Použití probiotických bakterií při výrobě kvasu

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství a mikrobiologie a výživy rostlin

Použití probiotických bakterií při výrobě kvasu Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Bc. Jitka Švancarová

Brno 2010

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Použití probiotických bakterií při výrobě kvasu“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne 30.4. 2010 podpis diplomanta ……………………….

Dovoluji si poděkovat všem, kteří přispěli svými radami, ochotou a časem k vypracování této diplomové práce, zejména Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D., Jagodě Šušković, Ph.D., DrSC. Blažence Kos, izv. Prof., DrSC. Jasně Beganović, doc., Andreji Leboš Pavunc, dipl. Ing. a Kseniji Habjanič, dipl. Ing. Dále bych chtěla poděkovat vedení Fakulty technologie potravin a biotechnologie univerzity v Záhřebu za umožnění pobytu v Chorvatsku, kde jsem spolupracovala na projektu Using probiotic bacteria in sourdough. V neposlední řadě děkuji celé mé rodině za psychickou a finanční podporu.

Annotation The aim of diploma thesis was to summarize knowledge about production and using of fermented flour as a sourdough. Because cereals compose considerable part of the human food, this diploma thesis is focused on quality improving. It deals with probiotic strains and its effect on human health. In practical part thesis, there is devoted to multi-strain probiotic strains what could be used for sourdough production in future. Particular commercial samples, which are used in bakeries, are compared too. Different parameters of commercial sourdough can be seen from the results. During the experiments, it was resulted that by using probiotic strains we reach the same acidification. Moreover very strong antimicrobial activity against bakery pathogens was registered. Key words: sourdough, probiotic strains, microorganisms, cereals. Abstrakt Cílem diplomové práce bylo shrnutí poznatků o výrobě a využití fermentované mouky v podobě kvasu. Protože cereálie tvoří značnou část lidské potravy, diplomová práce se zaměřuje na zlepšení jejich kvality. Pojednává zejména o probiotických kmenech a jejich účincích na zdraví člověka. Praktická část je věnována multikulturní směsi probiotických kmenů, které by mohly být v budoucnosti používány pro produkci kvasu. Kvas s těmito kmeny je porovnáván s komerčními vzorky, které pekárny používají. Z výsledků je vidět, že každý komerční kvas vykazuje rozdílné parametry. Během měření bylo zjištěno, že používáním probiotických kmenů se dosáhne stejné kvality okyselení jako při použití komerčních vzorků. Přitom je navíc dosaženo vyšší hygienické kvality, protože byla zaznamenána jejich velice silná antimikrobiální aktivita proti patogenům v mouce. Klíčová slova: kvas, probiotické kmeny, mikroorganismy, cereálie.

Obsah 1 2 3

ÚVOD..........................................................................................................................8 CÍLE PRÁCE..............................................................................................................9 LITERÁRNÍ PŘEHLED...........................................................................................10 3.1 Probiotika.............................................................................................................10 3.1.2 Mikroorganismy s probiotickými vlastnostmi.............................................14 3.1.2.1 Lactobacillus.........................................................................................15 3.1.2.2 Grampozitivní koky..............................................................................16 3.1.2.3 Bifidobakterium ssp..............................................................................18 3.1.2.4 Kvasinky...............................................................................................18 3.2 Prebiotika........................................................................................................21 3.3 Symbiotika......................................................................................................22 3.4 Cereálie jako substrát probiotik............................................................................23 3.5 Enkapsulace probiotik za použití cereálií............................................................22 3.6 Kvas.....................................................................................................................26 3.6.1 Historie kvasu................................................................................................28 3.6.2 Ekologie kvasu..............................................................................................29 3.6.3 Výroba kvasu................................................................................................33 3.6.3.1 Typ I.....................................................................................................35 3.6.3.2 Typ II....................................................................................................36 3.6.3.3 Typ III...................................................................................................37 4 MATERIÁLY A METODA ZPRACOVÁNÍ...........................................................38 4.1 Charakteristika materiálu......................................................................................38 4.1.1 Použité mikroorganismy...............................................................................38 4.1.2 Živná média..................................................................................................38 4.1.3 Použité chemikálie.......................................................................................40 4.1.4 API................................................................................................................41 4.1.5 Použité nástroje a přístroje...........................................................................41 4.2 Použité metody......................................................................................................41 4.2.1 Uchovávání mikroorganismů.......................................................................41 4.2.2 Kultivace mikroorganismů...........................................................................42 4.2.3 API...............................................................................................................42 4.2.3.1 API 50 CHL..........................................................................................42 4.2.3.2 API 20 STREP......................................................................................42 4.2.4. SDS - PAGE buněčných proteinů................................................................43 4.2.5 Izolace DNA.................................................................................................44 4.2.6. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).........................................44 4.2.7 Příprava supernatantní kultury pro určení antimikrobiální aktivity.............45 4.2.8 Určení antimikrobiální aktivity turbidimetrickou metodou.........................45 4.2.9 Stanovení vyprodukované mléčné kyseliny v těstě.....................................45 4.2.10 Určení koncentrace těkavých kyselin..........................................................46 4.2.11 Určení počtu živých mikroorganismů přítomných v těstě nepřímou metodou..................................................................................................................46 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE...........................................................................47 5.1 Identifikace kmenů bakterií mléčného kvašení....................................................47 5.2 Testování antimikrobiální aktivity.......................................................................51

6

5.3 Fermentace pšeničné mouky.................................................................................54 5.3.1 Předběžný pokus...........................................................................................54 5.3.2 Fermentace pšeničné mouky směsnou kulturou bakterií mléčného kvašení 55 5.3.3 Fermentace směsi hladké pšeničné a žitné mouky se směsnou kulturou bakterií mléčného kvašení ve třech fázích.............................................................57 5.3.4 Fermentace těsta ve třech fázích použitím komerčního vzorku suchého kvasu......................................................................................................................58 5.3.4.1 Fermentace žitného těsta s Böcker Reinzucht – Sauerteig für mehr Brot - Aroma (vzorek B1).........................................................................................60 5.3.4.2 Fermentace bílé pšeničné mouky s Böcker Reinzucht – Sauerteig Weitzen für weitzentypisches aroma (vzorek B2).............................................61 5.3.4.3 Fermentace bílé pšeničné mouky Böcker Le Chef Ernst Böcker Gmbh a Co DE 32427 Minden (vzorek B3).................................................................62 6 ZÁVĚR..................................................................................................................63 7 POUŽITÁ LITERATURA....................................................................................66

7

1

ÚVOD

Ve vyspělých zemích se čím dál více objevují civilizační choroby, které jsou způsobeny

stresem,

vysokým

pracovním

vypětím,

nedostatkem

pohybu

a

pravděpodobně nejvíce špatným stravováním. Soubor těchto faktorů pak většinou vyúsťuje v problémy se zažíváním, zácpou, průjmy, obezitou a mnohými dalšími neduhy, jež provázejí populaci s „vysokou životní úrovní“. Řešením zdravotních komplikací u jednotlivců většinou bývá změna životního stylu, avšak ne vždy se podaří skloubit zásady zdravého životního rytmu s vysokým pracovním tempem. Částečně se dá předcházet mnohým onemocněním jiným stravováním majícím pozitivní vliv na zdraví organismu. Taková strava zahrnuje konzumaci funkčních potravin, mezi které se řadí probiotika, prebiotika a symbiotika. Nejčastějším potravinářským výrobkem s probiotickým účinkem jsou mléčné výrobky.

Produkce nemléčných potravin s probiotickým účinkem je pro současný

potravinářský průmysl výzvou. Všeobecnou snahou je výroba vysoce kvalitních potravin s maximálním využitím čistě přírodních surovin. V tomto ohledu se do stravy nebo sladkostí přidávají různé kmeny mikroorganismů. V posledních letech jsou zkoumány obiloviny a výrobky z nich jako potenciální funkční potravina. Z celosvětové produkce tvoří cereálie 73 % a pokrývají tak z více než 60 % spotřebu vlákniny, bílkovin, vitamínů, energie a minerálů potřebných pro lidský organismus. Za doložení počátku zájmu o obiloviny (cereálie) ve vztahu ke zdraví lze považovat Hippokratovo doporučení z 5. století před Kristem “jíst celozrnný chléb pro jeho příznivý vliv na činnost střev“. Aplikace cereálií nebo jejich částí jako funkčních potravin lze shrnout do následujících možností: -

substráty pro kvašení a růst probiotických mikroorganismů, zejména Lactobacillus a Bifidobacterium,

-

vláknina, která má mnoho blahodárných účinků na lidský organismus a je nezbytnou částí stravy,

-

prebiotika obsahující nestravitelné sacharidy,

-

enkapsulační materiál zajišťující lepší stabilitu probiotik.

8

2

CÍLE PRÁCE Cílem této práce je shrnout poznatky o probiotických bakteriích, jejich vlivu na

lidské zdraví a o substrátu který je vyžadován pro jejich optimální růst a přežití. Dále se zaměruje na mikrobiologickou a technologickou charakterizaci kvasu používaného pro výrobu chleba. Praktická část se věnuje fenotypovému a genotypovému potvrzení používaných bakterií pro fermentaci mouky pomocí metod API, SDS - PAGE a izolace DNA. Dílčím experimentem bylo optimalizovat parametry pro produkci kvasu pomocí probiotických bakterií, k nimž řadí množství přidaného inokula a vody. Dále byla zjišťována schopnost probiotických bakterií inhibovat některé druhy bakterií, které mohou být potenciálními patogeny. Multikulturní směs startovacích kultur obsahující vybrané kmeny bakterií mléčného kvašení, charakterizovaná jako probiotika na Fakultě technologie potravin University v Záhřebu, byla vyhodnocená jako vhodná startovací směs pro výrobu kvasu. Hlavním experimentem bylo srovnání použitých startovacích kultur k výrobě fermentovaného těsta.

9

probiotických a komerčních

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1

Probiotika Slovo probiotika je řeckého původu „pro bios“, v překladu znamená „pro život“.

Definice probiotik není jednoznačná, nejpřesnější verzi použil Havenaar a Huis in’t Veld v roce 1992, kteří uvádí probiotika jako živé mikroorganismy mající příznivý účinek na lidskou i zvířecí střevní mikroflóru. Tento účinek je však podmíněn dostatečným množstvím živých bakterií. Prvními potravinami s probiotickými účinky byly v Evropě kysané mléčné výrobky. Dnes se ale nabídka potravin s příznivými vlastnostmi rozšířila i mezi ostatní mléčné a masné výrobky, nápoje a jiné kvašené výrobky, např. šťávu z kysaného zelí. Z tohoto pohledu se záměrně přidávají do mléčných výrobků druhy Bifidobacterium a Lactobacillus. Lidské zdraví výrazně ovlivňuje střevní mikroflóra, která je jedním z faktorů zajišťujících správné trávení potravy. V dnešní době je znám princip, jak probiotika pozitivně ovlivňují rovnováhu mikroorganismů v trávícím traktu, proto se potravinářský průmysl snaží vyvinout nové funkční potraviny s probiotickým účinkem. Charalampopoulos (2002) uvádí, že cereálie jsou potravinou, u které je také možné dosáhnout probiotických účinků. Šušković (2001) tvrdí, že mikroflóru ve střevě můžeme rozdělit do 3 skupin. Do první řadíme bakterie zdraví prospěšné, skládající se z bifidobakterií, laktobacilů a dalších druhů bakterií mléčného kvašení. Druhá skupina je považována za neprospěšnou. Patří sem Enterobacteriaceae a různé druhy rodu Clostridium. Poslední skupina zahrnuje všechny ostatní bakterie, které působí neutrálně. Podle Kovaříkové a Erbena (2007) je velice důležité, aby se vytvořila rovnováha mezi

enteropatogenními

bakteriemi,

neutrálně

působícími

a

probiotickými

mikroorganismy. Účinnost probiotik závisí na jejich odolnosti vůči prostředí trávícího traktu, schopnosti přežít a množit se. Vlivy způsobující narušení bilance ve střevě můžeme vidět v Tabulce 1.

10

Tab. 1 Faktory způsobující narušení rovnováhy mikroorganismů ve střevě (Šušković, 2001) Exogení faktory Užívání antibiotik Přehnaná hygiena Stres Stárnutí Cestování Poruchy peristaltiky Onemocnění jater nebo ledvin Radiační záření Chemoterapie Percinózní anémie Poruchy imunitního systému

Endogení faktory Dostupnost živin Diety Hodnota pH ve střevě Redoxní potenciál Průjem Antagonismus baktérií Synergismus baktérií Vrstva mucinu Lysozym Obrana

Nejdůležitější vlastností pro přežití probiotických mikroorganismů je odolnost vůči žlučovým kyselinám a snášení teplot do 40 °C. Bylo definováno 20 kritérií, které charakterizují kmeny s probiotickým vlastnostmi, nejvýznamnější jsou tyto: -

musí být zdravotně nezávadné (humánní původ),

-

nesmí být patogenní,

-

musí mít antagonistický vliv na patogenní střevní mikroflóru,

-

musí být dostatečně rezistentní, aby dokázaly přežít technologický zákrok, ani nesmí nijak negativně ovlivňovat organoleptické vlastnosti potraviny,

-

nízké pH ani žlučové kyseliny je nepoškozují,

-

zůstávají živé po celou dobu trvanlivosti potraviny,

-

jsou schopny dalšího růstu a přichytávají se na epitelární buňky střev,

-

prokazují pozitivní vliv na zdraví.

Všechny známé bakterie s probiotickým účinkem patří do skupiny bakterií mléčného kvašení, která zahrnuje druhy Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc,

Pediococcus, Enterococcus

a Bifidobacterium. Z vyjmenovaných

mikroorganismů jsou jako probiotika, která lze přidávat do potravin, komerčně dostupné pouze některé kmeny rodů Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus, lze však využívat i další druhy, např. Lactococcus, Pediococcus aj.

