Preanalytická variabilita hemokoagulačných vyšetrení
Pardubice, Říjen 2010
Hlavná úloha koagulačného systému
•
Udržať krv v tekutom stave umožniť odovzdávanie okysličenej krvi orgánom
•
Zamedziť stratám krvi v mieste poranenia cievy vytvorenie zrazeniny zmenou rozpustného fibrinogénu na nerozpustný fibrín
•
Zachovať rovnováhu medzi týmito dvoma protikladnými úlohami
Čo je “Hemostáza” ? Hemostáza je zastavenie krvácania pomocou kombinácie aktivít veľkého množstva individuálnych procesov •
Cieľom týchto procesov je: • Zachovať zloženie a tekutosť krvi v krvných cievach • Utesniť otvor v krvnej cieve a zastaviť straty krvi • Obnoviť normálnu cievnu štruktúru
Rozdiel medzi hemostázou a koaguláciou : Koagulácia = je len jednou časťou (aj keď nevyhnutnou) hemostatického procesu
Aké sú súčasti hemostázy? Hemostáza má 3 základné súčasti: 1. Cievny systém udržiavanie tekutosti krvi, ochrana pred nežiadúcim a samoúčelovým zrážaním krvi • produkcia látok podporujúcich zrážanie krvi v prípade poškodenia cievnej steny •
2. Trombocyty – krvné doštičky •
tvorba primárnej hemostatickej zátky (adhézia, release reaction, agregácia)
3. Plazmatické hemokoagulačné faktory • bielkoviny krvnej plazmy • I až XIII plus ko-faktory
Aké sú súčasti hemostázy? Po spustení hemostázy – fibrinolýza Aktivované koagulačné faktory (najmä trombín) musia byť inhibované: - Antitrombín III - Proteín C - Proteín S - Heparín kofaktor II, alfa 2 makroglobulín, alfa 1 antitrypsín, alfa 2 antiplazmín Krvná zrazenina po splnení svojej úlohy – odstránená, aby sa upravil prietok krvi a obnovila neporušiteľnosť cievnej steny (plazmín)
Koagulačné teórie • Klasická zrážacia teória (1904) • Kaskádovitá teória zrážania podľa Mc Farlana (1964) - Séria proteolytických reakcií - Plazmatické hemokoagulačné faktory – neaktívne prekurzory - Po aktivácii – zmena na aktívne enzýmy (kaskádovitá aktivácia všetkých faktorov až po aktiváciu protrombínu na trombín a premenu fibrinogénu na fibrín)
Vnútorná a vonkajšia cesta aktivácie • Vnútorná cesta • Prvým podnetom je kontakt faktora XII. s aktivujúcimi povrchmi (obnažený subendotel, kolagén, povrch aktivovaných Tr, sklo)
• Vonkajšia cesta • Začína sa uvoľnením tkanivového faktora a plazmatického faktora XII. Vonkajšou a vnútornou cestou sa aktivuje faktor X. a tu začína spoločná cesta aktivácie protrombínu
Hemokoagulačné faktory vnútornej cesty
Faktory II, V, VIII, IX, X, XI a XII Najčastejšie vykonávané screeningové testy na vyhodnotenie vnútornej cesty hemokoagulácie sú testy Activated Partial Thromboplastin Time (aPTT)
Hemokoagulačné faktory vonkajšej cesty Faktory II, V, VII a X
Najčastejšie vykonávané screeningové testy na vyhodnotenie vonkajšej cesty hemokoagulácie sú testy Prothrombin Time (PT or INR)
Preanalytická fáza & Analýza
Správny postup pri odbere krvi Miesto odberu Antikoagulant Technika odberu Turniket Tok krvi Miešanie
Periferálna véna Na citrate 0.105-109M, 0.129M, Ratio 1:9 Uzavretý odberový vákuový systém Nie dlhšie ako 60”, zvýšenie koag.fakt. Bez prekážok, správna pozícia ihly v žile Ihneď po odbere
Typ materiálu na koagulačné testy a dĺžka skladovania • Plná citrátová krv (veľmi zriedkavo)
• Citrátová plazma • Citrated PLATELET-RICH plasma (PRP) – plazma bohatá na Tr • Centrifugácia, 5’, 100g (∼ 800 rpm): plat. aggregation tests
• Citrated PLATELET-POOR plasma (PPP) – plazma chudobná na Tr • Centrifugácia, 10’, 1500-2000g (∼ 3000 rpm): všetky rutinné koag. testy
• Citrated PLATELET-FREE plasma (PFP) – plazma bez Tr • Centrif. 30’, 2500 g: mrazená plazma ( poolovaná kontrolná plazma) • Centrifugácia do 1 až 2h po odbere (horný limit 4h) pri 20°C skúmavky uzavreté až do doby analýzy • Testy vykonané ihneď po centrifugácii, ak je možné v analyzátore z primárnej skúmavky • Testy vykonávané neskôr - aliquotovať a zamraziť
BD Produkty
Skúmavky na odber vzorky Sódium citrátové skúmavky s modrým vrchnákom Aditívum 0.105, 0.109 alebo 0.129 mol/L tri-sodium citrate. Odstránenie kalcia z krvi a zabránenie jeho schopnosti naštartovať koagulačný proces Pomer krvi a aditíva – 9 : 1 Správne pre-analytické zaobchádzanie a dodržiavanie podmienok centrifugácie sú kritické Poznámka: warfarin a heparin sú dôležité liečivá. Obe majú veľmi úzky terapeutický index – presnosť výsledkov testov je životne dôležitá
