Posouzení výsledků stanovení fosfolipázy s lipoproteiny v souvislosti s aterosklerózou
A2
asociované
Beňovská M.1,2, Babušíková L.1, Pařenica J.3, Tůmová J.1 1
Oddělení klinické biochemie a hematologie, Fakultní nemocnice Brno Katedra laboratorních metod MU, Brno 3 Interní kardiologická klinika, Fakultní nemocnice Brno 2
SOUHRN Cíl práce: Představení nového biochemického parametru Lp-PLA2 v souvislosti s aterosklerózou, infarktem myokardu a cévní ischemickou příhodou. Metoda stanovení: Ve FN Brno byla nainstalována a zavedena imunoturbidimetrická metoda ke stanovení fosfolipázy A2 asociované s lipoproteiny ( Lp-PLA2) od americké společnosti diaDexus. Výsledky: Zúčastnili jsme se studie Enablement a porovnali tak přesnost a výtěžnost našich výsledků stanovení Lp-PLA2 na mezinárodní úrovni. Dále byla změřena koncentrace Lp-PLA2 u čtyřech souborů sestavených z 90-ti pacientů dle diagnózy. Současně byl u těchto pacientů stanoven Chol, TG, HDL, LDL, ApoB, Lp(a), CRP a NT-proBNP a vyčíslena shoda mezi Lp-PLA2 a jednotlivými parametry. Závěr: Metoda stanovení Lp-PLA2 byla zavedena a představena klinikům kardiologické a neurologické kliniky FN Brno. Do budoucna je cílem u pacientů se středním a vysokým kardiovaskulárním rizikem stanovovat Lp-PLA2 opakovaně a ověřovat tak efektivitu léčby. Klíčová slova: fosfolipáza A2 asociovaná s lipoproteiny, ateroskleróza, cévní mozková příhoda, infarkt myokardu SUMMARY Beňovská M., Babušíková L., Tůmová J.: Evaluation of the results of the determination of lipoprotein-associated phospholipase A2 in relation to atherosclerosis Objective: The goal of this work is to introduce the new biochemical test parameter Lp-PLA2 in relation to atherosclerosis. Method of determination: A turbidimetric immunoassay for the measurement of Lp-PLA2 from the American company diaDexus was installed and implemented at FN Brno. Results: We took part in the Enablement study to compare the precision and recovery factor of our results of Lp-PLA2 measurements on an international scale. Further, the concentration of Lp-PLA2 was measured for four selected groups of 90 patients that were put together based on their diagnosis. Simultaneously, the values of Chol, TG, HDL, LDL, ApoB, Lp(a), CRP and NT-proBNP were measured for these patients and the concordance between Lp-PLA2 and individual parameters was quantified. Conclusion: The method of determination of Lp-PLA2 has been established and presented to specialists at the cardiology and neurology clinics of FN Brno. The future goal is to measure Lp-PLA2 repeatedly for patients with moderate or high cardiovascular risk to determine the treatment efficiency. Key words: lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp-PLA2, atherosclerosis, stroke, myocardial infarction
Lp-PLA2 a její význam Fosfolipáza A2 asociovaná s lipoproteiny (Lp-PLA2) patří mezi nové nadějné biochemické parametry. V České republice prozatím toto stanovení není rozšířeno. Fosfolipáza A2 asociovaná s lipoproteiny je považována za cirkulující biomarker. Je navázána z 80% na LDL cholesterol, z 20% na HDL cholesterol a dále na Lp(a) a ostatní lipoproteiny. Lp-PLA2 je jedním ze skupiny intracelulárních a sekrečních fosfolipidových enzymů, které hydrolyzují esterovou vazbu lipoproteinů obsaženou v buněčných membránách. Enzym je produkován makrofágy a pěnovými buňkami ve vaskulární intimě. Bylo prokázáno, že se Lp-PLA2 podílí na kaskádě zánětu, který probíhá v aterosklerotickém plátu. Její unikátnost spočívá v tom, že na rozdíl od CRP zvýšená hladina je specifická pouze pro zánětlivé procesy aterosklerotického plátu. Při hydrolýze oxidovaných LDL částic tento enzym generuje prozánětlivý mediátor – lyzofosfatidylcholin, který podporuje rupturu plátu a přispívá k ischemické nekróze. Můžeme konstatovat, že vysoká hladina Lp-PLA2 ukazuje na nestabilní a naopak nízká hladina na stabilní aterosklerotický plát. Nízká hladina Lp-PLA2 má tedy negativní prediktivní hodnotu [1,2]. U pacientů se zvýšenou hladinou Lp-PLA2