11

3.1.1

Pozitivní vliv probiotik na lidský organismus

Jak uvádí Šušković (2001), už v 19. století byl objeven význam střevní mikroflóry pro organismus, jako ochranného faktoru proti případným patogenním mikroorganismům Mečnikovem během jeho výzkumu cholery. O mnoho desetiletí později byl tento poznatek zásadně rozvinut. Byl proveden pokus na zvířatech, kterým byla podávána pouze antibiotika. Ukázalo se, že myši byly daleko více náchylné k infekcím způsobeným Salmonella typhimurium, Shigella flexneri a Vibrio cholerae. Potlačení nežádoucích bakterií je způsobeno produkcí antibakteriálních substancí, které se skládají z primárních metabolitů, jako je kyselina mléčná, oxid uhličitý, acetaldehyd, peroxid a bakteriociny, které úspěšně inhibují růst patogenů. Lactococcus lactis produkuje nisin, Pediococcus pentosaceus tvoří pediocin a Lactobacillus helveticus vytváří lactin. Ouwehand a Elaine (2006) předpokládají, že probiotické bakterie mají blahodárný vliv na permeabilitu bariéry střevního traktu, která je při střevních onemocněních snížena. Probiotika ji dokáží podpořit a zlepšit její funkčnost i v průběhu nemoci. Není přesně objasněno, jak probiotika ovlivňují střevní trakt během oslabení nemocí, ale předpokládá se, že působí i na imunitní systém. Svačina a kol (2008) uvádí, že bifidobakterie produkují imunologické látky, které mají antibiotický a antimodulační účinek bránící růstu nežádoucí mikroflóry (Escherchia coli, Proteus, Staphyllocccus aureus, Salmonella typhosa), jež se může podílet na vzniku toxických produktů fermentace, jako jsou amoniak, aminy, nitrosaminy, fenoly, indoly a další. Reakčními produkty nestrávených polysacharidů, které jsou fermentovány probiotickými mikroorganismy se stávají mastné kyseliny, které jsou zdrojem energie pro buňky střevního epitelu, jež se snadněji prokrvuje. Dále vznikají některé aminokyseliny, polyaminy, růstové faktory, vitamíny a antibiotika. Tyto substance kryjí významnou část potřeb střevní sliznice, která se není schopná vyživovat pouze z krve, a podílejí se na řadě metabolických procesů (Lipská a Visokai, 2009). Šušković (2001) tvrdí, že antimutagenní aktivita probiotik je způsobena denaturací

β-glukuronidasy,

β-glukosidasy,

12

nitroreduktasy,

azoreduktasy,

a

steroid-7-α-dehydroxylasy. Tyto enzymy jsou známé pro podporu vzniku karcinogenů. Laktobacily

umějí

také

degradovat

nitrosaminy,

jež

jsou

potravinovými

prekarcinogeny. Laktosová intolerance nedovoluje značné části populace konzumaci potravin obsahující laktosu. Probiotické bakterie proměňují laktósu v kyselinu mléčnou, která zdravotní potíže nepůsobí. Potraviny obsahující probiotické bakterie mají také schopnost snižovat koncentraci cholesterolu v krvi, protože zabraňují navazování na žlučové kyseliny, a odchází tak z těla ven. Lipská a Visokai (2009) tvrdí, že v poslední době se o střevní mikroflóře uvažuje jako o cílové preventivní struktuře odpovídající na složení potravy. Objem metabolitických procesů je tu srovnatelný s játry. Hvízdalová (2009) uvádí, že probiotika byla testována z pohledu vlivu na fyziologické vlastnosti organismu laboratorních zvířat, u nichž se vyskytují chronická bakteriální a virová onemocnění. V průběhu experimentu byl odhalen synergický terapeutický účinek probiotik Bacillus subtilis, Lactobacillus lactis působící na symptomy nemocí. Zároveň bylo zaznamenáno snížení množství stafylokoků v krvi a na kůži pokusných zvířat. Bylo zjištěno, že snížení výskytu nebo úbytek počtu charakteristických znaků patogenních procesů je u sledovaných zvířat patrné díky použití probiotik v potravinách a pro lékařské účely. Probiotika také potlačila růst bakterie Staphylococcus aureus v organismu laboratorních zvířat a na jejich kožním porostu. Na Obrázku 1 můžeme vidět vlivy probiotik na lidský organismus, jako je aktivace imunitního systému, podpora mucinózní bariéry, syntéza vitamínů, působení na metabolismus žlučových kyselin, produkce mastných kyselin s krátkým řetězcem a snižování pH v tlustém střevě.

13

Obr 1. Působení probiotik v těle

3.1.2

Mikroorganismy s probiotickými vlastnostmi Probiotické mikroorganismy patří mezi bakterie mléčného kvašení, které tvoří

velkou přirozenou skupinu nesporulujících, nepohyblivých grampozitivních koků a tyčinek fermentujících sacharidy za fakultativně anaerobních podmínek a tvořících kyselinu mléčnou. Bakterie mléčného kvašení se vyskytují ve fermentovaných potravinách jako jsou mléčné a masné výrobky, v zelenině, rostlinách a v tlustém střevě zvířat a lidí. Bakterie mléčného kvašení prodlužují dobu údržnosti potravin díky inhibici nežádoucí mikroflóry, a to snižováním pH, redoxního potenciálu a produkcí látek antimikrobiální povahy. Mají také podíl na vzniku organoleptických látek dodávajících potravině aroma. Dle Šušković (2001) má probiotický účinek

také rod Bifidobacterium.

Probiotické mikroorganismy byly přidávány po mnoho let do potravy, aniž by byl zaznamenán jakýkoliv jejich nepříznivý efekt na gastrointestinární soustavu lidí a zvířat.

14

3.1.2.1

Lactobacillus Elmeleigy a Carlstorm (2003) tvrdí, že bakterie rodu Lactobacillus jsou tyčinky,

které se většinou spojují v dlouhé řetízky. Některé mohou způsobovat kažení potravin, naopak jiné jsou nezbytnou součásti mléčného průmyslu. Burdychová (2007) uvádí, že jsou fakultativně anaerobní. Nepohybují se a vyskytují se i ve dvojicích. Jejich metabolismus je fermentativní. Pro svůj růst vyžadují velké množsví růstových látek (aminokyseliny, vitamíny, nukleotidy, mastné kyseliny atd.) Zdroj uhlíku i energie jim poskytují sacharidy. Můžeme je nalézt v mléce, mléčných výrobcích, na povrchu rostlin, zelenině, ovocných šťávách atd. Podle Goktepe (2005) je

Lactobacillus nejznámějším probiotickým rodem,

hlavně kvůli své přítomnosti v mléčných produktech. Ačkoliv jsou anaerobní a získávají svoji energii fermentací, mohou

žít v přítomnosti kyslíku díky své peroxidasové

aktivitě. Konečným produktem fermentace sacharidů je kyselina mléčná, která se tvoří přes pyruvát. Charakteristickým znakem pro tento rod je schopnost přežít při nízkém pH. Možnost růstu v kyselém prostředí dává laktobacilům konkurenceschopnost v prostředí bohatém na živiny. Jen velice zřídka jsou patogenní. Lactobacillus acidophillus se nachází v trávícím ústrojí savců. Příznivě působí na tamní mikroflóru. Používá se při výrobě acidofilního mléka a dalších mlékárenských a farmaceutických produktů. Presumptivní kmeny Lactobacillus acidophillus vytvářejí na tuhé selektivní půdě charakteristické kolonie (Obr. 2).

Obr. 2 Kolonie Lactobacillus acidophyllus

15

Dle Goktepe (2006) je Lactobacillus rhamnosus nejstudovanějším probiotickým lactobacilem. Je stabilní vůči žlučovým kyselinám a nízkému pH. Bylo dokázáno, že Lactobacillus rhamnosus přežije 4 hodiny při pH 3 v žaludeční šťávě. In vitro bylo možné pozorovat, jak je schopen přilnout k epitelovým buňkám. Vykazuje antibakteriální aktivitu pro široké spektrum mikroorganismů. Ačkoliv bylo in vitro dokázáno, že působí jako antagonista vůči Salmonella typhimurium u myší, nebylo možné tento poznatek převést do experimentu in vivo. Z výzkumů vlivu probiotik na vznik zubního kazu vyplývá, že Lactobacillus rhamnosus má podíl na snížení množství bakterie Streptococcus mutans. Další významnou bakterií mléčného kvašení je Lactobacillus reuterii, který je v přírodě velice rozšířený. Může být izolován z různých potravin a gastrointestinálního traktu

zvířat.

Produkuje

3-hydroxypropionalaldehyd,

jež

vykazuje

relativně

širokospektrální protimikrobiání aktivitu. Rennenberg (2008) tvrdí, že druh Lactobacillus sanfranciscensis byl nalezen pouze v kvasu. Nadto se vyskytuje v kváscích po celém světě. Je používán na výrobu tzv. vestfálského perníku (severozápad Německa), italského panettone a samozřejmě kvasového chleba ze San Francisca. De Vuys a Neysens (2004) uvádí, že Lactobacillus sanfranciscencis se původně jmenoval Lactobacillus sanfrancisco nebo Lactobacillus brevis ssp lindneri. Poprvé byl nalezen ve francouzském chlebu ze San Francisca jako faktor odpovědný za produkci kyselin. Patří mezi obligátně heterofermentativní bakterie mléčného kvašení, které mohou produkovat vysoké dávky kyseliny mléčné a octové z maltosy. Z tohoto důvodu napomáhá v kvasových chlebech kynutí tím, že produkuje plyn a okyseluje těsto.

3.1.2.2

Grampozitivní koky Charalampopulos (2009) tvrdí, že rody Lactococcus a Streptococcus pocházejí

z čeledi Streptococcaceae. Rod Streptococcus zahrnuje asi 67 druhů grampozitivních koků známých pro svou převážnou patogenitu. Oproti tomu, druhy Streptococcus termophilus jsou známé GRAS („generally reconized as a safe status“, v překladu „obecně považovány jako bezpečné“), díky své dlouhé historii jejich používání v potravinářském průmyslu. Je to možné jen proto, že Streptococcus termophilus má ztracený nebo inaktivovaný gen virulence, který charakterizuje patogení streptokoky.

16

Streptokoky jsou nesporulující koky o velikosti cca 2 µm. Mohou být oválné až vejčité, vyskytují se po dvojicích nebo v řetízcích. Optimální teplota jejich růstu je cca 37 °C. Dokáží fermentovat laktosu na kyselinu mléčnou. V alkalickém prostředí mohou produkovat z glukosy ethanol, kyselinu octovou a mravenčí. Jak vyplývá z názvu, Streptococcus thermophilus preferuje růst při vyšší teplotě. Optimum je 50 °C, dokáže ale přežít i záhřev na 60 °C po dobu 30 minut. Jeho základním požadavkem na výživu je především dostatek aminokyselin, proto může jako médium využít mléko (Charalampopoulos, 2009). Symbióza v jogurtové kultuře se odehrává tím způsobem, že Streptococcus thermophilus produkuje kyselinu mravenčí a oxid uhličitý. Dochází tak ke stimulaci růstu Lactobacillus bulgaricus. Ten produkuje aminokyseliny, které stimulují růst Streptococcus thermophilus. Velmi kritický je obsah kyslíku (více jak 4 mg/kg), který proces zpomaluje (Šustová, 2008). Goktepe (2006) poukazuje na to, že pomocí molekulárních metod byly monitorovány bakterie mléčného kvašení v dozrávajících sýrech. Ukázalo se, že dominantní mikroflóru zde tvoří Lactobacillus a Streptococcus thermophilus. Další studie byly zaměřeny na způsoby snižování cholesterolu v krvi. U pacientů s hypercholesterolemií se užíváním kysaného mléka obsahujícího Enterococcus faecium a Streptococcus thermophilus snížil LDL – cholesterolu. Z rodu Streptococcus se vyštěpil podobný rod Lactococcus. Jeho ovoidní buňky jsou fakultativně anaerobní o velikosti 0,5 – 1,2 µm, optimální teplota se pohybuje kolem 30 °C. Metabolismus vykazuje homofermentativní aktivitu. Je důležitou součástí čistých mlékařských kultur při výrobě smetany, másla, kyselého mléka, tvarohů a sýrů. Charalampopoulos (2009) uvádí, že rod Lactococcus tvoří mezofilní skupina streptokoků skládající se ze 6 hlavních druhů. Nejdůležitější z nich je druh Lactococcus lactis pro svou fermentační schopnost. Dělí se do tří subspecies – Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae a Lactococcus lactis ssp. lactis, který zahrnuje biovar diacetylactis. Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diaceylactis je významný pro tvorbu diacetylu. Sloučenina poskytuje aroma kysaným mléčným výrobkům. Za přítomnosti

17

fruktosy vytváří hlavně oxid uhličitý a kyselinu octovou. Štěpí kyselinu citrónovou, kdy se ve značné míře tvoří acetoin a z něj se oxidací vzdušným kyslíkem tvoří diacetyl.

3.1.2.3

Bifidobakterium ssp. Dle Burdychové (2007) jsou bakterie rodu Bifidobacterium tyčinkovitého tvaru

o různé délce. Jsou grampozitivní

a striktně anaerobní. Nacházejí se ve velké

koncentraci ve stolici kojenců krmených mateřským mlékem. Růst bifidobakterií podporují prebiotika (laktulosa, inulin, algináty atd.) Jsou obsaženy v řadě kysaných mléčných výrobků a výživových doplňcích. Řada z nich má probiotické schopnosti. Optimální teplota růstu je mezi 37 – 41 °C při pH 6,5 – 7. V přítomnosti oxidu uhličitého dokáží kyslík tolerovat. Mezi bakterie s probiotickým účinkem řadíme Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longhum, která je známa pro svou přítomnost v kyselém mléce, Bifidobacterium bifidum a další. Dle Tamime (2005) Bifidobacterium ssp. patří k jednomu z mála druhů mikroorganismů, které mají schopnost produkovat vitamín B12 (kobalamin). Je důležitým kofaktorem metabolismu aminokyselin, cukrů, mastných kyselin a nukleových kyselin. Bifidobakterie také tvoří vitamin K, známý pro svou postranslační karboxylaci glutamátu. Bifidobacterium

bifidum

je

nejlépe

rozpoznatelnou

bakterií

rodu

Bifidobacterium, protože se od ostatních fylogeneticky odlišuje. Buňky mají pelikulární tvar a často se objevují v rozvětvených řetízcích. Nejčastější bifidobakterií je Bifidobacterium longum, jehož kolonie se zřídka kdy větví. Jsou velice podobné bakterii Bifidobacterium breve (Charalampopoulos, 2009).

3.1.2.4

Kvasinky Jsou eukaryotické, heterotrofní a většinou jednobuněčné organismy, jež se

rozmnožují pučením nebo dělením. Mohou vytvářet podlouhlé buňky, které pučí pouze na pólech a zůstávají tak spojeny v dlouhá vlákna, která se nazývají pseudomycelium. V určitých místech se mohou tvořit blastospory, svazky kratších elipsoidních buněk. U jiných druhů se může tvořit pravé mycelium, jež vzniká příčným dělením protáhlých buněk. I zde vznikají blastospory. Tvorba mycelia je charakteristickým znakem organismů majících silný aerobní metabolismus.

18

Hlavním průmyslovým významem kvasinek je výroba alkoholických nápojů a pekařského droždí. Dokáží zkvašovat glukosu a přitom produkovat ethanol a oxid uhličitý. Sacharomyces boulardii je nepatogenní kvasinkou s optimem růstu 37 °C. Je rezistentní proti žaludečním kyselinám. Za poslední dvě desetiletí bylo proti průjmům vyzkoušeno mnoho probiotických bakterií, ale ač mnoho z nich fungovalo pro velkou část populace, žádná nevykazovala účinnost na všechny pacienty. V osmdesátých letech byla světu představena Sacharomyces boulardii, která se používá jako kvasinka předcházející průjmům pro pacienty užívající antibiotika. Sacharomyces boulardii má mnoho výhod proto, aby se stala ideálním probiotikem. Ačkoliv se tyto kvasinky přirozeně vyskytují na povrchu ovoce lychee, dokáží dobře růst i při teplotě prostředí trávícího traktu člověka. Přestože dobře přežívá cestu zažívacím ustrojím, organismus ji eliminuje, jakmile se přestane orálně podávat (Karpa, 2003). Tato kvasinka byla podávána dětem společně s antibiotiky. Děti měly očividně menší problémy s průjmy. Výsledky ukázaly, že je třeba se soustředit na nejslibnější kmeny (Lactobacillus rhamnosus, Bacillus coagulans a Sacharomyces boulardii) v dávkách 5 – 40 KTJ denně. Ač nejpoužívanějšími probiotiky jsou Lactobacillus a Bifidobacteria, druhy Sacharomyces boulardii (Sacharomyces cerevisie) se užívají také. Jelikož patří mezi eukaryotní mikroorganismy, jsou přirozeně rezistentní proti všem antibiotikům (Charalampopoulus, 2009). V případě jednoho pacienta, který šestkrát zkolaboval během osmi měsíců díky průjmům způsobeným Clostridium difficile, mu po tři měsíce byl podáván vancomycin spolu s kvasinkou Sacharomyces boulardii a průjem se už neobjevil (Karpa, 2003).

19

Tab. 2 Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Vyhl. 77/2003, Sb.) Název kysaného výrobku Použitá mlékařská kultura Lactobacillus acidophylus, Acidofilní mléko

mezofilní a termofilní

Mléčná mikroflóra v 1g 106 Lactobacilus acidophylus

kultury Protosymbiotická směs Streptococcus salivarius ssp. Jogurty

107

thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Monokultury nebo směsné

Kysané mléko

Kefír

Kefírové mléko

kultury bakterií mléčného

106

kvašení Kvasinky Kluyveromyces

106 bakterií mléčného

marxianus, Sacharomyces

kvašení,

cerevisiae, Leuconostoc, Lactococcus a Acetobacter Kluyveromyces, Torulopsis

104 kvasinky 10 bakterií mléčného

nebo Candida valida a

kysání,

symbiotické termofilní bakterie Bifidobacterium ssp.

