POTENSI EKSTRAK Rhizophora sp. SEBAGAI INHIBITOR TIROSINASE
ANASTASIA LIEKE LIANADEVY NURREFIYANTI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK ANASTASIA LIEKE LIANADEVY NURREFIYANTI. Potensi Ekstrak Rhizophora sp. sebagai Inhibitor Tirosinase. Dibimbing oleh ETI ROHAETI dan IRMANIDA BATUBARA. Rhizophora sp. merupakan salah satu jenis tanaman yang memiliki banyak manfaat sebagai bahan obat herbal, salah satunya sebagai pemutih kulit. Penelitian ini bertujuan mencari bagian dan jenis dari Rhizophora sp. yang memiliki aktivitas inhibitor tirosinase paling baik. Bagian daun, batang, dan akar R. mucronata dan R. stylosa diekstraksi dengan metanol dan diuji aktivitasnya untuk mendapatkan aktivitas inhibitor tirosinase paling baik. Berdasarkan hasil yang diperoleh, ekstrak daun, batang, dan akar R. mucronata dari daerah Tritih, Cilacap; Gebang, Cirebon; Eretan Kulon, Indramayu; Pantai Ujung Negoro, Batang; Pantai Sigundu, Batang; dan Pantai Kapuk, Jakarta tidak memiliki potensi inhibitor tirosinase. Dari segi monofenolase, aktivitas akar R. mucronata dari Samboja, Kalimantan Timur memberikan daya inhibisi yang lebih baik daripada daun dan batangnya dengan IC50 sebesar 15.34 µg/ml. Demikian pula, batang R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memberikan daya inhibisi yang lebih baik daripada batang R. mucronata, yaitu IC50 sebesar38.02 µg/ml.
ABSTRACT ANASTASIA LIEKE LIANADEVY NURREFIYANTI. Potency of Rhizophora sp. Extracts as Tyrosinase Inhibitor. Supervised by ETI ROHAETI and IRMANIDA BATUBARA. Rhizophora sp. is one of plant type that has benefit as medicinal plants, for example, as whitening agent. The purpose of this study is to discover the parts and species of Rhizophora sp. which have best tyrosinase inhibitory activity. Leaves, stems, and roots of R. mucronata and R. stylosa were extracted with methanol and were tested their activities in order to obtain the best tyrosinase inhibitory activity. Based on the results, extracts of leaves, stems, and roots of R. mucronata from Tritih, Cilacap; Gebang, Cirebon; Eretan Kulon, Indramayu; Ujung Negoro Beach, Batang; Sigundu Beach, Batang; and Kapuk Beach, Jakarta were not potencial as tyrosinase inhibitor. Tyrosinase inhibitor activity from roots of R. mucronata from Samboja, East Kalimantan was higher than from its leaves and stems, especially for monophenolase with IC50 15.34 µg/ml. In perponderonce with, tyrosinase inhibitor activity from stems of R. stylosa from Samboja, East Kalimantan was also higher compared with stems of R. mucronata with IC50 38.02 µg/ml.
POTENSI EKSTRAK Rhizophora sp. SEBAGAI INHIBITOR TIROSINASE
ANASTASIA LIEKE LIANADEVY NURREFIYANTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul : Potensi Ekstrak Rhizophora sp. sebagai Inhibitor Tirosinase Nama : Anastasia Lieke Lianadevy Nurrefiyanti NIM : G44061757
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Eti Rohaeti NIP. 19600807 198703 2002
Dr. Irmanida Batubara, S. Si, M. Si NIP. 19750807 200501 2001
Mengetahui: Ketua Departemen,
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS NIP. 19501227 197603 2002
Tanggal lulus :
PRAKATA Segala puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa dengan berkat rahmat dan karunia-Nya, penulis dapat menyusun dan menyelesaikan skripsi. Skripsi ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Februari sampai Agustus 2010 di Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia FMIPA IPB, Laboratorium Biokimia Departemen Biokimia FMIPA IPB, dan Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Eti Rohaeti dan Dr. Irmanida Batubara, S. Si, M. Si selaku pembimbing yang telah banyak memberi arahan, motivasi, saran, dan solusi dari setiap permasalahan hingga terselesaikannya skripsi ini. Selain itu, penulis juga mengucapkan terima kasih kepada orang tua (Papi dan Mami), kakak adik (Ka Desy, Ka Angga, dan Rio), dan sahabat (Agnes, Mitha, Ranti, Laela, dan Nadya) yang telah memberikan kasih sayang, dorongan, dan doa kepada penulis selama menempuh studi, penelitian, dan penulisan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada staf Laboratorium Kimia Analitik, Laboratorium Biokimia, dan Pusat Studi Biofarmaka. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh rekan-rekan di Laboratorium Kimia Analitik (Ani, Rifa, Made, Puput, dan Tyo) dan teman-teman Kimia 43 atas semangat dan motivasinya kepada Penulis, atas diskusi, kerja sama, dan kebersamaan selama penulis menempuh studi dan menjalankan penelitian. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan secara umum.
Bogor, Agustus 2010 Anastasia Lieke Lianadevy Nurrefiyanti
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 2 Juli 1988 dari Bapak Yohanes Sriyanto dan Ibu Sondang Refiana. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara. Penulis menyelesaikan studi di SMA Negeri 90 Jakarta pada tahun 2006. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) pada Program Studi Kimia FMIPA melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama mengikuti masa perkuliahan penulis pernah aktif dalam organisasi Unit Kegiatan Mahasiswa Katolik (KEMAKI) IPB. Selain itu, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Lingkungan pada tahun 2008/2009; mata kuliah Elektroanalitik dan Teknik Pemisahan pada tahun 2008/2009; dan mata kuliah Kimia Analitik Layanan pada tahun 2009/2010, penulis berkesempatan melaksanakan kegiatan Praktik Lapangan di PT Tudung Putra Putri Jaya (Garudafood) Jakarta.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................................ vii DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................................viii PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1 TINJAUAN PUSTAKA Melanin dan Enzim Tirosinase ............................................................................ 1 Rhizophora sp ......................................................................................................... 2 Kromatografi Lapis Tipis ............................................................................ 3 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ............................................................................................ 3 Metode ........................................................................................................ 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Identifikasi Tanaman .......................................................................... Kadar Air .................................................................................................... Kadar Abu .................................................................................................. Ekstraksi ..................................................................................................... Uji Fitokimia ............................................................................................... Pelarut Terbaik ............................................................................................ Uji Aktivitas Inhibitor Tirosinase ................................................................ Perbandingan Pola Kromatografi Lapis Tipis ..............................................
