POTENSI DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum) SEBAGAI AKTIVATOR ENZIM GLUKOSA OKSIDASE
LAELA AGUSTANTI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ABSTRAK LAELA AGUSTANTI. Potensi Daun Sirih Merah (Piper crocatum) sebagai Aktivator Enzim Glukosa Oksidase. Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SURYANI. Salah satu jenis tanaman obat yang digunakan oleh masyarakat adalah sirih merah. Sirih merah telah diketahui sebagai obat antidiabetes dan diduga menggunakan mekanisme enzimatik dalam menurunkan kadar glukosa darah. Air rebusan dan ekstrak etanol 30% daun sirih merah diteliti untuk mempelajari mekanisme enzimatiknya dengan mengaktifkan kerja enzim glukosa oksidase pada beberapa konsentrasi. Pembanding yang digunakan adalah glukosa 10% tanpa ekstrak. Analisis dilakukan secara in vitro dengan menggunakan kit glukosa komersial. Air rebusan dan ekstrak etanol 30% daun sirih merah dicampur dengan glukosa 10% sebagai substrat enzim dan kit glukosa komersial kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10 menit. Produk berupa quinoneimina berwarna jingga diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 500 nm. Konsentrasi ekstrak air rebusan daun sirih merah 0, 0.2, 1, 2, 10, 20 dan 200 mg/mL memiliki aktivitas enzim berturut-turut sebesar 0.1209, 0.1800, 0.1816, 0.1618, 0.1305, 0.1214, dan 0.2316 μmol/mL.menit. Konsentrasi ekstrak etanol 30% daun sirih merah 0, 1000, dan 200000 ppm memiliki aktivitas enzimatik sebesar 0,1421, 0.2255, dan 12.4452 μmol/mL.menit. Berdasarkan hasil uji Tukey (α=0.05), hanya konsentrasi 200000 ppm ekstrak etanol 30 % yang berpotensi sebagai aktivator enzim glukosa oksidase.
ABSTRACT LAELA AGUSTANTI. Potency of Piper crocatum Leaf as Activator of Glucose Oxidase Enzyme. Under the direction of MEGA SAFITHRI and SURYANI. Piper crocatum is one of herb plant that already used by people. Its activity as antidiabetic drug was already known and the mechanism to lower the glucose level in blood was predicted through its enzyme. Leaf extract of Piper crocatum using water and ethanol 30 % was observed to study the enzimatic mechanism through activating glucose oxidase enzyme by several concentration and as a comparation was using glucose 10 % without extract. This research was done by in vitro using commercial glucose kit. Leaf extract of Piper crocatum with solvent water or ethanol 30% was mixed with glucose 10 % as enzyme substrate and commercial glucose kit, and then incubated in 37ºC for 10 minute. The product is quinoneimina which give orange colour and measured spectrophotometer at 500 nm wavelength. Concentration of boil water that used in this research was 0; 0.2; 1; 2; 10; 20; and 200 mg/mL have a enzyme activity in order were 0.1209, 0.1800, 0.1816, 0.1618, 0.1305, 0.1214, and 0.2316 μmol/mL.minute. Meanwhile concentration of ethanol 30% extact that used was 0, 1000 and 200000 ppm with it enzyme activity 0,1421, 0.2255 and 12.4452 μmol/mL.minute. Based on Tukey test (α=0.05), only concentration 200000 ppm ethanol 30% extract have potency as an activator of glucose oxidase enzyme.
POTENSI DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum) SEBAGAI AKTIVATOR ENZIM GLUKOSA OKSIDASE
LAELA AGUSTANTI
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul
:
Nama NIM
: :
Potensi Daun Sirih Merah (Piper crocatum) sebagai Aktivator Enzim Glukosa Oksidase Laela Agustanti G44104008
Disetujui Komisi Pembimbing
Mega Safithri, M.Si Ketua
Dr. Suryani Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya dalam menyelasaikan karya ilmiah ini. Shalawat dan salam semoga selalu terlimpah kepada Nabi Muhammad s.a.w. Karya ilmiah ini merupakan salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai Mei 2008 dengan judul Potensi Daun Sirih Merah (Piper crocatum) sebagai Aktivator Enzim Glukosa Oksidase. Ungkapan terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Mega Safithri, M.Si dan Ibu Dr Suryani selaku pembimbing atas segala kesabarannya, ilmunya dan pengarahannya selama penelitian dan penulisan skripsi. Terima kasih penulis juga sampaikan kepada Ibu Iis, Ibu Mery, Pak Arya serta seluruh staf Laboratorium Biokimia atas fasilitas dan kemudahan yang diberikan serta teman-teman penelitian mitha, abi, falakh atas bantuannya selama penelitian, safety atas pinjaman laptopnya, uda yudi atas ilmunya dalam pengolahan data, Pandu atas segala dukungannya dalam penyelesaian karya ilmiah ini. Tak lupa ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada sahabat-sahabatku dewi, intan, tyas, hanifah, dan auline atas kecerian dan kebersamaannya, Ibunda dan ayahanda tercinta, adikku feri atas segala dukungan, perhatian, kasih sayang, dan doanya. Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna karena keterbatasan pengalaman dan pengetahuan yang dimiliki penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang sekiranya dapat digunakan untuk perbaikan. Semoga karya ilmiah ini dapat berguna bagi pihak yang membutuhkan.
Bogor, Agustus 2008
Laela Agustanti
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Cirebon pada tanggal 29 Agustus 1986 dari pasangan Buhori Daryono dan Mamah Halimah. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 2004 penulis berhasil menyelesaikan sekolah di SMU Negeri 3 Cirebon. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biokimia, Jurusan Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia Umum S1 Teknologi Hasil Perikanan, S1 Biologi, Struktur dan Fungsi Subseluler pada tahun akademik 2007/2008. Penulis juga pernah melaksanakan Praktik Lapangan di Laboratorium Bioproses, bidang Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong. selama periode Juli sampai Agustus dengan judul Potensi β-Glukan dari Saccharomyces cerevisiae sebagai antibakteri. Selain itu, penulis juga aktif di Himpunan mahasiswa CREBs (Community of Research and Education in Biochemistry) sebagai anggota Departemen Keilmuan Bidang Mikrobiologi periode 2005/2006 dan 2006/2007.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... ix PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Sirih Merah....................................................................................................... 1 Diabetes Mellitus .............................................................................................. 2 Ekstraksi........................................................................................................... 3 Enzim Glukosa Oksidase .................................................................................. 3 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ................................................................................................. 4 Metode Penelitian ............................................................................................. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi........................................................................................................... 6 Analisis Fitokimia Ekstrak Etanol 30% Daun Sirih Merah ................................ 6 Analisis Kualitatif Logam ................................................................................. 7 Analisis In Vitro Sirih Merah Terhadap Aktivitas Enzim Glukosa Oksidase ...... 8 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ........................................................................................................ 10 Saran .............................................................................................................. 10 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 10 LAMPIRAN ...................................................................................................... 13