Kysaný mléčný výrobek v kombinaci s mezofilními a s bifidokulturou

6

termofilními bakteriemi mléčného kysání

20

102 kvasinky

106 bifidobakterie

3.2

Prebiotika Dle Šušković (2001) je strava ochuzená o vlákninu důvodem civilizačních

chorob. V současnosti je hlavním problémem

zácpa, průjem, obezita, hemoroidy,

kardiovaskulární onemocnění, cukrovka, rakovina tlustého střeva apod. Strava bohatá na vlákninu je výbornou prevencí proti těmto potížím. Štěpné produkty vlákniny jako např. pektiny, xylany, celulosa a oligosacharidy (inulin), které jsou v tenkém střevě nestravitelné a procházejí nezměněny až do tlustého střeva, plní svoji funkci tím, že slouží jako substrát pro mikrobiální enzymy. Souhrnně se tyto látky nazývají prebiotika. Jakmile dorazí do tlustého střeva, začne mikroflóra prebiotika selektivně fermentovat. Jsou na ně zaměřeny především probiotické bakterie Bifidobacterium a Lactobacillus (Tannock, 2002). Prebiotika by měla tvořit asi 10 % energetického příjmu potravy, a 20 % objemu přijaté stravy. Pokud jsou poměry dodrženy, můžeme mluvit o funkčně plnohodnotné potravě, která je schopna ovlivňovat tělesné funkce a působit preventivně proti některým chorobám. Jejich izolované podávání (xylosacharidů a fruktosacharidů) zvyšuje populaci bifidobakterií ve střevě a snižuje pH stolice. Dle Svačiny a kol. (2008) by měl dospělý člověk přijmout 25 – 30 g vlákniny. Hlavním metabolickým substrátem kolonocytů je butyrát. Oligofruktosa a inulin selektivně stimulují růst probiotických kmenů, aniž by docházelo k obdobným změnám u anaerobů, klostridií a koliformní mikroflóry (Lipská a Visokai, 2009). V in vitro experimentech se ukázalo, že frukto-oligosacharidy jsou specificky fermentovány bifidobakteriemi. Později se tato informace potvrdila ve zkoušce u lidských dobrovolníků, kteří užívali inulin a oligofruktósu. Bifidobakterie se pak staly dominantními v jejich trávícím ústrojí. Předpokládá se, že prebiotika také podporují absorpci vápníku ze stravy. Není přesně známo, jakým procesem se zvýšená absorpce realizuje, nicméně tento fakt je podložen praktickými výzkumy (Tannock, 2002).

21

Dle Šušković (2001) jsou nezbytná jistá kritéria, aby se doplňky potravy mohly nazývat prebiotiky: -

nesmí být hydrolyzovány v tenkém střevě,

-

musí být selektivním substrátem pro jeden druh, nebo omezený počet prospěšných bakterií, které stimuluje v růstu nebo aktivizuje jejich metabolismus,

-

musí být schopné pozměnit střevní mikroflóru tak, aby její kompozice byla zdraví prospěšnější, například zvyšovat počet sacharolytických druhů a snižovat množství bakterií typu Clostridium a Enterobacteriaceae.

3.3

Symbiotika Symbiotika jsou kombinací probiotik a prebiotik. Jsou to potraviny, či potravní

doplňky vznikající smícháním probiotických bakterií s jejich substrátem (prebiotikem). V tabulce 3 můžeme vidět srovnání všech skupin funkčních potravin. Šušković (2001) uvádí, že koncept symbiotik byl navržen k charakterizaci potravy a potravních doplňků, které zlepšují lidské zdraví, souhrně nazývaných jako funkční potraviny. Název, dle Kalače (2003), vzniknul z pozorovaného jevu synergismu, což znamená, že zdravotní přínos kombinace obou složek je větší než součet přínosů každé z nich aplikované samostatně. Pro symbiotika platí údaje uvedené pro jejich jednotlivé složky. Přednostně se doporučují pro kojence a starší osoby. U nekojených dětí pomáhají zlepšovat skladbu mikroflóry střevního traktu. U lidí ve věku asi 55 let poměrně klesá četnost bifidobakterií. Obě skupiny jsou citlivé vůči infekčním onemocněním a symbiotika mohou pomoci tuto dispozici zmírnit.

22

Tab. 3 Srovnání probiotik, prebiotik a symbiotik (Crow, 2006) Skupina

definice

příklad

Pozitivní vliv

Možnosti vývoje

na zdraví

v budoucnu

Kmeny Potravní doplněk

Probiotika

Prebiotika

Symbiotika

probiotických

s živými

laktobacily,

bakterií zlepšují

mikroorganismy,

bifidobakterie,

zdraví

které pozitivně

enterokoky,

konzumenta.

ovlivňují rovnováhu

streptokoky

Podporují růst

ve střevě.

mikroflóry během

Nestravitelná část

jejího oslabení. Ovlivňují

potravy, která

vyskytující se

selektivně

Frukto-

mikroflóru. Není

podporuje růst

oligosacharidy,

problém, aby bez

střevní mikroflóry

inulin,

změny prošly

nebo omezuje

galakto-

tenkým střevem. Je

množství bakterií ve

oligosacharidy

možné, aby malá

střevě a tím

dávka byla ve

zlepšuje zdraví. Směs probiotik a

všech potravinách

prebiotik, která má

Frukto-

pozitivní vliv na

oligosacharidy,

zdraví a pomáhá

bifidobakterie,

probiotikům, aby

lacticol,

bezpečně prošla

lactobacily

trávícím traktem

3.4

Společný efekt obou částí. Přežití probiotik při průchodu trávícím traktem má vyšší účinnost.

Produkce symbiotik, která podpoří přežití probiotik při průchodu střevním traktem.

Výroba nových multifunkčních prebiotik, která budou podporovat mikroflóru. Jsou odvozována z polysacharidů vlákniny.

Vývoj nových symbiotik na základě molekulárních technik využívajících probiotické enzymy.

Cereálie jako substrát probiotik Charalampopoulos (2009) uvádí, že fermentace kyseliny mléčné je dlouho

zavedená metoda, která se uplatňuje v Asii a Africe k produkci různých forem potravin (nápoje, kaše atd.) Cereálie, hlavně kukuřice, žito, proso a čirok se nechají nasát čistou vodou na půl až 2 dny, přičemž zrna změknou tak, že je snazší rozdrtit nebo pomlít v kaši. Během hnětení, které trvá 1 – 3 dny, probíhají různé kvasné procesy společně s mléčným kvašením. Během fermentace se začíná snižovat pH, které zároveň zvyšuje kyselost hmoty. 23

V západních zemích se používájí cereálie (žito a pšenice) pro produkci kvasu, který je tradičně vyráběn přidáním už předfermentovaného kvalitního kvasu. Tyto startovací kultury mohou být charakterizovány jako „kultura směsných kmenů“ a jsou dodávány v malých dávkách do pekáren. Počet laktobacilů v plně fermentovaném kvasu je více jak 109 KTJ/g. Dobrý růst bakterií mléčného kvašení předpovídá, že včleněním lidských probiotických kmenů do substrátu s upravenými podmínkami by bylo možné produkovat fermentované potraviny s definovanými a konstantními vlastnostmi. Pokud by se tyto potraviny vhodně skombinovaly s probiotiky a prebiotiky, mohly by mít ve výsledku významný podíl na dobrém prospívání zdraví (Charalampopoulos, 2009). Probiotické produkty jsou obvykle založeny na principu viability kultury, která je měřítkem probiotické aktivity čili schopnosti kmene dosáhnout vysoké populace buněk. Koncetrace přibližně 107 v 1 ml v době, kdy je produkt konzumován, je považována za funkční (Gomes a Malcata, 1999). Marklinder a Löner (1992) uvádí, že rychlé dosažení vysokého počtu buněk a určitého stupně kyselosti je výsledkem docílení kratších časů fermentace a zvyšení viability specifických kmenů. Tím se předchází růstu nežádoucí mikroflóry pocházející ze syrového materiálu. Proto je adaptibilita probiotických bakterií v substrátu kritériem ve výběru kmenů probiotik. Charalampopoulus (2009) uvádí, že Lactobacillus a Bifidobacterium mají jisté požadavky na výživu. Především na sacharidy, aminokyseliny, peptidy, mastné kyseliny, soli, deriváty nukleových kyselin a vitamíny. Nároky na výživu se mohou kmen od kmene velice lišit. Hlavními komponenty obilovin jsou škrob, voda volná a vázaná na

vlákninu, monosacharidy jako je glukosa, stachylosa, xylosa, fruktosa,

maltosa, arabinosa a glycerol. Obsah záleží na druhu materiálu, prostupu výroby a množství přidané vody.

Tabulka 4 udává složení obilovin ve srovnání s mlékem.

Obiloviny mají vyšší obsah některých esenciálních vitamínů, vlákniny a minerálů (fosfor), ale nižší obsah zkvasitelných cukrů (obvykle méně než 1 % v pšeničném těstě).

24

Tab. 4 Složení obilovin ve srovnání s mlékem na 100 g (Charalampopoulus, 2009) Parametr Voda (g) Bílkoviny (g) Tuky (g) Sacharidy (g) Vláknina (g) Popel (g) Vápník (mg) Fosfor (mg) Železo (mg) Draslík (mg) Thiamin (mg) Riboflavin (mg) Niacin (mg) Hořčík (mg)

Pšenice 12 13,3 2 71 2,3 1,7 41 372 3,3 370 0,55 0,12 4,3 113

Slad 8 13,1 1,9 77,4 5,7 2,4 40 330 4 400 0,49 0,31 900 140

Mléko 87,4 3,5 3,5 4,9 0,7 118 93 Stopy 144 0,03 0,17 0,1 13

Ve studii Charalampopouluse a kol. (2002) bylo zjištěno, že lidské kmeny Lactobacillus

reuteri,

Lactobacillus

plantarum,

Lactobacillus

acidophylus

a

Lactobacillus fermentum izolovaný z obilovin, mohou být kultivovány ve sladovém, krupičném a pšeničném extraktu bez jakýchkoliv přídavků. Dle výsledků slad podporoval růst lépe než krupice a pšenice zásluhou zvýšeného množství maltosy, sacharosy, glukosy, fruktosy a volných aminokyselin.

3.5

Enkapsulace probiotik za použití cereálií Dle Charalampopouluse a kol. (2002) byly v posledních letech použity metody

enkapsulace za účelem zlepšení životnosti probiotických kmenů. Bylo zkoumáno použití škrobu s vysokým podílem amylosy. Kmeny rodu Bifidobacterium, které byly izolované ze zdravých jedinců, byly adherovány na amylosové škrobové granule. Studie in viro ukazují, že tyto podmínky vedou ke zvýšenému přežití probiotických bakterií. In vivo byl tento poznatek také monitorován měřením počtu bifidobakterií ve výkalech myší, které enkapsulované bakterie užily orálně. Bylo zjištělo, že bakterie přežívají až 6 krát lépe než ty, co nejsou enkapsulované ve škrobu.

25

Modifikovaná

metoda

využívá

kalcium

alginát

pro

mikroenkapsulaci

probiotických bakterií v jugurtu. Ve srovnání s neenkapsulovanými bakteriemi je inkorporací škrobu jako prebiotik s alginátem zlepšena životnost bakterií. Přežití enkapsulovaných kultur bylo ve všech případeh vyšší než u volných buněk. Techniky jako je sprejové sušení, by mohly být používány k produkci malých uniformních mikrosfér obsahující živé probiotické bakterie (O’Riordan a kol., 2001).

3.6

Kvas Nejstarobylejší a nejpřirozenější pro nakypření těsta je použití chlebového

kvasu. Smícháme-li žitnou mouku s vodou v poměru cca 1 : 1, dojde k tomu, že vodou aktivované enzymy ze zrna začnou pomalu rozkládat škrob na jednodušší cukry a jejich přítomnost vitalizuje spory kvasinek a bakterie obsažené v mouce. Oxid uhličitý a další nízkomolekulární látky (kyselina octová a mléčná), dodávající typicky nakyslou chlebovou vůni a chránící kvas před napadením bakteriálními či plísňovými kulturami, jsou výsledkem práce těchto mikroorganismů. Kvas je směsí převážně mouky a vody, která je metabolicky aktivována heterogenní populací bakterií mléčného kvašení a kvasinkami. Hlavními metabolickými aktivitami je okyselování (bakterie mléčného kvašení), formování aroma (bakterie mléčného kvašení a kvasinky) a kynutí (bakterie mléčného kvašení a kvasinky), které se odráží ve fermentovaném těstě snížením pH (cca 4) a dosažením požadované chuti a vůně kvasového chleba. Různé kvasy jsou běžně používanými surovinami pro výrobu kynutého chleba, protože zlepšují jeho chuť a kvalitu. Dalšími produkty, do kterých se používá kvas, mohou být krekry, pizza a variace sladkého pečeného zboží. Stabilita zrání kvasu záleží na jeho mikroflóře, která pochází z mouky a dalších ingrediencí,

metabolické

aktivitě

(např.

amylasová

aktivita

mouky

nebo

mikroorganismů) a specifických technologických parametrech (chemická a enzymatická kompozice mouky, kvasu, teplota skladování, pH, redoxní potenciál a vlhkost těsta). Následkem ekologické diverzity se stejné kvasy od sebe pokaždé liší v závislosti na metabolické aktivitě mouky (Vuyst, 2009).

26

Produkce kvasu vždy byla a stále je zdlouhavý proces. V tradiční výrobě chleba je kvašení na jedné straně zaměřeno na kultivaci kvasinek a laktobacilů za účelem získání dostatečného množství oxidu uhličitého pro kynutí těsta a na druhé straně je kvašení podmínkou pro výrobu žitného chleba (Brandt, 2006). Dle Rennenberga (2008) je žitný chléb velice oblíbený ve východní a severní Evropě. Žitná mouka má vysokou amylasovou aktivitu a ačkoliv je inhibována kyselostí kvasu, degraduje během pečení škrob tak, že hotová střídka je velice vlhká. V jiných částech Evropy, kde se produkuje pšeničný chléb, byl kvas nahrazen pekařským droždím. Stále je ale nutné, aby pro speciality, jako je francouzská ‚baguette‘ a ‚panettone‘ ze severní Itálie byl použit kvas. V mezinárodní terminologii je použit pro kvas termín „sourdough“ nicméně česká terminologie pro něj užívá více termínů. Dle toho, zda je vyroben pouze z žitné mouky (kvas), a nebo z pšeničné mouky s přídavkem kvasnic. Hovoříme potom o omládku, který zraje cca 1 h a nebo poliši, jež zraje 2 hodiny a má jiné parametry.