5 5 6 6 6 7 8 8
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .....................................................................................................10 Saran ...........................................................................................................10 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................10 LAMPIRAN .....................................................................................................12
vii
DAFTAR TABEL Halaman 1
Kadar air daun, batang, dan akar Rhizophora sp. ......................................... 5
2
Kadar abu daun, batang, dan akar Rhizophora sp. ....................................... 6
3
Rendemen ekstrak R. mucronata dan R. stylosa dari berbagai daerah .......... 6
4
Hasil uji fitokimia daun, batang, dan akar Rhizophora sp. ............................ 6
5
Nilai IC50 pada daun, batang, dan akar Rhizophora sp. ................................. 8
6
Nilai Rf ekstrak daun, batang, dan akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah ....................................................................................10
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Reaksi tirosinase ......................................................................................... 2
2
Rhizophora stylosa dan Rhizophora mucronata............................................ 3
3
Hasil elusi ekstrak maserasi menggunakan fase diam pelat silika gel dan enam pelarut tunggal, yaitu aseton, eter, kloroform, heksana, metanol, dan etil asetat .............................................................................................. 7
4
Hasil elusi ekstrak maserasi menggunakan fase diam pelat silika gel dengan komposisi kloroform dan metanol dengan nisbah 9:1; 6:1; 3:1; 1:9; 1:6; dan 1:3 ............................................................................. 8
5
Hasil elusi ekstrak daun Rhizophora sp. dari berbagai daerah dengan UV 366 nm ..................................................................................... 9
6
Hasil elusi ekstrak batang Rhizophora sp. dari berbagai daerah dengan UV 366 nm ..................................................................................... 9
7
Hasil elusi ekstrak akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah dengan UV 366 nm ..................................................................................... 9
viii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Diagram alir penelitian ................................................................................13
2
Uji fitokimia ................................................................................................14
3
Penetapan kadar air serbuk daun Rhizophora sp. .........................................15
4
Penetapan kadar air serbuk batang Rhizophora sp. .......................................16
5
Penetapan kadar air serbuk akar Rhizophora sp. ...........................................17
6
Penetapan kadar abu daun Rhizophora sp.....................................................18
7
Penetapan kadar abu batang Rhizophora sp. .................................................19
8
Penetapan kadar abu akar Rhizophora sp......................................................20
9
Rendemen ekstrak kasar daun Rhizophora sp. dari berbagai daerah ...........21
10 Rendemen ekstrak kasar batang Rhizophora sp. dari berbagai daerah ........22 11 Rendemen ekstrak kasar akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah ............23 12 Uji aktivitas R. mucronata, R. stylosa, dan asam kojat ...............................24
1
PENDAHULUAN Tirosinase atau fenol oksidase adalah enzim utama yang terlibat dalam biosintesis melanin. Pigmen melanin, yang diproduksi melalui proses fisiologis yang disebut melanogenesis, memegang peranan yang sangat penting dalam melindungi kulit terhadap fotokarsinogenesis. Namun demikian, inhibisi terhadap enzim tirosinase untuk mengatur metabolisme pigmentasi telah menarik banyak perhatian terutama dalam dunia kosmetika. Oleh karena itu, beberapa senyawa aktif yang berasal dari tumbuhtumbuhan diteliti sebagai inhibitor tirosinase untuk menghindari produksi melanin secara berlebihan pada lapisan epidermal, sehingga dapat digunakan sebagai bahan kosmetik, atau sebagai bahan pemutih kulit (Zheng et al. 2008). Tirosinase banyak ditemukan pada mamalia, buah-buahan, dan juga di dalam proses pencokelatan jamur secara enzimatik (Chang 2009). Tirosinase mengkatalisis dua reaksi yang berbeda dalam pembentukan melanin, yaitu hidroksilasi tirosin menjadi dihidroksifenilalanin (DOPA) (monofenol) dan DOPA menjadi DOPA-kuinon (difenol) (Sanchez et al. 1995). Hambatan pada pembentukan ataupun aktivitas enzim ini akan menyebabkan pigmen melanin berkurang atau tidak terbentuk sehingga kulit menjadi putih. Rhizophora sp. merupakan salah satu jenis tanaman di Indonesia yang berfungsi sebagai bahan kosmetika. Senyawa aktif yang berada pada Rhizophora sp berfungsi sebagai inhibitor tirosinase yang dapat menurunkan penyakit hiperpigmentasi dan melanogenesis pada kulit (Batubara et al. 2010). Tanaman Rhizophora sp. di Indonesia ditemukan dalam berbagai spesies, seperti R. mucronata, R. stylosa, dan R. apiculata. Oleh sebab itu, pada penelitian ini potensi ekstrak maserasi Rhizophora sp. dari berbagai daerah terhadap inhibisi tirosinase diteliti untuk menemukan spesies yang memberikan potensi terbaik.
TINJAUAN PUSTAKA Melanin dan Enzim Tirosinase Melanin atau pigmen merupakan zat yang memberi kulit dan rambut warna alami. Pada manusia yang memiliki kulit yang lebih gelap, jumlah melanin yang dimiliki lebih tinggi.
Sebaliknya, pada kulit yang lebih terang, jumlah melanin yang dimiliki lebih rendah. Ada dua bentuk melanin, yaitu eumelanin dan feomelanin. Eumelanin memiliki sifat tidak larut dalam air dan berwarna cokelat gelap sampai hitam dalam retina mata. Feomelanin memiliki sifat larut dalam basa dan memberikan warna kuning sampai merah yang terdapat pada rambut pirang dan merah (Winata 2008). Kedua bentuk melanin tersebut disintesis dari oksidasi tirosin oleh enzim tirosinase, melalui jalur yang dikenal sebagai Raper Mason Pathway (Garret dan Grisham 2005). Tirosin diubah menjadi DOPA dan DOPA kuinon lebih dahulu sebelum menjadi eumelanin (melalui indol kuinon) atau feomelanin (melalui sisteinil DOPA). Reaksi tirosinase ini dapat dilihat pada Gambar 1. Apabila sintesis berkurang atau terjadi penurunan laju transfer melanosom dari melanosit ke keratinosit, akan terjadi keadaan hipopigmentasi kulit atau sebaliknya (Likhitwitayawuid 2008). Melanin dibentuk oleh melanosit dengan enzim tirosinase yang memainkan peranan penting dalam proses pembentukannya. Tirosinase atau fenol oksidase adalah enzim utama yang terlibat dalam biosintesis melanin. Tirosinase banyak ditemukan pada mamalia, buah-buahan, dan juga di dalam proses pencokelatan jamur secara enzimatik (Chang 2009). Tirosinase yang terdapat pada hewan berfungsi dalam proses pigmentasi pada kulit, mata, dan rambut, sedangkan pada tanaman berfungsi untuk menghambat reaksi enzimatik pencokelatan pada hasil pertanian yang dapat ditunjukkan ketika buah atau sayuran tersebut jatuh atau ketika dipotong (Likhitwitayawuid 2008). Inhibitor tirosinase ditemukan pada tanaman di Indonesia, yaitu Lintia palembanica dan Xylocarpus granatum (Batubara et al. 2010). Enzim tirosinase dapat mengkatalisis dua reaksi yang berbeda dalam pembentukan melanin, yaitu hidroksilasi tirosin menjadi dihidroksifenilalanin (DOPA) (monofenol) dan DOPA menjadi DOPA-kuinon (difenol) (Sanchez et al. 1995). Reaksi tirosinase ini dapat dilihat pada Gambar 1. Hambatan pada pembentukan ataupun aktivitas enzim ini akan menyebabkan pigmen melanin berkurang atau tidak terbentuk sehingga kulit menjadi putih. Salah satu jenis tanaman di Indonesia yang berfungsi sebagai inhibitor tirosinase adalah Rhizophora sp.
2
Gambar 1 Reaksi tirosinase (Jacques 2000). Rhizophora sp. Bakau adalah nama sekelompok tumbuhan dari marga Rhizophora, suku Rhizophoraceae. Tumbuhan ini memiliki ciri-ciri yang menyolok berupa akar tunjang yang besar, berkayu, pucuk yang tertutup daun penumpu yang meruncing, buah yang berkecambah, dan berakar ketika masih di pohon (vivipar). Bakau merupakan salah satu jenis pohon penyusun utama ekosistem hutan bakau. Tanaman bakau memiliki daun tunggal yang terletak berhadapan, terkumpul di ujung ranting dengan kuncup tertutup daun penumpu yang menggulung runcing. Tanaman bakau memiliki bunga yang berkelompok dalam payung tambahan yang bertangkai dan menggarpu. Buah dari tanaman bakau berbentuk telur memanjang sampai mirip buah pir yang kecil dan berwarna hijau cokelat (Tomlinson 1986). Hutan bakau disebut juga hutan mangrove. Mangrove membentuk ekosistem
yang unik dan ekosistem laut yang dominan dan terdiri dari tanaman, terutama pohon-pohon yang berbatasan dengan tepi pantai tropis di seluruh dunia. Tanaman bakau tumbuh subur dalam kondisi asin dan banjir harian di permukaan laut, dan tanaman bakau menyediakan struktur penting sebagai habitat (Tomlinson 1986). Tanaman bakau di Indonesia terdiri dari R. apiculata, R. stylosa, dan R. mucronata. Tanaman R. stylosa (Gambar 2) memiliki ciriciri sebagai berikut: pohon dengan satu atau banyak batang, kulit kayu halus, berwarna abuabu hingga hitam, dan memiliki akar tunjang dengan panjang 3 m. R stylosa dimanfaatkan sebagai bahan bangunan, kayu bakar, dan arang. Masyarakat Aborigin di Australia menggunakan kayu jenis ini untuk pembuatan bumerang, tombak, serta berbagai objek upacara. Tanaman ini juga dapat dimanfaatkan sebagai minuman untuk mengobati hematuria (pendarahan pada
2
Air seni) yang dapat dibuat dari buahnya (Tomlinson 1986). Tanaman R. mucronata (Gambar 2) memiliki ciri-ciri sebagai berikut: pohon dengan ketinggian mencapai 27 m, batangnya memiliki diameter hingga 70 cm dengan kulit kayu berwarna gelap hingga hitam, dan memiliki akar tunjang (Noor et al. 1999). Tanaman ini memiliki khasiat sebagai obat penyakit beri-beri, borok, dan hematoma (kulit batang), serta hepatitis (kulit batang, bunga, daun, dan akar) (Bandaranayake 1998). Kayu pada tanaman ini digunakan sebagai bahan bakar dan arang. Tanin dari kulit kayu digunakan untuk pewarnaan dan kadang-kadang digunakan sebagai obat dalam kasus hematuria (pendarahan pada air seni).
hidrogen dengan molekul polar air. Fase diam untuk KLT juga mengandung zat yang dapat berpendar fluor dalam sinar ultraviolet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Sudjadi 1985). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom (Ibnu dan Rohman 2007). Peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Khopkar 2007).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat
(a) Gambar
2
(b) Rhizophora stylosa (a) Rhizophora mucronata (b) (Tomlinson 1986).
Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi merupakan metode pemisahan fisik yang memisahkan komponenkomponen dan didistribusikan di antara dua fase, yaitu lapisan stasioner dengan permukaan luas dan suatu fase gerak, yaitu fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner. Fase gerak dapat berupa cairan maupun gas, sedangkan fase stasioner dapat berupa padatan maupun cairan. Pemisahannya terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk komponen yang berbeda (Day dan Underwood 2002). Kromatografi lapis tipis (KLT) digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang. Pada dasarnya KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyatanya terlihat pada fase diamnya atau medium pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas. Bahan adsorben sebagai fase diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel silika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentuk ikatan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara Rhizophora sp. dari berbagai daerah di Indonesia, metanol, nheksana, etanol, kloroform, etil asetat, aseton, eter, DMSO (dimetil sulfoksida), bufer fosfat pH 6.5, larutan L-tirosin, L-DOPA, enzim tirosinase dari jamur (Sigma, 333 unit/ml dalam buffer fosfat), dan asam kojat. Alat-alat yang digunakan di antaranya adalah kertas saring Whatman nomor 1, chamber, gelas piala, gelas ukur, pipet Mohr, pipet volumetrik, pelat silika gel, tabung reaksi, neraca analitik, penguap putar, pelat 96 sumur, aplikator KLT (Camag Linomat 5), multi-well plate reader dan vorteks. Metode Pengambilan Sampel Tanaman Rhizophora sp. diambil dari daerah Eretan Kulon Kandanghaur, Indramayu; Tritih, Cilacap; Pantai Ujung Negoro, Batang; Pantai Sigundu, Batang; Gebang, Cirebon; Pantai Kapuk, Jakarta; dan Samboja, Kalimantan Timur. Identifikasi dan bukti spesifik dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bogor, Indonesia. Sampel Rhizophora sp. selanjutnya mendapat perlakuan pengeringan, pembuatan serbuk, penentuan kadar air dan kadar abu, uji fitokimia, penentuan eluen terbaik, ekstraksi, uji aktivitas tirosinase, dan perbandingan pola KLT (Lampiran 1). Preparasi dan Ekstraksi Rhizophora sp. Preparasi sampel ekstrak Rhizophora sp. dilakukan dengan memisahkan bagian daun, batang, dan akar yang kemudian dikeringkan
3
dan direndam dalam metanol. Sampel tanaman kering ini diekstraksi dengan metanol dengan nisbah 1:10 selama 24 jam sebanyak 3 kali ulangan. Ekstrak yang diperoleh disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman nomor 1 dan dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 30 ºC. Penetapan Kadar Air Cawan porselen dikeringkan pada suhu 105 ºC selama 30 menit lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 3 g sampel dimasukkan dalam cawan dan dipanaskan pada suhu 105 ºC selama 4 jam sampai diperoleh bobot konstan, kemudian cawan porselen didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Kadar air ini ditetapkan berdasarkan penentuan persen terhadap bobot kering sampel. Kadar air (%) = A − B × 100 % B dengan A adalah bobot sampel basah (g) B adalah bobot sampel kering (g). Penetapan Kadar Abu Cawan porselen dikeringkan dalam tanur 600 °C selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan bobot awal ditimbang (X). Sebanyak 1 g (Y) sampel dimasukkan dalam cawan porselen. Sampel tersebut dipijarkan di atas nyala api pembakar Bunsen sampai tidak berasap lagi, kemudian dimasukkan ke dalam tanur listrik dengan suhu 600 °C selama 30 menit. Kemudian cawan porselen didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan sampel ditimbang kembali (Z). Kadar abu (%) = Z − X × 100 % Y
dengan X adalah bobot kosong cawan porselen (g) Y adalah bobot sampel (g) Z adalah bobot cawan dan bahan setelah diabukan (g). Uji Fitokimia Uji Alkaloid. Sampel ekstrak serbuk Rhizophora dengan bobot tertentu dilarutkan dengan 10 ml kloroform dan beberapa tetes NH4OH kemudian disaring ke dalam tabung reaksi bertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan
Dragendorf yang akan menimbulkan endapan dengan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga. Uji Saponin dan Flavonoid. Sampel ekstrak serbuk Rhizophora dengan bobot tertentu, dimasukkan ke dalam gelas piala besar kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Uji saponin dilakukan dengan pengocokan 10 ml filtrat dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih stabil. Sebanyak 10 ml filtrat yang lain ditambahkan 0,5 gram serbuk magnesium, 2 ml alkohol klorhidrat (campuran HCl 37 % dan etanol 95 % dengan volume yang sama), dan 20 ml amil alkohol kemudian dikocok kuat-kuat. Terbentuknya warna merah, kuning, dan jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sampel ekstrak serbuk Rhizophora dilarutkan dengan 25 ml etanol panas (50 oC) kemudian disaring ke dalam pinggan porselen dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke dalam lempeng lalu ditambahkan 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (uji LiebermanBurchard). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau atau biru menunjukkan adanya steroid. Uji Tanin. Sampel ekstrak serbuk Rhizophora ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring. Ke dalam sebagian filtrat ditambahkan larutan besi(III) klorida. Bila terjadi warna hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin. Uji Fenol. Sampel ekstrak serbuk Rhizophora dengan bobot tertentu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan FeCl3. Bila terbentuk warna ungu, biru atau hijau menunjukkan adanya senyawa golongan fenol. Bagan alir uji fitokimia dapat dilihat pada Lampiran 2. Penentuan Eluen Terbaik Ekstrak sampel Rhizophora sp. diuji untuk menentukan eluen terbaik dengan menggunakan metode KLT. Ekstrak Rhizophora sp ditotolkan ke dalam pelat silika gel sebanyak 25 kali totolan dengan setiap totolan dikeringkan terlebih dahulu. Kemudian masing-masing pelat yang sudah ditotol dikembangkan dalam eluen tunggal (aseton, eter, kloroform, heksana, metanol, dan etil asetat) (Houghton dan Raman 1998) di dalam masing-masing chamber. Eluen yang dipilih
4
ialah yang memberikan penampakan bercak terbanyak dan memiliki pemisahan yang baik. Analisis pola KLT ekstrak tanaman dari setiap daerah diuji dengan penotolan pada pelat KLT dengan menggunakan aplikator KLT, yaitu Camag Linomat 5. Uji Tirosinase (Batubara et al. 2010) Ekstrak tanaman dari masing-masing daerah dilarutkan di dalam DMSO hingga konsentrasi 20 mg/ml. Larutan stok ekstrak disiapkan dengan cara melarutkan ekstrak pekat ke dalam bufer fosfat 50 mM (pH 6.5) sehingga diperoleh konsentrasi 600 µg/ml. Setelah itu, ekstrak diuji dengan konsentrasi 7.81−2000.00 µg/ml dan asam kojat sebagai kontrol positif yang juga diuji pada konsentrasi 7.81−2000.00 µg/ml dalam pelat tetes 96 sumur, 70 µl dari masing-masing ekstrak pengenceran ini digabungkan dengan 30 µl enzim tirosinase (Sigma, 333 unit/ml dalam bufer fosfat). Setelah itu, pelat diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 110 µl substrat (L-tirosin 2 mM atau L-DOPA12 mM) ke dalam sumur. Kemudian pelat diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Larutan pada masing-masing sumur diukur dengan menggunakan multi-well plate reader pada panjang gelombang 490 nm untuk menentukan persen inhibisi dan nilai konsentrasi hambat 50% (IC50). Persen inhibisi dihitung dengan cara membandingkan serapan sampel tanpa penambahan ekstrak dan sampel dengan penambahan ekstrak. Pengukuran ini dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Inhibisi (%) = A − B × 100 % A
