Veterinaria Medika
Vol 7, No. 1, Pebruari 2014
Potensi Mycotoxin Binders Terhadap Berat dan Panjang Fetus Mencit (Mus musculus) Bunting yang Terpapar Zearalenone Potential of Mycotoxin Binders on Weight and Length of Fetus Pregnant Mice (Mus musculus) with Zearalenone Exposure 1
Nowo Siswo Yuworo, 2Abdul Samik, 1 Dikky Eka Mandala P, 1Kartika Eka Paksi 1
Program Magister Ilmu Biologi Reproduksi Universitas Airlangga 2 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya-60115 Telp. 031-5992785, Fax. 031-5993015 Email:
[email protected]
Abstract Zearalenone (ZEN), an estrogenic mycotoxin, is produced mainly by Fusarium fungi. Previous studies indicated that acute ZEN exposure induced oxidative stress and damage in multiple organs. In order to study the potential mycotoxin binders to eleminate the effect of zearalenon and to decrease apoptotic factors in fetal. The research has been done on Desember 2013 till January 2014. We used 20 pregnant mices randomly divided into 5 groups and each other have 4 examination. All groups were given treatment per oral with sonde till 10 days. K+ as positive control weren’t treated zearalenone and mycotoxin binders, K- as negative control were treated with zearalenone 0,1 mg/mice/day, P1 were treated with zearalenone 0,1 mg/mice/day and mycotoxin binders 0,5 mg/mice/day, P2 were treated with zearalenone 0,1 mg/mice/day and mycotoxin binders 1 mg/mice/day, P3 were treated with zearalenone 0,1 mg/mice/day and mycotoxin binders 2 mg/mice/day. The data was analyzed by ANOVA and to compare the mean differences among treatments tested by Duncan’s multiple range test. The result showed that the amount of weight not significant (p>0,05) between K- with K+, P1, P2, P3. The lenght not significant between P2, P3 with K+, K-, P1. The conclusion in this study, mycotoxin binders was not significant to reduce weight and lenght fetus of pregnant mice with exposure zearalenone. Keywords: Zearalenone, mycotoxin binders, weight and length of fetus, pregnant mice (Mus musculus) Pendahuluan Pakan adalah bahan makanan tunggal atau campuran, baik yang diolah maupun yang tidak diolah, yang diberikan kepada hewan untuk kelangsungan hidup, berproduksi, dan berkembang biak (Anggorodi, 1994). Jagung merupakan bahan pakan berenergi tinggi dengan kandungan protein yang relatif rendah jika dibandingkan dengan pakan biji-bijian lainnya. Kadar protein jagung sekitar 8,6 % - 9,0% (Lardy, 2013). Jamur Fusarium graminearum merupakan flora patogen yang dapat menyerang jagung dan mampu menghasilkan mikotoksin zearalenone (ZEN) (Riley et al., 2011).
81
Nowo Siswo Yuworo, dkk. Potensi Mycotoxin Binders Terhadap Berat ....
ZEN tersebut bila berikatan dengan reseptor estrogen (E2R) di sel granulosa akan membentuk Zearalenone Estrogen receptors complex (ZEN-E2R). ZEN-E2R meningkatkan proliferasi sel granulosa pada ovarium, dapat berdampak meningkatnya sekresi estrogen yang disebut hiperestrogenisme (Gajecka, 2013). Secara molekuler kondisi hiperestrogenisme yang disebabkan oleh ZEN dapat menghadirkan stres oksidatif dan menginduksi apoptosis jalur intrinsik dalam mitokondria (Zinedine et al., 2007). Mycotoxin binders efektif bekerja mengikat mikotoksin pada pakan. Mycotoxin binders mengandung bahan yang berpotensi besar untuk diserap termasuk karbon aktif aluminosilikat, selulosa, polisakarida, peptidoglikan, dan polimer sintetis seperti cholestryamine, polivinilpirolidon beserta turunannya (Avantaggiato et al., 2005). Mekanisme kerja mycotoxin binders dengan mengeliminasi gugus metil pada struktur kimia ZEN serta memunculkan senyawa charcoal, biotin, tiamin, aluminosilikat, serta vitamin C dan E yang bersifat antioksidan untuk menurunkan dampak paparan dari residu mikotoksin sebelum dimetabolisme tubuh (Doll et al., 2004). Materi dan Metode Penelitian Bahan Penelitian Bahan untuk gertak birahi : hormone PMSG diberikan secara subkutan sebanyak 5 IU kemudian HCG untuk superovulasinya diberikan sebanyak 5 IU 48 jam setelah pemberian PMSG. Bahan untuk perlakuan mycotoxin binders dan zearalenon® (Tocris Bioscience). Peralatan Penelitian Peralatan yang digunakan meliputi : jarum sonde lambung dan spuit, kandang hewan