Obr. 3 Kvas

27

3.6.1 Historie kvasu Používání kvasu pravděpodobně souvisí se začátky pěstování obilovin. Už v pradávných dobách (4000 př. n. l.), lidé uměli přeměnit syrové zrno mletím, kvašením a pečením na chutnou a výživnou stravu. První zmínky o kvasu byly nalezeny v egyptských hrobkách. Egypťané pravděpodobně jako první realizovali velkovýrobu chleba, aby mohli nasytit tisíce dělníků pracujících na stavbě pyramid (Rennenberg, 2008). Dle Raynera (2009) byl první kvasový chléb výsledkem spontánního kvašení pšeničné kaše. Po celé Evropě, Asii, na Středním východě, v Africe a v Jižní Americe se nacházejí pozůstatky kvašeného piva a pšeničné kaše. Vysoký zájem lidí o kvas je zaznamenán v Bibli v knize Exodus, ve které židovští otroci prchající z egyptské nadvlády ve spěchu nechali v Egyptě svůj kvas. Po pádu Římské říše pekařské řemeslo téměř zaniklo. Přežilo jen díky tomu, že se v klášterech a opatstvích pečení chleba zachovávalo. Veřejní pekaři se znovu objevili ve 12. století, kdy pomohli miliónům lidí přežít války, hladomor a nemoci. Američtí průkopníci také převáželi kvas ve svých vozech při cestě na západ. Byl tak populární, že „sourdough“ (v doslovném překladu „kyselé těsto“) se stalo přezdívkou pro zlatokopy v dobách zlaté horečky kolem roku 1848 (Rennenberg, 2008). Nutnost

používání

kvasu

poklesla

s použitím

průmyslově

vyráběného

pekařského droždí, které se začalo vyrábět Mautnerem ve Vídni v roce 1846. Je ovšem potřeba zmínit, že kvas byl pro pekaře do 20. století levnější variantou. První komerčně produkované kváskové startéry, vyvinuté kolem roku 1910 byly inspirované metodami výroby kvasnic pro použití v pivovarech a lihovarech. Doručovaly se pekařům každý týden a zajišťovaly konstantní kvalitu produkce kvasu. Takto je kvas připravován dodnes (Brandt, 2006). Rennenberg (2008) uvádí, že v San Franciscu je v každé pekárně původní kvas, nazývaný také jako „mother sponge“ (rodná houba). Je kontinuálně používán, udržován a pečlivě obnovován od doby, kdy byla konkrétní pekárna založena. S nadsázkou lze podotknout, že zdejší kvasy jsou nejstaršími obyvateli San Francisca. Žádná pekárna nemá stejný kvas, protože jeho vlastnosti se mění s podmínkami (teplota, vlhkost a obnovování) a protože obsahuje různé kmeny Lactobacillus sanfranciscensis a

28

kvasinek. Každá pekárna produkuje jiný chléb, protože

metabolická aktivita

mikroorganismů je rozhodující pro chuť chleba. Produkce kvasu je nezbytná pro produkci žitného chleba. Inhibice endogenních amyláz okyselením zaručuje degradaci škrobu a dosáhnutí potřebného objemu chleba. Proto zvyšující se užívání pekařského droždí doprovázela rostoucí potřeba látky vhodné k okyselení (tzv. okyselující přípravky), zejména v Německu a Rakousku, kde je dlouhá tradice produkce žitného chleba. Ve 20. létech 19. století se dostal na trh první okyselující přípravek (směs mouky a kyseliny mléčné). Protože aroma tohoto přípravku nebylo uspokojující, spotřebitelé si vyžádali vývoj nového produktu – sušeného kvasu, který se stal dostupným v roce 1970 (Bradnt, 2006). Kučerová (2004) uvádí, že v posledním desetiletí 20. století se začal rozšiřovat způsob přípravy kvasů zkráceným postupem z dodávané startovací kultury bez pozvolného pomnožování. Předfermentovaná kultura mléčných bakterií se rozmíchá s moukou a vodou přímo na potřebný objem kvasu.

Obr. 4 Pečení chleba ve středověku 3.6.2 Ekologie kvasu Vuyst a Neyens (2005) uvádí, že mouka a další ingredience nejsou vůbec mikrobiologicky sterilní. Když se smíchá voda s moukou, mikroorganismy se začnou množit. Konkurenční kvasinky spolu s bakteriemi mléčného kvašení dosáhnou daleko většího počtu kolonií tvořících jednotek než ostatní mikroflóra. Poměr bakterií mléčného kvašení ku kvasinkám je přibližně 100 : 1. Ačkoliv jisté ingredience, jako je

29

cukr a sůl nebo další aditiva podporují růst kvasinek i bakterií mléčného kvašení, je obtížné stanovit korelaci mezi určitými typy kvasinek a bakteriemi mléčného kvašení, protože vždy je mouka jiná a záleží také na poměru voda : mouka. Mikroflóra syrových obilovin se skládá z kvasinek a hub, řádově 104 – 105 KTJ/g, zatímco mouka obsahuje 2 . 104 – 6 . 106 KTJ/g. Bakterie, které nacházíme v kynutém kvasu jsou mezofilní gramnegativní aeroby (Pseudomonas) a fakultativní anaeroby (Enterobacteriaceae) stejně tak dobře jako grampozitivní bakterie mléčného kvašení (Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum a Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Pediococcus acidilacti, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc a Weissella). Samozřejmě se zde vyskytuje nežádoucí Staphylococcus aureus, Bacillus cereus a další. V obilovinách a v moukách byly detekovány kvasinky Candida, Cryptococcus, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora, Troichospora, Saccharomyces a Sporobolomyces. Mělo by být zdůrazněno, že Saccharomyces cerevisiae není přítomná v syrových materiálech. Její výskyt v kvasu může být vysvětlen aplikací pekařského droždí ve většině pekařských

úkonů.

Ze

zástupců

plísní

můžeme

v obilovinách

Cladosporium, Drechslera, Fusarium, Helminthosporium

nalézt

rody

s Ulocladium z polí a

Aspergillus s Penicillium ze skladovacích prostor (Vuyst a Neyens, 2005). Jakmile se mouka dostane do styku s vodou, vyskytující se amylasy začnou hydrolyzovat škrob na jeho podjednotky (sacharosa a maltosa). Maltasy štěpí maltosu na glukosu a fruktosu, které mohou být velice dobře metabolizovány kvasinkami. Laktobacily nejvíce využívají produkty metabolismu kvasinek. Směs se po čase dostane do vyvážené symbiózy mezi mikroorganismy. Nout (2005) uvádí, že dominanci laktobacilů vysvětluje několik faktorů. Především je to metabolismem sacharidů, který je vysoce přizpůsoben substrátu v těstě, zejména maltose a fruktose.

Využití maltosy v důsledku přítomnosti enzymu

maltosofosforylasy má za následek větší využití energie, než je tomu u homofermentativní deradace maltosy. Za druhé je to podmínkami růstu Lactobacillus sanfranciscensis s ohledem na teplotu a pH, které jsou adekvátní při fermentaci v kvasu. Třetím faktorem dominance jsou produkované antimikrobiální látky při fermentaci. Kompetitivita heterofermentativních laktobacilů se převážně spoléhá na důmyslné

30

využití maltosy. Zdrojem maltosy je mouka nebo Lactobacillus amylovorus, který je přítomný v druhém typu kvasu. Maltosa je štěpena fosforylasou bez dodání ATP. Vzhledem

k velkému

množství

maltosy

a

působení

Lactobacillus

sanfranciscensis spolu s Lactobacillus reuterii je do substrátu uvolňována glukosa, která vzniká při fosforylasové reakci. Vyprodukovaná glukosa je metabolizována ostatními laktobacily a kvasinkami, které maltosu nevyužívají (Nout, 2005). Spontánní fermentace kvasu prováděná v laboratoři ukazuje, že kvalitní typ mouky je zdrojem stabilních autochtoních bakterií mléčného kvašení a hraje hlavní roli v produkci stabilního kvasu (Van der Meulen a kol., 2007). Dle Nouta (2005) je nejvýznamnější metabolickou aktivitou v kvasu produkce nízkomolekulárních organických kyselin – laktátu a acetátu, a také oxidu uhličitého. Produkce plynu je důležitá pro kynutí těsta. Podmínkou pro pečení žitného chleba je okyselení, protože nízké pH inhibuje α-amylasy mouky. Mimo to aktivuje proteasy obilovin poskytující peptidy a aminokyseliny, které mohou být metabolizovány na prekurzory látek vytvářejících aroma. U pšeničného těsta kvasinky a bakterie způsobí nakynutí díky lepku, který zadrží vznikající oxid uhličitý. U kvasu je získání potřebného objemu složitější než u průmyslového pekařského droždí, protože laktobacily vždy převyšují počtem kvasinky 10x – 100 x a nízké pH inhibuje jejich metabolismus. V každé zemi jsou požadavky na kvas jiné. Ve střední, severní a východní Evropě je tradicí žitný chléb, pro jehož výrobu je třeba kvas s vyšším TTA („total titrable amount“, v překladu „celkové titrační množství“). V jižní Evropě, kde je nejoblíbenější pšeničný chléb, jsou preferovány pšeničné omládky a poliše s nižším titračním číslem. Kyselost je způsobena vznikajícími kyselinami, z nichž převažuje kyselina mléčná a kyselina octová. Kyselost a enzymy laktobacilů, které denaturují proteiny, jsou příčinou slabé síly lepku a hustší konzistence produktu (McGee a Harold, 2004). Nout (2005) uvádí, že se Lactobacillus franciscensis používá jako akceptor elektronů kyslík nebo fruktosu, která je při reakci redukována na manitol. Fruktosa je přítomna ve frukto-glukanech, ze kterých se vyvazuje kvasinkami Candida humilis a Candida

milleri.

Dostupnost

fruktosy

ovlivňuje

senzoricky

láktát : acetát, jenž je regulován dle požadavků na určitý druh výrobku.

31

důležitý

poměr

Dle Brandta (2006) hraje kyselina octová významnou roli v konečné kvalitě chleba (trvanlivost a aroma). Její produkci je možné řídit aerací nebo přidáváním fruktosy. Je však důležité znát, že také kvasinky jsou schopné fruktosu vyvazovat z frukto-oligosacharidů. Hlavními látkami, odpovídajícími za aroma hotového výrobku, jsou: -

methional (aroma vařených brambor),

-

fenylacetaldehyd (aroma medu),

-

2-metylbutanal,

-

3-metylbutanal,

-

kyselina octová.

Dle Nouta (2005) peptidy a aminokyseliny hrají důležitou roli jako prekurzory chuťových látek v pečených výrobcích z kvasu a promítají se do fyzikálních vlastností těsta. Screeningem genomu Lactobacillus sanfranciscensis bylo zjištěno, že tato bakterie nemá danou proteolytickou aktivitu. Místo toho produkuje kyseliny, které aktivují proteasy mouky. Vznikající peptidy transportuje Lactobacillus sanfranciscensis do buňky, kde jsou vneseny do systému hydrolas a proteinas. Ve srovnání s ostatními bakteriemi

mléčného

kvašení

přítomnými

v kvasu

se

kmeny

Lactobacillus

sanfranciscensis vyznačují nejvyšší aktivitou aminopeptidas, dipeptidas, tripeptidas a iminopeptidas. V průběhu fermentace Lactobcillus pontis produkuje ornitin, jež je aromatická aktivní aminokyselina, která podporuje pečenou chuť chleba. Ornithin je tvořen cestou arginin-deaminasy. Lactobacillus pontis má k dispozici arginin/ornitin antiporter, který umožňuje transport argininu do buňky a ornitinu z buňky, během této konverze je uvolňována energie. Při pečení je ornitin tepelně konvertován na 2–acetyl–1–pyrolin, jež je nositelem typické pečené chutě chlebové kůrky (Nout, 2005).

32

3.6.3 Výroba kvasu Kučerová (2004) uvádí, že se pro stabilizované kvasy užívají kvasomaty (fermentátory). Tento způsob je značně časově a sotimentově pružný. Dle Böckera, Stolze a Hammese (1995) byl kvas rozdělen do tří typů dle toho, jaká byla aplikována technologie pro jeho výrobu: -

typ I - tradiční kvas,

-

typ II - vyrobený s využitím urychlené technologie,

-

typ III - suchý kvas..

Každý typ je charakteristický pro svou specifickou mikroflóru baktérií mléčného kvašení viz. Tab. 5.

33

Tab. 5 Rozdělení kvasů a jejich mikroflóra (de Vuys a Neyensen, 2004) Typ Ia

Typ Ib Typ Ic Typ II Typ II Obligátně heterofermentativní Lactobacillus Lactobacillus brevis, brevis, L. buchneri, L. fermentum, L. fermentum, L. fermenti, L. fructivorans, Lactobacillus L. pontis, Lactobacillus Lactobacillus L. pontis, fermentum, brevis sanfranciscencis L. panis, L. reuteri, L. reuteri L. reuteri, L. L. sanfranciscensis, sanfranciscensis, W. cibaria W. confusa Fakultativně heterofermentativní L. alimentarius

Candida humilis (T. holmii, C. milleri) S. exiguus

L. casei

L. plantarum

L.

L.

paralimentarius,

pentosaceus

L. plantarum Obligátně homofermentativní L. acidophylus, L. acidophylus L. delbrueckii L. debrueckii, L. L. amylovorus, L. farminis, amylovorus L. farciminis, L. mindensis L. johnsoni Kvasinky Issatchenkia Candida humilis

orientalis

Může být přidána

(Candida

S. cerevisiae

krusei)

34

3.6.3.1

Typ I Dle Stolze (1999) je první typ produkován tradičními technikami, které jsou

charakterizovány kontinuálním denním obnovováním, aby byly mikroorganismy udržované v aktivní formě s vysokou metabolickou aktivitou produkující plyn. Tento proces probíhá při okolní teplotě 20 – 30° C a při pH kolem 4. Lactobacillus sanfranciscensis se nejvíce vyskytuje v prvním typu pšeničných omládků a polišů, v nichž se objevuje ve stálé asociaci s jistými kvasinkami. Díky tomu je vysoce specializovaný, heterotrofně fermentuje uhlohydráty a jeho metabolismus je energeticky výhodný (Hammes a kol., 1996). Tradiční první typ kvasu obsahující čistou kulturu řadíme do skupiny Ia. Typ Ib je tekutý kvas se spontánně rozvinutou kulturou získanou smícháním několika kvasů vyrobených z mouky.

Kvasy vyráběné v tropickém podnebí a fermentované při

vysokých teplotách patří do typu Ic (Stolz, 1999). Čisté kultury typu Ia jsou odvozeny od kvasu vzniklého přirozenou fermentací. Tyto kvasy jsou tvořeny dobře adaptovanou specifickou mikroflórou. Poskytují stabilní složení, mají vysokou schopnost okyselení a jsou resistentní proti mikrobiální kontaminaci. Typickým příkladem typu Ia je kvas obsahující Lactobacillus sanfranciscensis používaný k přípravě francouzského chleba ze San Francisca (viz Obr. 5) Dalšími pekařskými produkty využívající I typu kvasu mohou být Panettone, koláčky, toskánský a Altamura chléb.

Obr. 5 Francouzský chléb ze San Francisca

35

V tradičním kvasu typu I, který se připravuje za nižších inkubačních teplot, dominuje rod Lactobacillus, obzvláště pak Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paralientarius, Lactobacillus rossiae a Lactobacillus sanfranciensis (Nout, 2005). K produkci pšeničného omládku (poliše) a žitného kvasu je využíván tradiční fermentační čas pohybující se od 3 do 48 hodin. Tradiční proces výroby žitného kvasu typu Ib se skládá ze 3 kroků kvašení: -

čerstvý kvas,

-

základní kvas,

-

plný kvas.

Původní těsto („mother dough“) nebo startér je používáno jako inokulum pro každou další dávku těsta na chleba. Selektivita mikroflóry je zaručena nepřetržitou reinokulací nových dávek z předchozích. Tento proces se nazývá ‚back-slopping‘ (De Vuys a Neyensen, 2004). Hlavní částí mikroflóry v kvasu typu Ib jsou obligátně heterofermentativní kmeny Lactobacillus sanfranciscensis, které jsou přizpůsobeny podmínkám prostředí fermentace, jež záleží na aplikované technologii (Hammes a Gänzle 1998). Produkce plynu je nutná jen do doby, než se přidají pekařské kvasnice. Pokud jsou

kvasinky

přítomny

přirozeně,

jsou

často

asociovány

s Lactobacillus

sanfranciscensis a Lactobacillus pontis. Typ kvasu Ic je například čirokový kvas, který se používá v Africe. Je vyráběn při vyšších teplotách (asi 35 °C) a obsahuje obligátní heterofermentativní Lactobacillus fermentum, pontis, reuterii i homofermentativní druhy jako je Lactobacillus amylovorus. Ze zástupců kvasinek tu můžeme nalézt Issatchenkia orientalis (De Vuys a Neyensen, 2004).