dengan A adalah absorbans pada 490 nm tanpa ekstrak B adalah absorbans pada 490 nm dengan penambahan ekstrak
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Identifikasi Tanaman Tanaman Rhizophora sp. diambil dari berbagai daerah di Indonesia. Bagian daun, batang, dan akar Rhizophora sp. diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Bogor. Berdasarkan hasil identifikasi, diperoleh dua jenis tanaman, yaitu R. mucronata dan R. Kadar Abu
stylosa. Tanaman R. mucronata terdapat di daerah Tritih Cilacap, Gebang Cirebon, Eretan Kulon Indramayu, Pantai Ujung Negoro Batang, Pantai Sigundu Batang, Pantai Kapuk Jakarta, dan Samboja Kalimantan Timur. Sedangkan tanaman R. stylosa terdapat di daerah Samboja Kalimantan Timur. Kadar Air Perolehan kandungan air pada sampel serbuk kering daun, batang, dan akar Rhizophora sp. dari spesies R. mucronata dan R. stylosa berkisar antara 5.15%−12.54%. Tabel 1 menunjukkan bahwa daun, batang, dan akar Rhizophora yang berupa serbuk ada yang dapat dan tidak dapat disimpan dalam waktu yang relatif lama untuk digunakan lebih lanjut. Tabel 1
Spesies
Kadar air daun, batang, dan akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah Kadar air
Daerah Daun (%)
a a a a
Batang (%)
Cilacap 6.24 6.75 Indramayu 8.54 8.40 Cirebon 8.58 8.90 Pantai Ujung 6.83 6.93 Pantai Sigundu a 6.08 5.90 a Pantai Kapuk 10.07 9.22 a Samboja 5.15 5.25 Kaltim b Samboja 5.24 Kaltim Keterangan: (a): R. mucronata; (b): R. stylosa
Akar (%) 6.85 6.30 8.24 7.71 7.04 12.54 5.82
Penentuan kadar air berguna untuk mengetahui ketahanan suatu bahan agar dapat diperkirakan cara penyimpanan terbaik bagi sampel untuk menghindari pengaruh aktivitas mikrob (jamur). Hal ini sesuai dengan pernyataan Winarno (1997), yaitu bila kadar air yang terkandung dalam suatu bahan kurang dari 10%, maka kestabilan optimum bahan akan tercapai dan pertumbuhan mikrob dapat dikurangi. Tabel 1 menunjukkan bahwa sebagian besar sampel dapat disimpan aman dari pengaruh mikrob kecuali sampel serbuk kering daun dan akar R. mucronata dari Pantai Kapuk, Jakarta (Lampiran 3−5).
5
Perolehan kandungan abu pada sampel serbuk kering daun, batang, dan akar Rhizophora sp. dari spesies R. mucronata dan R. stylosa berkisar antara 3.13% dan 19.27%. Penentuan kadar abu bertujuan mengetahui besarnya kandungan mineral yang terdapat dalam sampel. Berdasarkan Tabel 2, diperoleh bahwa daun R. mucronata dari Tritih Cilacap, batang, dan akar R. mucronata dari Pantai Kapuk Jakarta memiliki kandungan mineral yang lebih banyak daripada daerah lainnya. Perhitungan kadar abu dapat dilihat pada Lampiran 6−8.
ekstrak dibandingkan dengan metode lain seperti refluks atau Soxhlet, yaitu maserasi dapat digunakan untuk mengekstraksi komponen sampel yang tahan dan tidak tahan panas. Ekstraksi menggunakan refluks atau Soxhlet yang menggunakan pemanasan dikhawatirkan dapat merusak komponen sampel yang akan dianalisis akibat pemanasan. Rendemen yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Rendemen ekstrak R. mucronata dan R. stylosa dari berbagai daerah Spesies
Tabel 2 Kadar abu daun, batang, dan akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah Spesies
Daerah Daun (%)
a a a a a a a
Kadar abu Batang (%)
Cilacap 13.88 7.55 Indramayu 13.24 6.95 Cirebon 13.22 7.86 Pantai Ujung 12.84 14.22 Pantai Sigundu 13.41 11.54 Pantai Kapuk 13.27 17.44 Samboja 13.13 10.1 Kaltim b Samboja 3.13 Kaltim Keterangan: (a): R. mucronata; (b): R. stylosa
Akar (%) 17.42 8.56 10.97 14.61 11.89 19.27 7.09
Ekstraksi Proses yang secara selektif mengambil zat terlarut dari suatu campuran dengan bantuan pelarut disebut ekstraksi (Harborne 1987). Metode ekstraksi bergantung pada polaritas senyawa yang akan diekstraksi. Prinsipnya adalah like dissolve like, yaitu pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut nonpolar akan melarutkan senyawa nonpolar. Pemilihan pelarut yang digunakan juga bergantung pada sifat kelarutan zat terlarut tersebut (Khopkar 2007). Suatu senyawa akan menunjukkan kelarutan yang berbeda-beda dalam pelarut yang berbeda pula. Sampel daun, batang, dan akar R. mucronata dan batang R. stylosa diekstraksi menggunakan metode maserasi. Maserasi dilakukan dengan cara merendam sampel ke dalam pelarut metanol. Keuntungan menggunakan maserasi dalam memperoleh
Daerah Daun (%)
Rendemen Batang (%)
Akar (%)
a
Cilacap
24.68
8.30
8.80
a
Indramayu
27.02
4.88
10.62
a
Cirebon
28.09
10.49
14.24
a
24.87
5.69
14.16
a
Pantai Ujung Pantai Sigundu
24.75
5.38
8.27
a
Pantai Kapuk
27.63
15.89
8.17
a
Samboja Kaltim
21.32
6.89
17.15
b
Samboja 8.61 Kaltim Keterangan: (a): R. mucronata; (b): R. stylosa
Berdasarkan hasil ekstraksi sampel Rhizophora sp. dari berbagai daerah, rendemen tertinggi diperoleh dari ekstrak metanol daun dari Gebang, Cirebon; ekstrak metanol batang dari Pantai Kapuk, Jakarta; dan ekstrak metanol akar dari Samboja, Kalimantan Timur, yaitu sebesar 28.09%; 15.89%; dan 17.15%. Perhitungan rendemen dapat dilihat pada Lampiran 9−11. Uji Fitokimia Uji kualitatif fitokimia terhadap ekstrak yang diperoleh digunakan untuk mengetahui senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam sampel. Uji yang dilakukan meliputi uji alkaloid, saponin, flavonoid, triterpenoid, steroid, tanin, dan fenol. Golongan senyawa dalam ekstrak kasar dapat ditentukan dengan melihat perubahan warna setelah ditambahkan pereaksi yang spesifik untuk setiap uji kualitatif.
Tabel 4 Hasil uji fitokimia daun, batang, dan akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah
6
Bagian
Senyawa
a
b
c
d
e
f
g
Daun
Alkaloid
++
+
+
+
++
++
++
Batang
Akar
Saponin
++
++
++
+
+
+
++
Flavonoid
+
+
+
+
+
+
+
Triterpenoid
-
-
-
-
-
-
-
Steroid
-
-
-
-
-
-
-
Tanin
+
+
+
+
+
+
+
Fenol
+
+
++
++
++
++
++
Alkaloid
++
+
+
+
++
++
+++
Saponin
++
++
+
++
++
++
+++
Flavonoid
+
+
+
+
+
+
++
Triterpenoid
-
-
-
-
-
-
-
Steroid
-
-
-
-
-
-
-
Tanin
++
++
++
+
+
+
++
Fenol
-
-
-
-
-
-
-
Alkaloid
++
+
+
+
++
++
+++
Saponin
+
++
++
+
+
++
+++
Flavonoid
+
+
+
+
+
+
+++
Triterpenoid
-
-
-
-
-
-
-
Steroid
-
-
-
-
-
-
-
Tanin
+
+
++
+
+
++
++
Fenol Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi; semakin banyak (+) intensitas warna semakin meningkat; (a): Tritih Cilacap; (b): Eretan Kulon, Indramayu; (c): Gebang, Cirebon; (d): Pantai Ujung Negoro, Batang; (e): Pantai Sigundu, Batang; (f): Pantai Kapuk, Jakarta; (g): Samboja, Kalimantan Timur, (a-g): daun, batang, dan akar R. mucronata: (g): batang R. stylosa.
