PROFIL PROTEIN TERLARUT PADA BERBAGAI PELARUT DARI 7 MACAM KACANG-KACANGAN
IHSAN NUR RAMDHAN
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
PROFIL PROTEIN TERLARUT PADA BERBAGAI PELARUT DARI 7 MACAM KACANG-KACANGAN
IHSAN NUR RAMDHAN
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK IHSAN NUR RAMDHAN. Profil Protein Terlarut Pada Berbagai Pelarut dari 7 Macam Kacang-Kacangan. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan NUR RICHANA Kacang panjang, kedelai, komak, buncis, gude, tunggak, dan kacang hijau merupakan 7 macam kacang-kacangan yang sering dijadikan olahan makanan di Indonesia. Penelitian ini bertujuan melihat profil protein terlarut dari 7 macam kacang-kacangan tersebut. Penentuan kandungan gizi secara umum dilakukan dengan analisis proksimat. Penentuan protein terlarut dilakukan dengan metode Bradford. Elektroforesis gel poliakrilamid SDS digunakan untuk mengetahui pola serta bobot molekul protein dari 7 macam sampel. Penentuan kandungan asam amino dilakukan dengan menggunakan HPLC. Kadar protein secara umum berdasarkan hasil uji metode Kjeldahl didapatkan kadar protein pada kacang gude sebesar 35,23%, kacang kedelai sebesar 28,13%, kacang panjang sebesar 24,84%, kacang buncis sebesar 23,74%, kacang tunggak sebesar 19,66%, kacang komak sebesar 19,57%, dan kacang hijau sebesar 19,19%. Hasil SDS PAGE menunjukkan pada kacang panjang terdapat 9 pita protein dengan BM 16,84 – 109,61 KDa, kacang kedelai terdapat 5 pita protein dengan BM 12,04 – 64,44 KDa, kacang komak terdapat 10 pita protein dengan BM 17,32 –112,72 KDa, kacang buncis terdapat 14 pita protein dengan BM 13,09 –153,31 KDa, kacang gude terdapat 7 pita protein dengan BM 12,38 –62,66 KDa, kacang tunggak terdapat 14 pita protein dengan BM 13,84 –149,08 KDa, dan kacang hijau terdapat 16 pita protein dengan BM 13,09 –157,66 KDa. Kata kunci : profil protein, kacang-kacangan, asam amino
ABSTRACT IHSAN NUR RAMDHAN. Soluble Protein Profiles In Various Solvents from 7 Types of Nuts. Under the direction of MARIA BINTANG and NUR RICHANA Long bean, soybeans, komak peanuts, green snap beans, nuts gude, cowpea, and green beans are 7 kinds of nuts are often used as processed food in Indonesia. This study examined the soluble protein profiles of 7 kinds of nuts. Determination of nutrient content was generally done by including proximate analysis. Determination of soluble protein performed by the method of Bradford. SDS polyacrylamide gel electrophoresis was used to determine the pattern and the molecular weight of 7 different protein samples. Determination of amino acid content was done using HPLC. The protein content is generally based on Kjeldahl method of bean protein content nuts gude at 35, 23%, soybeans at 28.13%, long bean at 24.84%, green snap beans at 23.74%, cowpea at 19.66%, komak peanuts at 19.57%, and green beans at 19.19%. SDS PAGE results showed there were 9 long bean protein bands with MW 16.84 - 109.61 kDa, there are 5 bands soybeans protein with MW from 12.04 - 64.44 kDa, nuts komak there were 10 protein bands with BM 17.32 -112.72 kDa, green snap beans there are 14 protein bands with MW 13.09 - 153.31 kDa, there are 7 nuts gude protein bands with BM 12.38 - 62.66 kDa, cowpea with 14 protein bands with MW 13,84 - 149.08 kDa, and green beans are 16 protein bands with MW 13.09 - 157.66 kDa. Keywords : protein profile, nuts, amino acid
PROFIL PROTEIN TERLARUT PADA BERBAGAI PELARUT DARI 7 MACAM KACANG-KACANGAN
IHSAN NUR RAMDHAN
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi: Nama NIM
: :
Profil Protein Terlarut Pada Berbagai Pelarut Dari 7 Macam Kacang-Kacangan Ihsan Nur Ramdhan G84062116
Disetujui Komisi Pembimbing,
Dr. Ir. Nur Richana, M.Si. Anggota
Prof. Dr. drh. Maria Bintang MS. Ketua
Diketahui,
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, Rabb semesta alam yang telah memberikan begitu banyak nikmat dan kemudahan sehingga kegiatan penelitian ini dapat diselesaikan. Shalawat serta salam semoga selalu tercurah limpah kepada Rasulullah SAW, keluarga dan sahabat beliau, serta pengikutnya hingga akhir jaman. Kegiatan penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai Juni 2012 bertempat di Laboratorium Penelitian Balai Besar Pascapanen Pertanian Cimanggu, Laboratorium Terpadu IPB Baranang Siang, dan Laboratorium Departemen Biokimia IPB Dramaga dengan judul Penentuan Protein Terlarut dari Berbagai Macam Pelarut Pada 7 Macam Kacang-Kacangan. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang M.S. sebagai Pembimbing I dan Dr. Ir. Nur Richana M.Si sebagai pembimbing II yang telah banyak memberikan saran dan masukan dalam penelitian ini. Secara khusus juga penulis ucapkan terima kasih dan sembah sujud bakti kepada kedua orang tua penulis, Alm. Bapak Yudhi Sofyan dan Ibu Neneng Nur’aeni atas pengorbanan penuh inspirasi bagi penulis. Kepada keluarga terdekat khususnya adik-adik tercinta Irham, Intan, Indah, dan adik sepupu Feby dan Faqih. Selain itu, ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh staff dan laboran Laboratorium Biokimia dan Balai Besar Pascapanen Pertanian. Terima kasih juga kepada teman seperjuangan Eko Hadi Wibowo yang senantiasa memberikan motivasi kepada penulis, Husein, Fahry, Edwin, Gayang, dan seluruh teman-teman Biokimia angkatan 43, 44, dan 45 yang telah memberikan dukungan kepada penulis. Penulis sadar bahwa penelitian ini masih jauh dari kesempurnaan karena keterbatasan pengetahuan serta wawasan penulis. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi banyak orang dan untuk kemajuan ilmu pengetahuan. Wassalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh Bogor, 02 Oktober 2012
Ihsan Nur Ramdhan
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 20 April 1989 dari Ayah Alm. Yudhi Sofyan dan ibu Dra. Neneng Nur’ Aeni. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMU N 1 Leuwiliang Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pada tahun kedua penulis memilih Mayor Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Badan Operasional DPMKM IPB 2006/2007, himpunan profesi mahasiswa Biokimia (CREBs) di Divisi Bioanalisis pada tahun 2007/2008. Penulis juga aktif sebagai pengajar matematika di Bimbingan Belajar Nurul Fikri Bogor pada tahun 2010/2011. Penulis melakukan praktek kerja lapang di laboratorium penelitian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Cimanggu Bogor dari bulan Juli sampai September 2010.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL …………………………………………………………......
i
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………………..
i
DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………………..
ii
PENDAHULUAN……………………………………………………………... 1 TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................
1
Kacang Panjang …………………………………………………………. Kacang Kedelai …………………………………………………………. Kacang Komak ………………………………………………………….. Kacang Buncis …………………………………………………………… Kacang Gude …………………………………………………………….. Kacang Tunggak ………………………………………………………… Kacang Hijau ……………………………………………………………. Protein …………………………………………………………………… Elektroforesis ……………………………………………………………. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) …………………...…
1 1 2 2 2 3 3 3 4 4
BAHAN DAN METODE ……………………………………………………. 5 Bahan dan Alat ………………………………………………………….. 5 Metode …………………………………………………………………...... 5 HASIL DAN PEMBAHASAN.......…………………………………………… Komposisi Kimia .......................................................................................... Fraksi Protein Terlarut.................................................................................... Analisis Asam Amino.……………………………………………………... Bobot Molekul Protein ..................................................................................
7 7 7 8 9
SIMPULAN DAN SARAN................................................................................. 10 Simpulan ........................................................................................................ 10 Saran .............................................................................................................. 10 DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………… 10 LAMPIRAN …………………………………………………………………... 12
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil analisis fraksi protein terlarut pada 7 macam kacang-kacangan......... 8 2 Hasil analisis asam amino pada 7 macam kacang-kacangan........................ 9 3 Hasil Analisis SDS-PAGE........................................................................... 10 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Kacang Panjang............................................................................................ 1 2 Kacang Kedelai............................................................................................ 2 3 Kacang Komak...............................................................................….......... 2 4 Kacang Buncis................................................................................…......... 2 5 Kacang Gude...................................................................................…......... 3 6 Kacang Tunggak..............................................................................…........ 3 7 Kacang Hijau................................................................................................ 3 8 Diagram hasil analisis komposisi kimia....................................................... 7 9 Hasil analisis SDS-PAGE............................................................................. 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Diagram Alir Penelitian Secara Umum.................................................... 12
2
Kadar air...................................................................................................