3.6.3.2

Typ II Industrializace pečení žitného chleba a potřeba rychlejší, efektnější a řízené

fermentace velkých dávek kvasu vyústila ve vývoj typu II, který má polotekutou konzistenci. Tyto pekařské sériové produkty slouží hlavně k okyselení těsta. Existuje také několik modifikovaných urychlených procesů fermentace. Běžné je dlouhodobé jednostupňové kvašení s kontinuálním rozšiřováním kvasu. Zaručuje spolehlivost a je flexibilní (Stolz a Böcker, 1996).

36

Dle De Vuyste a Neysens (2004) proces trvá 2 – 5 dní, pak se zvyšuje teplota (obvykle nad 30 °C), aby došlo k urychlení dějů v kvasu. Tento typ obsahuje velké množství kyselin, které po 24 hodinách sníží pH až na 3. Vysoký výtěžek kvasu umožňuje, aby byl dopravován pumpou. Čerstvý produkt je dodáván do lokálních pekáren, kde musí být do jednoho týdne spotřebován. Průmyslový kvas II. typu je charakteristický vyšší teplotou přípravy a delší dobou fermentace s větším množstvím vody. V porovnání s prvním typem průmyslový kvas obsahuje termo a acido – rezistní formy rodu Lactobacillus. Výsledkem široké produkce prvního a druhého typu kvasu a vyvíjením taxonomie bakterií mléčného kvašení během posledních deseti let bylo objeveno několik nových kmenů. Potvrdilo se, že přítomné heterofermentativní kmeny rodu Lactobacillus jsou typické pro ekosystém kvasu. Kmeny patřící do rodů Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus a Weissella se vyskytují s mnohem menší frekvencí, ačkoliv některé z těchto druhů jsou přítomné

na zrnech obilovin a v mouce. Mohou také být

dominantními mikroorganismy v počátečních fázích fermentace nebo ve speciálních druzích kvásků (Vuyst a Neysens, 2005). V druhém typu dominuje Lactobacillus reuteri. Tento fakt se připisuje jeho konkurenceschopnosti mezi ostatními bakteriemi, která je dána nejen jeho výkonným mechanismem metabolismu sacharidů, ale také antimikrobiálním potenciálem (Gänzle a Vogel, 2003). Proti tomu rozšířený výskyt určitých bakterií mléčného kvašení v kvasu může odrážet nejen jejich adaptibilitu k podmínkám převládající fermentace, ale také jejich vnitrodruhovou heterogenitu, která se projevuje diverzitou genotypu Lactobacillus rossiae (Scheirlinck a kol., 2009).

3.6.3.3

Typ III Třetím typem jsou sušené kvasy ve formě prášku, které obsahují definované

startovací kultury. Jsou používány jako okyselující přípravky a nositele aroma. Obsahují bakterie mléčného kvašení, které jsou odolné vůči sušení a jsou schopné v přežít v prášku, například heterofermentativní Lactobacillus brevis a fakultativně heterofermentativní kmeny Lactobacillus plantarum. Sušení může probíhat sprejovou nebo bubnovou technologií. Samozřejmě, že sušené kvasy jsou na trh dodávány s dlouhou dobou minimální trvanlivosti. Použití suchého kvasu je velice jednoduché a zaručuje výrobu standardizovaných produktů (Stolz a Böcker, 1996).

37

4

MATERIÁLY A METODA ZPRACOVÁNÍ

4.1

Charakteristika materiálu

4.1.1 Použité mikroorganismy Ke produkci kvasu byly použity vybrané kmeny bakterií mléčného kvašení: -

Lactobacillus helveticus (M92)

-

Lactobacillus plantarum (L4)

-

Enterococcus faecium (L3)

-

Lactobacillus fermentum (A8)

-

Lactococcus lactis ssp. lactis (LMG 9450)

Uvedené kmeny bakterií jsou součástí sbírky mikroorganismů Laboratoře pro antibiotika, enzymy, probiotika a startovací kultury potravin Fakulty technologie potravin a biotechnologie Univerzity v Záhřebu. V rámci charakterizace aplikovaných kmenů bakterií byla testována jejich antimikrobiální

aktivita

k

následujícím

druhům

testovacích

patogenních

mikroorganismů vyskytujících se v mouce: -

Staphylococcus aureus (3048)

-

Escherichia coli (3014)

-

Bacillus subtilis (ATCC 6633)

Uvedené

testovací

mikroorganismy

jsou

rovněž

součástí

sbírky

mikroorganismů Laboratoře pro antibiotika, enzymy, probiotika a startovací kultury potravin Fakulty technologie potravin a biotechnologie Univerzity v Záhřebu.

4.1.2

Živná média

K mikrobiologickým analýzám bylo pracováno s následujícími živnými médii: •

MRS – DeMann – Rogosa - Sharpe agar, Biolife (Itálie) složení (g/l): pepton 10; masový extrakt 10; kvasniční extrakt 5; glukosa 20; Tween 80 1; MgSO4 · 7 H2O 0,1; MnSO4 · 7 H2O; acetát sodný 5; agar 20, destilovaná voda. Hodnota pH substrátu je 6,5; 70,2 g směsi se rozmíchá v 1 litru destilované vody, přivede

38

se k varu, steriluje v autoklávu při 121 ºC/15 min a před nalitím do Petriho misek vychladí na 40 – 50 °C. • MRS broth – DeMann – Rogosa - Sharpe bujón, Biolife (Itálie) má stejné složení jako substrát MRS-agar, je ale bez přidaného agaru. 70,2 g směsi a 1,4 g agaru se rozmíchá v 1 litru destilované vody, přivede se k varu, steriluje v autoklávu při 121 ºC/15 min a před nalitím do Petriho misek vychladí na 40 – 50 °C. • M17 agar, Biolife (Itálie) složení (g/l): kasein 2,5; pepton 2,5; sójový pepton 5,0; kvasniční extrakt 2,5; masový extrakt 5,0; laktosa 5,0; glycerofosfát sodný 19,0; MgS 0,25; kyselina askorbová 0,5; agar 13; destilovaná vody. Hodnota pH substrátu je 7,1; 55,2 g směsi se rozmíchá v 1 litru destilované vody, přivede se k varu, steriluje v autoklávu při 121 ºC/15 min a před nalitím do Petriho misek vychladí na 40 – 50 °C. • M17 bujón, Biolife (Itálie) má stejné složení jako substrát M17 agar, ale bez přidaného agaru; 55,2 g směsi s 1,1 g agaru se rozmíchá v 1 litru destilované vody, přivede se k varu, steriluje v autoklávu při 121 ºC/15 min a před nalitím do Petriho misek vychladí na 40 – 50 °C. • HB médium, Biolife (Itálie) složení živného média (g/l): pepton 15; masový extrakt 3; NaCl 5; K3PO4 0,3; destilovaná voda. Hodnota pH substrátu je 7,3; 40 g směsi se rozmíchá v 100 ml destilované vody, přivede se k varu, steriluje v autoklávu při 121º C/20 min a před nalitím do Petriho misek vychladí na 40 – 50 °C. • PCA médium, Biolife (Itálie) složení substrátu (g/l): tripton 5,0; kvasniční extrakt 2,5; dextrosa 1,0; agar 15; destilovaná voda. pH média je 7,0; 23,5 g směsi se rozmíchá v 1 litru destilované vody, přivede se k varu, steriluje v autoklávu při 121 ºC/15 min a před nalitím do Petriho misek vychladí na 45 – 50 °C. • VRBL agar, Biolife (Itálie) složení média pro zjištění počtu koliformních bakterií (g/l): kvasniční extrakt 3,0; pepton 7,0; žlučové soli 1,5; laktosa 10,0; NaCl 5,0; agar 15; krystalová violeť 0,002. pH média je 7,4; 41,5 g směsi se

39

rozmíchá v 1 litru destilované vody, přivede se k varu, povaří se při 110 ºC/20 min a před nalitím do Petriho misek vychladí na 40 – 50 °C.

Médium MRS je optimální pro růst kmenů Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3 a Lactobacillus fermentum A8, M17 pro růst kmene Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450. Médium HB je určené pro růst testovacích mikroorganismů. Pro určení počtu mikroorganismů přítomných v těstě se užívá agarové médium: MRS – selektivní půda pro laktobacily i další související bakterie mléčného kvašení; M17 – selektivní půda pro laktokoky, VRBL pro počet bakterií čeledi Enterobacteriaceae a PCA – půda pro celkový počet mikroorganismů. Všechny mikrobiální kultury byly kultivovány při 37 °C po dobu 96 h mimo média M17, které bylo použito pro kultivaci kultur při 30 °C po dobu 96 h. 4.1.3

Použité chemikálie Hydroxid sodný (Kemika, Chorvatsko), fenolftalein (Carlo Erba, Itálie),

Chloridsodný (Kemika, Chorvatsko), Dodecilsulfát sodný (Sigma, SAD)Glycerol (Alkaloid, Makedonie), Tris (hydroxymethyl)-aminometan (Carlo Erba, Itálie), Kyselina chlorná (Kemika, Chorvatsko), Glycin (Gram-mol, Chorvatsko), Akrylamid (Sigma, SAD), TEMED (N, N, N`, N`-tetramethylethylen), (Sigma, SAD) βmerkaptoetanol (Sigma, SAD), methylenová modř R-250 (Sigma, SAD), izopropanol (Kemika, Chorvatsko), methanol (Kemika, Chorvatsko), ethanol (Kemika, Chorvatsko), kyselina octová (Kemika, Chorvatsko), standard pro elektroforézu proteinů, (Pharmacia, SAD), glukosa (Kemika, Chorvatsko), lysozim (EuroBio, Francie), RNA-asa A, (Qiagen, Španělsko) ,fenol-chloroform (Sigma, SAD), acetát sodný (Kemika, Chorvatsko), magnezium chlorid (Kemika, Chorvatsko), komplex III (dihydrát sodné soli ethylen-diamintetraoctové kyseliny), (Kemika, Chorvatsko), ethidien bromid (Boehringer Manheim GmbH, Mainheim), agarosa (Appligane, Strasbourg), DNA bakteriofaga  (New England Biolabs), PCR pufer 10x (Fermentas), magnezium chlorid, 25 mM (Fermentas), dNTP mix, 10 mM (Fermentas), Taq polymeraza, 1 U (Fermentas), Oligonukleotidy (Invitrogen, SAD).

40

4.1.4 API API 50 CHL medium bylo použito k identifikaci rodu Lactobacillus a souvisejících rodů. Metoda užívá již připravenou soustavu medií, které umožňují fermentaci 49 sacharidů na 50

API proužcích.

Media se skládají z (g/l

demineralizované vody): polypeptonu 10; kvasničního exktraktu 5; Tween 80 1 ml; fosfátu draselného 2; octanu sodého 5; citrátu diamonného 2; magnezium sulfátu 0,20; MnS 0,05; bromkrezolové violeti 0,17, pH media je 6,1 - 7,1. API 20 Strip je standardizovaný systém složen ze 20 biochemických testů. Umožňuje identifikaci skupin nebo individuálních streptokoků a enterokoků. Medium se skládá z (g/l demineralizované vody): L-cysteinu 0,5; triptonu 20; chloridu sodného 5; sulfidu sodného 0,5; fenolové červeni 0,17, pH media je 7,4 - 7,6.

4.1.5

Použité nástroje a přístroje PH - metr (Metrohm, Švýcarsko), byreta pro určení množství mléčné kyseliny,

autokláv (Sutjeska, Jugoslavie), termostat (Instrumentarija, Chorvatsko), vibro-mísič EV-100 (Kartell, Itálie), váha (Tehtnica, Slovensko), centrifuga CENTAUR 2 (Sanyo, Velká Británie), centrifuga Centric (Tehtnica, Slovensko), elektroforetický aparát (Sigma, SAD), počítadlo mikrotitračních destiček LKB 5060-006 (GDV, Itálie), elektroforetická

vana

Cleaver

(Scientific

Itd.),

DNA-termoblok

(Eppendorf),

transluminátor MiniBIS Pro (DNT), denzimat (BioMerieux, Francie).

4.2

4.2.1

Použité metody

Uchovávání mikroorganismů Bakterie

Lactobacillus

helveticus

M92,

Lactobacillus

plantarum

L4,

Enterococcus faecium L3 a Lactobacillus fermentum A8 jsou uchovávány při – 80 °C v tekuté MRS živné půdě s obsahem glycerolu (15 %) . Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450 je uchováván při – 80 °C v tekuté živné půdě M17 s obsahem glycerolu 15 % a testovací mikroorganismy jsou uchovávány při – 80 °C v ochranné živné půdě s 15 % glycerolu. 41

4.2.2

Kultivace mikroorganismů Bakteriální kmeny bylo naočkováno do 5 ml sterilního tekutého média, které je

optimální pro růst každého bakteriálního kmene. Jsou kultivovány 24 h při optimální teplotě pro jejich růst. Kultivace Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a testovacích patogenních mikroorganismů se provádí při 37 °C, a bakteriální kmeny Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450 při 30 °C.

4.2.3

API

4.2.3.1

API 50 CHL Zkoumané bakteriální kultury, Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus

plantarum L4 a Lactobacillus fermentum A8 byly kultivovány anaerobně v Petriho miskách na MRS živném médiu 24 h při 37 °C. Do zkumavek, které obsahují API 50 CHL medium pro laktobacily, bylo pomocí mikrobiologické kličky dodáno několik identických kolonií z MRS agaru. Hustota inokula, která se měří v dezimatu, musí být 2 McF. Suspenze byla napipetována po proužek do ampulí API 50 CH, které obsahovaly 49 různých sacharidů. Do všech ampulek byl nakapán minerální olej, aby bylo zajištěno anaerobní prostředí. Byly inkubovány při 37 °C po 48 hodin, po této době byly výsledky odečteny. Pozitivní výsledek byl udán, došlo-li k okyselení. To bylo indikováno změnou barvy fialového bromkrezolu na žlutou. Biochemický profil byl identifikován pomocí programu ApiWeb (verze 5.0).

4.2.3.2

API 20 STREP Zkoumané bakteriální kultury, Enterococcus faecium L3 a Lactococcus lactis

ssp. lactis LMG 9450 byly kultivovány v anaerobním prostředí na MRS agaru 24 h při 37 °C. Dobře izolované kolonie se rozptýlily v 0,3 ml sterilní vodě. Celá suspenze byla přelita na Columbia agar s dodatkem ovčí krve. Misky byly inkubovány 24 h při 37 °C v anaerobním prostředí. Do zkumavek, které obsahovaly API SUSPENSION medium pro streptokoky i jiné související mikroorganismy, se pomocí mikrobiologické kličky dodalo několik identických kolonií z živné půdy. Hustota inokula, která byla měřena v dezimatu, musela být 4 McF. Do první poloviny ampulí API 20 Strep byla napipetována

42

připravená suspenze. Zbytek suspenze byl přenesen do zkumavky, která obsahovala API GP medium a dobře promíchána. Tyto suspenze byly nakapány do druhé poloviny ampulek. Do zbytku ampulky byl nakapán minerální olej, aby bylo dosaženo anaerobního prostředí. Po 4 hodinách inkubace při 37 °C byla do VP testu přidána 1 kapka VP1 a VP2 reagens, do HIP testu 2 kapky NIN reagens a do PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL i LAP testů po 1 kapce ZYM A a ZYM B reagens. Po 10 minutách byly odčítány výsledky reakcí. Biochemický profil se identifikuje pomocí progamu ApiWeb (verze 6.0).