Berdasarkan hasil uji, diperoleh golongan senyawa yang terdapat pada masing-masing ekstrak tanaman (Tabel 4). Hasil tersebut menunjukkan kandungan flavonoid batang dan akar Rhizophora sp dari berbagai daerah mengandung senyawa flavonoid yang berbeda-beda. Batang dan akar Rhizophora sp dari Samboja, Kalimantan Timur mengandung senyawa flavonoid yang banyak daripada daerah lainnya.
Setiap pendeteksian mempunyai fungsi yang berbeda. Pendeteksian dengan UV 254 nm digunakan untuk alkaloid, flavonoid, dan triterpena, sedangkan UV 366 nm untuk flavonoid, alkaloid, triterpena, dan lignan (Fernand 2003).
Pelarut Terbaik Pemilihan pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak atau eluen dimulai dengan menguji enam pelarut tunggal, yaitu aseton, eter, kloroform, heksana, metanol, dan etil asetat. Sampel yang digunakan ialah ekstrak maserasi R. mucronata dan R. stylosa dengan menggunakan metode pendeteksian ialah dengan lampu UV 366 nm. Terlihat pada Gambar 3, pelarut yang menghasilkan noda terbanyak dan yang terpisah dengan baik ialah kloroform dengan 6 noda dan metanol dengan 2 noda.
a
b
c
d
e
f Gambar 3
Hasil elusi ekstrak maserasi menggunakan fase diam pelat silika gel dan enam pelarut tunggal, yaitu aseton (a), eter (b), kloroform (c), heksana (d), metanol (e), dan etil asetat (f).
Setelah dua pelarut tunggal terpilih, dilanjutkan dengan penentuan nisbah komposisi dari pelarut kloroform dan metanol.
7
Nisbah yang diujikan ialah 9:1; 6:1; 3:1; 1:9; 1:6; dan 1:3 (Houghton dan Raman 1998). Komposisi yang paling banyak memunculkan noda ialah saat fase gerak menggunakan kloroform:metanol dengan nisbah 9:1 dengan 3 noda (Gambar 4).
Gambar 4
Hasil elusi ekstrak maserasi menggunakan fase diam silika gel dengan komposisi kloroform dan metanol dengan nisbah 9:1; 6:1; 3:1; 1:9; 1:6; dan 1:3 (berurut dari kiri ke kanan).
Uji Aktivitas Inhibitor Tirosinase Uji aktivitas tirosinase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya daya inhibisi senyawa bioaktif yang terdapat pada ekstrak metanol daun, batang, dan akar dari spesies R. mucronata dan R. stylosa dari berbagai daerah. Parameter yang digunakan untuk pengukuran aktivitas inhibitor tirosinase dari Rhizophora sp adalah IC50, yaitu bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas inhibitor tirosinase sebesar 50%. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan kurva hubungan antara % inhibisi (sebagai sumbu y) dan konsentrasi ekstrak (sebagai sumbu x). Hasil yang diperoleh (Tabel 5) menunjukkan bahwa sebagian besar ekstrak daun, batang, dan akar yang berasal dari pulau Jawa tidak memberikan nilai IC50 pada monofenolase dan difenolase hingga konsentrasi 2000 µg/ml. Hal ini mengindikasikan bahwa bagian daun, batang, dan akar R. mucronata dari pulau Jawa tidak memiliki potensi inhibitor tirosinase. Lampiran 12 menunjukkan pelat yang menampakkan aktivitas tirosinase yang ditunjukkan dengan munculnya warna yang memberikan serapan pada panjang gelombang 490 nm. Ekstrak daun, batang, dan akar R. mucronata dan R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memiliki potensi sebagai
inhibitor tirosinase pada monofenolase. Ekstrak akar R. mucronata memiliki aktivitas inhibitor tirosinase lebih baik daripada daun dan batang dari segi monofenolase. Hal ini dikarenakan nilai IC50 ekstrak akar R. mucronata lebih kecil daripada ekstrak daun dan batang R. mucronata. Jika dibandingkan dengan batang R. mucronata, maka batang R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memiliki aktivitas inhibitor tirosinase yang lebih baik dalam hal monofenolase. Hal ini dikarenakan nilai IC50 ekstrak batang R. stylosa lebih kecil daripada ekstrak batang R. mucronata. Perhitungan nilai IC50 dapat dilihat pada Lampiran 12. Tabel 5 Nilai IC50 pada daun, batang, dan akar Rhizophora sp. IC50
IC50
Spesies
Bagian
Daerah
(µg/ml)
(µg/ml)
a
Daun Batang Akar Daun Batang Akar Daun Batang Akar Daun Batang Akar Daun Batang Akar Daun Batang Akar Daun Batang Akar Batang
Cilacap
X -
Y -
Cirebon
-
-
Indramayu
-
-
Pantai Ujung Negoro Pantai Sigundu
-
-
-
-
Pantai Kapuk
-
-
Samboja Kal-Tim
409.36 75.89 15.34 38.02
-
a
a
a
a
a
a
b
Samboja Kaltim
Asam Kontrol 7.02 140.71 kojat positif Keterangan: (a): R. mucronata; (b): R. stylosa; (X): monofenolase; (Y): difenolase; (-): tidak memiliki aktivitas inhibitor tirosinase.
Perbandingan Pola Kromatografi Lapis Tipis Pelarut yang digunakan untuk menentukan pola KLT seluruh ekstrak ialah pelarut yang menghasilkan jumlah noda terbanyak dan memiliki pemisahan yang baik, yaitu kloroform:metanol (9:1). Noda hasil elusi oleh berbagai pelarut dilihat di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Perbandingan pola KLT yang dilakukan pada ekstrak daun Rhizophora sp. dari
8
berbagai daerah ditunjukkan pada Gambar 5. Berdasarkan gambar tersebut, masing-masing ekstrak daun R. mucronata dari Tritih, Cilacap (a); Gebang, Cirebon (b); Eretan Kulon, Indramayu (c); Pantai Ujung Negoro, Batang (d); Pantai Sigundu, Batang (e); Pantai Kapuk, Jakarta (f); dan R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur (g) memberikan pemisahan noda. Nilai Rf (Tabel 6) yang diperoleh pada setiap noda yang dihasilkan memiliki kesamaan sehingga daun R. mucronata dari berbagai daerah memiliki senyawa yang sama.
a
b
Gambar 6
a
b
c
d
e
f
g Gambar 5
Hasil elusi ekstrak daun Rhizophora sp. dari berbagai daerah dengan UV 366 nm.
Hasil perbandingan pola KLT yang dilakukan pada batang R. mucronata dari berbagai daerah dan R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur terdapat pada Gambar 6. Berdasarkan gambar tersebut, masing-masing ekstrak batang R. mucronata dari Tritih, Cilacap (a); Gebang, Cirebon (b); Eretan Kulon, Indramayu (c); Pantai Ujung Negoro, Batang (d); Pantai Sigundu, Batang (e); Pantai Kapuk, Jakarta (f); Samboja, Kalimantan Timur (g); dan R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur (h) memberikan pemisahan noda. Nilai Rf (Tabel 6) yang diperoleh pada setiap noda yang dihasilkan memiliki kesamaan sehingga batang R. mucronata dari berbagai daerah memiliki senyawa yang sama. Sedangkan pada batang R. mucronata dan R. stylosa dari daerah Samboja, Kalimantan Timur tidak memberikan pemisahan noda pada hasil elusi. Hal ini dikarenakan eluen yang digunakan tidak dapat memisahkan senyawasenyawa yang terkandung dalam ekstrak batang R. mucronata dan R. stylosa.
c
d
e
f
g
h Hasil elusi ekstrak batang Rhizophora sp. dari berbagai daerah dengan UV 366 nm.
Hasil perbandingan pola KLT yang dilakukan pada akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah terdapat pada Gambar 7. Berdasarkan gambar tersebut, masing-masing ekstrak akar R. mucronata dari Tritih, Cilacap (a); Gebang, Cirebon (b); Eretan Kulon, Indramayu (c); Pantai Ujung Negoro, Batang (d); Pantai Sigundu, Batang (e); Pantai Kapuk, Jakarta (f); dan R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur (g) memberikan pemisahan noda. Nilai Rf (Tabel 6) yang diperoleh pada setiap noda yang dihasilkan memiliki kesamaan sehingga akar R. mucronata dari berbagai daerah memiliki senyawa yang sama. Sedangkan pada akar R. mucronata dari daerah Samboja Kalimantan Timur tidak memberikan pemisahan noda pada hasil elusi. Hal ini dikarenakan eluen yang digunakan tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak akar R. mucronata.
a
b
c
d
e
f
g Gambar 7 Hasil elusi ekstrak akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah dengan UV 366 nm.