“Horúce miesta“ pre-analytiky
Odberové techniky
‘Obtiažny odber’ (kontaminácia vzorky tkanivovým tromboplastínom – aktivácia koagulačného systému) Nesprávne poradie odoberaných vzoriek (kontaminácia aktivátorom zrážania alebo iným antikoagulantom) Nevhodné miesto odberu (nedokonale prepláchnutý katéter – kontaminácia heparínom) ‘Dead Space’ prvá skúmavka odoberaná krídlovou ihlou s hadičkou (nesprávny pomer krv:aditívum) Neprimerane rázne miešanie (možná aktivácia Tr) Použitie veľmi tenkej ihly (CLSI doporučuje ihlu nie menšiu ako 23G)
“Horúce miesta“ pre-analytiky Odber pomocou ihly a striekačky
Oneskorený prenos vzorky do skúmavky (CLSI doporučuje maximum do 1 minúty) Porušenie buniek počas prenosu vzorky do skúmavky Vzorky s viditeľnou hemolýzou sú na analýzu nevhodné. Prítomnosť hemolýzy takmer vždy indikuje aktiváciu Tr a v niektorých prípadoch aj trombolýzu
Transport vzorky - odporúčania Vzorky na hemokoagulačné vyšetrenia by mali byť transportované pri teplote nie vyššej ako 24oC* (v lab. kde sa testovanie oneskoruje, transportuje sa v chlade) PT/INR testy môžu byť vykonané do 24 hrs po odbere* (centrifugované alebo necentrifugované vzorky) aPTT testy vo vzorkách od non-heparinizovaných pacientov by mali byť vykonané do 4 hrs po odbere (centrifugované alebo necentrifugované vzorky) aPTT testy vo vzorkách obsahujúcich nefrakcionovaný heparín by sa mali scentrifugovať do 1 hod po odbere (pre schopnosť PF4 sprostredkovať neutralizáciu heparínu). Plazma by mala byť testovaná do 4 hrs od odberu Vzorky na vyšetrenie ostatných koagulačných testov (špecifické faktory) by mali byť centrifugované a testované do 4 hrs od doby odberu * Skladovanie vzoriek na vyšetrenie INR pri 2oC až 4oCmôže spôsobiť chladovú aktiváciu faktoru VII a tým ovplyvniť presnosť INR testov Vyššie zmienené podmienky transportu a skladovania sú v súlade so súčasnými CLSI odporúčaniami1 1 CLSI Document H21–A5E, 2008
Pre-analytické faktory ovplyvňujúce kvalitu koagulačných testov – bežné presvedčenie Dva kľúčové faktory:
Koncentrácia citrátu
Pomer vzorky ku aditívu
Pre-analytické faktory ovplyvňujúce kvalitu koagulačných testov – BD štúdie Aktivácia Tr spôsobená kontaktom s povrchom v odberovej skúmavke je kľúčovým faktorom prehliadaným v minulosti Parametre: Skúmavkový „Headspace“ Typ skúmavky (sklo alebo plast)
Preanalytické faktory ovplyvňujúce koagulačné testy Nedoplnené/ Preplnené skúmavky
Nedostatočné miešanie
Tourniqet > 1 min
Poradie odberu vzoriek
Chybné výsledky koagulačných vyšetrení
Zvýšený „Headspace“ v čiastočne naplňovaných skúmavkách
Čo je to „čiastočne naplňovaná skúmavka“ ?
Ktoré tesy sú ovplyvnené? Ovplyvnené: aPTT testy u pacientov na terapii nefrakcionovaným heparínom Počet Tr v citrátových vzorkách (EDTA indukovaná pseudothrombocytopaenia)
Neovplyvnené: aPTT testy u normálnych pacientov alebo tých, ktorí nedostávajú UFH terapiu PT (INR) testy – u všetkých pacientov
Problém čiastočne naplňovaných skúmaviek Čiastočne nap.citr. skúmavky
Skúmavkový „Head Space“ Aktivácia trombocytov
Agregácia trombocytov
Na základe mnohých klinických štúdií BD zistila, že voľný priestor „head space“ v čiastočne napĺňaných citrátových skúmavkách spôsobuje aktiváciu trombocytov, čo môže byť príčinou ďalších problémov Falošne znížený počet Tr
Nesprávna diagnóza Trombocytopénie
Uvoľnenie PF4 Neutralizovan ý heparín
Falošne skrátený aPTT
Nesprávne nasadená th heparínom
Riešenie????
Head space the same as 4.5 mL Tube
1.8 mL
2.7 mL
BD VacutainerTM Plus Citrate Tube
Detailný pohľad na skúmavku
. Všeobecný rozmer skúmavky: 13 x 75 mm Vonkajšia stena je z Polyethylene terephthalate (PET) • Udržiava vákuum • Zodpovedajúci rozmer
Vnútorná stena je z Polypropylene (PP) • Znížená aktivácia Tr • Lepšie udržanie tekutého aditíva ako v PET
Dostupné produkty
1.8 ml 0.109 / 0.129 M Citrate 2.7 ml 0.109 / 0.129 M Citrate
BD Vacutainer ® Plus Citrate Tube
Dostupné produkty
•Všetky katalógové čísla majú minimálnu risku plnenia vyznačenú zvnútra vonkajšej PET skúmavky
Minimálna riska plnenia
•Riska plnenia reprezentuje minimálny objem krvi potrebný na analýzu vzorky
Minimum Fill line
Děkuji!
šťastná zkumavka = šťastný pacient