13
3
Kadar Abu................................................................................................
13
4
Kadar protein............................................................................................
14
5
Kadar lemak.............................................................................................
14
6
Kadar serat................................................................................................ 15
7
Prosedur pembuatan reagen bradford....................................................... 15
8
Prosedur pembuatan larutan standar protein............................................
15
9
Kurva standar protein...............................................................................
16
10
Penentuan fraksi protein terlarut..............................................................
16
11
Kromatogram standar asam amino........................................................... 18
12
Kromatogram sampel kacang panjang.....................................................
19
13
Kromatogram sampel kacang kedelai......................................................
20
14
Kromatogram sampel kacang komak.......................................................
21
15
Kromatogram sampel kacang buncis.......................................................
22
16
Kromatogram sampel kacang gude..........................................................
23
17
Kromatogram sampel kacang tunggak.....................................................
24
18
Kromatogram sampel kacang hijau..........................................................
25
19
Hasil analisis asam amino menggunakan HPLC...................................... 26
20
Hasil analisis bobot molekul protein SDS-PAGE..............................................
27
21
Kurva standar marker SDS-PAGE.....................................................................
27
22
Bobot molekul protein secara keseluruhan.........................................................
28
PENDAHULUAN Indonesia dikenal sebagai negara dengan biodiversitas yang tinggi dan memiliki keanekaragaman hayati flora dan fauna yang sangat melimpah. Keanekaragaman hayati meliputi berbagai perbedaaan atau variasi bentuk, penampilan, jumlah, dan sifat-sifat yang terlihat pada berbagai tingkatan, baik tingkatan gen, tingkatan spesies, maupun tingkatan ekosistem. Keanekaragaman jenis adalah perbedaan antar spesies, dalam hal ini ialah keluarga kacang kacangan. Keanekaragaman jenis kacang-kacangan diantaranya ialah kacang panjang, kedelai, komak, buncis, gude, tunggak, dan kacang hijau. Kacang-kacangan telah lama dikenal sebagai sumber protein. Di masyarakat kacang-kacangan dikenal memiliki keistimewaan sebagai produk bergizi dengan harga murah, memiliki kandungan karbohidrat dan protein tinggi, mengandung berbagai macam mineral, dan kandungan lemak yang baik untuk kesehatan (Depkes 1979). Terdapat 7 macam jenis kacang yang sering dijadikan bahan olahan makanan di masyarakat Indonesia. Kacang-kacangan tersebut ialah kacang panjang, kacang kedelai, kacang komak, kacang buncis, kacang gude, kacang tunggak, dan kacang hijau. Kacang panjang sering digunakan sebagai sayuran pelengkap makanan. Kacang kedelai banyak diolah menjadi bumbu makanan dan menjadi makanan tahu dan tempe. Kacang komak biasa digunakan sebagai sayuran. Kacang buncis populer diolah menjadi sayur buncis. Kacang gude biasanya dimanfaatkan dengan cara dimakan secara langsung dan menjadi sumber pangan alternatif. Kacang tunggak sering dimanfaatkan sebagai sayuran. Kacang hijau populer dikonsumsi sebagai bubur kacang hijau. Dengan banyaknya manfaat dan olahan dari 7 macam kacang tersebut, maka menjadi hal yang penting untuk mengetahui kadar protein serta kandungan asam amino dan karakteristiknya. Penelitian ini bertujuan untuk melihat profil protein dari 7 jenis kacang yakni kacang panjang, kedelai, komak, buncis, gude, tunggak, dan kacang hijau. Profil protein yang dianalisis meliputi penentuan kandungan protein, sifat fraksi protein, analisis asam amino, dan penentuan bobot molekul protein. Penelitian ini diharapkan bermanfaat sebagai sumber informasi ilmiah tentang kandungan protein dan asam amino dari
kacang panjang, kedelai, komak, buncis, gude, tunggak, dan kacang hijau. Hipotesis penelitian ini bahwa kacang panjang, kedelai, komak, buncis, gude, tunggak, dan hijau memiliki kandungan protein yang tinggi, dan memiliki profil yang berbeda satu dengan yang lain. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari hingga bulan Agustus 2012 di Laboratorium Penelitian Balai Besar Pasca Panen Cimanggu Bogor, Laboratorium Terpadu IPB Baranang Siang, dan Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor. TINJAUAN PUSTAKA Kacang Panjang Kacang panjang (Vigna unguiculata) termasuk dalam kelas Magnolipsida, ordo Fabales, famili Fabaceae, dan genus Vigna. Kacang panjang (Gambar 1) merupakan tumbuhan yang dijadikan sayur atau ulam. Ia tumbuh dengan cara memanjat atau melilit. Kacang panjang merupakan sumber protein yang baik. Kandungan zat pada tanaman ini diantaranya vitamin A, thiamin, riboflavin, besi, fosfor, kalium, vitamin C, asam folat, magnesium, dan mangan.Tanaman ini juga dapat digunakan sebagai bahan obat-obatan untuk mengobati beberapa penyakit seperti kanker payudara, leukemia, antibakteri, antivirus, antioksidan, gangguan saluran kencing, peluruh kencing, batu ginjal, mencegah kelainan antibodi, meningkatkan fungsi limpa, meningkatkan penyatuan DNA dan RNA, dan meningkatkan fungsi sel darah merah (Fitriasari et al. 2007)
Gambar 1 Kacang Panjang Kacang Kedelai Kacang kedelai (Glycine soja) termasuk dalam kelas Magnoliopsida, ordo Fabales, famili Fabaceae, dan genus Glycine. Kacang ini menjadi salah satu tanaman polongpolongan yang menjadi bahan dasar banyak makanan dari Asia Timur seperti tahu dan
tempe. Berdasarkan peninggalan arkeologi, tanaman ini telah dibudidayakan sejak 3500 tahun yang lalu di Asia Timur. Kedelai putih diperkenalkan ke Nusantara oleh pendatang dari Cina sejak maraknya perdagangan dengan Tiongkok, sementara kedelai hitam sudah dikenal lama oleh penduduk setempat. Kedelai merupakan sumber utama protein nabati dan minyak nabati dunia (Setiawati 2006). Di Indonesia, kedelai (Gambar 2) menjadi sumber gizi protein nabati utama, meskipun Indonesia harus mengimpor sebagian besar kebutuhan kedelai. Ini terjadi karena kebutuhan Indonesia yang tinggi akan kedelai putih. Kedelai putih bukan asli tanaman tropis sehingga hasilnya selalu lebih rendah daripada di Jepang dan Cina. Pemuliaan serta domestikasi belum berhasil sepenuhnya mengubah sifat fotosensitif kedelai putih. Di sisi lain, kedelai hitam yang tidak fotosensitif kurang mendapat perhatian dalam pemuliaan meskipun dari segi adaptasi lebih cocok bagi Indonesia (Setiawati 2006).
Gambar 3 Kacang Komak Kacang Buncis Kacang buncis (Phaseolus vulgaris) diklasifikasikan ke dalam kelas Magnoliopsida, ordo Fabales, famili Fabaceae, dan genus Phaseolus. Kacang buncis (Gambar 4) merupakan sejenis polongpolongan yang dapat dimakan. Buah, biji, dan daunnya dimanfaatkan orang sebagai sayuran. Sayuran ini kaya dengan kandungan protein. Tanaman ini berasal dari Amerika Tengah dan Amerika Selatan. Buncis adalah sayur yang kaya dengan protein dan vitamin dan berfungsi membantu menurunkan tekanan darah serta berperan dalam metabolisme gula dalam darah dan amat sesuai dimakan oleh mereka yang mengidap penyakit diabetes atau hipertensi. Kandungan serat dan enzim yang tinggi dapat membantu penurunan berat badan.Kacang buncis tumbuh melilit, mempunyai akar tunggang dan sisi yang panjang dan memerlukan tiang untuk memanjat (Rukmana 1998).
Gambar 2 Kacang kedelai Kacang Komak Kacang komak (Lablab purpureus) termasuk dalam kelas Magnoliopsida, ordo Fabales, famili Fabaceae, dan genus Lablab. Kacang Komak (Gambar 3) merupakan salah satu sumber protein yang cukup tinggi setelah kedelai dan kacang tanah. Di Asia Tenggara, kacang komak populer sebagai sayuran polong muda atau digunakan dalam sayur kari. Kandungan lemak rendah sangat cocok untuk orang-orang yang diet terhadap makanan dengan kandungan lemak tinggi. Biji kacang ini juga mengandung vitamin A, B, dan C yang cukup tinggi. Biji tanaman ini mengandung tanin, dan tripsin. Kandungannya sangat beragam tergantung varietasnya, namun dengan perendaman atau pemanasan akan menghilangkan aktivitas dari senyawa ini (Subagio et al. 2006).