9
Tabel 6 Nilai Rf komponen ekstrak daun, batang, dan akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah Bagian a 0.54 0.64 0.73
b 0.51 0.61 0.69
c 0.57 0.63 0.79 0.85
Batang
0.64 0.74 0.87
0.64 0.74 0.87
0.64 0.74 0.87
Akar
0.62 0.8 0.91
0.62 0.8 0.91
0.62 0.8 0.91
Daun
Rf (cm) d 0.56 0.64 0.73
e 0.54 0.63 0.79 0.81 0.76
f 0.55 0.63 0.71
0.64 0.74 0.87
0.66 0.76 0.88
0.61 0.71 0.85
0.62 0.79 0.89
0.62 0.87 0.89
0.62 0.79 0.89
g 0.56 0.64 0.73
Keterangan: (a): Tritih, Cilacap; (b): Gebang, Cirebon; (c): Eretan Kulon, Indramayu; (d): Pantai Ujung Negoro, Batang; (e): Pantai Sigundu, Batang; (f): Pantai Kapuk, Jakarta; (g): Samboja, Kalimantan Timur.
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
Simpulan
Bandaranayake WM. 1998. Traditional and medical uses of mangroves. Mangroves Salt Marshes 2: 133-148.
Ekstrak daun, batang, dan akar R. mucronata yang berasal dari daerah pulau Jawa tidak memiliki aktivitas inhibitor tirosinase, sedangkan ekstrak R. mucronata dan R. stylosa daerah Samboja, Kalimantan Timur memiliki aktivitas inhibitor tirosinase. Aktivitas ekstrak akar R. mucronata dan batang R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memberikan daya penginhibisi yang lebih baik, yaitu dari segi monofenolase (IC50: 15.34 µ g/ml dan IC50: 38.02 µg/ml). Hasil dari KLT ekstrak daun, batang, dan akar R. mucronata dari berbagai daerah (Tritih Cilacap, Gebang Cirebon, Eretan Kulon Indramayu, Pantai Ujung Negoro Batang, Pantai Sigundu Batang, Pantai Kapuk Jakarta, dan Samboja Kalimantan Timur) yang diteliti memberikan pemisahan noda dan nilai Rf yang diperoleh pada setiap noda yang dihasilkan memiliki kesamaan. Saran Perlu dilakukan uji aktivitas inhibitor tirosinase dari tanaman Rhizophora sp. dari daerah lain, uji toksisitas in vitro dan in vivo, uji karakteristik dengan spektroskopi NMR untuk menentukan suatu senyawa penciri secara kuantitatif, dan mencari eluen yang lain untuk bagian tanaman yang tidak memberikan noda.
Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T, Rahminiwati M, Djauhari E. 2010. Potency of Indonesia medicinal plants as tyrosinase inhibitor and antioxidant agent. J Biol Sci 10: 138-144. Chang TS. 2009. An updated review of tyrosinase inhibitor. J Mol Sci 10:2440-2475 Day RA, Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Ed ke-6. Sopyan I, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Quantitative Analysis 6th Ed.. Fernand VE. 2003. Initial characterization of crude extracts from Phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and Quassia amara L. using normal phase thin layer chromatography [tesis]. Lousiana: Program Pascasarjana, University of Suriname. Garret, Grisham. 2005. Biochemistry. America: Mc-Graw Hills. Harborne JB. 1987. Bandung: ITB.
Metode
Fitokimia.
Houghton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extract. London: Chapman & Hall.
10
Ibnu GG, Rohman A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
comprehensive review of it’s mechanism. J Biochim Biophys Acta, 1247:1-11.
Jacques S. 2000. Optical Absorption of Melanin. [terhubung berkala]. http://omlc.ogi.edu/spectra/melanin/inde x.htm. [10 Feb 2010].
Sudjadi. 1985. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Jakarta: Ghalia Indonesia. Tomlinson PB. 1986. The Botany of Mangrove. Cambridge: Cambridge Univ Pr.
Khopkar SM. 2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo A, penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry.
Winarno FG. 1997. Ilmu Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.
Likhitwitayawuid K. 2008. Stilbenes with tyrosinase inhibitor activity. J Curr Sci 94:44-52.
Winata T. 2008. Sintesis metil-p-butoksisinamat dan uji aktivitasnya sebagai inhibitor tirosinase. [skripsi]. Surabaya: Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala.
Noor YR, Khazali M, Suryadiputra INN. 1999. Panduan Pengenalan Mangrove di Indonesia. Bogor: PKA/WI-IP. Sanchez-Ferrer A, Rodri’gez-Lo’pez JN, Garcia-Carmona F. 1995. Tyrosinase: a
Zheng CW. 2008. Tyrosinase inhibitors from paper mulberry (Broussonetia papyrifera). J Food Chem 106:529-535.
13
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram alir penelitian Pengambilan tanaman Rhizophora sp. dari berbagai daerah
Identifikasi tanaman Rhizopora sp dari berbagai daerah
Daun
Batang
Akar
Pengeringan dan pembuatan serbuk
Serbuk daun kering -
Serbuk batang kering
Serbuk akar kering
Penentuan kadar air, kadar abu, dan uji fitokimia Ekstraksi dengan metanol Ekstrak metanol daun
Ekstrak metanol batang
Ekstrak metanol akar
- Uji aktivitas tirosinase - Penentuan eluen terbaik dengan KLT - Penentuan pola KLT dengan Camag Linomat
Perbandingan aktivitas tirosinase dan pola KLT
Lampiran 2 Uji fitokimia
15
a) Uji alkaloid 0.1 g sampel ekstrak dengan 10 ml kloroform dan beberapa tetes amonia saring 10 tetes H2SO4 lapisan asam +pereaksi Dragendorf endapan
Meyer
Wagner
endapan putih
endapan coklat
jingga b) Uji saponin, flavonoid, dan tanin 0.1 g sampel dilarutkan dalam 10 ml air panas didihkan selama 5 menit saring
kocok
busa 10 menit
+ 0.5 mg Mg +1 mL HCl pekat + 1 mL amil alkohol
+ 10 mL FeCl3 1%
merah/kuning/ jingga (flavonoid)
biru tua (tanin)
saponin c) Steroid/triterpenoid 0.1 g sampel dilarutkan dalam 25 mL etanol panas uapkan pelarut residu dilarutkan dalam eter ekstrak eter + 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat
merah/ungu (triterpenoid)
hijau/biru (steroid)
Lampiran 3 Kadar air serbuk daun Rhizophora sp. dari berbagai daerah
16
Spesies
Daerah
Ulangan
Kadar air
Bobot (g) Kosong
Isi
Kering+kosong
Kering
(%)
Samboja Kalimantan
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2
1.9134 1.8893 1.9179 1.9882 1.9397 1.9889 1.9701 1.9211 2.0201 1.9951 1.8939 1.9550 1.9175 1.9642 1.9187 1.9528 1.9112 1.9725 1.9634 1.9704