coba, tempat pakan dan minum, dissecting set, papan seksi, penggaris, timbangan digital dengan skala gram untuk mengukur dosis mycotoxin binders, zearalenon dan berat fetus mencit. Mekanisme Pengawinan Mencit Mencit dikawinkan secara bertahap sesuai dengan kelompok perlakuan, dengan cara dikumpulkan dengan satu mencit jantan dalam satu kandang (personal mating). Mencit betina yang sudah kawin bisa diketahui dengan memeriksa sumbat vagina (vaginal plug) pada 17 jam sesudah penyuntikan HCG. Sumbat vagina terdiri dari gelatin yang sudah menggumpal dan berfungsi agar spermatozoa tidak tumpah keluar. Apabila terdapat sumbat vagina maka dianggap kopulasi telah terjadi dan pada saat itu dianggap kebuntingan hari ke nol. Mekanisme Perlakuan Paparan zearalenon diberikan secara peroral pada mencit yang sedang bunting dengan dosis 0 mg/ekor/hari, 0,14 mg/ekor/hari, 0,56 mg/ekor/hari, 1,12 mg/ekor/hari dan 1,12 mg/ekor/hari dengan penambahan mycotoxin binders dosis 2 mg/ekor/hari sebagai kelompok control positif (K+). Pemberian dilakukan secara peroral dengan jarum sonde lambung dan dilakukan secara berulang sampai pada hari ke 10 sejak hari pertama perlakuan. Cara Pengambilan Data Mencit yang telah dibuntingkan, pada hari ke 11 dibedah dengan teknik laparotomi untuk mengambil bagian uterus. Selanjutnya fetus dikeluarkan dan
82
Veterinaria Medika
Vol 7, No. 1, Pebruari 2014
dipisahkan dari plasenta materna. Berat fetus diketahui dengan cara ditimbang pada timbangan analitik. Sedangkan panjang fetus diukur dengan penggaris di atas medan terang. Cara Analisis Data Hasil rata-rata berat dan panjang fetus didapat dari ulangan pada masing-masing perlakuan. Selanjutnya hasil rata-rata tersebut dianalisis dengan Analysis of Varian (ANOVA). Jika terdapat hasil yang berbeda nyata (p<0,05) maka dilanjutkan dengan uji Duncan. Hasil dan Pembahasan Dari hasil analisis statistik dengan uji homogenitas Kolmogorov-Smirnov didapatkan hasil signifikansi (p>0,05) yang artinya bahwa data homogen dan terdistribusi normal sehingga analisis selanjutnya menggunakan uji ANOVA. Pada uji ANOVA untuk berat badan fetus tidak terdapat perbedaan yang nyata antara K+, P1, P2, P3 dan K-. Untuk panjang fetus tidak terdapat perbedaan nyata antara K+, K-, P1 dan P2, P3. Hasil tersebut dilanjutkan dengan uji Duncan’s multiple range test, dan dapat dilihat pada tabel sebagai berikut : Tabel 1. Rerata Berat dan Panjang Fetus pada Semua Kelompok Perlakuan Weight Lenght Perlakuan Mean ± SD Mean ± SD b K+ 1,05 ± 0,01 2,20a± 0,24 K0,87a± 0,58 2,05a ± 0,58 b P1 1,02 ± 0,01 2,03a± 0,89 P2 1,03b± 0,08 2,72b± 0,14 b P3 1,01 ± 0,01 2,91b± 0,48 Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata antar tiap perlakuan (p<0,05) Zearalenon merupakan mikotoksin estrogen non steroid karena dibiosintesis oleh jamur Fusarium graminearum (Frizzell et al., 2011). Zearalenon memiliki struktur resorcyclic acid lactone yang dapat menembus membrane sel untuk mengikat reseptor estrogen (E2) di dalam sitosol dan membentuk Zearalenone E2 Receptor Complex (ZEA-E2R). Kompleks ini akan ditransfer menuju inti sel dan mengikat reseptor estrogen spesifik di inti sel yang akan mengaktifkan respon mRNA yang biasanya diperankan oleh reseptor estrogen (E2) (Frizzell et al., 2011). Zearalenon juga dimetabolisme di hati dengan enzim dehidrogenase hidroksisteroid yang diubah menjadi dua isomer metabolit, yakni α Zearalenol dan β Zearalenol. Kedua isomer ini yang dapat bekerja mengaktifkan reseptor estrogen (E 2) dan mengakibatkan kadar estrogen meningkat disebut hiperestrogenisme. Keberadaan α Zearalenol dan β Zearalenol berlebihan dalam darah dapat berdampak tidak terkontrolnya proliferasi sel sehingga memacu terjadinya karsinogenik (Malekinejad et al., 2005; Fink-Gremmels, 2008; Frizzell et al., 2011). Estrogen bersifat lipofilik sehingga dapat dengan mudah menembus lapisan lipid bilayer. Mitokondria bertindak sebagai organel utama dalam mengkontrol sintesis hormone steroid sehingga akan mengalami ketidakseimbangan apabila terdapat perpindahan estrogen eksogen yang dibiosintesis dari mikotoksin zearalenon (Frizzell et
83
Nowo Siswo Yuworo, dkk. Potensi Mycotoxin Binders Terhadap Berat ....
