Isolation of immunostimulating strain Bacillus pumilus JB-1 from Chungkukjang and fermentational characteristics of JB-1. Korean Journal of Microbiology and Biotechnology 32:291-296. Lee SK, Bae DH, Kwon TJ, Lee SB, Lee HH, Park JH, Heo S, Johnson MG. 2001. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KDO-13 isolated from soybean paste. J Microbiol Biotechnol 11(5): 845– 852. Liu JG, Xing JM, Chang TS, Ma ZY, Liu HZ. 2005. Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods. Process Biochem 40: 2757–2762. Noh KA, Kim DH, Choi NS, Kim SH. 1999. Isolation of fibrinolytic enzyme producing strains from kimchi. Korean Journal of Food Science and Technology 31:219–223. Ogbadu LJ, Okagbue RN. 1988. Fermentation of African locus bean (Parkia biglobosa) seeds: involvement of different species of Bacillus. Food Microbiology 5:195-199. Olajuyigbe FM, Ajele JO. 2008. Some Properties of Extracellular Protease from Bacillus licheniformis Lbbl-11 Isolated from “iru”, A Traditionally Fermented African Locust Bean Condiment. Global Journal of Biotechnology & Biochemistry 3(1):42-46. Ouoba LII, Cantor MD, Diawara B, Traore AS, Jakobsen M. 2003. Degradation of African locust bean oil by Bacillus subtilis and Bacillus pumilus isolated from soumbala, a fermented African locust bean condiment. Journal of Applied Microbiology 95:868–873. Paik HD, Lee SK, Heo S, Kim SY, Lee H, Kwon TJ. 2004. Purification and characterization of the fibrinolytic enzyme produced by Bacillus subtilis KCK-7 from Chungkookjang. J Microbiol Biotechnol 14(4): 829–835. Pandey A, Mann M. 2000. Proteomics to study genes and genomes. Nature 405: 837–846.

67 Park SG, Kho CW, Cho S, Lee DH, Kim SH, Park BC. 2002. A functional proteomic analysis of secreted fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis 168 using a combined method of two-dimensional gel electrophoresis and zymography. Proteomics 2:206-211. Peng Y, Yang X, Zhang Y. 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl Microbiol Biotechnol 69:126–132. Peng Y, Huang Q, Zhang R, Zhang Y. 2003. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus emyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food. Biochem Mol Biol 134:4552. Peng Y, Zhang YZ. 2002. Optimation of fermentation conditions of douchi fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. Chin J Appl Environ Biol 8:285-289. Philips CI, Bogyo M. 2005. Micro review proteomic meets microbiology technical advance in the global mapping of protein expression and function. Cell microb 8:1061-1076. Roitsch CA, Hageman JH. 1983. Bacillopeptidase F: two forms of a glycoprotein serine protease from Bacillus subtilis 168. J. Bacteriol. 155: 145–152. Seo JH, Lee SP. 2004. Production of fibrinolytic enzyme from soybean grifts fermented by Bacillus firmus NA-1. J Med Food 7(4):442-449. Sugimoto S, Fujii T, Morimiya T, Johdo O, Nakamura T. 2007. The fibrinolytic activity of a novel protease derived from tempeh producing fungus, Fusarium sp. BLB. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(9):2184-2189. Sulchan M, Rukmi MGI. 2007. Effect of tempe tempe gembus on cholesterol profile in hyperlipidemic rats. Med J Indones 16(4):205-212. Sulchan M, Endang NW. 2007. Nilai Gizi dan Komposisi Asam Amino Tempe Tempe gembus serta Pengaruhnya terhadap Pertumbuhan Tikus. Maj Kedokt Indon 57(3):80-85. Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. 1990. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol. 84:139-143. Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H. 1987. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experientia 15:1110-1111. Voet D, Voet JG. 1990. Biochemistry. Ed ke-2. New York: Wiley. hlm 1087-1095. Wang J, Wang M, Wang Y. 1999. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Streptomyces spp. Chin J Biotechnol 15(2):83–89. Wong AHK, Mine Y. 2004. Novel Fibrinolytic shrimp paste, a traditional Asian fermented seasoning. J Agric Food Chem 52:980-986. Xiao-lan L, Lian-Xiang D, Fu-Ping L, Xi-Qun Z, Jing X. 2005. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12. Appl Microbiol Biotechnol 67(2): 209–214. Yanagisawa Y, Chatake T, Chiba-Kamoshida K, Naito S, Ohsugi T, Sumi H, Yasuda I, Morimoto Y. 2010. Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto. Acta Crystallogr Sect. F 66: 1670-1673.