3.0004 3.0002 3.0002 3.0002 3.0010 3.0010 3.0002 3.0009 3.0007 3.0020 3.0012 3.0019 3.0018 3.0011 3.0010 3.0013 3.0019 3.0022 3.0004 3.0009
4.7178 4.7004 4.7416 4.7198 4.6882 4.7423 4.7244 4.6573 4.7586 4.7700 4.6952 4.7686 4.7382 4.7720 4.7467 4.6585 4.6216 4.6554 4.8077 4.8168
2.8044 2.8111 2.8237 2.7316 2.7485 2.7534 2.7543 2.7362 2.7385 2.7749 2.8013 2.8136 2.8207 2.8078 2.8280 2.7057 2.7104 2.6829 2.8443 2.8464
6.53 6.30 5.88 8.95 8.41 8.25 8.20 8.82 8.74 7.56 6.66 6.27 6.03 6.44 5.76 9.85 9.71 10.64 5.20 5.15
timur
3
1.9038
3.0007
4.7513
2.8475
5.11
R.mucronata
Cilacap
R.mucronata
Indramayu
R.mucronata
Cirebon
R.mucronata
Ujung Negoro
R.mucronata
Pantai Sigandu
R.mucronata
Kapuk
R.mucronata
Contoh perhitungan kadar air Daerah Cilacap ulangan 1 Bobot kering = (bobot kering bahan + bobot cawan kosong) – bobot cawan kosong = 4.7178 g – 1.9134 g = 2.8044 g Kadar air = bobot basah bahan – bobot kering × 100% bobot basah bahan = 3.0004 g – 2.8044 g × 100% 3.0004 g = 6.53%
Lampiran 4 Kadar air serbuk batang Rhizophora sp. dari berbagai daerah
17
Spesies
Daerah
R.mucronata
Cilacap
R.mucronata
Indramayu
R.mucronata
Cirebon
R.mucronata
Ujung Negoro
R.mucronata
Pantai Sigandu
R.mucronata
Kapuk
R.mucronata
Samboja Kalimantan timur Samboja Kalimantan timur
R. stylosa
Ulangan 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Kadar air
Bobot (g) Kosong 1.9472 1.9061 1.9361 1.9896 1.9559 1.9576 1.9482 1.9882 1.9892 1.9010 1.9707 1.9624 1.8796 1.9100 1.8820 1.9334 1.9780 1.9271 1.9744 1.9425 1.9383 1.9662 1.9582 1.9731
Isi 3.0012 3.0015 3.0014 3.0014 3.0013 3.0015 3.0012 3.0010 3.0013 3.0016 3.0015 3.0016 3.0015 3.0015 3.0016 3.0014 3.0014 3.0011 3.0006 3.0002 3.0005 3.0003 3.0004 3.0009
Kering+kosong 4.7530 4.7025 4.7299 4.7428 4.7021 4.7056 4.6768 4.7201 4.7308 4.6987 4.7302 4.7856 4.7079 4.7333 4.7041 4.6625 4.6988 4.6508 4.8131 4.7880 4.7824 4.8093 4.8016 4.8167
Kering 2.8058 2.7964 2.7938 2.7532 2.7462 2.7480 2.7286 2.7319 2.7416 2.7977 2.7595 2.8232 2.8283 2.8233 2.8221 2.7291 2.7208 2.7237 2.8387 2.8455 2.8441 2.8431 2.8434 2.8436
Contoh perhitungan kadar air Daerah Cilacap ulangan 1 Bobot kering = (bobot bahan kering + bobot cawan kosong) – bobot cawan kosong = 4.7530 g – 1.9472 g = 2.8058 g Kadar air = bobot basah bahan – bobot kering × 100% bobot basah bahan = 3.0012 g – 2.8058 g × 100% 3.0012 g = 6.51%
Lampiran 5 Kadar air serbuk akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah
(%) 6.51 6.83 6.92 8.27 8.50 8.45 9.08 8.97 8.65 6.79 8.06 5.94 5.77 5.94 5.98 9.07 9.35 9.24 5.40 5.16 5.21 5.24 5.23 5.24
18
Spesies
Daerah
R.mucronata
Cilacap
R.mucronata
Indramayu
R.mucronata
Cirebon
R.mucronata
Ujung Negoro
R.mucronata
Pantai Sigandu
R.mucronata
Kapuk
R.mucronata
Samboja Kalimantan timur
Ulangan 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Kosong 1.9183 1,9546 1,9694 1.9608 1.9758 1.9612 1.8836 1.9930 2.0086 2.0275 1.8984 1.9546 1.9497 1.9104 1.9836 1.9305 1.9004 1.9185 1.9986 1.9159 1.9257
Isi 3.0014 3.0013 3.0014 3.0016 3.0014 3.0018 3.0011 3.0013 3.0013 3.0016 3.0016 3.0017 3.0014 3.0012 3.0016 3.0016 3.0012 3.0013 3.0003 3.0004 3.0006
Bobot (g) Kering+kosong 4.7404 4.7294 4.7601 4.7785 4.7964 4.7601 4.6301 4.7543 4.7624 4.7910 4.6789 4.7215 4.7358 4.7051 4.7731 4.5578 4.5250 4.5416 4.8223 4.7430 4.7520
Kering 2.8221 2.7748 2.7907 2.8177 2.8206 2.7989 2.7465 2.7613 2.7538 2.7635 2.7805 2.7669 2.7861 2.7947 2.7895 2.6273 2.6246 2.6231 2.8237 2.8271 2.8263
Contoh perhitungan kadar air Daerah Cilacap ulangan 1 Bobot kering = (bobot bahan kering + bobot cawan kosong) – bobot cawan kosong = 4.7404 g – 1.9183 g = 2.8221 g Kadar air = bobot basah bahan – bobot kering × 100% bobot basah bahan = 3.0014 g – 2.8221 g × 100% 3.0014 g = 5.97%
Lampiran 6 Kadar abu daun Rhizophora sp. dari berbagai daerah
Kadar air (%) 5.97 7.55 7.02 6.13 6.02 6.76 8.48 8.00 8.25 7.93 7.37 7.82 7.17 6.88 7.07 12.47 12.55 12.60 5.89 5.78 5.81
19
Spesies
Daerah
R.mucronata
R.mucronata
Ulangan
Cilacap
Indramayu
R.mucronata
Cirebon
R.mucronata
Ujung Negoro
Kadar abu
Cawan porselen
Sampel
Bobot (g) Cawan + sampel
1 2
28.9539 30.8338
1.0027 1.0021
29.0842 30.9636
0.1303 0.1298
13.97 13.89
3 1
28.4682 29.4497
1.0019 1.0049
28.5976 29.5716
0.1294 0,1219
13.78 13.45
2
29.3104
1.0023
29.4259
0.1155
12.69
3 1 2 3
29.3848 32.9051 29.7747 28.7518
1.0033 1.0030 1.0031 1.0041
29.5089 33.0245 29.8962 28.8714
0.1241 0.1194 0.1215 0.1196
13.59 13.07 13.41 13.17
1 2
29.1802 29.0263
1.0040 1.0038
29.3018 29.1466
0.1216 0.1203
13.19 12.91
3
27.7596
1.0033
27.8759
0.1163
12.42
abu
(%)
R.mucronata
Pantai Sigundu
1 2
29.1804 28.0304
1.0025 1.0029
29.3076 28.1545
0.1272 0.1241
13.56 13.29
R.mucronata
Kapuk
3 1
27.7616 32.7379
1.0021 1.0018
27.8874 32.8551
0.1258 0.1172
13.37 13.13
2 3
29.3099 29.3819
1.0035 1.0016
29.4265 29.5024
0.1166 0.1205
13.02 13.66
1 2 3
33.7584 31.4001 27.8571
1.0007 1.0007 1.0003
33.8841 31.5240 27.9802
0.1257 0.1239 0.1231
13.29 13.09 13.01
R.mucronata
Samboja
Contoh perhitungan kadar abu berdasarkan bobot kering Daerah Cilacap ulangan 1 Bobot abu = (bobot cawan + sampel) – bobot cawan porselen = 29.0842 g – 28.9539 g = 0.1303 g Kadar abu =
=
bobot abu × 100% (1 – kadar air) x bobot sampel 0.1303 g × 100% (1 – 0.0699) x 1.0027 g
= 13.97%
Lampiran 7 Kadar abu batang Rhizophora sp. dari berbagai daerah
20
Spesies
Daerah
R.mucronata
Ulangan
Cilacap
R.mucronata
Indramayu
R.mucronata
Cirebon
R.mucronata
Ujung Negoro
R.mucronata
Pantai Sigundu
R.mucronata
Kapuk
R.mucronata
Samboja
R. stylosa
Samboja
Kadar abu
Cawan porselen
Bobot (g) Cawan + Sampel sampel
abu
1
27.3293
1.0009
27.3989
0.0696
7.47
2
30.6436
1.0008
30.7139
0.0703
7.58
3
32.8542
1.0009
32.9246
0.0704
7.60
1
34.9835
1.0011
35.0467
0.0632
6.94
2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
39.3812 27.8385 29.9401 27.6614 34.0801 28.5866 31.4009 26.4765 30.7808 26.4012 40.0288 26.4758 32.2519 31.7419 27.0022 29.5635 27.0970 29.6964 27.2692 30.5970