Gambar 4 Kacang Buncis Kacang Gude Kacang gude (Cajanus cajan) termasuk dalam kelas Magnoliopsida, ordo Fabales, famili Fabaceae, dan genus Cajanus. Kacang gude (Gambar 5) adalah sejenis tanaman kacang-kacangan yang bersifat tahunan (perenial). Bijinya dapat dimakan sebagai sayuran dan menjadi sumber pangan alternatif. Tanaman ini relatif tahan panas dan kering sehingga cocok sebagai tanaman penghijauan kawasan kering. Di Filipina ia dikenal sebagai "kadios".
Budidaya gude telah dilakukan sejak 3000 tahun lalu. Pusat keanekaragamannya sangat mungkin di Asia, lalu tersebar ke Afrika Timur dan melalui perdagangan budak terbawa ke benua Amerika. Pada masa kini, gude telah tersebar di seluruh bagian dunia yang beriklim tropis dan subtropis. Budidaya dapat dilakukan sebagai tanaman semusim maupun tahunan, meskipun sejak tahun ketiga biasanya produksi biji menurun. Penanamannya dapat bersifat tunggal (monokultur) maupun sebagai komponen tanam campur dengan serealia atau legum lainnya. Sebagai legum, kacang gude juga mampu mengikat nitrogen dari udara dengan membentuk bintil-bintil akar. Kacang gude dikenal sangat tahan kekeringan dan masih mampu menghasilkan pada wilayah dengan curah hujan tahunan kurang dari 650 mm.Produksi kacang gude dunia sekitar 46.000 km2 dan 82% dihasilkan di India (Indrasari et al 1992).
Gambar 5 Kacang gude Kacang Tunggak Kacang Tunggak (Vigna unguiculata, L) termasuk dalam kelas Magnoliopsida, ordo Fabales, famili Fabaceae, dan genus Vigna. Biji kacang tunggak (Gambar 6) memiliki kandungan protein, lemak, dan serat yang baik untuk kesehatan. Tanaman ini diperkirakan berasal dari Afrika Barat. Di samping toleran terhadap kekeringan kacang tunggak juga mampu mengikat nitrogen dari udara. Daun dan polongnya yang masih muda cukup nikmat bila dikonsumsi sebagai sayuran (Winda et al 2007).
Gambar 6 Kacang Tunggak
Kacang Hijau Kacang hijau (Vigna radiata) termasuk dalam kelas Magnoliopsida, ordo Fabales, famili Faboideae, dan genus Vigna. Kacang hijau (Gambar 7) adalah sejenis tanaman budidaya dan palawija yang dikenal luas di daerah tropika. Tumbuhan ini memiliki banyak manfaat dalam kehidupan sehari-hari sebagai sumber bahan pangan berprotein nabati tinggi. Kacang hijau di Indonesia menempati urutan ketiga terpenting sebagai tanaman pangan legum, setelah kedelai dan kacang tanah (Adianto 2004). Kacang hijau memiliki kandungan protein yang cukup tinggi dan merupakan sumber mineral penting, antara lain kalsium dan fosfor. Sedangkan kandungan lemaknya merupakan asam lemak tak jenuh. Kandungan kalsium dan fosfor pada kacang hijau bermanfaat untuk memperkuat tulang (Richana 2000). Kacang hijau juga mengandung rendah lemak yang sangat baik bagi mereka yang ingin menghindari konsumsi lemak tinggi. Kadar lemak yang rendah dalam kacang hijau menyebabkan bahan makanan atau minuman yang terbuat dari kacang hijau tidak mudah berbau.Lemak kacang hijau tersusun atas 73% asam lemak tak jenuh dan 27% asam lemak jenuh. Umumnya kacang-kacangan memang mengandung lemak tak jenuh tinggi. Asupan lemak tak jenuh tinggi penting untuk menjaga kesehatan jantung (Richana 2000).
Gambar 7 Kacang Hijau Protein Protein adalah salah satu biomakromolekul yang penting peranannya dalam makhluk hidup. Fungsi protein itu sendiri secara garis besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekular (Lehninger 1982). Semua jenis protein terdiri atas rangkaian dan kombinasi dari 20 jenis asam amino. Setiap jenis protein mempunyai jumlah dan urutan asam amino yang khas. Di dalam sel, protein terdapat baik pada membran plasma
maupun membran internal yang menyusun organel sel seperti mitokondria, retikulum endoplasma, nukleus dan badan golgi dengan fungsi yang berbeda-beda bergantung pada tempatnya (Koolman 1994). Protein diperkenalkan sebagai molekul makro pemberi keterangan, karena urutan asam amino dari protein tertentu mencerminkan keterangan genetik yang terkandung dalam urutan basa dari bagian yang bersangkutan dalam DNA yang mengarahkan biosintesis protein. Tiap jenis protein memiliki ciri khas diantaranya susunan kimia yang khas, bobot molekular yang khas, dan urutan asam amino yang khas (Poedjiadi 1994). Elektroforesis adalah Prinsip dari elektroforesis pergerakan suatu molekul bermuatan di dalam medan listrik. Pada elektroforesis gel poliakrilamid, pergerakan protein merupakan respon terhadap medan listrik, terjadi melalui pori di dalam matriks gel yang ukuran porinya dipengaruhi oleh konsentrasi akrilamid. Sesuai dengan prinsip tersebut, elektroforesis dapat digunakan untuk memisahkan campuran kompleks protein, memeriksa komposisi subunit, mengetahui keragaman pada sampel protein, serta untuk memurnikan protein yang akan dianalisis. Laju pergerakan protein ditentukan oleh kombinasi antara ukuran pori gel dan muatan, ukuran, serta bentuk protein (Bintang 2010). Pada elektroforesis gel terbentuk melalui pencampuran larutan akrilamid dengan amonium persulfat dan TEMED (N, N, N’, N’-tetrametil etilendiamin), sehingga mengakibatkan monomer akrilamid mengalami polimerisasi. Penambahan senyawa N, N’-metilen bisakrilamid dalam proses polimerisasi membentuk penyilangan antar rantai panjang sehingga akan membentuk gel dengan tingkat porositas yang ditentukan oleh rantai panjang dan derajat penyilangan antar rantai. Sodium Dedosil Sulfat (SDS) merupakan deterjen anionik yang dapat bereaksi dengan bagian hidrofobik protein sehingga membentuk kompleks bermuatan negatif, akibatnya pada daerah yang bermuatan listrik protein akan bergerak ke muatan positif. Tahapan kerja elektroforesis gel poliakrilamid SDS secara singkat adalah preparasi sampel menggunakan zat warna, persiapan gel tumpuk dan pisah, memasukkan sampel ke dalam sumur gel, running SDS PAGE, visualisasi menggunakan coomasie blue, dan pencucian (Estheria 2008).