al., 2011). 75% hormone estrogen eksogen akan ditransfer menuju mitokondria dan bukan menuju inti sel hati, kelenjar adrenal ataupun sel limpa (Felty dan Roy., 2005). Gangguan pada mitokondria akan mengakibatkan aktifnya megachannel sehingga akan berdampak pada kegagalan transport electron. Aktifnya megachannel juga akan diikuti masuknya ion Ca2+ ekstrasel dan terakumulasi dengan ion Ca 2+ intrasel yang terdapat pada mitokondria dan reticulum endoplasma. Kadar Ca2+ yang tinggi akan mengakibatkan peningkatan permeabilitas membrane pada mitokondria serta akan diekspresikan sejumlah proapoptotik protein seperti bax, bcl 2, bak yang akan membawa sinyal apoptosis jalur intrinsic (Kilianska dan Miśkiewicz, 2003; Maresca dan Fantini, 2010). Ekspresi bax yang berlebihan dalam sitosol akan merusak membrane mitokondria dan meriliskan sitokrom c ke sitosol. Rilisnya sitokrom c dapat menyebabkan oligomerasi Apoptotic Protease Activating Factor 2 (Apaf 2) ke kompleks yang disebut apoptosom. Apoptosom akan ditangkap dan mengaktifkan caspase 9 (Kumar et al., 2005). Peningkatan permeabilitas membran sel akibat toksin zearalenone dapat mengaktifkan caspase-3, sehingga terjadinya fragmentasi DNA, kemudian sel mengalami apoptosis (Abid-Essefi et al. 2004). Apoptosis, atau kematian sel terprogram, adalah mekanisme alami dimana tubuh menghilangkan sel-sel yang tidak perlu atau berpotensi berbahaya untuk mempertahankan fungsi jaringan normal. Selama implantasi, apoptosis penting bagi remodelling jaringan yang sesuai dari desidua induk dan invasi perkembangan embrio (Payne et al., 1999; Galan et al., 2000). Apoptosis di lapisan trofoblas dari plasenta dari kehamilan normal selama kehamilan lebih tinggi pada trimester ketiga dibandingkan dengan plasenta trimester pertama (Smith et al., 1997). Hal ini menunjukkan bahwa regulasi apoptosis plasenta sangat penting untuk fisiologi normal kehamilan. Namun, peningkatan apoptosis trofoblas adalah kondisi patologis yang menyebabkan komplikasi kehamilan seperti aborsi, lahir mati dan berat lahir fetus rendah (Aschkenazi et al., 2002). Aktifnya megachannel karena gangguan pada mitokondria dan terjadinya reaksi apoptosis juga dapat meningkatkan kadar Reactive Oxygen Species (ROS) yang dapat tertranslokasi melewati darah menuju otak, limpa, hati, plasenta dan kelenjar mammae. Hasil dari proses fosforilasi oksidatif yang merupakan radikal bebas yang bersifat oksidator akan membentuk ROS. Radikal bebas pada sel hidup dapat terbentuk pada membrane plasma dan organel seperti mitokondria, reticulum endoplasma dan sitosol melalui proses metabolism (Hougaard et al., 2011; Dachlan dkk., 2011) Mycotoxin binders mengandung bahan yang berpotensi besar untuk diserap termasuk karbon aktif aluminosilikat, selulosa, polisakarida, peptidoglikan, dan polimer sintetis seperti cholestryamine, polivinilpirolidon beserta turunannya (Avantaggiato et al., 2005). Mekanisme kerja mycotoxin binders dengan mengeliminasi gugus metil pada struktur kimia zearalenon serta memunculkan senyawa charcoal dan aluminosilikat untuk menurunkan dampak paparan dari residu mikotoksin sebelum dimetabolisme tubuh (Doll et al., 2004). Kesimpulan Berdasarkan hasil analisis data dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa mycotoxin binders tidak signifikan memperbaiki berat dan panjang fetus mencit (Mus musculus) bunting yang terpapar zearalenone.