4.2.4. SDS - PAGE buněčných proteinů Bakteriální kultury Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450 byly centrifugované při 9000 ot./min 15 min. Buňky jsou omyty sterilním roztokem chloridu sodného (0,9 %), znovu centrifugovány a resuspendovány ve 100 µl sterilním roztoku chloridu sodného. Do něj byl přidán 1 g skleněných kuliček (r = 2 mm). Suspenze se rozmíchala na vortexu po dobu 4 minut tak, že se opakovala 30 sekundová fáze míchání a 30 sekundová fáze chlazení v ledu. Dále byl přidán 1 ml SDS - a (0,0625 Tris - HCl, pH 6,8; 2 % (w/v) SDS; 10 % (v/v) glycerolu). Vzorky byly povařeny 10 minut, zchlazeny v ledu (3 - 4 min) a centrifugovány při 9000 ot./min 15 min. Pro stanovení koncentrace proteinů ve vzorku byla provedena elektroforéza na SDS - polyakrylamid gelu (SDS - PAGE). Do 15 µl každého připraveného vzorku bylo přidáno 5 µl redukující reagens. Vše bylo povařeno 2 - 3 min. Po vaření byl celý objem vzorků nanesen na 10 % polyakrylamidový gel. SDS - polyakrylamidová gelová elektroforeza (SDS-PAGE) byla provedena v elektroforetické vaně při konstantním napětí od 200 V po 45 min. Po dokončení elektroforézy byl gel obarven v 0,1 % methylenové modři R - 250 s 50 % methanolem a 7 % octové kyselině nejméně 3 hodiny. Po barvení byl gel inkubován v 7 % octové kyselině do odbarvení pozadí.

43

4.2.5

Izolace DNA Čerstvé médium MRS bylo naočkováno 5 % kulturami Lactobacillus helveticus

M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450 a inkubováno 18 hodin při 37 °C. Objem 1,5 ml kultury byl centrifugován a buňky omyty v GTE pufru (25 mM TRIS + 10 mM EDTA + 50 mM glukosa). Buňky byly re-suspendovány v 500 µl GTE pufru, s přídavkem lysozimu (8 mg/500 µl) a RNA-zy (50 µl/ml), a inkubovány 30 min při 37 °C. Pak bylo přidáno 250 µl 2 % SDS a zvortexováno 1 min. Poté bylo přidáno 100 µl neutrálního fenolchloroformu, zvortexováno 30 sekund a centrifugováno na 13 000 ot./min po dobu 5 min. Supernatant, bez interfáze, byl smíchán s 1/10 objemu vzorku 3 M octanem sodným (pH = 4,8), a 1 objemu vzorku izopropanolu. Po inkubaci (5 minut při pokojové teplotě) následovala centrifugace na 13 000 ot./min po dobu 10 min. Usazenina byla re-suspendována v 300 µl 0,3 M octanu sodném a 10 mM MgCl2 a zvortexována. Dále bylo přidáno 700 µl ethanolu (zchlazeného na –20 °C). Vzorek byl inkubován 24 hodin při – 20 °C. Následovala centrifugace při 14000 ot./min po 20 min. Sediment byl suspendován v 75 % ethanolu zchlazeným na –20 °C a znovu centrifugován na 13 000 ot./min po dobu 5 min. Usazenina DNA byla re-suspendována v 50 µl TE pufru.

4.2.6. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD metodou provádí reprodukce DNA molekuly v DNA - termobloku, Mastercycler personal, “Eppendorf”. Jako vzorek byla použita veškerá izolovaná DNA bakteriálních buněk. Pro syntézu požadovaných fragmentů DNA byly použity dva oligonukleotidy, 2A (5´-ACG AGG CAC -3´) a 2B (5´-ACG CGC CCT -3´) pro bakteriální mléčnou kyselinu. Objem reakční směsi byl 50 µl a skládál se ze: vzorku DNA (1µl), primerů (1 µM), 10x pufru (5,0 µl), MgCl2 (4 mM), deoxyribonukleosid trifosfátu (4 x 0,2 µM), Taq polymerasy (2,5 U). Reakční směs byla denaurována 5 min při 94 °C, a reakce byla opakována 40krát. Dvoušroubovice DNA byla denaturována 30 sekund při 94 °C, a dalších 30 sekund při 36 °C probíhala syntéza komplementarních řetězů. Komplementarní spárování primerů s matricí DNA trvalo 2 minuty při 52 °C.

44

Po proběhnutí reakce bylo naneseno 10 µl reakční směsi na 1,5 % agarózní gel. Dále byla provedena elektroforéza při napětí 100 V po 2 h. Po provedení elektroforézy byl gel 30 minut inkubován v ethidiumbromidu, osvícen ultrafialovým světlem v transiluminátoru a vyfotografován přes červený filtr. 4.2.7 Příprava supernatantní kultury pro určení antimikrobiální aktivity Centrifugací kultury bakterií Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450 při 9000 ot./min po dobu 5 min, byla odstraněna voda. Supernatantní bakteriální kultury byly sterilně přefiltrovány přes membránový mikrofiltr s póry 0,22 µm tak, aby byly zachyceny bakteriální buňky.

4.2.8 Určení antimikrobiální aktivity turbidimetrickou metodou Do otvorů mikrotitračních destiček bylo přidáno 240 µl supernatantní zkoumané bakteriální kultury a 10 µl testovacích mikroorganismů, které byly nakultivovány v ochranném médiu. Antibakteriální aktivita zkoumaných bakteriálních kultur k testovacím mikroorganismům po 24 hodinách kultivace při 37 °C byla stanovena spektrofotometrickým měřením absorbance při vlnové délce 620 nm pomocí počítače mikrotitračních destiček (LKB 5060-006, „GDV“, Itálie). Rozdíl v absorbanci ochranného bujónu bez přidané supernatantních zkoumaných bakterií a vzorku s dodaným supernatantem je přímo úměrný inhibici růstu testovacích mikroorganismů. Slepá zkouška byla provedena na neinokulovaný ochranný bujón. 4.2.9 Stanovení vyprodukované mléčné kyseliny v těstě 1 ml vzorku těsta byl rozředěn s 19 ml destilované vody v Erlenmeyerově baňce na 100 ml. Rozředěný vzorek byl titrován 0,1 M NaOH na indikátor fenolftalein změny barvy z bílé do růžové. Počet mililitrů NaOH potřebných k neutralizaci představuje kyselost udávanou ve stupních Soxhlet - Henkela (°SH).

°SH = V ◌ּ 20 ◌ּ fNaOH ◌ּ 2 % mléčné kyseliny = º SH ◌ּ 0,0225 V = ml 0,1 M NaOH (1º SH ~ 0,0225 g mléčné kyseliny na 100 g) 45

4.2.10

Určení koncentrace těkavých kyselin 5 ml vzorku bylo dáno do baňky spolu s 1 ml 25 % H3PO4. Z předlohy se

předestilovalo 60 ml a získaný destilát byl zahřát do bodu varu a titrován 0,1 M NaOH na indikátor fenolftalein.

koncentrace těkavých kyselin = 1,2 x V x fNaOH (g/l) V – ml 0,1 M NaOH spotřebované k neutralizaci vzorku

4.2.11

Určení počtu živých mikroorganismů přítomných v těstě nepřímou

metodou Vzorek byl připraven desítkovým naředěním. Na živné médium v Petriho misce bylo naneseno 100 µl vzorku odpovídajícího desítkového ředění. Po kultivaci 48 h při optimální teplotě byly sečteny narostlé kolonie a vypočítán počet živých buněk na 1 gram vzorku.

46

5

VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE Praktická část je zaměřena na potvrzení teoretické možnosti využití

probiotických kmenů pro produkci kvasu. Definovaná multikulturní startovací směs kmenů Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8, izolovaných z různých zdrojů byla definována na Fakultě technologie potravin University v Záhřebu v Laboratoři pro antibiotika, enzymy, probiotika a startovací kultury potravin. Probiotické kmeny L. helveticus M92, L. plantarum L4, E. faecium L3 a L. fermentum A8 byly vybrány pro své vlastnosti podporující zdraví (Šušković a kol., 2000; Kos a kol., 2001; Kos a kol., 2003, Frece a kol., 2005) a technologickém přínosu při různých typech fermentace potravin (Kos a kol., 2008). Kmeny bakterií mléčného kvašení byly vybrány k tomu, aby podpořily rapidní a intenzivní procesy okyselování pro

docílení pozitivního

ovlivnění nutričních a technologických vlastností kvasu. L. plantarum byl vybrán, protože je často obsažen v ekosystému kvasu a jeho dominance ve fermentovaných obilovinách je připisována všestrannému metabolismu sacharidů (DeVuyst and Neysens, 2005).

5.1

Identifikace kmenů bakterií mléčného kvašení V rámci předběžných výsledků byla provedena fenotypová a genotypová

charakterizace kmenů bakterií mléčného kvašení Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450, odebraných při fermentaci mouky. Fenotypová a genotypová charakteristika byla provedena pomocí klasických mikrobiologických a molekulárních metod k tomu, aby bylo možné potvrdit přítomnost čistých kultur zkoumaných kmenů bakterií mléčného kvašení, které byly užity pro fermentaci mouky. V předchozích testech bylo zjištěno, že všech 5 kmenů bylo grampozitivní, katalasa negativní a nesporulující. Nejdříve byla provedena fenotypová charakterizace použitou API biochemickou metodou. Bakteriální kmeny Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4 a Lactobacillus fermentum A8 byly charakterizovány testem API 50 CHL a pro Enterococcus faecium L3 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450 byla užita metoda API 20 Strep. V Tabulce 6 a 7 jsou jednotlivé výsledky fermentace sacharidů, které 47

byly vystaveny působení každého kmenu. Na Obrázku 6 a 7 jsou soustavy ampulek s aplikovanými kmeny kultur bakterií mléčného kvašení. Dle změny barvy jsou odčítány výsledky. Výsledky byly kontrolovány po 24 a 48 hodinách poté, co byla přítomnost kmenů potvrzena. U zkoumaných kmenů byl prokázán různý metabolismus sacharidů. Ze zjištěných údajů vyplynula možnost, že použitá směs kmenů přispěje k optimálnímu okyselení a senzorické hodnotě.

Tab. 6 Fermentační profil bakterií mléčného kvašení Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4 a Lactobacillus fermentum A8 získané biochemickým testem API 50 CHL Sacharidy Kontrola Glycerol Eritriol D-arabinosa L-arabinosa Ribosa D-xylosa L-xylosa Adonitol Β-methyl-xylosid Galaktosa D-glukosa D-fruktosa D-manosa L-sorbosa Rhamnosa Dulcitol Inozitol Manitol Sorbitol Α-methyl-D-manosid α-methyl-D-glukosid N-acetyl glukosamin Amygdalin 2-keto-glukonát

M9 2 + + + + ± + + -

L4

A8

Sacharidy

M92

L4

A8

+ + + + + + + + + + + -

± + + + + + + -

Arbutin Exulin Salicin Celobiosa Maltosa Laktosa Melibiosa Saharosa Trehalosa Inulin Melezitosa D-rafinosa Amidon Glykogen Xylitol β-gentobiosa D-turanosa D-liksosa D-tagatosa D-fukosa L-fukosa D-arabitol L-arabitol Glukonát 5-keto-glukonát

+ ± ± + + ± + ± ± ± -

+ + + + + + + + + + + + + + -

+ + + + + + -

- negativní reakce, nedošlo ke změně barvy; + pozitivní reakce, změna barvy na žlutou v průběhu 48 hodin; ± proměna barvy na zelenožlutou Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Lactobacillus fermentum A8

48

Obr. 6 Fenotypová identifikace bakterií mléčného kvašení API 50 CHL testem

Tab. 7 Výsledky biochemického testu API 20 Strep bakteriálních kmenů Enterococcus faecium L3 a Lactococcus lactis subsp. lactis LMG 9450 LMG

Test

L3

Voges-Proskauer Hydrolýza hipurata Hydrolýza eskulina

+ +

9450 + ± +

Pyrolidonil arylamidasa

±

±

Α-galaktosidasa β-glukuronidasa Β-galaktozidasa Alkalická fosfatasa Leucin aminopeptidasa Arginin dihydrolasa

+ + +

± + +

LMG

Fermentace

L3

Ribosa Arabinosa Manitol Sorbitol /

+ + +

9450 + ±

-

-

+ + + -

+ + + -

Sorbitol Laktosa Trehalosa Inulin Rafinosa Škrob Glykogen

- negativní reakce; + pozitivní reakce L3 – Enterococcus faecium L3, LMG 9450 – Lactococcus lactis subsp. lactis LMG 9450

49

Obr 7. Fenotypová identifikace kmene Enterococcus API 20 Strep testem

SDS - PAGE elektroforéza posloužila pro úplnost fenotypové charakterizace použitých kmenů. Profil izolovaných bakteriálních proteinů seřazených dle jejich molekulové hmotnosti (kDa) lze vidět na Obr. 8. Nadto byla fenotypová charakterizace použitých kultur podpořena genotypovým profilem kmenů metodou RAPD PCR, která byla provedena dvěma specifickými primery 2A (5´-ACG AGG CAC -3´) a 2B (5´-ACG CGC CCT -3´). RAPD metoda isolované DNA přesně rozlišila všech 5 kmenů bakterií mléčného kvašení (Obr. 9).

Obr. 8 SDS-PAGE veškerých buněčných proteinů aplikovaných bakterií mléčného kvašení S – standard, proteiny menší molekulové hmotnosti; 1 – Lactobacillus helveticus M92; 2 – Lactobacillus plantarum L4; 3 – Enterococcus faecium L3; 4 – Lactobacillus fermentum A8; 5 – Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450

50

Obr. 9 Fragmenty DNA aplikovaných bakterií mléčného kvašení získaných RAPD metodou M – standard 1 kb; R1 – Lactobacillus helveticus M92; R2 – Lactobacillus plantarum L4; R3 – Enterococcus faecium L3; R4 – Lactobacillus fermentum A8; R5 – Lactococcus lactis ssp. lactis LMG9450

5.2

Testování antimikrobiální aktivity Na grafu 1 jsou zobrazeny křivky růstu bakterií v MRS tekutém médiu při 37 °C

- Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a na M17 tekutém médiu při 30 °C - Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450. Graf ukazuje, že postupem času se počet mikroorganismů zvyšuje, což je dokázáno rostoucí absorbancí (620 nm). V tomto případě byl dosažen u vzorku Lactobacillus fermentum A8 nejrychlejší nárůst absorbance. Zkoumaná antimikrobiální aktivita supernatantní kultury bakterií mléčného kvašení proti testovacím mikroorganismům, potenciálním kontaminantům mouky, Staphylococcus aureus 3048 (Graf 2), Escherichia coli 3014 (Graf 3) i Bacillus subtilis ATCC 6633 (Graf 4) byla získána použitím turbidimetrické metody.