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) High Performance Liquid Chromatoghraphy (HPLC) merupakan suatu analisis kromatografi dengan teknik menggunakan tekanan tinggi yang berguna untuk pemisahan ion atau molekul terlarut dalam suatu larutan. Teknik ini berkembang untuk mengatasi kelemahan-kelemahan pemisahan pada kromatografi gas seperti senyawa yang relatif tidak tahan panas dan senyawa yang tidak volatil. HPLC berdasarkan kepolaran kolomnya dibagi menjadi dua fase yaitu normal (normal phase) dan terbalik (reverse phase). Kromatografi fase normal menggunakan fase diam yang lebih polar daripada fase gerak. Kromatografi fase terbalik menggunakan fase gerak yang lebih polar daripada fase diam. Proses pemisahan campuran komponen terjadi di dalam kolom yaitu berdasarkan perbedaan distribusi masing-masing komponen pada fase diam dan fase gerak. Zat-zat yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan tertahan lebih lama dalam kolom sedangkan yang berinteraksi lemah akan keluar dengan cepat dari kolom (Khopkar 1990). Instrumen HPLC terdiri atas sistem eluen yaitu fase gerak, sistem tekanan yaitu pompa, injeksi contoh, kolom, dan sistem deteksi yang berupa detektor. Sistem eluen pada HPLC dapat menggunakan berbagai macam pelarut, biasanya air dan pelarut organik. Eluen yang digunakan dapat berupa pelarut tunggal atau campuran dari dua atau lebih pelarut. Keadaan ini menyebabkan ada dua jenis sistem elusi yaitu isokratik dan gradien. Sistem isokratik eluen tidak mengalami perubahan konsentrasi tetapi pada sistem gradien eluen mengalami perubahan konsentrasi. Sistem tekanan pada HPLC menggunakan pompa bertekanan tinggi. Pompa harus tahan terhadap semua jenis pelarut, dapat mencapai tekanan sampai 6000 psi, dan dapat mengantarkan aliran terukur 0.01-1.0 atau 0.1-20 ml/menit (Khopkar 1990). Injeksi contoh pada HPLC menggunakan syringe dengan volume 5-50 µl. Kolom pada HPLC ada dua jenis yaitu kolom pelindung dan kolom pemisahan. Kolom pelindung digunakan untuk menahan zat-zat pengotor yang dapat menyumbat kolom pemisahan sehingga memperpanjang masa pakainya. Kolom pelindung atau pra kolom sering dipasanag antara katup pemasukkan dan kolom utama tetapi butirannya lebih keras dan lebih besar (20-40 µm) (Gritter 1991). Kolom
ini memiliki panjang 10-30 cm dengan diameter 3-10 mm dan diisi dengan fase diam yang sama dengan kolom analis. Sistem deteksi pada HPLC menggunakan beberapa macam detektor. Salah satunya detektor UV yang dapat berfungsi jika pelarut mengandung kromofor UV (benzena/toluena) atau jika zat terlarut mempunyai gugus fungsi –C=C-, C=O-, -N=O-, dan –N=N-. Sel detektor yang bersih sangat menentukan pada pendeteksian yang teliti (Khopkar 1990). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji kacang panjang, kedelai, komak, buncis, gude, tunggak, dan kacang hijau, aquades NaCl 10%, etanol 70%, NaOH 0.2%, NaOH 0.1N, metanol, trietil amin, fenil isotiosianat, asetonitril, natrium asetat pH 5.75, buffer fosfat 0.01M pH 7.6, NaCl 0.15 M, separating gel 10%, stacking gel 4%, pethroleum ether, dan low range protein marker (Richana 2000). Alat-alat yang digunakan ialah alat-alat gelas, destilator, sentrifuse, vortex, vertical elektroforesis BioRad, HPLC, labu erlenmeyer, pipet tetes, pipet volumetrik, eksikator, corong kaca, biuret, kertas saring, dan labu kjeldahl. Metode Analisis Proksimat Kadar Air. Cawan yang akan digunakan untuk penghitungan dikeringkan ke dalam oven dengan suhu 1000C selama 1 jam. Cawan didinginkan dalam eksikator dan setelah dingin ditimbang bobotnya. Sampel kering sebanyak 2 gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan. Cawan yang telah berisi sampel dikeringkan ke dalam oven 1000C selama 3 jam. Setelah 3 jam cawan yang berisi sampel ditimbang (BSN 1992). Kadar air = (a-b)/a x 100% a : Bobot bahan sebelum dikeringkan b : Bobot bahan setelah dikeringkan Kadar Abu. Cawan yang akan digunakan untuk penghitungan dikeringkan ke dalam oven dengan suhu 1000C selama 1 jam. Cawan didinginkan dalam eksikator dan setelah dingin ditimbang bobotnya. Sampel kering sebanyak 2 gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan. Cawan yang telah berisi sampel dikeringkan ke dalam
tanur dengan suhu 5000C selama 4 jam. Setelah 4 jam cawan yang berisi sampel ditimbang (BSN 1992). Kadar abu = a/b x 100% a : Bobot abu sampel b : Bobot sampel Kadar Protein. Sebanyak 0.5 gram sampel dimasukkan kedalam labu kjeldahl. Kemudian ditambahkan 2 gram selen dan 12 ml H2SO4 pekat di ruang asam. Aquadest sebanyak 20 ml kedalam labu kjeldahl dan kemudian dipanaskan di atas pemanas listrik pada suhu 4200C selama 2 jam. Larutan akan jernih kehijau-hijaun. Larutan didinginkan dan masukkan larutan kedalam alat penyuling. Larutan ditambahkan 5 ml NaOH 30%. Larutan disulingkan selama 10 menit, kemudian ditambahkan 10 ml asam borat dan 2 tetes merah metil. Titrasi dilakukan terhadap sampel dengan menggunakan HCl 0,1N (BSN 1992). K.Protein = (Va– Vb) x NHCl x14x100x FK Bobot sampel x 1000 Keterangan: Va = Volume akhir titrasi Vb = Volume awal titrasi FK = Faktor Koreksi Kadar Lemak. Sampel sebanyak 2 gram ditimbang dan dimasukkan kedalam kertas saring dan kapas. Sampel dimasukkan kedalam determinator lemak. Sampel dikeringkan selama 1 jam dan kemudian diekstrak dengan menggunakan heksana selama 2 jam. Sampel dikeringkan dalam oven 1000C selama 1 jam. Sampel didinginkan dan ditimbang bobotnya (BSN 1992). Kadar Lemak =
(Ba–Bk) x100% Bobot sampel
Keterangan: Ba = Bobot labu ditambah sampel Bk = Bobot labu kosong Kadar Serat Kasar. Sampel ditimbang 1 gram, kemudian dimasukkan kedalam labu erlenmeyer. Kedalam sampel ditambahkan 50 ml H2SO4 1.25% dan didihkan selama 30 menit. Kedalam sampel ditambahkan 50 ml NaOH 3.25% dan didihkan selama 30 menit. Siapkan kertas saring dan timbang bobotnya. Sampel disaring menggunakan kertas saring dan corong kaca. Endapan yang terdapat pada kertas saring dicuci dengan H2SO4 1.25%, air
panas, dan etanol. Endapan lemak dan kertas saring kemudian ditimbang bobotnya (BSN 1992). Kadar serat = bobot serat x 100% bobot sampel Penentuan Protein Terlarut Analisis dilakukan secara bertahap yaitu menggunakan pelarut air, larutan NaCl 10%, etanol 70%, dan NaOH 0,2%. Protein di dalam setiap fraksi ditetapkan menurut metode Bradford. Penentuan protein terlarut dengan metode Bradford dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer. Sampel fraksi protein yang sudah dipisahkan sebanyak 50 µl ditambahkan dengan 2,5 ml reagen Bradford. Setelah divortex, sampel ditentukan absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm (Richana 2000). Persamaan kurva standar Y = ax + b X = absorbansi sampel Y = konsentrasi sampel (M) Analisis Asam Amino Analisis asam amino dilakukan dengan menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Tepung biji sampel seberat 1 g dari masing-masing varietas yang sudah diekstrak lemaknya ditambahkan 8 ml HCl 6N dan dialirkan gas nitrogen, kemudian dihidrolisis selama 24 jam di dalam oven pada suhu 1050C. Hasil hidrolisis disaring, dan sebanyak 10 µl hasil penyaringan diderivatisasi. Larutan derivatisasi terdiri atas 350 µl metanol, 50 µl air HPLC grade, 50 µl trietil amin, dan 50 µl fenilisotiosianat. Kondisi operasi HPLC meliputi suhu 380C, tekanan 2053 psi, fase diam menggunakan C18 dengan pendukung silika. Fase gerak terdiri dari asetronitril dan air (60:40) dan natrium asetat pH 5,75 dengan kecepatan alir 0,75 ml/menit. Jenis kolom adalah kolom fase terbalik dengan detektor UV. Perhitungan kandungan asam amino dilakukan dengan cara membandingkan khromatogram contoh dan standar pada waktu retensi yang sama, serta dapat langsung dilihat dari data yang keluar dari alatnya (Richana 2000). Penentuan Bobot Molekul Menggunakan SDS-PAGE
Protein
Protein diekstrak dari 1 gram tepung sampel kacang ditambah 3 ml buffer fosfat 0,01 M pH 7,6 yang mengandung 0,15 M
NaCl. Kemudian dilakukan pengadukan selama 3 menit, lalu dimasukkan ke dalam pendingin selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi diambil sebanyak 100 µl dan ditambah 200 µl sampel buffer. Larutan kemudian dipanaskan 2 menit dengan suhu 1000C. Larutan sampel kemudian digunakan untuk menentukan berat molekul protein menggunakan SDS-PAGE. Gel poliakrilamid dicetak di antara dua lempengan kaca. Larutan gel pisah atau separating gel 10% (lampiran 5) yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikro pipet sampai batas tertentu, kemudian ditambahkan dengan akuades sampai penuh agar permukaan gel rata. Setelah gel mengering, akuades dibuang dan sisa air pada cetakan gel diserap dengan kertas saring. Kemudian larutan gel tumpuk atau stacking gel 4% (lampiran 5) yang telah dibuat dimasukkan ke dalam cetakan dan dipermukaan gel dipasang sisir berlubang lalu didiamkan sampai mengeras. Setelah gel mengeras, cetakan gel dipindahkan ke perangkat elektroforesis. Preparasi sampel dilakukan dengan memasukkan sampel yang telah disiapkan ke dalam tabung kemudian ditambahkan bufer sampel dengan perbandingan 1:1 dan dipanaskan pada suhu 1000C selama 5 menit. Sampel dimasukkan ke dalam sumur yang telah dicetak pada gel poliakrilamid sebanyak 15 µl, kemudian alat elektroforesis diberi tegangan 200 volt sampai pewarna mencapai ujung gel. Visualisasi gel menggunakan coomasie blue dilakukan setelah gel dilepaskan dari cetakan, kemudian direndam di dalam larutan perwarna coomasie blue selama semalam dan digoyangkan dengan alat penggoyang. Selanjutnya, gel dicuci sebanyak dua kali dengan menggunakan larutan dekolorisasi masing masing selama 15 menit. Setelah pita terlihat, gel dicuci dengan akuades. Identifikasi dan analisis pola SDS-PAGE membandingkan antara pita protein yang telah dipisahkan sebelumnya dengan protein. Standar bobot molekul ialah SDS 6H Low Range protein marker (116.8, 95.84, 65.7, 47.36, dan 27.7 kD). Bobot molekul dari masing masing protein ditentukan dengan cara menghitung nilai Rm dari masing-masing pita protein yang nampak, kemudian dibuat kurva standar hubungan antara log BM dengan Rm dari protein standar hingga nilai BM protein dapat dihitung (Richana 2000).