68 Yoon SJ, Yu MA, Sim GS, Kwon ST, Hwang JK, Shin JK, Yeo IH, Pyun YR. 2002. Screening and characterization of microorganisms with fibrinolytic activity from fermented foods. J Microbiol Biotechnol 12(4): 649–656.

69

8

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan

Penelitian ini berhasil mengisolasi mikroba penghasil protease fibrinolitik dari pangan fermentasi Indonesia. Bacillus licheniformis RO3 (AB968524) dari oncom merah dan Bacillus pumilus 2.g (AB968524) dari tempe gembus. B. licheniformis RO3 dapat ditumbuhkan pada media yang mengandung tepung oncom merah dan menghasilkan aktivitas protease fibrinolitik yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan media komersil. Protease fibrinolitik yang dihasilkan dari B. licheniformis RO3 dengan media produksi ½ LB dan tepung oncom merah 1% (b/v) memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 60oC. Bacillus pumilus 2.g menghasilkan beberapa protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik kuat. Enzim fibrinolitik dengan berat molekul 20 kDa telah dimurnikan dari supernatan kultur B. pumilus 2.g dengan tahapan pengendapan amonium sulfat, kromatografi pertukaran ion, dan kromatografi hidrofobik. Enzim fibrinolitik murni stabil antara pH 5 hingga pH 9 dan suhu kurang dari 60℃. Aktivitas fibrinolitik meningkat dengan adanya 5 mM MgCl2 dan 5 mM CaCl2 tetapi dihambat oleh 1 mM PMSF, 1 mM SDS, dan 1 mM EDTA. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g mampu menghidrolisis substrat sintetik N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-PhepNA, substrat untuk subtilisin dan kimotripsin, secara efisien. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g termasuk dalam golongan protease serin kelompok subtilisin. Enzim Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g dapat mendegradasi rantai α dan β dari fibrinogen dengan cepat tetapi tidak dapat mendegradasi rantai γ. Bacillus licheniformis RO3 dan B. pumilus 2.g dapat menghasilkan beberapa protease ekstraseluler. Kombinasi analisis elektroforesis satu dimensi dan dua dimensi yang dilanjutkan dengan analisis spektrometri massa menggunakan MALDI-TOF-MS, menunjukkan bahwa terdapat dua fraksi protein dari B. licheniformis RO3 dan 3 fraksi dari B. pumilus 2.g. yang baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya. Saran Studi isolasi yang dilakukan pada oncom merah dan tempe gembus hanya mampu mendapatkan bakteri penghasil protease fibrinolitik. Perlu dilakukan isolasi dan skrining menggunakan media khusus untuk kapang dan khamir sehingga didapatkan pula mikroorganisme lain penghasil protease fibrinolitik. Tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media produksi protease fibrinogenolitik namun perlu dilakukan kajian lebih mendalam tentang seberapa banyak tepung oncom merah yang harus ditambahkan dalam media produksi dan komponen dari tepung oncom merah yang paling berperan dalam meningkatkan aktivitas enzim. Tahapan pemurnian enzim yang efektif dan efisien perlu dikaji lebih lanjut untuk meningkatkan kemurnian enzim, misalnya dilakukan tahapan pemurnian dengan filtrasi gel. Dilihat dari karakter enzim fibrinolitik yang dihasilkan maka perlu dilakukan kajian mengenai aplikasinya sebagai ingredien pangan fungsional maupun obat trombolitik, terutama karena enzim fibrinolitik yang dihasilkan

70

hanya stabil antara pH 5 hingga pH 9 dan suhu kurang dari 60℃. Penelitian yang disarankan adalah kajian mikroenkapsulasi. Perlu dilakukan kajian lebih lanjut dalam hal pemisahan fraksi protein yang terdapat dalam protease fibrinoltik baik yang berasal dari B. licheniformis RO3 maupun B. pumilus 2.g. Pemisahan fraksi protein yang baik dapat menghasilkan identifikasi dan karakterisasi enzim yang baik pula. Sebelum dilakukan pemisahan menggunakan elektroforesis 2D, enzim harus benar-benar murni sehingga fraksi protein yang terdeteksi hanyalah fraksi protein yang benar-benar memiliki aktivitas sebagai protease fibrinolitik.