dochází až k několikanásobně vyššímu riziku vzniku primární a sekundární kardiovaskulární příhody [3]. Velký význam Lp-PLA2 je tedy v predikci infarktu myokardu a cévní mozkové příhody i v určení pravděpodobnosti jejich recidivy. V současnosti se popisuje, že při 76% náhlých kardiovaskulárních úmrtí dojde k ruptuře aterosklerotického plátu a asi 87% CMP má ischemický charakter. Léčba určovaná hladinou Lp-PLA2 by proto měla vést k redukci vzniku koronárních onemocnění a CMP [4,5]. Byla provedena řada studií, ve kterých se srovnávala hodnota Lp-PLA2 s dalšími parametry. Pokud je současně zvýšena hodnota Lp-PLA2 i CRP, je pozorován synergický efekt a riziko IM i CMP je výrazně vyšší. Zvýšené hodnoty LDL cholesterolu naopak nepatří mezi rizikové faktory CMP [6]. Velmi nadějné jsou preklinické studie prováděné na zvířatech. Bylo zjištěno, že inhibice enzymu Lp-PLA2 tlumí zánětlivý proces a zpomaluje progresi aterosklerotického onemocnění [1]. V dnešní době se k posouzení koronárního rizika v široké míře užívají hladiny cholesterolu a jiných lipidů. Pouze u 50% osob s koronárním onemocněním však byly zjištěny zvýšené hladiny cholesterolu [5]. Problematikou kardiovaskulárního onemocnění se zabývala americká společnost pro posouzení kardiovaskulárního rizika American Heart Association/ Centers for Disease Control (AHA/CDC). Z jednání této společnosti v červnu 2008 vyplynulo doporučení, že stanovení Lp-PLA2 by mělo být používáno jako další rizikový parametr pro pacienty se středním nebo vysokým rizikem vzniku kardiovaskulárního onemocnění. Závěrem doporučení jsou následující hodnoty : Koncentrace Lp-PLA2 menší než 200 ng/ml jsou považovány za nízké riziko Koncentrace Lp-PLA2 v rozmezí 200-235 ng/ml jsou považovány za hraniční riziko Koncentrace Lp-PLA2 větší než 235 ng/ml jsou považovány za vysoké riziko [7] Dle doporučení AHA/CDC by byl pacient se dvěma rizikovými faktory klasifikovaný jako středně rizikový, v případě, že má současně hladinu Lp-PLA2 větší než 200 ng/ml, reklasifikován do skupiny s vysokým kardiovaskulárním rizikem. Měla by u něj být nasazena agresivní léčba rizikových faktorů aterosklerózy a změněna cílová hodnota LDL cholesterolu z 3,4 mmo/l na 2,6 mmo/l. U pacientů po IM, kteří mají vysoké hodnoty Lp-PLA2, je doporučena cílová hodnota LDL cholesterolu dokonce 1,8 mmo/l [3].
Assess Patients through traditional risk factors
Test Measure Lp-PLA2 levels in individuals assessed as moderate or high risk
Treat To appropriate LDL-C Goal
Fig. 1. Recommendation for use of Lp-PLA2 [3]
Cut off hodnota pro Lp-PLA2 je tedy u rizikových pacientů 200 ng/ml. Doporučená frekvence testování pacientů s kardiovaskulárními problémy a hodnotou Lp-PLA2 nižší než 200 ng/ml je 1x ročně. Zdá se, že parametr Lp-PLA2 na rozdíl od posuzování rizika kardiovaskulárního onemocnění dle Framinghama dobře hodnotí riziko všech etnických skupin [3]. V roce 2005 bylo stanovení Lp-PLA2 schváleno komisí US Food and Drug Administration. Výsledky Lp-PLA2 ukázaly systematické spojení s rizikem cévní mozkové příhody. To může mít obrovský význam, neboť CMP je druhou nejčastější příčinou smrti na světě, léčba je finančně velmi náročná a 15 - 30% pacientů má trvalé následky [4]. Z uvedených faktů vyplývá, že stanovení Lp-PLA2 je doporučováno u pacientů s rizikovými faktory aterosklerózy a v rámci sekundární prevence u pacientů po IM a CMP.