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tanaman sirih merah ....................................................................................... 2 2 Reaksi katalisis enzim glukosa oksidase .......................................................... 4 3 Prinsip reaksi dari kit Randox glukosa ............................................................. 4 4 Struktur klorofil dan hemoglobin ..................................................................... 8 5 Aktivitas enzim ekstrak air rebusan daun sirih merah terhadap enzim glukosa oksidase. ......................................................................................................... 9 6 Aktivitas enzim ekstrak etanol 30% daun sirih merah terhadap enzim glukosa oksidase .......................................................................................................... 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan penelitian ........................................................................................ 14 2 Tahapan penelitian uji in vitro terhadap aktivitas enzim glukosa oksidase ..... 15 3 Data λ maksimum pada konsentrasi 1.0 % v/v ............................................... 16 4 Data konsentrasi standar glukosa ................................................................... 17 5 Perhitungan bobot jenis ekstrak air rebusan dan rendemen ekstrak etanol 30% ................................................................................................... 18 6 Perhitungan pembuatan konsentrasi ekstrak air rebusan daun sirih merah ............................................................................................................ 18 7 Data aktivitas enzimatik ekstrak air rebusan daun sirih merah ....................... 19 8 Perhitungan aktivitas enzim ekstrak air rebusan daun sirih merah .................. 20 9 Data dan perhitungan aktivitas enzim dari ekstrak etanol 30% daun sirih merah ............................................................................................ 21 10 Hasil analisis statistika ekstrak air rebusan daun sirih merah menggunakan minitab 14 ..................................................................................................... 22 11 Hasil analisis statistika ekstrak etanol 30% daun sirih merah menggunakan minitab 14 ..................................................................................................... 22 12 Hasil analisis statistika ekstrak (air rebusan dan etanol 30%) menggunakan minitab 14 ..................................................................................................... 23 13 Hasil analisis kualitatif logam ........................................................................ 23 14 Hasil analisis fitokimia ekstrak etanol 30% daun sirih merah ......................... 24
PENDAHULUAN Penyakit gula atau Diabetes mellitus adalah penyakit yang disebabkan oleh tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia). Sebagian masyarakat lebih mengenal penyakit diabetes dengan sebutan “kencing manis” karena dalam urin penderita kadar glukosa lebih tinggi daripada keadaan normal. Penyebab lain timbulnya penyakit diabetes mellitus akibat adanya gangguan hormonal seperti insulin yang. berperan dalam metabolisme glukosa dalam sel tubuh. Penyakit ini tidak hanya menyerang orang tua saja bahkan dapat menyerang anak-anak (Mahler 1991). Jumlah penderita diabetes mellitus di dunia tiap tahunnya terus meningkat. Menurut survei organisasi kesehatan dunia WHO, Indonesia menempati urutan ke-4 terbesar dalam jumLah penderita diabetes melitus dengan tingkat pertumbuhan sebesar 8,6% per tahun dari total penduduk, sedangkan urutan diatasnya India, China dan Amerika Serikat (Departemen Kesehatan 2005). Berbagai usaha telah dilakukan untuk mengobati penyakit ini seperti penyuntikan insulin ataupun penggunaan obat antidiabetes yang dijual secara komersil. Mahalnya harga insulin dan obat-obat antidiabetes pada saat ini menyebabkan sebagian besar masyarakat mulai beralih ke penggunaan obat tradisional karena harganya yang lebih murah, mudah didapat dan tidak menimbulkan efek samping. Obat tradisional adalah tumbuhan yang digunakan sebagai obat. Menurut Widowati et al (1997), ada 46 jenis tanaman di Indonesia yang berfungsi sebagai obat antidiabetes. Sirih hijau (Piper betle) adalah salah satu tumbuhan yang telah terbukti secara ilmiah berkhasiat sebagai obat antidiabetes (Arawbella 2005). Sirih mempunyai beberapa jenis yaitu sirih merah, sirih hitam, sirih putih, sirih keraton, dll. Sirih merah telah diketahui mempunyai potensi yang sama dengan sirih hijau sebagai antihiperglikemia/antidiabetes. Sirih Merah (Piper crocatum) dikenal sebagai tanaman hias kemudian berubah menjadi tanaman obat setelah dikenalkan oleh Bambang Sudewo (Duryatmo 2005). Sirih merah mempunyai beberapa khasiat lainnya sebagai obat untuk hipertensi (darah tinggi), kanker, dan keputihan sehingga tanaman ini mendapat perhatian khusus dari herbalis untuk mengetahui manfaat-manfaat lainnya. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui manfaat dari sirih merah, diantaranya sebagai hepatoprotektor
(Windyagiri 2006), antibakteri (Sugiharti 2007), memeperbaiki pankreas yang rusak (Permata 2006). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Safithri & Fahma (2005), rebusan daun sirih merah memiliki potensi sebagai antidiabetes dengan dosis 20g/kg berat badan namun mekanisme kerjanya belum diketahui. Tanaman obat yang berfungsi sebagai antidiabetes memiliki beberapa mekanisme kerja. Salah satunya melalui mekanisme kerja enzim glukosa oksidase. Enzim glukosa oksidase adalah enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis oksidasi β-D-glukosa menjadi asam glukonat dengan menggunakan molekul oksigen sebagai akseptor elektron. Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian Safithri & Fahma (2005) untuk menyelidiki mekanisme kerja yang dilalui oleh sirih merah. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan potensi daun sirih merah dalam mengaktifkan kerja enzim glukosa oksidase. Selain itu, untuk membandingkan ekstrak dengan pelarut air rebusan dan alkohol 30% yang dapat mengaktifkan kerja enzim glukosa oksidase lebih tinggi. Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak air rebusan daun sirih merah berpotensi sebagai aktivator kerja enzim glukosa oksidase. Rebusan daun sirih merah pada konsentrasi tertentu akan menunjukkan aktivitas yang optimum dalam mengaktifkan kerja enzim glukosa oksidase. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memperkuat informasi ilmiah kepada masyarakat mengenai potensi sirih merah sebagai obat penurun kadar gula darah pada penderita diabetes mellitus melalui aktivasinya terhadap kerja enzim glukosa oksidase.
TINJAUAN PUSTAKA Sirih Merah Sirih hijau (Piper betle) termasuk tanaman famili piperaceae yang merambat dan bersandar pada batang pohon lain. Sirih mempunyai panjang mencapai puluhan meter, bentuk daun pipih menyerupai jantung dan permukaan daun berwarna hijau dan licin. Sirih telah dikenal sejak 600 SM sebagai antiseptik karena kandungan senyawa kavibetol dan kavikolnya. Selain itu, sirih juga mengandung kalsium nitrat, sedikit gula, dan pati (Duryatmo 2005). Tidak hanya sebagai antiseptik, sirih juga banyak digunakan untuk mengobati sakit mata, eksim, bau mulut, luka, mimisan, sariawan, sakit gigi, dan menjaga
2
kesehatan alat kelamin wanita (Mursito 2002). Tanaman sirih terdiri dari beberapa jenis, salah satunya adalah sirih merah. Sirih merah (Piper crocatum) merupakan jenis sirih yang banyak dimanfaatkan sebagai tanaman hias pada tahun 1900-an namun sekarang mengalami perubahan fungsi menjadi tanaman obat sejak dikenalkan oleh Bambang Sudewo, seorang produsen tanaman obat di Blunyahrejo. Klasifikasi lengkap dari tanaman sirih merah ini adalah sebagai berikut: Divisi Spermatophyta, Subdivisi Angiospermae, Kelas Monochlamydeae, Bangsa Piperales, Suku Piperaceae, Genus Piper, Jenis Piper crocatum (Duryatmo 2005). Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya bersulur dan beruas dengan setiap buku tumbuh bakal akar, daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, mempunyai warna yang khas yaitu permukaan atas hijau gelap berpadu dengan tulang daun berwarna merah hati keunguan, daun berasa pahit, berlendir, serta mempunyai bau yang khas seperti sirih (Duryatmo 2005). Tanaman sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar matahari agar warna merah daunnya tidak menjadi pudar, buram, kurang menarik (Sudewo 2005). Tanaman sirih merah (Gambar 1) dapat mengobati hipertensi, diabetes mellitus, leukimia, TBC, maag, asam urat dan batu ginjal (Sudewo 2005). Secara empiris, air rebusan daun sirih merah berkhasiat sebagai antihiperglikemia dengan dosis 20 g/kg BB dapat menurunkan glukosa darah sampai 40% selama 13 hari pencekokan pada tikus putih yang diabetes (Safithri & Fahma 2005), bersifat tidak toksik dengan kandungan senyawa fitokimia alkaloid, flavonoid dan tanin (Salim 2006), dapat memperbaiki kelenjar eksokrin dan endokrin pankreas pada
Gambar 1 Tanaman sirih merah (Sudewo 2005).
tikus yang hiperglikemia (Permata 2006), serta sebagai hepatoprotektor untuk memperbaiki sel-sel hepatosit hati tikus hiperglikemia yang rusak (Windyagiri 2006). Selain itu, menurut Sugiharti (2007) ekstrak sirih merah dengan pelarut etanol 30% terbukti memiliki aktivitas antibakteri dan dapat digunakan untuk menghambat bakteri B.subtilis dan P.aeruginosa.