51

Graf. 1 Závislost růstu bakterií mléčného kvašení Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a

A 620

Lactococcus lactis subsp. lactis LMG 9450 při optimálních podmínkách růstu

1,6 1,4 1,2 1

M92 L4

0,8 0,6 0,4 0,2 0

L3 A8 LMG 9450

0

5

10

15

20

25

30

t (h)

Graf. 2 Inhibice růstu testovacích mikroorganismů Staphylococcus aureus 3048 supernatantní

kulturou

bakteriálních

kmenů

Lactobacillus

helveticus

M92,

Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450; kontrola – růst testovacího mikroorganismu Staphylococcus aureus 3048 v ochranném bujónu

A 620

Staphylococcus aureus 3014 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

kontrola M92 L4 L3 A8 0

5

10

15

20

25

t (h)

52

30

LMG 9450

Graf. 3

Inhibice růstu testovacích mikroorganismů Escherichia coli 3014

supernatantní

kulturou

bakteriálních

kmenů

Lactobacillus

helveticus

M92,

Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450; kontrola – růst testovacího mikroorganismů Escherichia coli 3014 ochranném bujónu

A 620

Escherichia coli 3014 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 0

kontrola M92 L4 L3 A8 LMG 9450 5

10

15

20

25

30

t (h)

Graf. 4 Inhibice růstu testovacích mikroorganismů Bacillus subtilis ATCC 6633 supernatantní

kulturou

bakteriálních

kmenů

Lactobacillus

helveticus

M92,

Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 i Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450; kontrola – růst testovacích mikroorganismů Bacillus subtilis ATCC 6633 v ochranném bujónu

Bacillus subtilis ATCC 6633 1,2 kontrola

A 620

1

M92

0,8

L4

0,6

L3

0,4

A8

0,2

LMG 9450

0 0

5

10

15

20

25

t (h)

53

30

Silná antimikrobiální aktivita, která je důležitou vlastností probiotik, je způsobena produkcí pestré směsi látek jako je kyselina mléčná, peroxid vodíku a bakteriociny. Použití probiotik je tak nejpřirozenějším způsobem konzervace. Dokáží inhibovat široké spektrum mikroorganismů způsobující kažení potravin (Geddes a kol., 1999). Na Grafu 2, 3 a 4 lze vidět rapidní pokles vitality patogenů Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus 3048 a Escherichia coli 3014 působením probiotických bakterií. Staphylococcus aureus 3048 byl nejvíce inhibován kmenem Lactobacillus plantarum L4. Indikátor fekálního znečištění Escherichia coli 3014 a bakterie způsobující nitkovitost chleba Bacillus subtilis ATCC 6633 nejméně rostly v přítomnosti

Lactobacillus

helveticus

M92,

Lactobacillus

plantarum

L4

a

Enterococcus faecium L3. Inhibici nejvíce způsobovala přítomnost kyseliny mléčné, jejíž produkce byla nejdůležitější vlastností startovacích kultur používaných pro výrobu kvasu (Clarke, Schober a Arendt, 2002; Gianotti a kol., 1997). Rychlá produkce kyseliny mléčné během prvního a druhého dne je nezbytná pro produkci kvasu z technologických a hygienických důvodů. Výsledky ukázaly, že aplikované kmeny mohou být užity pro efektivní výrobu kvasu. Navíc jsou výhodné díky svým antagonistickým vlastnostem proti Escherichia coli a Bacillus subtilis, obvyklým kontaminantům během fermentace.

5.3

Fermentace pšeničné mouky

5.3.1 Předběžný pokus V rámci předběžných výsledků byla provedena fermentace těsta, získaného mícháním pšeničné mouky a vody v objemu 2 : 3 (celková hmotnost těsta byla 25 g), s kulturami bakterií mléčného kvašení, které jsou částí sbírky Laboratoře pro antibiotika, enzymy, probiotika a startovací kultury potravin (Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450) , u kterých byla monitorována změna pH hodnoty. V Tabulce 8 si lze všimnout poklesu pH během 24 hodin u různých kultur. Nejrapidnější pokles je zaznamenán u 10 % inokula směsné kultury, která po 6 hodinách snížila pH těsta na pouhých 3,41 a po 24 hodinách 3,22. Pokud by mělo být

54

těsto fermentováno touto kulturou, nemělo by správné parametry pro produkci chleba, protože by heterofermentativní bakterie měly příliš kyselé prostředí pro to, aby produkovaly látky podporující aroma a nebylo by dosaženo správného nakynutí. Protože používání příliš velkého množství bakterií je pro výrobce nákladné. Je zřejmé pro produkci chleba je lepší použít 1 % kulturu, která dle výsledků vykazuje pokles pH v optimálním čase.

Tab. 8 Monitorování změn pH hodnot kvašení (provedené s 10 % a 1 % inokulem každé mikrobiální kultury a 10 % inokulace směsnou kulturou) těsta (hladká pšeničná mouka:voda = 2 : 3) PH

směsná

v čase

kultura 6,22 3,41 3,22 M92** 6,23 5,88 3,57

0h 6h 24h 0h 6h 24h

M92*

L4*

L3*

A8*

6,13 4,10 3,42 L4** 6,22 4,89 3,41

6,05 3,84 3,37 L3** 6,23 4,18 3,43

6,08 3,80 3,40 A8** 6,18 4,74 3,44

6,24 3,94 3,43 LMG 9450** 6,34 3,92 3,22

M92 – Lactobacillus helveticus M92, L4 – Lactobacillus plantarum L4, L3 – Enterococcus faecium L3, A8 – Lactobacillus fermentum A8, LMG 9450 – Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450 * 10 % inokulum jediné kultury; ** 1 % inokulum jediné kultury

5.3.2 Fermentace pšeničné mouky směsnou kulturou bakterií mléčného kvašení Kvašení pšeničné mouky bylo dosaženo přidáním vody v různých poměrech, přičemž celková hmotnost byla 1 kg, a dodáním různých procent inokula směsné kultury bakterií mléčných kvašení (Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450). Během fermentace je monitorována změna hodnoty pH a obsah mléčné kyseliny. Počet mikroorganismů ve vzorcích těsta je určován počítáním kolonií na Petriho miskách s PCA médiem pro celkový počet mikroorganismů, selektivním ochranným médiem pro růst bakterií mléčného kvašení (MRS půda a M17 půda), a selektivním médiem pro růst Enterobacteriacae (VRB půda) na začátku a konci fermentace.

55

V Tabulce 9 jsou vyjádřeny údaje fermentace hladké pšeničné mouky v poměru s vodou 1 : 1 s 10 % inokulem bakterií mléčného kvašení, v Tabulce 10 údaje fermentace hladké pšeničné mouky v poměru s vodou 3 : 1 s 1 % inokulem bakterií mléčné kyseliny, a v Tabulce 11 údaje fermentace hladké pšeničné mouky v poměru s vodou 3 : 2 s 0,2 % inokulem bakterií mléčného kvašení. Srovnáním vzorků bylo zjištěno, že nejlepší růst bakterií mléčného kvašení byl zaznamenán u vzorku PB3, kam byl přidán největší podíl vody. Bakterie mléčného kvašení za dobu 24 hodin zvýšily svůj počet celkem o 3 řády přičemž počet bakterií čeledi Enterobacteriaceae zůstal nezměněn. Produkce mléčné kyseliny i pokles hodnot pH probíhaly u všech vzorků poměrně plynule.

Tab. 9 Parametry fermentace vzorku PB1 s 10 % inokulem každé jedné kultury a počet mikroorganismů (hladká pšeničná mouka : voda = 1 : 1) Mléčná Čas (hodiny) 0 18

PH

kyselina

5,78 3,36

(%) 18,8 38,8

PCA agar

MRS agar

(KTJ/g)

(KTJ/g)

9

2,43 . 10 6,23 . 109

9

2,18 . 10 4,9 . 1010

M17

VRB

agar

agar

(KTJ/g) 5,42 . 106 2,4 . 107

(KTJ/g) 2,1 . 102 2,0 . 102

Tab. 10 Parametry fermentace ve vzorku PB2 s 1 % inokulem každé jedné kultury a počty mikroorganismů (hladká pšeničná mouka : voda = 3:1) Mléčná Čas (hodiny) 0 30

PH

kyselina

5,80 3,14

(%) 8,0 48,4

PCA agar

MRS agar

(KTJ/g)

(KTJ/g)

5,63 . 107 8,92 . 109

3,21 . 107 1,34 . 109

M17

VRB

agar

agar

(KTJ/g) 1,2 . 103 1,4 . 105

(KTJ/g) 1,1 . 102 2,0 . 102

Tab. 11 Parametry fermentace ve vzorku PB3 0,2 % inokulem každé jedné kultury a počty mikroorganismů (hladká pšeničná mouka : voda = 3 : 2) Mléčná Čas (hodiny) 0 24

pH

kyselina

5,68 3,69

(%) 12 49,6

PCA agar

MRS agar

(KTJ/g)

(KTJ/g)

5

7,45 . 10 4,87 . 108

56

5

6 . 10 1,74 . 108

M17

VRB

agar

agar

(KTJ/g) 3,14 . 102 2,56 . 104

(KTJ/g) 1 . 102 1,5 . 102

5.3.3 Fermentace směsi hladké pšeničné a žitné mouky se směsnou kulturou bakterií mléčného kvašení ve třech fázích Fermentace směsi pšeničné a žitné mouky (v poměru 3 : 2), při stejném poměru s vodou, při teplotě od 25 °C ± 3 °C, přičemž hmotnost s vodou byla stejná (1 kg), byla provedena naočkováním směsnou kulturou bakterií mléčného kvašení (Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450) ve třech fázích. V první fázi byla inokulována třetina celkové hmotnosti mouky a vody s 0,1 % každé jedné kultury. Po 8 hodinách fermentace byla směs použita jako inokulum pro druhou fázi. Byla smíchána s druhou třetinou celkové hmotnosti mouky a

vody. Po 16 hodinách

fermentace začínala třetí fáze, kdy byla smíchána druhá fáze, která byla použita jako inokulum, s třetí třetinou celkové hmotnosti směsi mouky a vody. Fermentace byla následována postupnou změnou hodnoty pH (Tabulka 12) a na konci fermentace byl změřen obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin, jejichž největší podíl tvořila kyselina octová a v menší míře pak propionát a butyrát (Tabulka 13). Brandt (2006) uvádí, že kyselina octová hraje důležitou roli v kvalitě chleba (chuť, inhibice a trvanlivost). Počet mikroorganismů ve vzorcích těsta byl odečítán na Petriho miskách s médii pro určení celkového počtu mikroorganismů a selektivními médii pro růst bakterií mléčného kvašení (MRS půda) na počátku a na konci fermentace (Tabulka 14). Z předchozího

experimentu

bylo

zjištěno,

že

pro

dobrou

reprodukci

mikroorganismů je nejlépe použít 3 díly mouky a 2 díly vody. V tomto případě byla vyzkoušena fermentace pomocí technologie „back-sloping“, čili postupná reinokulace vzorků, která zaručila postupný pokles pH a možnost, aby heterofermentativní bakterie mléčného kvašení vytvořily dostatečné množství aromatických látek. Z mikrobiologické analýzy v Tabulce 14 je vidět, jak probiotické bakterie zvýšily svoji populaci o tři řády. Cílem tohoto experimentu bylo dokázat, že probiotické bakterie se také mohou využívat v technologii produkce fermentovaného těsta, protože naměřené pH i obsah kyseliny mléčné přesně odpovídají požadavkům, které si předurčila jako optimum firma Erns and Böcker, Minden, která financuje projekt „Použití probiotických bakterií pro výrobu kvasu. Využití probiotických bakterií přináší mnohé další výhody, jako je předem potvrzená antimikrobiální aktivita, která zaručuje lepší hygienickou jakost

57

hotového výrobku a produkci vitamínů. Dle Charalampopoulose byla zaznamenána zvýšená hodnota riboflavinu, thiaminu, niacinu a lysinu v důsledků působení bakterií mléčného kvašení ve fermentovaných směsích obilovin.

Tab. 12 Změna hodnoty pH během fermentace provedené ve třech fázích v vzorku PB4 Čas (h) 1. fáze 2. fáze 3. fáze

0 6 6* 24 24*

PH 5,86 5,47 5,73 3,69 4,79

* po přídavku nového množství mouky a vody

Tab. 13 Obsah kyseliny mléčné a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku PB4 Mléčná kyselina (%) 49,6

Těkavé kyseliny (g/l) 3,0

Tab. 14 Mikrobiologická analýza ve vzorku PB4

Čas (h) Začátek fermentace Konec fermentace

5.3.4

M17

VRB

agar

agar

(KTJ/g)

(KTJ/g)

1,07 . 109

4,62 . 104

1 . 101

1,74 . 1012

3,56 . 107

1 . 102

PCA

MRS agar

(KTJ/g)

(KTJ/g)

4,23 . 109 3,75 . 1012

Fermentace těsta ve třech fázích použitím komerčního vzorku suchého kvasu Fermentace mouky (ve stejném poměru s vodou) je provedena ve třech fázích,

při teplotě 25 ± 3 °C, přičemž byl jako inokulum použit komerční vzorek suchého kvasu, který se přidá v první fázi. Těsto z první fáze bylo použito jako inokulum pro druhou fázi. To se pak využilo jako inokulum pro třetí fázi. Fermentace byla provázena změnou hodnoty pH (Tabulky 15, 18 a 21) a na konci fermentace byl určen obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin (Tabulky 16, 19 a 22). Počet

58

mikroorganismů ve vzorcích těsta byl odečten na Petriho miskách s PCA agarem, selektivní půdou pro růst bakterií mléčné kyseliny (MRS médium), na začátku a konci fermentace (tabulky 17, 20 a 23). Fermentace byla provedena u třech různých vzorků komerčního kvasu Böcker Reinzucht – Sauerteig für mehr Brot - Aroma (vzorek B1), Böcker Reinzucht – Sauerteig Weitzen für weitzentypisches aroma (vzorek B2) a Böcker Le Chef Ernst Böcker Gmbh and Co DE 32427 Minden (vzorek B3). Nejdůležitějšími parametry pro produkci chleba bylo pH fermentované mouky, ať už se jednalo o pšeničnou, žitnou mouku nebo směs pšeničné a žitné mouky. Mělo dosáhnout 3,9 – 4 (± 10 %) během 20 – 25 hodin. K okyselení dojít musí, ale nesmí být příliš rychlé, aby aktivita mikroorganismů nebyla inhibována. Obsah mléčné kyseliny by měl být v rozmezí 35 – 40 %. V přehledu těchto tří vzorků můžeme vidět, že u vzorku B2 a B3 došlo k okyselení velice pozdě – u vzorku B2 pH pokleslo na požadovanou hodnotu za 30 hodin a pH B3 až za 45 hodin. U vzorku B1 lze vidět, jak postupně klesalo pH na požadovanou hodnotu v předurčeném čase. Obsah kyseliny mléčné je u všech vzorků nad optimální hodnotou, přičemž vzorek B1 se jí blíží nejvíce. Naopak vzorek B3 ji přesahuje o 200 %. Je třeba poznamenat, že kontaminace vzorků čeledí Enterobacteriaceae byla u všech stejná. Obsah těkavých kyselin udává míru aktivity heterofermentativních bakterií. U vzorku B1 a B2 je obsah velice podobný, ale u vzorku B3 je vidět, že pH kleslo příliš nízko a bakterie nebyly schopné produkovat tolik těkavých kyselin jako u předešlých vzorků. Brandt (2006) uvádí, že TTA je odvislé od technologie výroby suchého kvasu, která lze provádět vymrazovánm, sprejovým nebo bubnovým sušením. V průměru se TTA pohybuje od 40 - 220. Právě u bubnového sušení hodnota TTA většinou přesahuje 200. Tyto kvasy se pak užívají pro pečivo, u kterého je požadovaná vyšší kyselost. Vzhledem k tomu, že bod varu kyseliny octové je 118 °C, její obsah v suchém kvasu silně závisí na technice sušení.

