PRODUKSI DAN APLIKASI KITINASE DARI B. licheniformis HSA3-1a DALAM MENGHIDROLISIS KITIN DARI LIMBAH UDANG DAN DINDING SEL JAMUR Ganoderma sp. Hasnah Natsir 1), Abd. Rauf Patong1), Maggy T.Suhartono2) and Ahyar Ahmad1) 1)
Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Hasanuddin University, Jl. Perintis Kemerdekaan Km 10 Tamalanrea, Makassar, South Sulawesi, Indonesia 90245 2) Departement of Food Technology and Human Nutrition Fateta and Research Center for Biotechnology, Bogor Agricultural University, Jl. Raya Dramaga, Campus IPB. PO.BOX 220, Bogor 16002, West Java, Indonesia Email:
[email protected]
ABSTRAK Kitinase merupakan enzim golongan hidrolitik yang dapat menghidrolisis kitin dari berbagai sumber. Kitinase ini mempunyai aplikasi komersial dalam bidang pertanian dan kesehatan. Produksi kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a dilakukan secara ekstraseluler pada kondisi optimum, kemudian kitinase tersebut diaplikasikan dalam menghidrolisis kitin dari limbah udang dan kitin pada jamur Ganoderma sp. penyebab penyakit busuk batang pada kelapa sawit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri B. licheniformis HSA3-1a potensial menghasilkan kitinase yang diproduksi maksimum pada kondisi waktu fermentasi 72 jam, konsentrasi koloidal kitin 0,5%, suhu 55oC dengan nilai aktivitas 0,225 U/mL. Kemampuan kitinase dalam menghidrolisis kitin dari limbah udang ditunjukkan dengan hasil pengujian aktivitas enzim yang menggunakan substrat kitin dari limbah udang dengan aktivitas 0,48 Unit/mL dan pola tekstur kitin sebelum dan sesudah hidrolisis terlihat berbeda yang dianalisis dengan menggunakan SEM (Scanning Electron Microscope). Kitinase juga dapat menghidrolisis kitin pada dinding sel jamur Ganoderma sp., hal ini ditunjukkan dengan adanya zona inhibisi disekitar koloni setelah diinkubasi 48 jam sebesar 19,5 mm. Kata kunci: B. licheniformis, Kitinase, Kitin, Ganoderma sp. PENDAHULUAN Kitinase adalah enzim yang dapat mendegradasi kitin, menjadi oligomer sampai dimernya. Kitinase dan hasil hidrolisisnya banyak dimanfaatkan dalam bidang bioteknologi pertanian, kesehatan dan lingkungan (Muzzarelli and Peter, 1997; Patil et. al., 2000). Mekanisme kerja enzim kitinase dalam menghidrolisis kitin pada limbah udang dan jamur patogen, terkait dengan adanya kitin pada limbah udang dan pada dinding sel
jamur yang dapat dimanfaatkan oleh enzim tersebut sebagai substratnya (Katatny et. al., 2000). Kitin merupakan polimer linier yang tersusun dari 2.000–3.000 monomer Nasetil-D-glukosamin yang dihubungkan dengan ikatan -1,4-glikosida. Sumber utama kitin adalah limbah hasil laut seperti: kulit udang, lobster, dan cangkang kepiting, serta dinding sel jamur dan bakteri (Wang and Chang,1997 dan Natsir et.al. 2002).