Diabetes Mellitus Diabetes mellitus adalah jenis penyakit metabolisme yang disebabkan oleh menurunnya hormon insulin yang diproduksi oleh sel beta pulau langerhans dalam kelenjar pankreas (Vessby 1994). Insulin merupakan hormon yang berperan dalam metabolisme glukosa khususnya sebagai perantara masuknya glukosa di dalam darah ke sel-sel jaringan tubuh lainnya seperti otot dan jaringan lemak. Penurunan jumlah insulin yang disekresikan oleh kelenjar pankreas mengakibatkan glukosa yang masuk ke dalam tubuh tidak dapat diproses secara sempurna sehingga kadar glukosa di dalam darah meningkat atau disebut hiperglikemia (Mahler 1991). Kadar glukosa dalam darah yang tinggi hingga melewati batas normal dapat menyebabkan penyakit gula atau diabetes mellitus. Batas kadar glukosa normal dalam darah adalah 80-<110 mg/dl pada saat puasa dan 110-<160 mg/dl setelah makan (Departemen Kesehatan 2005). Selain menurunnya produksi insulin, timbulnya penyakit diabetes mellitus juga dapat disebabkan oleh faktor keturunan/genetik, pola makan, obesitas, obatobatan yang bersifat toksik atau beracun yang mampu merusak sel beta. Gejala umum yang dialami oleh penderita diabetes mellitus, yaitu sering buang air (poliuria), sering haus (polidipsia), sering lapar (polifagia), tubuh menjadi lemah dan mudah merasa lelah sehingga berat badan terus menurun, infeksi pada saluran kemih, dll (Guyton 1997). Penyakit diabetes mellitus diklasifikasikan ke dalam beberapa kelompok, salah satunya berdasarkan gejala klinis/medis yaitu diabetes mellitus tipe 1, diabetes mellitus tipe 2, gestational diabetes mellitus. Diabetes mellitus tipe 1 adalah tipe diabetes mellitus yang tergantung pada ketersediaan insulin. Penyebab timbulnya diabetes mellitus tipe 1 akibat kerusakan pada sel beta pulau Langerhans yang memproduksi insulin. Tipe ini dapat diderita oleh anak-anak maupun
3
orang dewasa. Saat ini, diabetes mellitus tipe 1 hanya dapat diobati dengan penyuntikan insulin secara rutin kepada penderita (Bierman 1985). Diabetes mellitus tipe 2 adalah tipe diabetes mellitus yang tidak tergantung pada insulin. Pada tipe ini, sel beta pulau Langerhans tidak rusak tapi insulin yang disekresikan jumlahnya sedikit dan tidak mencukupi kebutuhan tubuh akan insulin. Penderita tipe ini umumnya orang dewasa dan sifatnya diwariskan (diturunkan). Pengobatan untuk diabetes mellitus tipe 2 dilakukan dengan pengaturan pola makan dan olahraga namun dapat pula diobati dengan obat-obatan antidabetes tertentu tergantung resep dokter (Mahler 1991). Gestational diabetes mellitus merupakan jenis diabetes mellitus yang dialami seseorang saat hamil padahal sebelum hamil kadar glukosa darah dalam keadaan normal. Wanita hamil yang menderita diabetes mellitus akan berpengaruh terhadap kondisi janin dalam kandungannya terutama terhadap berat bayinya yang dapat mencapai berat lebih dari 4 Kg. Pengobatan untuk tipe ini dengan mengontrol kadar glukosa darah penderita (ibu hamil) ataupun dengan mengkonsumsi obat tradisional yang berpotensi sebagai antidiabetes (Mahler 1991). Berbagai usaha pengobatan bermunculan untuk mengobati penyakit ini namun pengobatan yang salah untuk penyakit diabetes mellitus dapat berdampak negatif terhadap beberapa organ tubuh seperti mata, jantung, dan ginjal. Obat-obat antidiabetes sekarang ini sudah banyak ditemukan. Obat antidiabetes (hipoglikemik) adalah golongan obat yang dapat menurunkan kadar glukosa darah dan terbagi ke dalam dua, yaitu obat yang disintesis secara kimia dan obat tradisional (herba) (Nurachman 2004). Mahalnya obat yang disintesis secara kimia menyebabkan sebagian masyarakat mencari alternatif obat antidiabetes yang murah dan mudah diperoleh tetapi mempunyai potensi yang sama dengan obat-obat yang disintesis secara kimia dalam mengobati penyakit diabetes mellitus yaitu dengan menggunakan tanaman obat seperti sambiloto, pare, sirih merah,dll. Ekstraksi Ekstraksi adalah peristiwa pemindahan zat terlarut (solut) diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur (Adijuwana & Nur 1989). Ekstraksi dapat diartikan juga cara untuk memisahkan campuran beberapa zat
menjadi komponen-komponen yang terpisah. Ekstraksi dapat dilakukan dengan dua cara fase air (aqueus phase) dan fase organik (organic phase). Ekstraksi fase air menggunakan air sebagai pelarut sedangkan ektraksi fase organik menggunakan pelarut organik seperti kloroform, eter dan sebagainya. Kelarutan zat di dalam pelarut tergantung dari kepolarannya. Zat yang polar hanya larut dalam pelarut polar, sedangkan zat yang non polar hanya larut dalam pelarut non polar (Winarno et al. 1973). Pelarut yang dapat digunakan untuk ekstraksi harus memenuhi dua syarat, yaitu pelarut tersebut harus merupakan pelarut yang terbaik untuk bahan yang diekstraksi dan pelarut tersebut harus terpisah dengan cepat setelah pengocokan (Winarno et al. 1973). Hal lain yang harus diperhatikan adalah selektivitas, kemampuan untuk mengekstrak, toksisitas, kemudahan untuk diuapkan, dan harga pelarut (Harborne 1987). Pelarut organik yang biasa digunakan untuk memproduksi konsentrat, ekstrak minyak atsiri dari bunga, daun, biji, akar, dan bagian lain dari tanaman adalah etil asetat, heksana, eter, benzena, toluena, etanol, isopropanol, aseton, dan air (Mukhopadhyay 2002). Metode ekstraksi dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu ekstraksi sederhana dan ekstraksi khusus. Ekstraksi sederhana terdiri dari maserasi, perkolasi, reperkolasi, evakolasi, dan dialokasi. Ekstraksi khusus terdiri dari sokletasi, arus balik, dan ultrasonik (Harborne 1996). Penelitian ini menggunakan ekstraksi dengan maserasi.
Enzim Glukosa Oksidase (GOD) Enzim GOD (EC 1.1.3.4) termasuk ke dalam enzim oksidoreduktase yang berfungsi untuk mengkatalisis reaksi oksidasi β-Dglukosa menjadi asam glukonat dengan menggunakan molekul oksigen sebagai akseptor elektron. Enzim GOD terdapat dalam bentuk glikoprotein dengan kandungan mannosa sebesar 16%. Enzim ini banyak diproduksi oleh jamur Aspergillus niger dan Penicillium yang didistribusikan diantara membran ekstrasellular di sekitar dinding sel fungi. Karateristik dari enzim GOD yang diperoleh dari Aspergillus niger yaitu sebagai berikut: bobot molekul (BM) = 160.000 Dalton, enzim ini mengandung 74% protein, 16% mannosa, dan 2% gula amina, serta pH optimum untuk enzim ini sebesar 5,5. Selain itu, enzim ini akan stabil bila disimpan pada
4
suhu rendah (Bright 1969). Enzim ini merupakan enzim yang sering digunakan untuk mengetahui mekanisme kerja enzimatik dari bahan yang berpotensi sebagai antidiabetes di beberapa penelitian. Salah satu tanaman yang telah dibuktikan secara empiris berkhasiat sebagai obat antidiabetik dengan menggunakan metode enzimatik (glukosa oksidase) secara in vivo adalah daun lidah buaya (Azizah 2005). Gambar 2 menunjukkan reaksi katalisis oksidasi β-D-glukosa ke bentuk D-glucono1,5-lakton yang kemudian dihidrolisis menjadi asam glukonat yang kemudian terlibat dalam jalur pentosa fosfat dalam tubuh (Lehninger 2004). Jalur pentosa fosfat merupakan jalur metabolisme oksidatif sitoplasma yang dimulai dari glukosa 6-fosfat seperti halnya pada glikolisis. Jalur ini menyediakan dua prekursor penting untuk jalur anabolik, yaitu NADPH yang diperlukan untuk biosintesis lipid dan ribosa 5-fosfat, suatu prekursor biosintesis nukleotida. Hasil oksidasi enzim GOD berupa asam glukonat berfungsi sebagai substrat awal dalam jalur pentosa fosfat untuk membentuk 6-fosfoglukonat dengan produk lain berupa NADPH yang dapat digunakan untuk biosintesis lipid (Koolman 1994). Penentuan aktivitas glukosa oksidase dapat menggunakan enzim GOD murni maupun menggunakan kit komersial yaitu kit glukosa randox. Pada penelitian ini menggunakan kit komersial yang mengandung enzim GOD, enzim peroksidase dan pelarut-pelarut lainnya (buffer dan reagen 4-aminofenazon dan fenol) yang dapat diukur secara spektrofotometer. Prinsip kerja dari kit Randox ini ditunjukkan oleh Gambar 3, yaitu glukosa dikatalisis secara oksidasi enzimatik oleh GOD yang akan membentuk asam glukonat dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida yang terbentuk bereaksi dengan fenol dan aminofenazon yang dikatalisis oleh enzim peroksidase (POD) membentuk senyawa quinoneimina yang berwarna jingga dan dapat dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500-546 nm (Barham 1972).