Rm = Jarak pergerakan pita protein daritempat awal (cm) Jarak pergerakan pewarna protein standar dari tempat awal(cm) HASIL DAN PEMBAHASAN Komposisi Kimia Komposisi kimia 7 macam kacangkacangan disajikan pada Gambar 8. Penentuan kadar air bertujuan untuk mengetahui ketahanan terhadap penyimpanan suatu bahan, karena adanya kandungan air suatu bahan merupakan tempat tumbuhnya bakteri dan organisme pengurai lainnya (Putri 2006). Dalam penyimpanan biji kacang-kacangan semakin rendah kandungan kadar air dari biji, maka akan semakin awet dan tahan lama suatu biji dapat disimpan (Harjadi 1986). Hasil analisis kadar abu (Lampiran 3) didapatkan bahwa kandungan mineral tertinggi terdapat pada kacang gude sebesar 6,21% dan kandungan mineral terendah terdapat pada kacang panjang sebesar 3,84%. Bila dibandingkan kadar air dengan kadar abu, maka kacang gude mengandung paling sedikit air, keadaan ini mempengaruhi perhitungan kadar abu, begitu pula kacang panjang dengan kadar air tinggi, maka perhitungan kadar abu menjadi rendah. Penentuan kadar protein total dengan menggunakan metode kjeldahl (Lampiran 4) menghasilkan nilai protein tertinggi terdapat pada kacang gude sebesar 35,23 %. Kadar protein terendah terdapat pada kacang hijau sebesar 19,19 %.
Penentuan kadar lemak dengan menggunakan heksana sebagai pelarut (Lampiran 5) menghasilkan kadar lemak tertinggi pada kacang gude sebesar 19,86%. Kadar lemak terendah terdapat pada kacang kedelai sebesar 4,00 %. Penentuan serat kasar pada sampel (Lampiran 6) menghasilkan kadar serat tertinggi pada kacang komak sebesar 11,79%. Kadar serat kasar terendah terdapat pada kacang buncis dengan kadar sebesar 0,40 %. Setiap kacang-kacangan memiliki karakteristik yang berbeda. Sehingga kandungan kadar protein, lemak, dan serat kasar pada setiap jenis kacang-kacangan merupakan ciri khas dari varietas tersebut (Richana 2000). Fraksi Protein Terlarut Hasil pengamatan fraksi protein dari 7 macam sampel kacang-kacangan yang meliputi albumin, globulin, prolamin, dan glutelin yang didasarkan pada kurva standar protein (Lampiran 9). Fraksi albumin didapatkan setelah sampel dilarutkan dalam air. Fraksi globulin didapatkan setelah sampel dilarutkan dalam NaCl 10%. Fraksi prolamin didapatkan setelah sampel dilarutkan dalam etanol 70%. Fraksi glutelin didapatkan setelah sampel dilarutkan dalam NaOH 0,2%. Hasil analisis fraksi protein terlarut tersebut terdapat pada Tabel 1. Fraksi albumin dan globulin pada kacang panjang memiliki konsentrasi tertinggi sebesar 0,0040 mg/ml. Fraksi prolamin memiliki konsentrasi terendah sebesar 0,0034 mg/ml.
Gambar 8 Diagram hasil analisis komposisi kimia
Tabel 1 Hasil analisis fraksi protein terlarut pada 7 macam kacang-kacangan Sampel
Albumin
Konsentrasi (mg/ml) Globulin Prolamin
Glutelin
Kacang panjang
0,0040
0,0039
0,0034
0,0040
Kacang kedelai
0,0037
0,0037
0,0036
0,0039
Kacang komak Kacang buncis
0,0039
0,0038
0,0035
0,0040
0,0040
0,0039
0,0035
0,0040
Kacang gude Kacang tunggak
0,0038
0,0038
0,0035
0,0039
0,0039
0,0039
0,0036
0,0040
Kacang hijau
0,0040
0,0039
0,0034
0,0040
Fraksi glutelin pada kacang kedelai memiliki konsentrasi tertinggi sebesar 0,0039 mg/ml. Fraksi prolamin memiliki konsentrasi terendah sebesar 0,0036 mg/ml. Fraksi glutelin pada kacang komak memiliki konsentrasi tertinggi sebesar 0,0040 mg/ml. Fraksi prolamin memiliki konsentrasi terendah sebesar 0,0035 mg/ml. Fraksi albumin dan glutelin pada kacang buncis memiliki konsentrasi tertinggi sebesar 0,0040 mg/ml. Fraksi prolamin memiliki konsentrasi terendah sebesar 0,0035 mg/ml. Fraksi glutelin pada kacang gude memiliki konsentrasi tertinggi sebesar 0,0039 mg/ml. Fraksi prolamin memiliki konsentrasi terendah sebesar 0,0035 mg/ml. Fraksi glutelin pada kacang tunggak memiliki konsentrasi tertinggi sebesar 0,0040 mg/ml. Fraksi prolamin memiliki konsentrasi terendah sebesar 0,0036 mg/ml. Fraksi albumin dan glutelin pada kacang hijau memiliki konsentrasi tertinggi sebesar 0,0040 mg/ml. Fraksi prolamin memiliki konsentrasi terendah sebesar 0,0034 mg/ml. Analisis Asam Amino Asam amino esensial sangat dibutuhkan oleh manusia karena tidak dapat disintesis sendiri oleh tubuh. Semakin lengkap dan tinggi kandungan gizi asam amino dalam biji maka nilai gizi semakin baik dan diharapkan dapat menyamai protein hewani (Richana 2000). Pengamatan terhadap asam amino pada 7 sampel kacang-kacangan ini didapatkan 15 asam amino yang terdapat pada sampel (Tabel 2). Secara umum kandungan asam amino terbesar terdapat pada asam aspartat, asam glutamat, dan leusina. Kandungan asam amino terkecil terdapat pada metionina yang merupakan asam amino sulfat. Semua kacang yang diteliti hanya didapatkan 15 asam amino dari 20 asam amino. Hal ini disebabkan 5
asam amino lainnya pada hidrolisis asam amino tidak terdeteksi. Pada kacang panjang, asam amino yang memiliki nilai terbesar ialah asam glutamat yakni sebesar 4,12%. Asam amino dengan kadar terkecil ialah metionina yakni sebesar 0,28%. Pada kacang kedelai, asam amino yang memiliki nilai terbesar ialah asam glutamat yakni sebesar 7,15%. Asam amino dengan kadar terkecil ialah metionina yakni sebesar 0,45%. Pada kacang komak, asam amino yang memiliki nilai terbesar ialah asam glutamat yakni sebesar 3,36%. Asam amino dengan kadar terkecil ialah metionina yakni sebesar 0,12%. Pada kacang buncis, asam amino yang memiliki nilai terbesar ialah asam glutamat yakni sebesar 4,85%. Asam amino dengan kadar terkecil ialah metionina, yakni sebesar 0,27%. Pada kacang gude, asam amino yang memiliki nilai terbesar ialah asam glutamat yakni sebesar 8,50%. Asam amino dengan kadar terkecil ialah metionina yakni 0,52%. Pada kacang tunggak, asam amino yang memiliki nilai terbesar ialah asam glutamat yakni sebesar 3,66%. Asam amino dengan kadar terkecil ialah metionina yakni sebesar 0,18%. Pada kacang hijau, asam amino yang memiliki nilai terbesar ialah asam glutamat yakni sebesar 2,66%. Asam amino dengan kadar terkecil ialah metionina yakni sebesar 0,16%. Asam amino essensial merupakan asam amino yang tidak dapat disintesis oleh tubuh. Asam amino essensial terdiri atas 8 macam asam amino yakni isoleusin, leusin, lisin, fenilalanin, metionin, treonin, triptofan, dan valin. Pada hasil analisis asam amino terdapat 7 asam amino essensial dalam sampel,
Tabel 2 Hasil analisis asam amino pada 7 macam kacang-kacangan Panjang Kedelai Komak Buncis Gude Asam Amino (%) (%) (%) (%) (%)
Tunggak (%)
Hijau (%)
Asam Aspartat
2,75
4,28
2,39
2,83
5,01
2,53
1,68
Asam Glutamat
4,12
7,15
3,36
4,85
8,50
3,66
2,66
Serina
1,21
1,94
1,21
1,20
2,20
1,28
0,74
Histidina
0,71
0,76
0,58
0,72
1,00
0,57
0,39
Glisina
1,18
1,39
0,82
0,81
1,61
0,84
0,56
Treonina
0,85
1,32
0,79
0,87
1,52
0,84
0,47
Arginina
1,49
2,40
1,17
1,62
2,85
1,11
0,92
Alanina
1,14
1,70
1,00
1,09
1,94
0,94
0,66
Tirosina
0,78
1,27
0,68
0,76
1,36
0,67
0,44
Metionina
0,28
0,45
0,12
0,27
0,52
0,18
0,16
Valina
1,41
1,96
1,20
1,38
2,27
1,23
0,85
Fenilalanina
1,58