1
Penggunaan kitinase telah dilaporkan oleh beberapa peneliti antara lain: Katatny dkk. (2000) menggunakan kitinase dan 1,3glukanase dari Trichoderma harzianum sebagai agensia fungisida dalam pengendalian jamur Sclerotium rolfsii secara in vitro; sedangkan Harjono dan Widyastuti (2001) menggunakan endo-kitinase murni dari Trichoderma reesei sebagai fungisida dalam menghambat perkecambahan spora jamur patogen Ganoderma philippii secara in-vitro. Berdasarkan informasi pada latar belakang, maka dilakukan produksi kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a dan diaplikasikan dalam hidrolisis kitin pada limbah udang dan kitin pada dinding sel jamur Ganoderma sp. METODE PENELITIAN Bahan: Bakteri B. licheniformis HSA3-1a yang diisolasi dari sumber air panas Sulili Sulawesi Selatan, kitin dari limbah udang, NaOH, HCl, N-asetil-D-glukosamin, Na2CO3, K3[Fe(CN)6], CuSO4.5H2O, Sephadeks G-75 dan bahan untuk medium. Produksi Enzim Kitinase Produksi kitinase dilakukan dengan menggunakan inokulum aktif 10-15% dari spora biakan B. licheniformis HSA3-1a dengan komposisi medium: (NH4)2SO4 0,7%, yeast ekstrak 0.05%, bakto tripton 0,1%, NaCl 0,1%, K2HPO4 0,1%, MgSO4.7H2O 0,01% dan koloidal kitin 0,5%, dishaker pada 55 oC, 180 rpm selama 72 jam, Selanjutnya kitinase yang dihasilkan diuji aktivitas enzim dengan metode schales (Natsir et al., 2010), dan uji protein. Pengukuran Aktivitas Kitinase Prinsip pengukuran aktivitas kitinase didasarkan pada jumlah gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis koloidal kitin dan diukur dengan dengan metode Schales modifikasi (Toharisman et al., 2005; Natsir et al.,2010). Uji aktivitas enzim menggunakan substrat koloidal kitin 0,3 % yang diinkubasi pada 55 oC selama 30 menit. Selanjutnya
campuran enzim, substrat dan bufer ditambah reagen Schales. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 420 nm. Pengukuran ini menggunakan N-asetil-Dglukosamin sebagai larutan standar. Satu unit aktivitas enzim kitinase didefinisikan sebagai sejumlah enzim yang menghasilkan 1µmol N-asetil-D-glukosamin per menit. Aplikasi kitinase dalam menghidrolisis kitin limbah udang. Uji hidrolisis kitin menggunakan sampel: 1) serbuk kitin dari limbah udang windu 2) glikol kitin, dan 3) koloidal kitin yaitu serbuk kitin sigma yang dibuat dalam bentuk koloid. Sebelum menggunakan kitin dari limbah udang terlebih dahulu dilakukan isolasi kitin dari limbah udang secara kimiawi. Isolasi kitin dari limbah udang mengikuti metode Bastaman dkk. (1998) dan Natsir, dkk. (2007) dengan menggunakan larutan NaOH 0,5M pada tahap deproteinasi, dan HCl 1,0 N pada tahap demineralisasi. Hasil isolasi berupa serbuk kitin digunakan sebagai substrat dalam uji hidrolisis kitinase kasar dan murni. Analisis struktur kitin hasil hidrolisis kitinase menggunakan alat SEM (Scanning Electron Microscope). Aplikasi kitinase dalam hidrolisis kitin pada dinding sel jamur secara in vitro Uji aktivitas kitinase dalam hidrolisis kitin ini menggunakan jamur uji Ganoderma sp. Pengujian dilakukan dengan metode difusi agar yang menggunakan paper disc. Biakan jamur Ganoderma sp. telah tumbuh dalam medium potato dekstrose agar (PDA) selama 1x24 jam, dimasukkan paper disc yang telah diberi kitinase ektrak kasar dan kitinase murni, kemudian diinkubasi 2-3 hari. Pengamatan zona hidrolisis dilakukan setiap hari dengan mengukur zona inhibisi pada biakan jamur uji tersebut. Zona inhibisi memberikan indikasi aktivitas hidrolisis kitinase pada dinding sel jamur. 2
HASIL DAN PEMBAHASAN Produksi Kitinase Enzim kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a diproduksi maksimum selama 72 jam dalam medium sintetik minimum (MSM) dengan kondisi suhu 50 oC dan pH 7,0 yang seiring dengan pertumbuhan sel mencapai akhir fase stasioner dengan aktivitas kitinase sebesar 0,225 U/mL (Gambar 1). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut membutuhkan enzim kitinase sebagai strategi dalam mempertahan-kan hidupnya. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Toharisman et al. (2005) yang memproduksi kitinase dari B. licheniformis MB-2 maksimum pada jam ke-72 pada kondisi suhu 55oC, pH 7,0. serta kitinase dari Bacillus MH-1 diproduksi maksimum pada suhu 58 oC dalam kisaran waktu 72–96 jam (Sakai et al., 1998).
Berdasarkan hasil peneitian aplikasi kitinase ekstrak kasar dan kitinase murni dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a dalam menghidrolisis kitin dari koloidal kitin, dan kitin golongan crustaceae yaitu limbah udang windu (Gambar 2). Data hasil penelitian menunjukkan bahwa kitinase ini dapat menghidrolisis kitin dari limbah udang windu dengan aktivitas sebesar 0,48 U/mL.