Gambar 2 Reaksi katalisis enzim glukosa oksidase (Bright 1969).
GOD
Glukosa + O2 + H2O
Asam Glukonat + H2O2
2 H2O2 + 4-Aminofenazon + fenol POD
Quinoneimina + 4 H2O
Gambar 3 Prinsip reaksi dari kit Randox glukosa (Barham 1972).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun sirih merah, akuades, alkohol 30%, standar glukosa, dan kit glukosa Randox GL 2623. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis kualitatif logam adalah amonium oksalat 1%, kalium ferosianida, amonium tiosianat, amonium karbonat, amonium klorida, dinatrium hidrogen fosfat, amonium hidroksida. Bahanbahan yang digunakan untuk uji fitokimia adalah kloroform, NH4OH, H2SO4 2M, pereaksi (Dragendorf, Mayer & Wagner), metanol 30%, FeCl3 1%, akuades, etanol 30%, eter, asam asetat anhidrat dan H2SO4 pekat. Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer Genesys 10 UV, hot plate Gerhardf, penangas air memmert, neraca analitik ohauss GA200, vorteks Genie2, mikropipet, spot tes, shaker Eyela multi shaker MMS, oven, rotavapor R110 Buchi dan peralatan gelas (pipet volumetrik, pipet tetes, erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur, batang pengaduk, tabung reaksi, sudip, corong gelas).
Metode Penelitian Pembuatan Rebusan Daun Sirih Merah (Safithri 2005) Daun sirih merah segar ditimbang sebanyak 100 gram ditambahkan akuades sebanyak 500 mL, lalu direbus sampai volumenya menjadi 50 mL. Setelah itu disaring untuk mendapatkan ekstrak air daun sirih merah. Konsentrasi ekstrak air rebusan yang digunakan adalah 0.2, 1, 2, 10, 20, dan 200 mg/mL. Penentuan Bobot Jenis Ekstrak air rebusan daun sirih merah dimasukkan ke dalam urinometer dan dibaca
5
miniskus cairannya. Suhu cairan diukur kemudian dihitung faktor koreksinya. Ekstraksi Daun Sirih Merah dengan Etanol 30% (Safithri dan Fahma 2005) Ekstraksi yang dilakukan dengan cara maserasi. Daun sirih merah segar ditimbang sebanyak 50 gram kemudian dimaserasi menggunakan pelarut etanol 30% sebanyak 250 mL diatas shaker pada suhu ruang selama 24 jam. Selanjutnya disaring dan filtrat diambil serta sisanya dilakukan ekstraksi lagi dengan volume yang sama. Ekstraksi dilakukan selama 3 hari. Hasil yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator (T < 60 ºC) kemudian didestilasi uap untuk mengeluarkan fraksi volatilnya. Setelah itu didapat ekstrak etanol. Uji In Vitro Sirih Merah Terhadap Aktivitas Enzim Glukosa Oksidase (Barham 1972) Pengukuran dilakukan dengan menggunakan kit komersial berupa kit Randox GL 2623. Kit Randox ini mengandung buffer, enzim GOD-PAP Reagent (glukosa oksidase dan enzim peroksidase) dan standar glukosa yang dapat diukur secara spektrofotometer. Sebanyak 20 μL standar glukosa ditambahkan 20 μL sampel (rebusan daun sirih merah dengan konsentrasi 0.2, 1, 2, 10, 20 dan 200 mg/mL) dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 4000 μL GOD-PAP reagent yang sudah mengandung buffer (fosfat buffer 0.1 mol/l pH 7.0 dan fenol 11 mmol/l). Semua reagent dicampurkan kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 °C dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Pengukuran yang sama juga dilakukan pada ekstrak alkohol 30%. Blanko yang digunakan adalah akuades sebanyak 40 μL dengan perlakuan sama. Pengujian setiap sampel dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan. Analisis Kualitatif Logam (Kleiner 1958) Kalsium. Sebanyak 2 mL sampel ditambahkan dengan 1 mL amonium oksalat 1 %. Hasil positif adanya logam kalsium ditunjukkan dengan terbentuknya endapan berwarna putih. Magnesium. Sebanyak 2 mL sampel dipanaskan hingga mendidih kemudian ditambahkan kristal amonium karbonat dan NH4Cl hingga tidak terbentuk endapan lagi. Filtrat ditambahkan kristal dinatrium hidrogen fosfat dan amonium hidroksida hingga larutan
bersifat basa. Hasil positif adanya logam magnesium ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih. Besi. Sebanyak 2 mL sampel ditambahkan 1 mL amonium tiosianat. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau biru kehijauan. Selain itu, analisis kandungan logam dapat ditentukan dengan mencampurkan sampel sebanyak 2 mL dan 1 mL Kalium ferosianida. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah. Analisis Fitokimia Ekstrak Etanol 30 % Daun Sirih Merah (Harborne 1987) Analisis fitokimia yang dilakukan dalam penelitian ini hanya dilakukan secara kualitatif, analisis ini dilakukan untuk mengetahui senyawa-senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak etanol 30% daun sirih merah. Analisis dilakukan berdasarkan metode Harborne (1987). Senyawa yang diidentifikasi adalah alkaloid, saponin, flavonoid, steroid dan triterpenoid, dan tanin. Uji Akaloid. Sebanyak 0.05 gram ekstrak sirih merah ditambahkan 5 mL kloroform dan amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 1 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih ada pereaksi Meyer, endapan merah pada perekasi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Flavonoid. Sebanyak 0.05 gram ekstrak sirih merah ditambahkan dengan metanol 30% kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat ditambahkan dengan H2SO4, Senyawa flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4. Uji Saponin. Sebanyak 0.05 gram ekstrak sirih merah ditambahkan 5 mL akuades lalu dipanaskan selama 5 menit. Kemudian dikocok selama 5 menit. Uji saponin menunjukkan hasil positif jika terbentuk busa setinggi kurang lebih 1 cm dan tetap stabil setelah didiamkan selama 10 menit. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.05 gram ekstrak sirih merah ditambahkan 12.5 mL etanol 30% lalu dipanaskan selama 5 menit dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan dengan eter. Lapisan eter ditambahkan dengan pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu yang
6
terbentuk menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunujukkan adanya steroid. Uji Tanin. Ekstrak sirih merah sebanyak 0.05 gram ditambahkan 12.5 mL akuades kemudian dididihkan selama 5 menit. Larutan ini disaring dan filtratnya ditambahkan dengan FeCl3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menunjukkan adanya tanin. Analisis Data Data aktivitas enzim yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis secara statistik menggunakan ANNOVA yaitu RAL (Rancangan Acak Lengkap) satu faktor dengan dua kali ulangan pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α 0,05 dan kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey. Semua data dianalisis menggunakan program Minitab 14. Model rancangan tersebut: Yij =
+
i+
ij
keterangan : i = rebusan daun sirih merah j = ulangan; 1,2 Yi = pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j = rataan umum i = pengaruh perlakuan ke-i ij = pengaruh acak pada perlakuan ke-i, ulangan ke-j
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah metode rebusan dan maserasi. Metode rebusan dilakukan dengan merebus daun sirih merah dan air hingga volume air menjadi sepersepuluh dan diperoleh ekstrak kental berwarna merah kecoklatan. Perbandingan yang digunakan antara daun sirih merah dan air untuk merebus adalah 1:5. Hal ini disesuaikan dengan penelitian sebelumnya untuk melengkapi data penelitian tersebut. Pemilihan metode rebusan didasarkan pada kebiasaan masyarakat yang mengkonsumsi air rebusan daun sirih merah dari dua lembar daun per harinya untuk mengobati berbagai penyakit seperti hipertensi, keputihan, dan diabetes. Selain itu, metode rebusan ini merupakan metode yang mudah, murah dan praktis sehingga dapat dilakukan oleh masyarakat umum.