84
Veterinaria Medika
Vol 7, No. 1, Pebruari 2014
Daftar Pustaka Abid-Essefi, S., Z. Ouanes., W. Hassen., I. Baudrimont., E. Creppy., and H. Bacha. 2004. Cytotoxicity, inhibition of DNA and protein syntheses and oxidative damage in cultured cells exposed to zearalenone. J.Toxicol In Vitro. 18: 467– 474. Anggorodi, H.R. 1994. Ilmu Makanan Ternak Umum. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. 2 Aschkenazi, S., S. Straszewski., K.M. Verwer., H. Foellmer., T. Rutherford and G. Mor. 2002. Differential regulation and function of the fas/fas ligand system in human trophoblast cells. J.Biol Reprod. 66 : 1853–1861. Avantaggiato, G., M. Solfrizzo and A. Visconti. 2005. Recent advances on the use of adsorbent materials for detoxification of Fusarium mycotoxins. Food Additives and Contaminants. 22: 379–388. Dachlan, E.G., Widjiati dan B. Santoso. 2011. Pengaruh Paparan Partikulat Jelaga terhadap Peningkatan Lipid Peroksidase, Kejadian Apoptosis Plasenta dan Luaran Kebuntingan pada Mekanisme Molekuler Gangguan Kebuntingan Tikus (Rattus novergicus). Laporan Penelitian. Universitas Airlangga. Döll, S., S. Dänicke., H. Valenta and G. Flachowsky. 2004. In vitro studies on the evaluation of mycotoxin detoxifying agents for their efficacy on deoxynivalenol and zearalenone. J. Arch. Anim. Nutr. 58: 311-324. Felty, Q and D. Roy. 2005. Estrogen, mitochondria and growth of cancer and noncancer cells. J Carcinog 4: 1. Fink-Gremmels, J. 2008. The role of mycotoxins in the health and performance of dairy cows. J. Veterinary. 176(1) : 84-92. Frizzell, C., D. Ndossi., S. Verhaegen., E. Dahl., G. Eriksen., M. Srrlie., E. Ropstad., M. Muller., CT. Elliott and L. Connolly. 2011. Endocrine disrupting effects of zearalenone, alpha- and beta-zearalenol at the level of nuclear receptor binding and steroidogenesis. J. Toxicol Lett. 206: 210-217. Galan, A., J.E. O’Connor., D. Valbuena., R. Herrer., J. Remohi., S. Pampfer., A. Pellicer., and C. Simon. 2000. The human blastocyst regulates endometrial epithelial apoptosis in embryonic adhesion. J. Biol Reprod. 63 : 430–439. Gajecka, M. 2013. The effect of experimental low zearalenone intoxication on ovarian follicles in pre-pubertal bitches . Pol J Vet Sci. 16: 45-54. Hougaard, K.S., B. Fadeel., M. Gulumian., V.E. Kagan and K. Savolainen. 2011. Developmental Toxicity of Engineered Nanoparticles. In: Gupta RC, editor. Reproductive and Developmental Toxicology. Academic Press. Amsterdam. 269-290. Kiliańska, Z.M and A. Miśkiewicz. 2003. Caspases of the vertebrates – their role in apoptosis. Postępy Biologii Komórki. 30: 129-152. Kumar, V., R.S. Cotran and S. Robins. 2005. Basic Pathology 7th Ed Saunders Philadelphia. Alih bahasa. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. 3-33 Lardy, G. 2013. Feeding Corn to Beef Cattle. Department Head Animal Sciences. North Dakota State University. Fargo. North Dakota. Malekinejad, H., R.F. Mass-Bakker and J. Fink-Gremmels. 2005. Bioactivation of zearalenone by porcine hepatic biotransformation. In Veterinary Research. 36 (5-6) : 799-810.
85
Nowo Siswo Yuworo, dkk. Potensi Mycotoxin Binders Terhadap Berat ....
Maresca, M., J. Fantini. 2010. Some food-associated mycotoxins as potential risk factors in humans predisposed to chronic intestinal inflammatory diseases. J.Toxicol. 56: 282-294. Payne, S.G., S.C. Smith., S.T. Davidge., P.N. Baker and L.J. Guilbert. 1999. Death receptor Fas/Apo-1/CD95 expressed by human placental cytotrophoblasts does not mediate apoptosis. J. Biol Reprod. 60: 1144–1150. Riley, RT., K.A. Voss., R.A. Coulombe., J.J. Pestka., and D.E. Williams. 2011. Developing mechanism-based and exposure biomarkers for mycotoxins in animals. In: DeSaeger, S., editor. Determining Mycotoxins and Mycotoxigenic Fungi in Food and Feed. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. 245275. Smith, SC., PN. Baker., and EM. Symonds. 1997. Placental apoptosis in normal human pregnancy. Am J Obstet Gynecol,vol. 177, pp. 57–65. Zinedine, A., JM. Soriano., JC. Molto., and J. Manes. 2007. Review on the toxicity, occurrence, metabolism, detoxification, regulations and intake of zearalenone: An oestrogenic mycotoxin. Food and Chemical Toxicology. Vol 45: 1-18.
86