LAMPIRAN

Hasil identifikasi dengan API 50 CHB terhadap isolat 2.g

>gi|648296169|dbj|AB968523.1| Bacillus pumilus gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: 2.g TGGGCGGCCAGAAGGGAACCTTCTTCCCCGGATTTTAACGGCGGGACCGGTGAGGTAACACCGTGGGTAA CCTGCCCTGTAAGACTGGGATAATTCCGGGAAACCGGGAGTTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATG GTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGAAGGACCCGGGGGCGCATTAGCTAGTTGGTGA GGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAAC GCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAAC TGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT AGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATT CCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTA ACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG ATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG GAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCC CTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGAC AAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACA ATGGACAAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCCAGTCGGAA CGCAGTCTTGAACCTCAACTGCGTGAAACTTGGAATCCCTAGAAATCCCGGGATCAACTTGCCCCGGGTG AATACTTTCCCGGGGGGCTTTTTGTACCACCCGCACAAAGGG

Hasil identifikasi dengan API 50 CHB terhadap isolat RO3

>gi|648296170|dbj|AB968524.1| Bacillus licheniformis gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: RO3 GGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGA ATCGCTAGTAATCGCGATCAGCATGCCGCCCGGCAGCTGCTCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAA CACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTG AACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGGGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAACT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGGCGACCAATGCCTAACCCACCTGAAAGGGGTGATCGGCCACCC TGGGACTGAAACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAACAATAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTC TGACGGAACAACCCCCCGTGAGTGATGAAAGTTTTCGGATCCTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAG TACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACCTGCCAACAGC CGCGGTAATACCTAAGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTA AGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAAGGTCATTTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAAAAG AAGAAAGTGGAATTCCACGTGTAACGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAAGAACACCAGTGGCCAAAGCCA CTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAAGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAAGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCCTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAAGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAA GCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTTCAAAAGGAATTGACCGGGGCCCGCACAAGC GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAATCCTCTGACAACC CTAAAAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAAGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGGCGCAACCCTTGATCTTAAATTGCCAGCATTCAGTTGGGCAC TCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACA AATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAT CAGCATGCCGC

Kurva Standar BSA 0,45

Absorbansi (595nm)

0,4 0,35 0,3 0,25 y = 0,057x - 0,018 R² = 0,998

0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Konsentrasi Protein (mg/ml)

Kurva Standar Plasmin Luas Zona Bening (cm2)

0,35 0,3 0,25 y = 0,062ln(x) + 0,101 R² = 0,994

0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

10

20

30

Aktivitas (mU)

40

50

Pengendapan Amonium Sulfat Aktivitas relatif (%)

100 80 60 40 20 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% Amonium sulfat Supernatant

Pelet

Kurva Standar Marker Protein 6

log BM

5 4 3

y = -1,311x + 5,460 R² = 0,960

2 1 0 0

0,2

0,4

0,6 Rf (cm)

0,8

1

Kurva Standar pI 7

pH Aktual

6 5 4

y = 0,339x + 4,461 R² = 0,990

3 2 1 0 0

1

2

3

4

Titik Potong

5

6

7

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 31 Juli 1980 sebagai anak kedua dari tiga bersaudara dari pasangan H. Sulaiman Kurdi, SH (alm) dan Hj. Dra. Siti Markamah. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, lulus pada tahun 2003. Pada tahun 2003 hingga 2004 penulis bekerja sebagai dosen luar biasa pada Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Pertanian, Universtas Gorontalo. Pada tahun 2005 penulis diterima pada Magister Gizi Masyarakat, UNDIP dan lulus pada tahun 2007. Setelah menyelesaikan pendidikan S2, pada tahun 2008 penulis diterima sebagai dosen pada Program Studi Ilmu Gizi, Fakultas Kedokteran, UNDIP. Program pendidikan Doktor pada Mayor Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana, IPB ditempuh mulai tahun 2010 dengan Beasiswa dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan. Pada tahun 2013 penulis memperoleh kesempatan untuk mengikuti Sandwich-like program ke Gyeongsang National University dengan dana dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan. Selama mengikuti pendidikan Doktor, penulis beberapa kali menyampaikan hasil penelitiannya pada seminar internasional, diantaranya adalah pada International Conference Future of Food Factors di Jakarta pada 3-4 Oktober 2012, 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013 dan International Symposium on Food and Agro-Biodiversity di Semarang pada 16 – 17 Sepetember 2014. Satu artikel juga telah dipublikasikan pada Preventive Nutrition and Food Science Journal (PNF) Vol 19(3): 213-219 dengan judul “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus pumilus 2.g isolated from Tempeh Gembus, an Indonesian fermented food”. Artikel lain dengan judul “Proteolytic and fibrinolytic activities of several microorganisms screened from Red Oncom and Tempeh Gembus, Indonesian fermented soybean cakes”, telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of Microbiology, sedangkan artikel “The use of Red Oncom powder as potential production media for fibrinogenolytic protease derived from Bacillus licheniformis RO3” sedang dalam proses telaah untuk diterbitkan pada Proceedia Food Science Elsevier.