Ekstrak air rebusan ditentukan bobot jenisnya terlebih dahulu. Bobot jenis adalah rasio massa dari suatu zat dengan massa air pada volume dan temperatur yang sama. Bobot jenis yang diperoleh dari ekstrak air rebusan daun sirih merah sebesar 1,012 g/mL. Bobot jenis ini dapat digunakan untuk mengkonversi ke dalam konsentrasi. Konsentrasi ekstrak air rebusan yang digunakan adalah 0.2, 1, 2, 10, 20, dan 200 mg/mL. Metode ekstraksi yang kedua adalah maserasi dengan cara merendam sampel dalam pelarut tertentu. Maserasi merupakan metode yang sederhana karena tidak menggunakan pemanasan sehingga dapat mencegah rusaknya senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan terhadap suhu tinggi. Pelarut yang digunakan pada metode maserasi adalah etanol 30%. Hal ini didasarkan menurut Depkes 1981, untuk mengekstrak tanaman herbal maka etanol yang digunakan adalah etanol 30%. Maserasi ini dilakukan dengan merendam daun segar sirih merah yang telah diblender dengan pelarut etanol 30% dan didiamkan selama 3x24 jam dengan mengganti pelarut setiap 24 jam. Hal ini dilakukan untuk memperoleh hasil ekstrak yang maksimal. Ekstrak yang diperoleh kemudian dievaporasi untuk menguapkan sisa pelarut yang digunakan sehingga diperoleh ekstrak kental berwarna coklat tua. Pemekatan dilakukan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 oC untuk mencegah kemungkinan terjadinya kerusakan komponen yang terkandung dalam ekstrak. Nilai rendemen yang diperoleh sebesar 2,51%. Persentase tersebut menunjukkan banyaknya senyawa bioaktif yang terekstrak. Nilai rendemen ini lebih rendah dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan Tiagarna (2004) dengan pelarut yang sama dari buah mahkota dewa dengan nilai rendemen sebesar 35,80% dan ekstrak etanol 70% dari daun salam (Ekawati 2005) dengan nilai rendemen sebesar 18,45%. Perbedaan ini dipengaruhi oleh jenis tanaman dan pelarut yang digunakan. Konsentrasi ekstrak etanol 30% yang dibuat adalah 1000 dan 200000 ppm karena pada ekstrak air rebusan, konsentrasi tersebut memiliki aktivitas enzim yang paling tinggi dibandingkan konsentrasi lainnya. Analisis Fitokimia Ekstrak Etanol 30% Daun Sirih Merah Analisis fitokimia dilakukan pada ekstrak daun sirih merah dengan pelarut etanol 30%.
7
Analisis fitokimia merupakan salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit pada suatu tanaman secara kualitatif. Analisis fitokimia bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa metabolit yang diharapkan dapat berperan sebagai antihiperglikemia. Senyawasenyawa yang diuji antara lain alkaloid, saponin, flavonoid, triterpenoid, steroid, tanin. Hasil analisis fitokimia dapat dilihat pada Tabel 1. Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak etanol 30% daun sirih merah mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan tanin. Hasil uji fitokimia ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Salim (2006) yang menggunakan rebusan daun sirih merah yang terbukti mengandung alkaloid, flavonoid, dan tanin. Kesesuaian hasil uji fitokimia antara ekstrak air rebusan dan etanol 30% membuktikan bahwa etanol 30% menarik senyawa kimia yang sama dengan pelarut air. Pada ekstrak menunjukkan hasil yang positif untuk uji alkaloid terhadap ketiga pereaksi (Wagner, Mayer, dan Dragendorf). Adanya tanin ditunjukkan dengan terbentuknya warna hitam kehijauan dan flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah jingga. Alkaloid merupakan golongan terbesar dari senyawaan hasil metabolit sekunder pada tumbuhan. Alkaloid dapat ditemukan dalam berbagai bagian tanaman seperti biji, daun, ranting, dan kulit kayu (Suradikusumah 1989). Flavonoid adalah senyawa fenol yang banyak terdapat pada tumbuhan berpembuluh dan bersifat dapat larut dalam air (Harborne 1987). Alkaloid dan flavonoid merupakan senyawa aktif yang telah diteliti memiliki aktivitas antihipoglikemik (Ivorra et al. 1989). Flavonoid dapat menghambat kerja enzim αglukosidase dalam luteolin (Sang kim 2000). Enzim glukosidase merupakan enzim yang juga digunakan untuk mengetahui potensi suatu tumbuhan sebagai antidiabetes secara in vitro dengan mekanisme penghambatan. Selain itu, kedua senyawa tersebut dapat juga berfungsi sebagai senyawa antioksidan seperti yang telah dilaporkan oleh Hanani (2005) yang mengidentifikasi senyawa alkaloid sebagai antioksidan dalam spons callyspongia sp. Tanin merupakan senyawa polifenol yang dapat larut dalam air, gliserol, metanol, kloroform, eter. Tanin dapat menyebabkan tumbuhan mempunyai rasa sepat. Tanin berfungsi sebagai antioksidan karena kemampuannya dalam menangkap radikal bebas, menghambat radikal bebas, dan tumor
(Dangles et al. 2000). Aktivitas antioksidan dari suatu tumbuhan sangat dipengaruhi oleh keberadaan senyawa metabolit sekunder yang terkandung. Golongan polifenol pada teh telah terbukti berpotensi sebagai antioksidan (Frei 2003). Hasil analisis fitokimia ekstrak etanol 30% daun sirih merah mengandung senyawa metabolit sekunder yang sama dengan daun salam. Kesesuaian hasil analisis fitokimia dipengaruhi oleh kemampuan kedua tanaman sebagai antidiabetes. Daun salam mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, fenolik hidrokuinon, triterpenoid, dan tanin (Ekawati 2007). Tabel 1 Hasil analisis fitokimia ekstrak etanol 30% daun sirih merah Senyawa Hasil* Alkaloid + Saponin Flavonoid + Triterpenoid Steroid Tanin + *(+) = mengandung senyawa uji; (-) = tidak mengandung senyawa uji
Analisis Kualitatif Logam Analisis ini bertujuan untuk mengetahui dan menentukan jenis logam yang terkandung dalam kedua ekstrak (air rebusan dan etanol 30%). Umumnya pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim dilakukan secara eksternal. Logam yang dianalisis pada penelitian ini meliputi magnesium, besi dan kalsium. Hal ini dikarenakan ketiga logam tersebut merupakan logam yang umumnya ada di dalam suatu tanaman dan berfungsi untuk mengaktifkan kerja enzim-enzim tertentu yang terlibat dalam metabolisme di dalam tubuh. Tabel 2 menunjukkan hasil analisis kualitatif logam. Pada ekstrak air rebusan dan etanol 30% menunjukkan hasil positif mengandung logam magnesium (Mg). Magnesium berperan penting dalam tanaman karena merupakan satu-satunya unsur logam yang menyusun klorofil (Tisdale & Nelson 1975). Klorofil adalah zat pembawa warna hijau pada tumbuh-tumbuhan dengan atom pusatnya adalah magnesium (Gambar 4). Klorofil berperan melakukan fotosintesis, menyerap dan menggunakan energi sinar matahari untuk membentuk karbohidrat dari CO2 dan air pada tumbuh-tumbuhan
8
(Indrardjo 1986). Magnesium merupakan salah satu logam esensial utama. Magnesium dalam tubuh manusia berperan untuk mengaktifkan berbagai enzim yang mempercepat reaksi kimia, terlibat dalam reaksi enzimatik untuk sintesis protein, dan dibutuhkan sel otot dan saraf pada jantung agar dapat bekerja optimal (Darmono 1995). Terdapat perbedaan hasil untuk analisis logam besi antara ekstrak air rebusan dan etanol 30%. Logam besi hanya ditemukan pada ekstrak rebusan daun sirih merah yang ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah sedangkan pada ekstrak etanol 30% menunjukkan hasil yang negatif. Perbedaan hasil ini disebabkan oleh kemungkinan rusaknya logam besi selama pembuatan ekstrak etanol 30%. Tanaman dapat mengalami kekurangan logam besi meskipun besi diperlukan dalam pembentukan kloroplas, penyusun protein, dan enzim. Enzim yang mengandung besi contohnya sitokrom. Besi memiliki peran yang sangat penting bagi tubuh, yaitu untuk pembentukan hemoglobin (protein sel darah merah) yang bertugas mengantarkan oksigen dari paru-paru ke otak dan seluruh jaringan tubuh, untuk sintesis DNA, dan pelindung sel dari kerusakan akibat oksidasi (Sugiarto 2005). Kedua ekstrak menunjukkan hasil yang negatif untuk analisis logam kalsium. Kalsium termasuk unsur hara makro dalam tanaman. Ketersediaan kalsium dalam tanaman dipengaruhi oleh penggunaan pupuk N, P, dan K secara besar-besaran yang menyebabkan unsur kalsium terangkut dari tanah secara terus-terusan sehingga ketersediaan kalsium di tanah sangat kecil dan akibatnya kadar kalsium di dalam tanaman juga menjadi sedikit. Peran kalsium dalam tanaman adalah membantu pembentukan bintil akar pada tanaman, dan mengatur translokasi karbohidrat (Darmono 1995). Kalsium adalah logam penting untuk tubuh yang berperan dalam pembentukan tulang dan gigi, membantu fungsi pengeluaran dan aktivasi enzim-enzim pencernaan. Tabel 2 Hasil analisis kualitatif logam Logam Ekstrak air Ekstrak rebusan* etanol 30%* Magnesium + + Kalsium Besi + *(+) = mengandung logam uji; (-) = tidak mengandung logam uji
Penelitian tentang pengaruh ion tertentu terhadap aktivitas enzim glukosa oksidase telah dilakukan oleh Zeki (2007). Berdasarkan penelitiannya, aktivitas enzim glukosa oksidase dapat diaktifkan oleh HgCl2, Hg2Cl2, CuCl2 dan CuCl serta dapat dihambat oleh NaNO3.