59

Hmotnost startovacího inokula s moukou a vodou po určitých fázích (u všech tří vzorků) je: 1. fáze: Startovací inokulum Žitná mouka Voda Celková hmotnost

m (kg) 0,0085 0,0335 0,0335 0,08

Startovací inokulum Žitná mouka Voda Celková hmotnost

m (kg) 0,0755 0,1845 0,1845 0,4445

Startovací inokulum Žitná mouka Voda Celková hmotnost

m (kg) 0,4445 0,4718 0,4718 1,3886

2. fáze:

3. fáze:

5.3.4.1 Fermentace žitného těsta s Böcker Reinzucht – Sauerteig für mehr Brot Aroma (vzorek B1) Tab 15. Změna hodnoty pH během fermentace provedené ve třech fázích ve vzorku B1 Čas (h) 1. fáze 2. fáze 3. fáze

0 8 8* 24 24* 30

PH 4,95 4,73 4,87 3,71 4,7 3,9

* po přídavku nového množství mouky i vody

60

Tab. 16 Obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku B1 Mléčná kyselina (%) 45,0

Těkavé kyseliny (g/l) 4,8

Tab. 17 Mikrobiologická analýza ve vzorku B1 PCA

MRS agar

VRB agar

(KTJ/g)

(KTJ/g)

(KTJ/g)

5,38 . 108

4,75 . 107

102

2,1 . 1010

1,1 . 109

102

Čas Počátek fermentace Konec fermentace

5.3.4.2 Fermentace bílé pšeničné mouky s Böcker Reinzucht – Sauerteig Weitzen für weitzentypisches aroma (vzorek B2)

Tab 18. Změna hodnoty pH během fermentace provedené ve třech fázích ve vzorku B2 Čas (h) 1. 0 8 fáze 2. 8* 24 fáze 3. 24* 30 fáze

PH 4,95 4,69 4,46 4,92 5,45 3,79

* po přídavku nového množství mouky a vody

Tab. 19 Obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku B2 Mléčná kyselina (%) 62,1

těkavé kyseliny (g/l) 6,0

Tab. 20 Mikrobiologická analýza ve vzorku B2 PCA

MRS agar

VRB agar

(KTJ/g) 6,28 . 108 1,12 . 1010

(KTJ/g) 2,43 . 107 5,61 . 109

(KTJ/g) 1,5 . 102 2,0 102

Čas Počátek fermentace Konec fermentace

61

5.3.4.3

Fermentace bílé pšeničné mouky Böcker Le Chef Ernst Böcker Gmbh

a Co DE 32427 Minden (vzorek B3)

Tab. 21 Změna hodnoty pH během fermentace provedené ve třech fázích ve vzorku B3 Čas (h) 1. fáze 2. fáze 3. fáze

0 8 8* 24 24* 30 45

PH 5,43 5,43 5,54 5,63 5,74 4,76 3,53

* po přídavku nového množství mouky a vody

Tab. 22 Obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku B3 Mléčná kyselina (%) 120

Těkavé kyseliny (g/l) 3,84

Tab. 23 Mikrobiologická analýza vzorku B3 PCA

MRS agar

VRB agar

(KTJ/g)

(KTJ/g)

(KTJ/g)

7,35 . 1010

4,6 . 105

1,0 . 102

4,24 . 1012

5,72 . 109

1,5 . 102

Čas Začátek fermentace Konec fermentace

62

6

ZÁVĚR Využití probiotik a produkce funkčních potravin je pro potravinářský průmysl

velikou výzvou. Je nutné, aby byly produkovány nejen zdravotně nezávadné potraviny, ale také takové potraviny, které mohou spotřebitelům nabídnout vyšší obsah vitamínů a jiné nutričně cenné látky. Protože cereálie tvoří značný podíl stravy, je důležité se zaměřit na vylepšování jejich senzorických, technologických a nutričních vlastností. Kvas obsahuje dostatečné množství potřebných živin, aby v něm mohly růst probiotické bakterie a představuje směr pro vývoj nových funkčních potravin. Bohužel jsou probiotické bakterie v průběhu technologie usmrceny. Chléb tak nemůže mít probiotické účinky sám o sobě. Je ale důležité poznamenat, že probiotika nepůsobí na zdraví jen tím, že se dostanou živé do střevního traktu, ale v syrovém těstě syntetizují mnohé vitamíny (riboflavin, niacin, thiamin) a heterofermentativní bakterie tvoří látky mající vliv na chuť chleba. Obiloviny obsahují omezené množství využitelných aminokyselin díky limitujícímu množství threoninu, lysinu a tryptofanu. Ve srovnání s mlékem ostatními živočisnými produkty vykazují nižší stravitelnost bílkovin. Je to též způsobeno přítomností kyseliny fytové. Charalampopoulus (2006) uvádí, že působením mléčného kvašení je možné

efektivně snížit množství kyseliny fytové a taninů. Tím

se

dostupnost proteinů zlepší. Za poslední desetiletí bylo vyvinuto mnoho směrů využití probiotických kmenů bakterií. Tato studie si dala za úkol dokázat, zdali je možné je využívat i pro produkci kvasu, omládku i poliše. Experimenty prokázaly, že by to bylo nejen možné, ale i velice výhodné, aby místo komerčních suchých kvasů byly využity probiotické bakterie jako Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum A8 a Lactococcus lactis ssp. lactis LMG 9450. Komerční vzorky vykazovaly dobré prarametry, nemohou ale zaručit takovou stabilitu těsta co se týče hygienické jakosti. Jako nejlepší komerční suchý kvas byl posouzen Böcker Reinzucht - Sauerteig fur mehr Brot - Aroma, protože vykazoval výsledky nejvíce se shodující s optimálními parametry.

63

Seznam tabulek, grafů a obrázků: Tab. 1 Faktory způsobující narušení rovnováhy mikroorganismů ve střevě (Šušković, 2001)................................................................................................................................11 Tab. 2 Druhy mikroorganismů použitých v mléčných výrobcích (Šustová, 2008)..........20 Tab. 3 Srovnání probiotik, prebiotik a symbiotik (Crow, 2006)......................................23 Tab. 4 Složení obilovin ve srovnání s mlékem (Charalampopoulus, 2009).....................45 Tab. 5 Rozdělení kvasů a jejich mikroflóra (de Vuys a Neyensen, 2004).......................34 Tab 6. Fermentační profil bakterií mléčného kvašení Lactobacillus

helveticus M92,

Lactobacillus plantarum L4 a Lactobacillus fermentum A8 získané biochemickým testem API 50 CHL..........................................................................................................48 Tab. 7 Výsledky biochemického testu API 20 Strep bakteriálních kmenů Enterococcus faecium L3 a Lactococcus lactis subsp. lactis LMG 9450..............................................49 Tab. 8 Monitorování změn pH hodnot kvašení (provedené s 10 % a 1 % inokulem každé mikrobiální kultury a 10 % inokulace směsnou kulturou) těsta (hladká pšeničná mouka : voda = 2 : 3)......................................................................................................55 Tab. 9 Parametry fermentace vzorku PB1 s 10 % inokulem každé jedné kultury a počet mikroorganismů (hladká pšeničná mouka : voda = 1 : 1) ….........................................56 Tab. 10 Parametry fermentace ve vzorku PB2 s 1 % inokulem každé jedné kultury a počet mikroorganismů (hladká pšeničná mouka : voda = 3 : 1)...................................56 Tab. 11 Parametry fermentace ve vzorku PB3 0,2 % inokulem každé jedné kultury a počty mikroorganismů (hladká pšeničná mouka : voda = 3 : 2)....................................56 Tab. 12 Změna hodnoty pH během fermentace

provedené ve

třech fázích ve

vzorku PB4.......................................................................................................................58 Tab. 13 Obsah kyseliny mléčné a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku PB4.............58 Tab. 14 Mikrobiologická analýza ve vzorku PB4...........................................................58 Tab. 15 Změna vzorku

hodnoty

pH

během

fermentace

provedené ve třech fázích ve

B1......................................................................................................................60

Tab. 16 Obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku B1...............61 Tab. 17 Mikrobiologická analýza ve vzorku B1.............................................................61 Tab. 18 Změna hodnoty pH během fermentace provedené ve třech fázích ve vzorku B2.........................................................................................................................61 Tab. 19 Obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku B2...............61

64

Tab. 20 Mikrobiologická analýza ve vzorku B2.............................................................61 Tab. 21 Změna hodnoty pH během fermentace provedené ve třech fázích ve vzorku B3.........................................................................................................................62 Tab. 22 Obsah mléčné kyseliny a koncentrace těkavých kyselin ve vzorku B3...............62 Tab. 23 Mikrobiologická analýza vzorku B3.................................................................62

Obr. 1 Působení probiotik v těle ….................................................................................14 (dostupné na ) Obr. 2 Kolonie Lactobacillus acidophylus......................................................................15 (dostupné na ) Obr. 3 Kvas ….................................................................................................................27 (dostupné

na


starter7045.jpg>) Obr. 4 Pečení chleba ve středověku.................................................................................29 (dostupné na ) Obr. 5 Francouzský chléb ze San Francisca...................................................................35 (dostupné na ) Obr. 6 Fenotypová identifikace bakterií mléčného kvašení API 50 CHL testem............49 Obr. 7 Fenotypová identifikace kmene Enterococcus bakterie mléčného kvašení API 20 Strep testem.....................................................................................................................50 Obr. 8 SDS - PAGE veškerých buněčných proteinů aplikovaných bakterií mléčného kvašení.............................................................................................................................50 Obr. 9 Fragmenty DNA aplikovaných bakterií mléčného kvašení získaných RAPD metodou...........................................................................................................................51

65

7

POUŽITÁ LITERATURA

BÖCKER G. – STOLZ P. – HAMMES P., 1995: Neue Erkenntnisse zum Ökosystem Sauerteig und zur Physiologie des sauerteigtypischen Sämme Lactobacillus sanfrancisco und Lactobacillus pontis, Getreide Mehl und Brot, s. 370–374 BRANDT M., 2006: Sourdough for convenient use in baking, Elviser, Minden, s. 160 161 CLARKE I. -

SCHOBER J. - ARENDT K., 2000: Effect of single strain and

traditional mixed strain starter cultures on rheological properties of wheat dough and on bread quality. Cereal Chemistry, Faculty of Food Technology and Biotechnology, Zagreb, s. 640 – 647. CROW

D.,

2006:

comprehensive

scientific

rewiew,

DE VUYST L. – NEYSENS P., 2005: The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions, Trends Food Sci Technol 16, Elsevier, Brusel, s. 43 - 56 DIDIER R., 1997: Advanced Sourdough, National Baking Center, Minneapolis, s. 20 – 25 FRECE J. – KOS B. – SVETEC L. – ZGAGA Z. – MRŠA V. – ŠUSKOVIĆ J., 2005: Importance of S - layer proteins in probiotic activity of Lactobacillus acidophylus M92, Faculty of Food Technology and Biotechnology, Zagreb, s. 285 - 292 GÄNGZLE G. – VOGEL F., 2003: Contribution or reutericyclin production to the stable persistance of Lactobacillus reuteri in an industrial sourdough fermentation, Elsevier, Brussel, 45 s. GIANOTTI A. - VANNINI L. - GOBBETTI M. - CORSETTI A. - GARDINI F. GUERZONI M., 1997: Modeling of the activity of selected starters during sourdough fermentation. Food Microbiology, Elsevier, Brusel, s. 327 – 337 GOKTEPE I. – JUNEJA V. - AHMEDNA M., 2006: Probiotics in food and human health, CRC Press, Boca Raton, 494 s. GEDDES – KAISER – LEWUS – ROSS a kol., 1999: Developing aplications for lactococcal bacteriocins, Kluwer Academics, Dordrecht, s. 337 - 346 HVÍZDALOVÁ

I.,

2009:

Biologické

působení

probiotických



66

kultur,

HAMMES P. – STOLZ P. – GÄNZLE M., 1996: Metabolism of lactobacilli in traditional sourdough, Elsevier, Brussel, s.176 – 184 CHARALAMPOPOULOS D. – RASTALL R., 2009:

Prebiotics and Probiotics

science and technology, Springer , Whiteknights, 1265 s CHARALAMPOPOULOS D. – WAN R. – PANDIELLA S., 2002: Aplication of cereals and cereal components in functional food, C Webb, Manchester, 10 s. OUWEHAND A. – VAUGHAN E., 2006: Gastrointestinal Microbioloy, Taylor and Francis group, New York, 413 s. JANDOVÁ K.: Kvásek na chleba – starý dobrý pomocník, KALAČ P., 2003: Funkční potraviny, kroky ke zdraví, Dona, České Budějovice, 130 s. KARPA K., 2003: Bacteria for breakfast, Trafford publishing, Victoria, 336 s. KOVAŘÍKOVÁ E. – ERBAN E., 2007: Probiotika – přátele nejbližší, Výživa a potraviny 62/07, č. 6, s. 153 – 155s KOS B., 2001: Probiotički koncept: in vitro istraživanja s odabranim bakterijama mliječne kiseline, PhD Thesis, Faculty of Food Food Technology and Biotechnology, Zagreb, KOS B. - ŠUŠKOVIĆ J. - BEGANOVIĆ J. - GJURANČIĆ K. - FRECE J. IANNACCONE C. - CANGANELLA F., 2008: Characterization of the three selected probiotic strains for the application in food industry, World J.Microbiol. Biotechnol., Springer, Zagreb, s. 699 – 707 KOS B. - ŠUŠKOVIĆ J. - VUKOVIĆ S. - ŠIMPRAGA M. - FRECE J. - MATOŠIĆ S., 2003 : Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J. Appl. Microbiol.,Faculty of Food Technology and Biotechnology, Zagreb, s. 981–987. KUČEROVÁ J., 2004: Technologie cereálií, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 141 s. LIPSKÁ L. – VISOKAI V. a kol., 2009: recidivita kolorektálního karcinogenu, Grada Publishing, Praha, 431 s. MALCATA G., 1999: Bifidobacterium ssp. and Lactobacillus acidophylus: biological, biochemical, technological and therapeutical properites relevant for use as probiotics, Brussel, Elsevier, 157 s.

67

MARKLINDER I. – LÖNNER C., 1992: Fermentation properities of intestinal strains of Lactobacillus, of a sourdough and of a yoghurt starter culture in an oat-based nutritive solution, Elsevier, Brussel, 205 s. McGEE H., 2004: On Food and Cooking: The Science and Lore of the Kitchen, New York, Scribner, 544 s. MEULEN R. a kol., 2007: Screening of lactic acid bacteria isolates from diary and cereal products for exopolysacharide production and genes involved, Elsevier, Brussel, 258 s. NEVORAL J., 2005: Probiotika, Prebiotika a synbiotika, Pediatrická klinika 2. LF UK a FN Motol, Praha, s. 60 - 65 NOUT R. – WOSI W. – ZWIETERING M., 2005: Food Fermentation, Wageningen Academic Publishers, The Netherlands, 182 s. O’RIORDAN K. -

BUCKLE K. -

CONWAY P., 2001: Evaluation of

microensapsulation of a Bifidobacteria strains with starch as an approach to prolonging viability during storage, Elsevier, Brussel, s. 1059 – 1066 RAYENER L., 2009: Hand - baked sourdough Artisan breads in your own Kitchen, Lifeweawer, 170 s. RENNEBERG R. – DEMAIN A., 2008: Biotechnology for beginners, Elviser, Berlin, 349 s. SCHEIRLINCK I. – MEULEN R. – VUYST L. – VANDAMME P. – HUYS G., 2009: Molecular source tracking of predominant lactic acid bacteria in traditional Belgian sourdough and their production enviroments, Elsevier, Brussel, 1092 s. SVAČINA Š., 2008: Klinická dietologie, Grada Publishing, Praha, 384 s. SOLZ P.- BÖCKER G., 1996: Technology, properties and applications of sourdough products, Advances in Food Science, Stuttgart, s. 234 – 236 ŠUSTOVÁ K., 2008: Fermentované mléčné výrobky, Ústav technologie potravin, Brno, 9 s. ŠUŠKOVIĆ J. - BRKIĆ B. - MATOŠIĆ S., 1997: Mehanizam probiotičkog djelovanja bakterija mliječne kiseline, Mljekarstvo, Faculty of

Food Technology and

Biotechnoloy, Zagreb, s. 107-112 ŠUŠKOVIĆ J. – KOS B. – GORETA J. – MATOŠIĆ S., 2001: Role of Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria in symbiotic Effect, Elsevier, Zagreb, 235 s.

68

TAMIME Y., 2005: Probiotic diary products, Wiley-Blackwell, Oxford, 266 s. TANNOCK G., 2007: Probiotics and Prebiotics – where are we going?, Caister Academic Press, Wymondham, 335 s. VUYST L. – NEYENS P., 2005: Biodiversity of sourdough lactic acid bacteria, Trends Food sci. Technol.,elsevier, Brussel, s. 120 - 127 VUYST L. – VRANCKEN G. – RAVYTS F. – RIMAUX T. – WECK S., 2009: Biodiversity of ecological determinants, and metabolic exploitation of sourdough microbiota, Elsevier, Brussel, 10 s. VUYST L. – NEYENS P., 2004: The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions, Elsevier, Brusel, 14 s. YOUSEF A. – CARLSTORM C., 2003: Food microbiology: a laboratory manual, Wiley – IEEE, New Jersey, 277 s. Vyhláška 77/ 2003 Sb., kterou se stanovují požadavky na mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje

69