2,19
1,28
1,58
2,58
1,46
0,97
Isoleusina
1,26
1,92
1,09
1,25
2,24
1,18
0,79
Leusina
2,07
3,01
1,89
2,03
3,50
1,92
1,32
Lisina
1,72
1,81
1,49
1,34
2,39
1,66
1,16
sehingga kandungan asam amino dalam sampel kacang-kacangan sangat baik untuk tubuh manusia (Linder 1992). Bobot Molekul Protein Hasil elektroforesis 7 macam sampel kacang-kacangan menggunakan low range marker protein didapatkan pita protein (Gambar 9). Berat molekul protein terdapat pada 12.03 kDa sampai dengan 157.65 kDa. Intensitas warna yang lebih tebal dibandingkan pita yang lainnya menandakan protein yang terdapat pada pita tersebut cukup banyak. Pada kacang panjang didapatkan 9 pita berdasarkan penentuan berat molekul protein. Nilai berat molekul yang didapatkan dari 9 pita tersebut berkisar antara 16,84 –109,61 KDa dengan bobot tertinggi 109,61 KDa dan terendah 16,84 KDa (Tabel 3). Pada penentuan berat molekul protein pada kacang kedelai didapatkan 5 pita protein. Nilai berat molekul yang didapatkan berkisar pada 12,04 – 64,44 KDa dengan bobot molekul tertinggi 64,44 KDa dan terendah 12,04 KDa. Pada kacang komak didapatkan 10 pita berdasarkan penentuan berat molekul protein. Nilai berat molekul yang didapatkan dari 10 pita tersebut berkisar antara 17,32 –112,72
KDa dengan bobot tertinggi 112,72 KDa dan terendah 17,32 KDa.
Keterangan gambar : No. 1 = low range protein marker (14000-97000 KDa) No. 2 = kacang panjang No. 3 = kacang komak No. 4 = kacang tunggak No. 5 = kacang hijau No. 6 = kacang buncis No. 7 = kacang kedelai No. 8 = kacang gude Gambar 9 Hasil analisis SDS-PAGE pada 7 macam kacang-kacangan
Tabel 3 Hasil Analisis SDS-PAGE Pita ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Bobot Molekul (KDa) Panjang
Kedelai
Komak
Buncis
Gude
Tunggak
Hijau
109,61 92,68 62,66 54,49 47,38 24,9 22,9 19,91 16,84 -
64,44 36,84 27,85 16,37 12,04 -
112,72 70,08 60,93 52,98 47,38 42,36 28,64 25,61 22,9 17,32 -
153,31 109,61 95,31 80,59 66,27 57,62 44,8 32,03 27,85 24,9 21,66 19,36 16,37 13,09 -
62,66 56,03 43,57 26,34 22,27 15,06 12,38 -
149,08 109,61 90,13 78,37 68,14 59,25 42,36 32,03 26,34 23,55 21,66 19,36 16,37 13,84 -
157,66 112,72 95,31 87,64 68,14 60,93 51,52 43,57 31,15 27,85 24,9 22,9 20,48 18,31 15,92 13,09
Pada kacang tunggak didapatkan 14 pita berdasarkan penentuan berat molekul protein. Nilai berat molekul yang didapatkan dari 14 pita tersebut berkisar antara 13,84 –149,08 KDa dengan bobot tertinggi 149,08 KDa dan terendah 13,84 KDa. Pada kacang gude didapatkan 7 pita berdasarkan penentuan berat molekul protein. Nilai berat molekul yang didapatkan dari 7 pita tersebut berkisar antara 12,38 –62,66 KDa dengan bobot tertinggi 62,66 KDa dan terendah 12,38 KDa. Pada kacang hijau didapatkan 16 pita berdasarkan penentuan berat molekul protein. Nilai berat molekul yang didapatkan dari 16 pita tersebut berkisar antara 13,09 –157,66 KDa dengan bobot tertinggi 157,66 KDa dan terendah 13,09 KDa. Pada kacang buncis didapatkan 14 pita berdasarkan penentuan berat molekul protein. Nilai berat molekul yang didapatkan dari 14 pita tersebut berkisar antara 13,09 –153,31 KDa dengan bobot tertinggi 153,31 KDa dan terendah 13,09 KDa. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Kadar protein total berdasarkan hasil uji metode Kjeldahl dalam 7 macam kacangkacangan memiliki nilai yang cukup tinggi dengan kadar protein tertinggi terdapat pada kacang gude sebesar 35,23%. Dalam 7 macam
kacang-kacangan terdapat 7 asam amino essensial yang dibutuhkan oleh tubuh yaitu isoleusin, leusin, lisin, fenilalanin, metionin, treonin, dan valin. Bobot molekul protein terdapat pada 12.03 kDa sampai dengan 157.65 kDa. Saran Perlu dilakukan pengembangan produk dari kacang panjang, kedelai, komak, buncis, buncis, gude, tunggak, dan kacang hijau karena memiliki kandungan protein dan asam amino yang tinggi dan bermanfaat untuk tubuh manusia. Selain itu perlu dilakukan juga analisis berbagai macam varietas kacangkacangan tersebut yang memiliki kandungan gizi terbaik. DAFTAR PUSTAKA Adianto, Safitri DU, Yuli N. 2004. Pengaruh Inokulasi Cacing Tanah (Pontoscolex corethrurus Fr Mull) Terhadap Sifat Fisika Kimia Tanah dan Pertumbuhan Tanaman Kacang Hijau (Vigna radiata L.Wilczek) Varietas Walet. Jurnal Matematika dan Sains 9:175-182. Bintang M. 2010. Biokimia Penelitian. Jakarta: Erlangga
–
Teknik
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 1992. Cara Uji Makanan dan Minuman.
Jakarta: Standar Nasional Indonesia [Depkes] Direktorat Gizi Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1979. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Jakarta: Bhratara Karya Aksara. Christian GD. 1986. Analytical Chemistry. Kanada: J Wiley. Estheria F. 2008. Pengaruh Limbah Padat Sludge terhadap Produksi dan Kandungan Protein Jamur Tiram (Pleurotus ostreatus). [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan. Alam Institut Pertanian Bogor. Fitriasari A et al. 2007. Efek Proliteratif Ekstrak Etanolik Kacang Panjang Pada Sel T47D. Pharmacon 8:44-50. Harjadi W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: PT Gramedia. Indrasari, S.D., D.K. Sadra, D.S.Damardjati. 1992. Evaluation of producer acceptance on soy-pigeon pea tempe production in Puwakarta District, Indonesia. p. 604-615. Proc.the 4 th Asean Food Conference 1992. Bogor: IPB Press. Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. A. Saptorahardjo, penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analyical Chemistry. Koolman J, Rohm KH. 1994. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Physiol R, Wanandi Sodikin M, editor. SI, penerjemah; Jakarta: Hipokrates. Terjemahan dari: Color Atlas of Biochemistry. Lehninger AL. 1982. Dasar Dasar Biokimia. Thenawidjaja, penerjemah. Maggy Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry. Linder MC. 1992. Biokimia Nutrisi dan Aminuddin Parakkasi, Metabolisme. penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Nutritional Biochemistry and Metabolism. Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press. Putri BL. 2006. Analisis Diosmin dan Protein Tanaman Seledri (Apium graveolens L.)
dari Daerah Cipanas dan Ciwidey. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan. Alam Institut Pertanian Bogor. Richana N, Sukarno L, Thantowi A, Hakim L. 2000. Evaluasi Sifat Fisiko-Kimia dan Bio-Kimia Beberapa Varietas dan Galur Kacang Hijau. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan 19:98-105. Rukmana R. 1998. Bertanam Buncis. Jakarta: Kanisius. Setiawati BB. 2006. Kedelai Hitam Sebagai Bahan Baku Kecap Tinjauan Varietas dan Lama Fermentasi terhadap Mutu Kecap. Jurnal Ilmu-ilmu Pertanian 2:142-153. Subagio et al. 2006. KarakteristikBijidan Kacang Komak (Lablab Protein purpureus) Sebagai Sumber Protein. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 17:13-19. Winda H, Endang YP, Ridwan T. 2007. Pemanfaatan Kacang-kacangan Lokal Sebagai Bahan Baku Substitusi Tempe dan Tahu. Jurnal Teknologi Pascapanen Pertanian 3:1-8.
Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian Secara Umum Sampel Biji 7 Macam Kacang-Kacangan
Preparasi Sampel menjadi Tepung Kacang-Kacangan
Analisis Proksimat
Didapatkan : Kadar Air Kadar Abu Kadar Protein Kadar Lemak Kadar Serat
Penentuan Protein Terlarut (Metode Bradford)
Didapatkan : Kadar Albumin Kadar Globulin Kadar Prolamin Kadar Glutelin
Analisis Asam Amino (HPLC)
Penentuan Bobot Molekul Protein (Elekroforesis)
Lampiran 2 Kadar air Sampel Kacang panjang Kacang kedelai Kacang komak Kacang buncis Kacang gude Kacang tunggak Kacang hijau
Bobot basah (gram) 1,9087 1,9616 1,9670 1,9745 1,9988 1,9332 1,9162
Bobot kering (gram) 1,6465 1,7629 1,6997 1,7620 1,8057 1,6907 1,6912
Kadar air (%) 13,74 10,13 13,59 10,76 9,66 12,54 11,74
Contoh Perhitungan: Kadar air = bobot basah – bobot kering x 100% bobot basah = 1,9087 – 1,6465 x 100% 1,9087 = 13,74% Lampiran 3 Kadar Abu Sampel Kacang panjang Kacang kedelai Kacang komak Kacang buncis Kacang gude Kacang tunggak Kacang hijau
Bobot basah (gram) 1,9087 1,9616 1,9670 1,9745 1,9988 1,9332 1,9162
Contoh Perhitungan: Kadar abu = bobot abu x 100% bobot basah = 0,0732 x 100% 1,9087 = 3,84%
Bobot abu (gram) 0,0732 0,1216 0,0838 0,0778 0,1241 0,0862 0,077
Kadar abu (%) 3,84 6,20 4,26 3,94 6,21 4,46 4,02
Lampiran 4 Kadar protein Sampel Kacang panjang Kacang kedelai Kacang komak Kacang buncis Kacang gude Kacang tunggak Kacang hijau
Bobot sampel (gram) 0,5143 0,5143 0,5142 0,5124 0,5117 0,5119 0,5108
N HCl
Vo (ml)
0,1074 0,1074 0,1074 0,1074 0,1074 0,1074 0,1074
0 11,2 4,3 14,6 2,3 15,8 0
Vakhir (ml) 14,6 29,3 15,8 28,5 22,9 27,3 11,2
FK 6,25 5,71 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25
Kadar Protein (%) 24,84 28,13 19,57 23,74 35,23 19,66 19,19
Contoh Perhitungan: Kadar Protein = (Vakhir – Vawal) x N HCl x 14 x 100 x FK Bobot sampel x 1000 Kadar Protein = (14,6 – 0) x 0,1074 x 14 x 100 x 6,25 0,5143 x 1000 Kadar Protein = 24,84% Lampiran 5 Kadar lemak Sampel Kacang panjang Kacang kedelai Kacang komak Kacang buncis Kacang gude Kacang tunggak Kacang hijau
Bobot sampel (gram) 2,0421 2,0103 2,0223 2,0002 2,0000 2,0016 2,0506
Bobot labu (gram) 32,3756 32,5184 32,7833 32,9125 25,4702 25,5809 25,4362
Bobot labu + sampel akhir (gram) 32,4779 32,5989 32,8839 33,0503 25,8673 25,6888 25,5419
Kadar lemak (%) 5,11 4,00 4,98 6,89 19,86 5,39 5,13
Contoh Perhitungan: Kadar Lemak = (bobot labu + sampel akhir – bobot labu kosong) x 100% Bobot sampel Kadar Lemak = (32,4779 – 32,3756) x 100% 2,0421 Kadar Lemak = 5,11
Lampiran 6 Kadar serat Sampel Kacang panjang Kacang kedelai Kacang komak Kacang buncis Kacang gude Kacang tunggak Kacang hijau
Bobot sampel (gram) 1,0046 1,0017 1,0038 1,0094 1,0009 1,0000 1,0002
Bobot serat (gram) 0,0580 0,0391 0,1179 0,0040 0,0108 0,0277 0,0178
Kadar serat (%) 5,77 3,91 11,79 0,40 1,08 2,77 1,78
Contoh Perhitungan: Kadar serat = bobot serat x 100% bobot sampel Kadar serat = 0,0580 x 100% 1,0046 Kadar serat = 5,77% Lampiran 7 Prosedur pembuatan reagen bradford Reagen bradford dibuat dengan cara menimbang 0,01 gram Coomasie Brilian Blue (CBB) G-250 yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95%, lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85%. Campuran dihomogenkan lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah. Lampiran 8 Prosedur pembuatan larutan standar protein Larutan standar protein dibuat dengan menimbang 0,01 gram standar BSA (Bovine Serum Albumin) yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Kemudian dilakukan pengenceran untuk mendapatkan stok BSA 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, dan 500 ppm. Konsentrasi 100 ppm 200 ppm 300 ppm 400 ppm 500 ppm
Stock BSA 1000 ppm (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
H2O steril (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan menambahkan 50 µl larutan dengan 2,5 ml reagen bradford. Kemudian larutan divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan didapatkan persamaan matematika untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai absorbansi standar yang akan digunakan pada pengukuran kadar protein terlarut.