Gambar 1. Aktivitas kitinase ekstrak kasar dan kitinase murni dari B. licheniformis HAS3-1a dalam menghidrolisis kitin
Hasil analisis SEM menunjukkan bahwa pola tekstur kitin dari limbah udang sebelum dan sesudah hidrolisis oleh kitinase terlihat berbeda. Tekstur kitin sebelum hidrolisis terlihat utuh dan kompak sedangkan setelah hidrolisis terlihat mulai terurai dan tidak kompak (Gambar 3). Gambar 1. Produksi enzim kitinase dari B. licheniformis HAS3-1a pada kondisi suhu 50oC, pH 7,0 dengan kecepatan aerasi 180 rpm.
Aplikasi kitinase dalam menghidrolisis kitin pada limbah udang Kitinase dapat menghidrolisis kitin menjadi derivatnya yang banyak dimanfaatkan dalam bidang seperti: industri bahan obat, kosmetik, kapsul, dan dapat digunakan dalam bidang biokimia dan bioteknologi.
A
B
Gambar 3. Pola tekstur kitin dari limbah udang: (A) sebelum hidrolisis dan (B) setelah hidrolisis oleh kitinase.
3
Aplikasi kitinase dalam hidrolisis kitin pada dinding sel jamur secara in vitro Pengujian hidrolisis kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a terhadap jamur patogen tanaman dilakukan secara in vitro menggunakan jamur Ganoderma sp. yang diisolasi dari kelapa sawit. Pengujian hidrolisis ini selanjutnya disebut pengujian bioaktivitas yang menggunakan kitinase ekstrak kasar dan kitinase murni sebanyak 40 µL, kontrol negatif, dan kontrol positif (fungisida komersial yang bioaktivitasnya dianggap100%). Hasil pengujian aktivitas menunjukkan bahwa kitinase murni dengan konsentrasi enzim 0,024 mg (0,092 unit aktivitas kitinase) yang memiliki zona inhibisi 19,5 mm bioaktivitasnya sebesar 45%. Sedangkan kitinase ekstrak kasar hanya memiliki zona inhibisi 9,5 mm pada konsentrasi enzim 0,012 mg bioaktivitasnya hanya mencapai 11,7%. (Tabel 1). Hal ini dapat terjadi karena konsentrasi kitinase murni lebih tinggi yang menyebabkan zona inhibisi luas daripada enzim ekstrak kasar.
khususnya Ganoderma sp. secara in vitro. Secara teoritis enzim kitinase dapat digunakan dalam pengendalian hayati jamur patogen tanaman karena dinding sel jamur patogen tersebut mengandung kitin yang merupakan substrat dari enzim kitinase. Terkait dengan aplikasi kitinase dalam menghidrolisis kitin pada dinding sel jamur patogen tanaman yaitu sebagai agensia fungisida dilaporkan oleh: Katatny et al., (2000) menggunakan kitinase dari T. harzianum sebagai agen biokontrol dalam pengendalian hayati jamur patogen tanaman secara in vitro, khususnya pada jamur Sclerotium rolfsii, dan Mateos et al. (2007) melakukan peneliktian terhadap T. harzianum strain CECT 2413 dan menghasilkan kitinase yang menghambat pertumbuhan jamur Rhizoctania solani dan P. chipthoptora secara in vitro. Kedua penelitian aplikasi kitinase sebagai agensia fungisida sebelumnya memperkuat teori bahwa kitinase dapat digunakan dalam hidrolisis dinding sel jamur patogen.
Tabel 1. Bioaktivitas kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a terhadap jamur Ganoderma sp. in vitro
Sampel
Vol (µL)
Konsentrasi (mg/mL)
Zona Inhibisi (mm)
Bioaktivitas Kitinase (%)
Ekstrak murni
40
0,024
19,5
45
Enzim crude
40
0,012
9,5
11,7
Kontrol negatif
20
0,002
6,0
0
Kontrol positif
20
0,002
36,0
100
Berdasarkan fenomena bioaktivitas pada Gambar 4 menunjukkan bahwa kitinase dari bakteri termofil isolat HSA3-1a dapat digunakan sebagai agensia fungisida dalam penanggulangan jamur patogen kelapa sawit
1 2 3 4
Gambar 4. Uji bioaktivitas kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a terhadap pertumbuhan Ganoderma sp. Ket: 1) enzim murni; 2). enzim ekstrak kasar; 3) kontrol negatif dan 4) kontrol positif. KESIMPULAN: Kesimpulan dari penelitian ini adalah kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a dapat menghidrolisis kitin dari limbah udang dan kitin pada dinding sel jamur Ganoderma sp.