1.0016 1.0019 1.0006 1.0007 1.0007 1.0008 1.0007 1.0009 1.0009 1.0007 1.0011 1.0009 1.0008 1.0004 1.0005 1.0005 1.0006 1.0007 1.0007 1.0005
39.4436 27.9025 30.0111 27.7334 34.1501 28.7215 31.5258 26.6120 30.8900 26.5111 40.1345 26.6212 32.4052 31.9136 27.1007 29.6527 27.1956 29.7269 27.2992 30.6254
0.0624 0.0640 0.0710 0.0720 0.0700 0.1349 0.1249 0.1355 0.1092 0.1099 0.1057 0.1454 0.1533 0.1717 0.0985 0.0892 0.0986 0.0305 0.0300 0.0284
6.87 7.04 7.88 7.98 7.73 14.54 13.68 14.45 11.62 11.72 11.28 16.14 17.08 19.11 10.44 9.43 10.43 3.23 3.17 3.00
Contoh perhitungan kadar abu berdasarkan bobot kering Daerah Cilacap ulangan 1 Bobot ab = (bobot cawan + sampel) – bobot cawan porselen = 27.3989 g – 27.3293 g = 0.0696 g Kadar abu =
=
(%)
bobot abu × 100% (1 – kadar air) x bobot sampel 0.0696 g × 100% (1 – 0.0696) x 1.0009 g
= 7.47%
Lampiran 8 Kadar abu akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah
21
Kadar abu
Bobot Spesies
Daerah
R.mucronata
Cilacap
R.mucronata
Indramayu
R.mucronata
Cirebon
R.mucronata
Ujung Negoro
R.mucronata
Pantai Sigandu
R.mucronata
Kapuk
R. stylosa
Samboja
Ulangan
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
(g) Cawan porselin 34.9866 33.8722 33.3839 32.2492 30.8279 33.7586 33.4938 33.1292 27.0029 30.362 29.5329 39.1576 30.8143 31.3664 28.4333 25.3637 30.8507 27.8589 27.8675 28.7845 26.9755
Sampel 1.0009 1.0006 1.0008 1.002 1.0026 1.0023 1.0013 1.0015 1.0014 1.0011 1.0013 1.0013 1.0006 1.0003 1.0005 1.0006 1.0004 1.0004 1.0008 1.001 1.0008
Cawan + sampel 35.1521 34.0313 33.5439 32.3333 30.9094 33.8331 33.5912 33.226 27.1086 30.4882 29.6689 39.2977 30.9293 31.4684 28.546 25.5467 31.003 28.0191 27.9299 28.8505 27.0468
abu 0.1655 0.1591 0.1600 0.0841 0.0815 0.0745 0.0974 0.0968 0.1057 0.1262 0.1360 0.1401 0.1150 0.1020 0.1127 0.1830 0.1523 0.1602 0.0624 0.0660 0.0713
Contoh perhitungan kadar abu berdasarkan bobot kering Daerah Cilacap ulangan 1 Bobot abu = (bobot cawan + sampel) – bobot cawan porselin = 35.1521 g – 34.9866 g = 0.1655 g Kadar abu =
=
bobot abu × 100% (1 – kadar air) x bobot sampel 0.1655 g × 100% (1 – 0.0597) x 1.0009 g
= 17.66%
Lampiran 9 Rendemen ekstrak kasar daun Rhizophora sp. dari berbagai
(%) 17.66 17.31 17.29 8.98 8.69 8.01 10.72 10.59 11.6 13.79 14.76 15.29 12.46 11.01 12.19 21.33 17.77 18.71 6.65 7.02 7.59
22
daerah Daerah
Cilacap Indramayu Cirebon Ujung Negoro Pantai Sigundu Kapuk Samboja
Rerata kadar air (%) 6.24 8.54 8.58 6.83
Bobot sampel (g) 10.0019 10.0076 10.0024 10.0019
Bobot ekstrak kasar (g) 2.3154 2.4721 2.5678 2.3180
Rendemen (%)
6.08
10.0026
2.3237
24.75
10.07 5.15
10.0051 4.0005
2.4871 0.8079
27.63 21.32
24.68 27.02 28.09 24.87
Contoh perhitungan penentuan rendemen ekstrak daun dari Cilacap: Rendemen =
=
bobot ekstrak kasar × 100% (1 – kadar air) x bobot sampel 2.3154 g × 100% (1 – 0.0624) x 10.0019 g
= 24.68%
Lampiran 10 Rendemen ekstrak kasar batang Rhizophora sp. dari berbagai daerah
23
Daerah
Cilacap Indramayu Cirebon Ujung Negoro Pantai Sigundu Kapuk Samboja Samboja (R. stylosa)
Rerata kadar air (%) 6.75 8.40 8.90 6.93
Bobot sampel (g) 10.0016 10.0015 10.0016 10.0017
Bobot ekstrak kasar (g) 0.7747 0.4473 0.9552 0.5300
Rendemen (%)
5.90
10.0017
0.5064
5.38
9.22 5.25 5.24
10.0014 5.0007 5.0009
1.4426 0.3264 0.4081
15.89 6.89 8.61
8.30 4.88 10.49 5.69
Contoh perhitungan penentuan rendemen ekstrak batang dari Cilacap: Rendemen = =
× 100% bobot ekstrak kasar (1 – kadar air) x bobot sampel 0.7747 g × 100% (1 – 0.0675) x 10.0016 g
= 8.30%
Lampiran 11 Rendemen ekstrak kasar akar Rhizophora sp. dari berbagai daerah Daerah
Rerata kadar air
Bobot sampel
Bobot ekstrak
Rendemen (%)
24
Cilacap Indramayu Cirebon Ujung Negoro Pantai Sigundu Kapuk Samboja
(%) 6.85 6.30 8.24 7.71
(g) 10.0014 10.0013 10.0017 10.0023
kasar (g) 0.8203 0.9950 1.3072 1.3069
7.04
10.0018
0.7608
8.27
12.54 5.82
10.0012 5.0009
0.7149 0.8079
8.17 17.15
8.80 10.62 14.24 14.16
Contoh perhitungan penentuan rendemen ekstrak akar dari Cilacap: Rendemen =
=
bobot ekstrak kasar × 100% (1 – kadar air) x bobot sampel 0.8203 g × 100% (1 – 0.0685) x 10.0014 g
= 8.80%
Lampiran 12 Uji aktivitas pada R. mucronata, R. stylosa, dan asam kojat
25
Daun R. mucronata Keterangan: Kolom 1, 4, dan 7 adalah sampel dengan tanpa penambahan substrat Kolom 2, 5, dan 8 adalah sampel dengan penambahan L-Tirosin Kolom 3, 6, dan 9 adalah sampel dengan penambahan L-DOPA Baris A-G adalah sampel dengan penambahan ekstrak Baris H adalah sampel dengan tanpa penambahan ekstrak
Batang R. mucronata Keterangan: Kolom 1, 4, dan 7 adalah sampel dengan tanpa penambahan substrat Kolom 2, 5, dan 8 adalah sampel dengan penambahan L-Tirosin Kolom 3, 6, dan 9 adalah sampel dengan penambahan L-DOPA Baris A-G adalah sampel dengan penambahan ekstrak Baris H adalah sampel dengan tanpa penambahan ekstrak
Lanjutan Lampiran 12
26
A B C D E F G H Akar R. mucronata Keterangan: Kolom 4, 7, dan 10 adalah sampel dengan tanpa penambahan substrat Kolom 5, 8 dan 11 adalah sampel dengan penambahan L-Tirosin Kolom 6, 9, dan 12 adalah sampel dengan penambahan L-DOPA Baris A-G adalah sampel dengan penambahan ekstrak Baris H adalah sampel dengan tanpa penambahan ekstrak
Batang R. stylosa Keterangan: Kolom 1, 4, dan 7 adalah sampel dengan tanpa penambahan substrat Kolom 2, 5, dan 8 adalah sampel dengan penambahan L-Tirosin Kolom 3, 6, dan 9 adalah sampel dengan penambahan L-DOPA Baris A-G adalah sampel dengan penambahan ekstrak Baris H adalah sampel dengan tanpa penambahan ekstrak
Lanjutan Lampiran 12 1
2 3
4 5 6 7
8 9
27
A B C D E F G H Asam kojat Keterangan: Kolom 1, 4, dan 7 adalah sampel dengan tanpa penambahan substrat Kolom 2, 5, dan 8 adalah sampel dengan penambahan L-Tirosin Kolom 3, 6, dan 9 adalah sampel dengan penambahan L-DOPA Baris A-G adalah sampel dengan penambahan ekstrak Baris H adalah sampel dengan tanpa penambahan ekstrak