Lampiran 9 Kurva standar protein Persamaan Kurva ppm Absorbansi A B 0 0 0,001 0,0032 100 0,146 0,001 0,0032 200 0,278 0,001 0,0032 300 0,416 0,001 0,0032 400 0,516 0,001 0,0032 500 0,55 0,001 0,0032
Lampiran 10 Penentuan fraksi protein terlarut Absorbansi Sampel Albumin Globulin Prolamin Kacang panjang 0,792 0,658 0,21 Kacang kedelai 0,469 0,518 0,377 Kacang komak 0,744 0,639 0,26 Kacang buncis 0,824 0,719 0,313 Kacang gude 0,64 0,642 0,334 Kacang tunggak 0,745 0,697 0,358 Kacang hijau 0,803 0,712 0,233
Glutelin 0,827 0,729 0,81 0,837 0,738 0,806 0,779
Konsentrasi (mg/ml) Globulin Prolamin 0,0039 0,0034 0,0037 0,0036 0,0038 0,0035 0,0039 0,0035 0,0038 0,0035 0,0039 0,0036 0,0039 0,0034
Glutelin 0,0040 0,0039 0,0040 0,0040 0,0039 0,0040 0,0040
Sampel Kacang panjang Kacang kedelai Kacang komak Kacang buncis Kacang gude Kacang tunggak Kacang hijau
Albumin 0,0040 0,0037 0,0039 0,0040 0,0038 0,0039 0,0040
Contoh Perhitungan: Persamaan kurva standar Y = 0,001X + 0,032 X = absorbansi sampel Y = konsentrasi sampel (M) Y = (0,001 x 0,792) + 0,032 Y = 0,0040
Lampiran 11 Kromatogram standar asam amino
Lampiran 12 Kromatogram sampel kacang panjang
Lampiran 13 Kromatogram sampel kacang kedelai
Lampiran 14 Kromatogram sampel kacang komak
Lampiran 15 Kromatogram sampel kacang buncis
Lampiran 16 Kromatogram sampel kacang gude
Lampiran 17 Kromatogram sampel kacang tunggak
Lampiran 18 Kromatogram sampel kacang hijau
Lampiran 19 Hasil analisis asam amino menggunakan HPLC Parameter Protein & N Compounds Amino Acid Aspartic acid Glutamic acid Serine Histidine Glycine Threonine Arginine Alanine Tyrosine Methionine Valine Phenylalanine I-leucine Leucine Lysine Tryptophane TOTAL AA
Kacang Tunggak
Kacang Kacang Kacang Kacang Kacang Kacang Buncis Panjang Komak Gude Hijau Kedelai
2.53 3.66 1.28 0.57 0.84 0.84 1.11 0.94 0.67 0.18 1.23 1.46 1.18 1.92 1.66
2.83 4.85 1.20 0.72 0.81 0.87 1.62 1.09 0.76 0.27 1.38 1.58 1.25 2.03 1.34
2.75 4.12 1.21 0.71 1.18 0.85 1.49 1.14 0.78 0.28 1.41 1.58 1.26 2.07 1.72
2.39 3.36 1.21 0.58 0.82 0.79 1.17 1.00 0.68 0.12 1.20 1.28 1.09 1.89 1.49
5.01 8.50 2.20 1.00 1.61 1.52 2.85 1.94 1.36 0.52 2.27 2.58 2.24 3.50 2.39
1.68 2.66 0.74 0.39 0.56 0.47 0.92 0.66 0.44 0.16 0.85 0.97 0.79 1.32 1.16
4.28 7.15 1.94 0.76 1.39 1.32 2.40 1.70 1.27 0.45 1.96 2.19 1.92 3.01 1.81
20.06
22.60
22.55
19.07
39.51
13.77
33.54
Lampiran 20 Hasil analisis bobot molekul protein SDS-PAGE
Lampiran 21 Kurva standar marker SDS PAGE LMW (14000-97000)
Protein Phosporylase b Albumin Ovalbumin Carbonic anhydrase Trypsin inhibitor α-Lactalbumin
Mr 97000 66000 45000 30000 20100 14400
Log BM Migrasi 4,986772 4,9 4,819544 4,9 4,653213 4,9 4,477121 4,9 4,303196 4,9 4,158362 4,9
Band 1,2 2,05 3 3,3 4,05 4,7
Rf 0,2449 0,4184 0,6122 0,6735 0,8265 0,9592
Log BM 4,9868 4,8195 4,6532 4,4771 4,3032 4,1584
Lampiran 22 Bobot molekul protein secara keseluruhan Sampel
Migrasi
Band
Panjang (cm)
4,9
1,1
0,2245
4,9
1,4
0,2857
4,9
2,1
0,4286
4,9
2,35
0,4796
4,9
2,6
4,9
3,75
4,9 4,9 4,9 4,9
Komak (cm)
Tunggak (cm)
Hijau (cm)
Rf
A
B
Log BM
BM (Dalton)
Kda
-1,190
5,307
5,0399
109611,76
109,612
-1,190
5,307
4,9670
92682,98
92,683
-1,190
5,307
4,7970
62661,39
62,661
-1,190
5,307
4,7363
54486,10
54,486
0,5306
-1,190
5,307
4,6756
47377,42
47,377
0,7653
-1,190
5,307
4,3963
24904,95
24,905
3,9
0,7959
-1,190
5,307
4,3599
22901,14
22,901
4,15
0,8469
-1,190
5,307
4,2991
19913,28
19,913
4,45
0,9082
-1,190
5,307
4,2263
16837,81
16,838
1,05
0,2143
-1,190
5,307
5,0520
112719,75
112,720
4,9
1,9
0,3878
-1,190
5,307
4,8456
70076,34
70,076
4,9
2,15
0,4388
-1,190
5,307
4,7849
60933,64
60,934
4,9
2,4
0,4898
-1,190
5,307
4,7241
52983,77
52,984
4,9
2,6
0,5306
-1,190
5,307
4,6756
47377,42
47,377
4,9
2,8
0,5714
-1,190
5,307
4,6270
42364,30
42,364
4,9
3,5
0,7143
-1,190
5,307
4,4570
28641,78
28,642
4,9
3,7
0,7551
-1,190
5,307
4,4084
25611,12
25,611
4,9
3,9
0,7959
-1,190
5,307
4,3599
22901,14
22,901
4,9
4,4
0,8980
-1,190
5,307
4,2384
17315,24
17,315
4,9
0,55
0,1122
-1,190
5,307
5,1734
149083,15
149,083
4,9
1,1
0,2245
-1,190
5,307
5,0399
109611,76
109,612
4,9
1,45
0,2959
-1,190
5,307
4,9549
90127,46
90,127
4,9
1,7
0,3469
-1,190
5,307
4,8941
78368,74
78,369
4,9
1,95
0,3980
-1,190
5,307
4,8334
68144,15
68,144
4,9
2,2
0,4490
-1,190
5,307
4,7727
59253,54
59,254
4,9
2,8
0,5714
-1,190
5,307
4,6270
42364,30
42,364
4,9
3,3
0,6735
-1,190
5,307
4,5056
32031,07
32,031
4,9
3,65
0,7449
-1,190
5,307
4,4206
26337,31
26,337
4,9
3,85
0,7857
-1,190
5,307
4,3720
23550,49
23,550
4,9
4
0,8163
-1,190
5,307
4,3356
21655,66
21,656
4,9
4,2
0,8571
-1,190
5,307
4,2870
19364,22
19,364
4,9
4,5
0,9184
-1,190
5,307
4,2141
16373,55
16,374
4,9
4,8
0,9796
-1,190
5,307
4,1413
13844,77
13,845
4,9
0,45
0,0918
-1,190
5,307
5,1977
157657,37
157,657
4,9
1,05
0,2143
-1,190
5,307
5,0520
112719,75
112,720
4,9
1,35
0,2755
-1,190
5,307
4,9791
95310,96
95,311
4,9
1,5
0,3061
-1,190
5,307
4,9427
87642,40
87,642
4,9
1,95
0,3980
-1,190
5,307
4,8334
68144,15
68,144
4,9
2,15
0,4388
-1,190
5,307
4,7849
60933,64
60,934
4,9
2,45
0,5000
-1,190
5,307
4,7120
51522,86
51,523
4,9
2,75
0,5612
-1,190
5,307
4,6391
43565,52
43,566
4,9
3,35
0,6837
-1,190
5,307
4,4934
31147,89
31,148
Buncis (cm)
Kedelai (cm)
Gude (cm)
4,9
3,55
0,7245
-1,190
5,307
4,4449
27852,05
27,852
4,9
3,75
0,7653
-1,190
5,307
4,3963
24904,95
24,905
4,9
3,9
0,7959
-1,190
5,307
4,3599
22901,14
22,901
4,9
4,1
0,8367
-1,190
5,307
4,3113
20477,91
20,478
4,9
4,3
0,8776
-1,190
5,307
4,2627
18311,09
18,311
4,9
4,55
0,9286
-1,190
5,307
4,2020
15922,09
15,922
4,9
4,9
1,0000
-1,190
5,307
4,1170
13091,82
13,092
4,9
0,5
0,1020
-1,190
5,307
5,1856
153310,33
153,310
4,9
1,1
0,2245
-1,190
5,307
5,0399
109611,76
109,612
4,9
1,35
0,2755
-1,190
5,307
4,9791
95310,96
95,311
4,9
1,65
0,3367
-1,190
5,307
4,9063
80590,85
80,591
4,9
2
0,4082
-1,190
5,307
4,8213
66265,23
66,265
4,9
2,25
0,4592
-1,190
5,307
4,7606
57619,76
57,620
4,9
2,7
0,5510
-1,190
5,307
4,6513
44800,79
44,801
4,9
3,3
0,6735
-1,190
5,307
4,5056
32031,07
32,031
4,9
3,55
0,7245
-1,190
5,307
4,4449
27852,05
27,852
4,9
3,75
0,7653
-1,190
5,307
4,3963
24904,95
24,905
4,9
4
0,8163
-1,190
5,307
4,3356
21655,66
21,656
4,9
4,2
0,8571
-1,190
5,307
4,2870
19364,22
19,364
4,9
4,5
0,9184
-1,190
5,307
4,2141
16373,55
16,374
4,9
4,9
1,0000
-1,190
5,307
4,1170
13091,82
13,092
4,9
2,05
0,4184
-1,190
5,307
4,8091
64438,12
64,438
4,9
3,05
0,6224
-1,190
5,307
4,5663
36837,12
36,837
4,9
3,55
0,7245
-1,190
5,307
4,4449
27852,05
27,852
4,9
4,5
0,9184
-1,190
5,307
4,2141
16373,55
16,374
4,9
5,05
1,0306
-1,190
5,307
4,0806
12038,47
12,038
4,9
2,1
0,4286
-1,190
5,307
4,7970
62661,39
62,661
4,9
2,3
0,4694
-1,190
5,307
4,7484
56031,03
56,031
4,9
2,75
0,5612
-1,190
5,307
4,6391
43565,52
43,566
4,9
3,65
0,7449
-1,190
5,307
4,4206
26337,31
26,337
4,9
3,95
0,8061
-1,190
5,307
4,3477
22269,70
22,270
4,9
4,65
0,9490
-1,190
5,307
4,1777
15056,16
15,056
4,9
5
1,0204
-1,190
5,307
4,0927
12379,82
12,380