4
Biochem. Molecular Biology Biophysics. 6 (4): 279–282.
UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih disampaikan kepada Dirjen Dikti atas bantuan Hibah Doktor yang diberikan untuk menyelesaikan penelitian dan penyusunan Disertasi pada Program Studi S3 Ilmu Kimia Universitas Hasanuddin. REFERENCES Bastaman, S., Aprianita, N. dan Hendarti. 1998. Penelitian Limbah Udang sebagai Bahan Industri Kitin dan Kitosan. Balai Besar Penelitiaan dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian. Jakarta. Harjono and Widyastuti, S.M. 2001. Antifungal Activity of Purified Endochitinase Produced by Biocontrol Agent Trichoderma reesei Against Ganoderma philippii. Pakistan J. of Biological Sciences. 4 (10): 1232-1234. Katatny, M.H.EI., W. Somitsch, K.H. Robra, M.S.EI-Katatny and G.M. Gubitz, (2000), Production of Chitinase and 1,3Glucanase by Trichoderma harzianum for Control of the Phytopathogenic Fungus Sclerotium rolfsii. J. Food Technol. Biotechnol. 38 (3) : 170 – 180. Mateos, M.M.A., Jarana, J.D., Codon, A.C. and Benitez, T. 2007. pH and Pacl Control Development and Antifungal Activity in Trichoderma harzianum. J. Fungal Genetic and Biology , 44: 1355 – 1367. Muzzarelli, R.A.A. and Peter, M.G. 1997. Chitin Handbook. European Chitin Society. Atec, Grottamare. Italy. 165–174; 305–311. Natsir, H., Jawahir, B., dan Fitriani. 2007. Konversi Kitin dari Limbah Udang Apiapi (Metapenaeus monodon) Menjadi Senyawa Kitosan Secara Enzimatis. Jurnal Marina Chemica Acta, Edisi Khusus FK3TI, ISSN: 1411-2132, Natsir, H., Chandra, D., Rukayadi, Y., Suhartono, M.T., Hwang, J.K. and Pyun, Y.R. 2002. Biochemical Characteristics of Chitinase Enzyme from Bacillus sp. of Kamojang Creater, Indonesian. J. of
and
Natsir, H., Patong, A.R., Suhartono,M.T. and Ahmad, A. 2010. Production and Characterization of Chitinase Enzymes from Hot Spring in South Sulawesi, Bacillus sp. HSA3-1a. Indo. J. of Chem. 10 (2): 256–260. Rahayu, S., Tanuwijaya, F., Suhartono, M.T., Hwang, J.K. dan Pyun, Y.R. 2004. Study of Thermostable Chitinase Enzymes from Indonesia Bacillus K29-14. J. Microbiol. and Biotech. 4: 647–652. Sakai,
K., Yokota, A., Kurokawa, H., Wakayama, M. and Moriguchi, M. 1998. Purification and Characterization of Three Termostable Endochitinases of a Noble Bacillus sp. Strain, MH-1 Isolated from Chitin-Containing Compost. J. Appl. and Env. Microbiology. 64 (9): 3397–3402.
Toharisman, A., Suhartono, M.T., Spindler, B.M., Hwang, J.K. and Pyun, Y.R. 2005. Purification and Characterization of a Thermostable Chitinase from Bacillus licheniformis MB-2. World J. Microbiol. Biotechnol. 21 (5): 730–738. Wang, S.L. and Chang, W.T. 1997. Purification and Characterization of Two Bifungsional Chitinases/Lysozymes Extracellularly Produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a Shrimp and Crab Shell Powder Medium. J. Appl. and Environmental Micro-biology. 63 (2): 380. Yuli, E.P., Suhartono, M.T., Rukayadi, Y., Hwang, J.K. and Pyun, Y.R. 2004 Characteristic of Thermostable Chitinase Enzymes from the Bacillus sp. J. Enzyme and Microbial Technology.13–26.
5