Gambar 4 Struktur klorofil dan hemoglobin (www.chem-is-try.org).
Analisis In Vitro Sirih Merah Terhadap Aktivitas Enzim Glukosa Oksidase Analisis yang dilakukan menggunakan metode kit glukosa randox. Substrat glukosa dioksidasi oleh enzim glukosa oksidase menghasilkan asam glukonat dan peroksida. Peroksida yang terbentuk, aminofenazon dan fenol akan bereaksi dengan enzim peroksidase menghasilkan quinoneimina. Senyawa yang terbentuk ini akan menghasilkan warna jingga sehingga dapat diukur secara spektrofotometri. Semakin banyak quinoneimina yang terbentuk maka semakin banyak glukosa yang terukur sehingga aktivitas glukosa oksidase dapat ditentukan. Pengukuran dilakukan secara spektrofotometri pada panjang gelombang 500 nm. Mekanisme enzimatik glukosa oksidase merupakan salah satu jalur antidiabetes terkait dengan jalur pentosa fosfat dan hal ini menjelaskan mengenai hubungan antara antidiabetes dan antioksidan dari suatu sampel. Asam glukonat yang dihasilkan sebagai produk hidrolisis glukosa oksidase akan bergabung dengan enzim yang analog dalam jalur pentosa fosfat yang kemudian membentuk 6-gosfoglukonat. Salah satu produk yang dihasilkan dari jalur pentosa fosfat adalah NADPH yang berfungsi sebagai pelindung sel dari kerusakan dan radikal bebas (Lehninger 2004). Peran NADPH tersebut dapat menjelaskan mengenai potensi sirih merah sebagai antidiabetes. Kadar glukosa darah yang tinggi pada penderita diabetes dapat turun jika mengkonsumsi sirih merah secara rutin karena semakin banyak glukosa yang diubah oleh
9
glukosa oksidase menghasilkan asam glukonat. Hal ini dikarenakan glukosa berfungsi sebagai subtrat untuk enzim glukosa oksidase. Sebelum analisis ekstrak, terlebih dahulu dilakukan pengukuran konsentrasi standar terdiri dari 2%, 4%, 6%, 8%, dan 10%. Analisis in vitro daun sirih merah terhadap aktivitas enzim glukosa oksidase pada penelitian ini menggunakan 2 ekstrak, yaitu air rebusan dan etanol 30%. Analisis ekstrak dilakukan dengan menambahkan 20 μL ekstrak (air rebusan dan etanol 30%) dengan 20 μL larutan standar glukosa 10 %. Pemilihan standar glukosa 10 % karena konsentrasi ini merupakan konsentrasi terbesar dalam deret konsentrasi standar yang menghasilkan absorbansi maksimum (Lampiran 4). Tingginya aktivitas enzimatik ditentukan dengan membandingkan aktivitas enzimatik ekstrak dan substrat (glukosa 10%) dengan aktivitas enzimatik yang hanya terdiri dari substrat (glukosa 10 %) saja tanpa ekstrak. Gambar 5 menunjukkan aktivitas enzimatik dari air rebusan pada konsentrasi 0.2, 1, 2, 10, 20 dan 200 mg/mL. Aktivitas enzim tertinggi terdapat pada konsentrasi 1 dan 200 mg/mL secara berturut-turut sebesar 0.1816 dan 0.2316 μmol/mL menit. Aktivitas enzim yang diperoleh tidak sebanding dengan peningkatan konsentrasi ekstrak air rebusan. Berdasarkan uji statistik konsentrasi tersebut menunjukkan nilai yang tidak berbeda nyata (p>0,05) dengan konsentrasi standar glukosa 10% tanpa ekstrak. Ini berarti, perlakuan yang diberikan, yaitu ekstrak rebusan untuk
Gambar 5 Aktivitas enzim ekstrak air rebusan daun sirih merah terhadap enzim glukosa oksidase (huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata).
konsentrasi 0.2 hingga 200 mg/mL memberikan peningkatan aktivitas enzimatik namun tidak mempengaruhi aktivitas enzim glukosa oksidase secara signifikan. Hal ini dipengaruhi oleh adanya senyawa lain yang terkandung dalam ekstrak yang ikut meningkat dengan meningkatnya konsentrasi dan senyawa ini dapat menghambat kerja senyawa aktif dalam ekstrak terhadap kerja enzim glukosa oksidase. Konsentrasi ekstrak etanol 30% yang digunakan adalah 1000 dan 200000 ppm. Pemilihan konsentrasi ini didasarkan karena pada konsentrasi tersebut dari ekstrak air rebusan memiliki aktivitas enzim yang lebih tinggi dibandingkan konsentrasi lainnya. Gambar 6 menunjukkan aktivitas enzim glukosa oksidase ekstrak etanol 30% lebih tinggi dibandingkan ekstrak air rebusan pada konsentrasi yang sama. Contohnya pada konsentrasi 200000 ppm memiliki aktivitas enzim sebesar 12.4452 μmol/mL.menit sedangkan pada ekstrak air rebusan hanya sebesar 0.2316 μmol/mL menit. Hasil uji statistik untuk konsentrasi 1000 ppm ekstrak etanol 30% menurut uji statistika nilainya tidak berbeda nyata (P<0,05). Sebaliknya konsentrasi 200000 ppm menunjukkan nilai yang berbeda nyata (p<0,05) dengan konsentrasi standar glukosa 10% tanpa ekstrak. Perbedaan hasil antara ekstrak air rebusan dan etanol 30% dipengaruhi oleh kandungan senyawa metabolit seperti flavonoid. Kadar flavonoid secara kuantitatif pada ekstrak etanol 30% telah diteliti secara empiris, yaitu nilainya lebih tinggi dibandingkan air rebusan.
Gambar 6 Aktivitas enzim ekstrak etanol 30% daun sirih merah terhadap enzim glukosa oksidase (huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata).
10
Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, flavonoid merupakan salah satu senyawa yang menyebabkan suatu tanaman berpotensi sebagai antidiabetes. Kadar flavonoid yang besar diduga dapat meningkatkan aktivitas enzim glukosa oksidase. Selain itu, adanya logam tertentu seperti besi yang hanya ditemukan dalam air rebusan diduga mempengaruhi aktivitas enzim glukosa oksidase. Berdasarkan nilai aktivitas yang diperoleh, besi yang terkandung dalam air rebusan diduga dapat menghambat kerja senyawa aktif dalam ekstrak air rebusan terhadap aktivitas enzim glukosa oksidase. Besi tidak terkandung di dalam ekstrak etanol 30% sehingga tidak mempengaruhi aktivitas enzimnya. Pada beberapa penelitian pengujian aktivitas enzim, ekstrak etanol 30% menghasilkan aktivitas enzim yang lebih tinggi dibandingkan air seperti pada enzim lipase dari tanaman bangle (Latifah 2001). Mekanisme enzimatik dari tanaman obat yang berpotensi sebagai antidiabetes secara in vitro masih jarang dilakukan. Namun penelitian mengenai kemampuan suatu tanaman obat sebagai aktivator enzim tertentu sudah banyak dilakukan contohnya pada tanaman bangle (Iswantini 2005) yang terbukti dapat mengaktifkan kerja enzim kolesterol oksidase. Nilai aktivitas enzim kolesterol oksidase yang diperoleh sebesar 537.24 μmol/mL.menit pada konsentrasi 200 ppm.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan uji fitokimia, ekstrak etanol 30% mengandung senyawa aktif yang sama dengan air rebusan yaitu alkaloid, flavonoid dan tanin. Logam yang terkandung pada ekstrak air rebusan dan etanol 30 % dari daun sirih merah adalah magnesium. Air rebusan tidak berpotensi sebagai aktivator. Ekstrak etanol 30% dengan konsentrasi 200.000 ppm yang berpotensi sebagai aktivator enzim glukosa oksidase. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengujikan ekstrak air rebusan dan etanol 30% terhadap enzim glukosidase. Uji lanjut menggunakan pelarut etanol dengan berbagai konsentrasi. Selain itu, perlu dilakukan analisis untuk menentukan senyawa aktif yang berperan dalam mengaktifkan kerja enzim glukosa oksidase dan penentuan secara
kuantitatif kadar logam pada kedua ekstrak dengan menggunakan spektroskopi serapan atom.
DAFTAR PUSTAKA Adijuwana, Nur MA. 1989. Teknik Spektroskopi dalam Analisis Biologi. Bogor: Pusat Antar Universitas IPB. Arambewela LSR. 2005. Antidiabetic activities of aqueous and ethanolic extracts of Piper betle leaves in rats. Journal of Ethnopharmacology. 102:239-245. Azizah T. Pengaruh decocta daun lidah buaya (Aloe vera L) terhadap kadar glukosa darah kelinci yang dibebani glukosa. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi. 6:26-34. Barham D. 1972. Manual Procedur of Glucose. New York: Randox Laboratories. Bierman EL. 1985. Diet and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 41:1113-1116. Bright. 1969. Glucoseoxidase. [terhubung berkala].www.biol.paisley.ac.uk/mac ro/enzyme_electrode/chapter3/. [2 Februari 2008]. Dangles et al. 2000. Antioxidant properties of anthocyanins and tannins: a mechanistic investigation with catechin and the 3’,4’,7trihydroxyflavylium ion. Journal Royal Society of Chemistry. 2:16531663. Darmono. 1995. Logam dalam Sistem Biologi Makhluk Hidup. Jakarta: UI Pr. Departemen Kesehatan. 2005. Diabetes mellitus masalah kesehatan masyarakat yang serius. http://www.depkes.go.id/index.php? option=news&task=viewarticle&sid =942 [1 Februari 2008]. Duryatmo S. 2005. Dulu hiasan kini obat. Trubus. 427: 37.
11
Ekawati RA. 2007. Potensi antioksidasi daun salam (Eugenia polyantha Weight.) pada lingkungan agrobiofisik yang berbeda. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Frei B, Higdon JV. 2003. Antioxidant activity of tea polyphenols in vivo: evidence from animal studies. Journal of Nutrition Science. 133(10):327532845. Guyton AC, Hall JE. 1997. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi 9. Setiawan I, Tengadi KA, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Texbook of Medical Physiology 9th Edition. Hanani E, Mu’nin A, Sekarini R. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp dari kepulauan seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2(3):127-133. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Iwang S, penerjemah. Bandung: ITB Pr. Terjemahan dari: Phytochemical Method. Indrardjo GB. 1986. Perbandingan Kiserit dan dolomit sebagai sumber magnesium pada tiga takaran TSP, dengan parameter pertumbuhan kacang tanah (Arachis hypogaea L.), serapan hara, dan sifat kimia latosol darmaga. [skripsi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Ivvora et al. 1989. A Review of natural and plants as potential antidiabetic drugs. Journal of Ethnopharmacology. 27:243-275. Iswantini D. 2005. Fraksinasi dan karakterisasi senyawa aktif dari bangle (Zingiber cassumunar roxb.) sebagai aktivator enzim kolesterol oksidase. Prosiding Simposium Nasional Kimia Bahan Alam XV. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptohardjo A, Penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry.
Klein G et al. 2007. Antidiabetes and antiobesity activity of lagerstroemia speciosa. Advance Access Publication. 4(4):401-407. Kleiner IS, Louis BD. 1958. Laboratory Instructions in Biochemistry Fifth Edition. New York: Mosby. Koolman, Jan. 2000. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Septelia Inawati Wanandi, penerjemah. Jakarta: Hipokrates. Terjemahan dari: Color Atlas of Biochemistry. Lehninger. 2004. Principles of Biochemistry. California: Worth. Latifah KD. 2001. Kajian senyawa golongan flavonoid asal tanaman bangle sebagai senyawa peluruh lemak melalui aktivitas lipase. [laporan penelitian]. Bogor: Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor. Mahler RJ. 1991. Diabetes, Obesity, and Vascular Disease. London: Hemisphere. Matjik AA. 2002. Rancangan Percobaan. Bogor: IPB Pr. Mukhopadhyay M. 2002. Natural Extract Using Supercritical Carbondioxide. London: CRC Pr. Mursito B. 2002. Ramuan Tradisional untuk Penyakit Malaria. Jakarta: Penebar Swadaya. Nuracman Z. 2004. Diabetes,ungkapan gangguan keseimbangan bahan bakar.http://www.kompas.com/keseh atan/news/0302/20/220453.htm. [1 Mei 2008]. Permata DA. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap perbaikan pankreas tikus putih hiperglikemia. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Safithri M, Fahma. 2005. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur sprague
12
dawley. [laporan penelitian]. Bogor: LPPM IPB. Salim A. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus galur sparague-dawley. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sang kim J et al. 2000. Inhibition of alphaglucocidase and amylase by luteolin, flavonoid. Journal Biosci, Biotechnol, Biochem. 64(11):24582461. Sittig
W. 1987. Fundamentals of Biotechnology. Weinheim: VCH.
Sudewo B. 2005. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah. Jakarta: Agromedia Pustaka. Sugiarto.
2003. Anorganik UNY Pr.
Dasar-Dasar Kimia Logam. Yogyakarta:
Sugiharti NP. 2007. Aktivitas antibakteri ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum). [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Suhatono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Suradikusumah E. 1989. Kimia Tumbuhan. Bogor: Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Tiagarna P. 2004. Uji toksisitas akut ekstrak air & etanol 30% daari buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl) pada mencit. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Tisdale SL, Nelson. 1975. Soil Fertility and Fertilizers. New York: Macmilan. Tsuge et al. 1975. Glucose oxidase. http: www.worthington-biochem.com [2 Februari 2008].
Vessby B. 1994. Dietary carbohydrates in diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 59: 742-745. Widowati L, Dzulkarnain, Sa’roni. 1997. Tanaman obat untuk diabetes mellitus. Cermin Dunia Kedokteran. 116: 53-60. Winarno, Fardiaz D, Fardiaz S. 1973. Ekstraksi, Kromatografi, dan Elektroforesis. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Windyagiri A. 2006. Potensi hepatoprotektor air rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) pada tikus putih hiperglikemia. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Wise DL. 1989. Applied Biosensors. Boston: Butterworth. Zeki SB. 2007. The effect of some ions on glucose oxidase and their kinetics. Bulletin Of The Catalysis Society Of India. Volume 6: 67-73.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Tahapan penelitian
Sampel (daun sirih merah)
Pembuatan ekstrak air rebusan daun sirih merah
Ekstraksi daun sirih merah dengan pelarut etanol 30%
Uji in vitro ekstrak (air rebusan dan etanol 30%) terhadap aktivitas glukosa oksidase
Analisis statistika
15
Lampiran 2 Tahapan penelitian uji in vitro terhadap aktivitas enzim glukosa oksidase 20 μl standar glukosa 10%
ditambah 20 μl ekstrak (air rebusan atau etanol 30%)
ditambah 4000 μl kit randox glukosa
pengukuran aktivitas glukosa oksidase secara spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm
- air rebusan daun sirih merah yang diuji dengan konsentrasi 0.2, 1, 2, 10, 20 dan 200 mg/mL. - komposisi kit randox : 1. Buffer : - Buffer fosfat - Fenol
0,1 mol/l pH7.0 11 mmol/l
2. GOD-PAP Reagent : - 4-aminophenazone - Glukosa Oksidase - Peroksidase
0.77 mmol/l ≥1.5 kU/l ≥1.5 kU/l
3. Standar - Glukosa
5.55 mmol/l (100 mg/dl)
16
Lampiran 3 Data λ maksimum pada konsentrasi 1.0 % v/v λ (nm) 480 500 520 540 560
Absorbansi 0.017 0.019 0.016 0.014 0.011
17
Lampiran 4 Data konsentrasi standar glukosa Konsentrasi (% v/v) 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
Absorbansi 0.000 0.032 0.051 0.121 0.135 0.155
18
Lampiran 5 Perhitungan bobot jenis ekstrak air rebusan dan rendemen ekstrak etanol 30% Perhitungan Bobot Jenis : BJ terbaca = 1,018 g/mL T larutan = 29 oC T alat = 20 oC Faktor koreksi = suhu larutan – suhu alat x 10-3 3 = 29 – 20 x 10-3 = 0,003 3 BJ terukur
= BJ terbaca + faktor koreksi = 1,018 + 0,003 = 1,021 g/mL
Data Rendemen Ekstrak etanol 30% : Ulangan Bobot ekstrak (gram) 1 0,5746 2 0.9520
Bobot segar (gram) 21,9493 39,7340 Rata-rata
Rendemen (%) 2,62 2,40 2,51
Perhitungan Rendemen : Ulangan 1 Rendemen = Bobot ekstrak x 100 % Bobot segar = 0,5746 x 100 % 21,9493 = 2,62 % Lampiran 6 Perhitungan pembuatan konsentrasi ekstrak air rebusan konsentrasi 0.2 mg/mL (0.2 mg ekstrak dalam 1 mL air rebusan) 1,021 gram = 2.10 -3 gram 1 mL x x = 2.10 -3 gram.1 mL 1,021 gram x = 1.96. 10-3 μL
Ulang an
Repli kasi
Absorbans
Standar Deviasi
[glukosa] (μmol/mL)
kontrol (20μL 10%)
1
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
0.018 0.017 0.022 0.022 0.019 0.017 0.041 0.041 0.020 0.025 0.038 0.036 0.020 0.019 0.034 0.033 0.014 0.015 0.029 0.027 0.018 0.014 0.024 0.023 0.042 0.035 0.039 0.036
0.010426 0.009327 0.009306 0.009306 0.009578 0.009327 0.009339 0.009339 0.009058 0.009149 0.009395 0.002094 0.009058 0.009466 0.009564 0.009754 0.010003 0.009668 0.009214 0.009772 0.010426 0.010003 0.007885 0.007246 0.003162 0.002082 0.002121 0.002094
1.1030 1.0424 1.3455 1.3455 1.1636 1.0424 2.4970 2.4970 1.2242 1.5273 2.3152 2.1939 1.2242 1.1636 2.0727 2.0121 0.8606 0.9212 1.7897 1.6485 1.1030 0.8606 1.4852 1.4062 2.5576 2.1333 2.3756 2.1939
2 0.2
1 2
1
1 2
2
1 2
10
1 2
20
1 2
200
1 2
Rata-rata [glukosa] (μmol/mL) 1.0727
Aktivitas Enzim (μmol/mL menit)
1.3455
0.1346
1.1030
0.1103
2.4970
0.2497
1.3758
0.1376
2.2546
0.2255
1.1939
0.1194
2.0424
0.2042
0.8909
0.0891
1.7191
0.1719
0.9818
0.0982
1.4457
0.1446
2.3455
0.2346
2.2848
0.2285
0.1073
Rata-rata Aktivitas (μmol/mL menit) 0.1209
SD
0,01085
0.1800
0,01357
0.1816
0,01373
0.1618
0,01278
0.1305
0,01164
0.1214
0,01091
0.2316
0,01674
Lampiran 7 Data aktivitas enzimatik ekstrak air rebusan daun sirih merah
Konsentrasi (mg/mL)
19
20
Lampiran 8 Perhitungan aktivitas enzimatik ekstrak air rebusan daun sirih merah konsentrasi 0.2 mg/mL ulangan 1 y = a + bx
Absorbans
[glukosa]
y = -2 . 10-4 + 0.0165 0,019 = -2 . 10-4 + 0.0165 x x = -2 . 10-4 - 0,019 - 0,0165 = 1,1636 µmol/mL [glukosa] = 1,1636 µmol/mL
Aktivitas =
[glukosa] Waktu inkubasi
= 1,1636 µmol/mL 10 menit = 0,11636 µmol/mL.menit
Ulangan
Replikasi
Absorbans
[Glukosa] (μmol/mL)
Rata-rata [glukosa] (μmol/mL)
Aktivitas Enzim (μmol/mL.menit)
Rata-rata Aktivitas (μmol/mL.menit)
SD
Kontrol (20 μL 10%)
1
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
0.024 0.023 0.023 0.023 0.038 0.037 0.037 0.036 2.112 2.297 1.974 1.830
1.4667 1.4061 1.4061 1.4061 2.3152 2.2545 2.2545 2.1939 128.0121 139.2242 119.685 110.9212
1.4364
0.1436
0.1421
0,0135
1.4061
0.1406
2.2849
0.2285
0.2255
0,0174
2.2242
0.2224
133.6182
13.3618
12.4452
2,2280
115.2849
11.5285
2 1.000
1 2
200.000
1 2
Untuk konsentrasi 1000 ppm ulangan 1 y = a + bx Absorbans
[glukosa] y = -2 . 10-4 + 0.0165
0,038 = -2 . 10-4 + 0.0165 x x = -2 . 10-4 - 0,038 - 0,0165 = 2,3152 µmol/mL [glukosa] = 2,3152 µmol/mL
Aktivitas enzim
=
[glukosa] Waktu inkubasi
= 2,3152 µmol/mL 10 menit = 0,23152 µmol/mL.menit
Lampiran 9 Data dan perhitungan aktivitas enzim dari ekstrak etanol 30% daun sirih merah
Konsentrasi (ppm)
21
22
Lampiran 10 Hasil analisis statistika ekstrak air rebusan daun sirih merah menggunakan minitab 14 One-way ANOVA: aktivitas versus konsentrasi air rebusan Source konsentrasi Error Total S = 0.05609
Level 1 10 0.2 2 20 200 kontrol
N 2 2 2 2 2 2 2
DF 6 7 13
SS 0.01981 0.02202 0.04183
MS 0.00330 0.00315
R-Sq = 47.35%
Mean 0.18155 0.13050 0.18000 0.16180 0.12090 0.23155 0.12095
StDev 0.06215 0.05855 0.09857 0.05996 0.03210 0.00431 0.01930
F 1.05
P 0.468
R-Sq(adj) = 2.22% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -------+---------+---------+---------+-(-----------*----------) (----------*-----------) (----------*-----------) (----------*-----------) (-----------*-----------) (-----------*-----------) (-----------*-----------) -------+---------+---------+---------+-0.080 0.160 0.240 0.320
Pooled StDev = 0.05609 Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of konsentrasi Individual confidence level = 99.46%
Lampiran 11 Hasil analisis statistika ekstrak etanol 30% air rebusan daun sirih merah menggunakan minitab14 One-way ANOVA: aktivitas enzim vs konsentrasi etanol 30% Source konsentrasi Error Total
DF 2 3 5
S = 0.7489
R-Sq = 99.04%
Level 1000 200000 kontrol
N 2 2 2
SS 173.117 1.682 174.800
Mean 2.255 12.445 0.142
StDev 0.043 1.296 0.002
MS 86.559 0.561
F 154.35
P 0.001
R-Sq(adj) = 98.40% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ----+---------+---------+---------+----(----*---) (---*---) (---*----) ----+---------+---------+---------+----0.0 4.0 8.0 12.0
Pooled StDev = 0.749 Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of konsentrasi
23
Lampiran 12 Hasil analisis statistika ekstrak (air rebusan dan etanol 30%) menggunakan minitab 14 One-way ANOVA: aktivitas vs konsentrasi (air rebusan dan etanol 30%) Source konsentrasi Error Total
DF 9 10 19
S = 0.4126
R-Sq = 99.38%
Level 10000 1000a 1000b 200 2000 20000 200000a 200000b kontrol a kontrol b
N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
SS 271.424 1.703 273.127
Mean 0.131 0.182 0.225 0.180 0.162 0.121 0.232 12.445 0.121 0.142
MS 30.158 0.170
StDev 0.059 0.062 0.004 0.099 0.060 0.032 0.004 1.296 0.019 0.002
F 177.14
P 0.000
R-Sq(adj) = 98.82% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --+---------+---------+---------+------(*-) (-*) (-*-) (-*) (*-) (-*-) (-*-) (-*) (-*-) (*-) --+---------+---------+---------+------0.0 3.5 7.0 10.5
Pooled StDev = 0.413 Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of konsentrasi
Lampiran 13 Hasil analisis kualitatif logam Ekstrak air rebusan
Kalsium
Besi
Magnesium
Ekstrak etanol 30%
Kalsium
Magnesium
Besi
24
Lampiran 14 Hasil analisis fitokimia ekstrak etanol 30% daun sirih merah
Alkaloid
Flavanoid Tanin Saponin
Triterpenoid Steroid