Metoda stanovení Lipoproteinová fosfolipáza A2 v séru či plasmě byla stanovována pomocí soupravy PLAC test od firmy diaDexus, kterou v ČR dodává firma Medista. Jedná se o imunoturbidimetrické stanovení založené na reakci Lp-PLA2 s dvěma vysoce specifickými protilátkami navázanými na polymerní mikročástice. Metoda byla prováděna na analyzátoru Hitachi 917 (Roche Diagnoscics). Vyšetření Lp-PLA2 má doporučené speciální podmínky pro měření vzorků. Vzorky je po odběru možno analyzovat nejdříve druhý den po zamražení na -20 oC (minimálně na 16 hod). Pro skladování delší než 3 dny je nezbytná teplota -70 oC.
Studie Enablement a studie FN Brno Naše pracoviště bylo vybráno k účasti na mezinárodní studii Enablement zabývající se stanovením Lp-PLA2, kterou organizovala firma diaDexus. V rámci této studie se měřily parametry metody Lp-PLA2 - opakovatelnost, reprodukovatelnost, výtěžnost kalibrátorů a výtěžnost souboru 30 dodaných pacientských sér (opakovaně). Studie přesně specifikovala, co má být který den provedeno. Ve spolupráci s kardiologickou a neurologickou klinikou FN Brno byla stanovena LpPLA2 u čtyř souborů pacientů sestavených dle diagnózy. Do prvních dvou skupin byli zařazeni pacienti sledovaní a léčení v rámci sekundární prevence - po IM a po CMP. Třetí a čtvrtý soubor byl sestaven v rámci primární prevence - z pacientů s nestabilní anginou pectoris a pacientů s dyslipidémií. U těchto pacientů byly v rámci studie vyšetřeny parametry Lp-PLA2, CHOL, TG, HDL, LDL, ApoB, Lp(a), CRP a NT- proBNP. Poznámka: Koncentrace Lp-PLA2 v prvních týdnech po IM nebo CMP není stabilní. Vzorky je z těchto důvodů nutno odebírat za 4-5 týdnů po příhodě.
Výsledky a diskuse a) Studie Enablement Intra Assay QC 1
mean[ng/ml] sd %cv
Precision
QC 2
Inter Assay QC 1
QC 2
143 1,589
346,4 2,978
146,2 4,492
362,3 12,859
1,1
0,9
3,1
3,5
Table 1. Intra Assay and Inter Assay precision on quality kontrols for Lp-PLA2 (intra assay: n=20, inter assay n= 10) Calibrator Ave. Value Recovered Recovered Recovered Recovered Ave. % [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] Recovery 0 0 0 0 0 50 48 49 49 48,7 97,30% 100 96 96 95 95,7 95,70% 250 268 270 262 266,7 106,70% 500 501 498 505 501,3 100,30% Table 2. Linearity by Calibrator Lp-PLA2 Recovery
LP-PLA2 METHOD COMPARISON ng/mL 600,0
500,0
Lab
400,0
300,0
200,0
100,0
0,0 0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
diaDeXus
Fig. 2. Plot of Lp-PLA2 in patient’s samples – value of diaDexus versus OKBH FN Brno
Vyhodnocení studie Enablement Opakovatelnost s variačním koeficientem do 1,1%, reprodukovatelnost s variačním koeficientem do 3,5%, výtěžnost 96-107% u kalibrátorů a 98-118% u vzorků pacientů nám přinesla velmi pozitivní hodnocení od firmy diaDexus a doporučení zavést na našem pracovišti stanovení Lp-PLA2 do rutinního provozu.
b) Studie FN Brno [ng/ml]
[ng/ml]
1600
500
1400
450
1200
400
1000
350
800
300
600
250
400
200
200
150
0
100 Stroke
MI
dyslipidemia
UAP
Fig. 4. Distribution of measured Lp-PLA2 values for groups of patiens with a history of stroke and myocardial infarction
Fig. 4. Distribution of measured Lp-PLA2 values for groups of patiens with dyslipidemia and unstable angina pectoris
Variable : Stroke Sample size : 15 Lowest value : 123,0000 Highest value : 1464,0000 Median : 227,0000 25th percentile: 201,2500 75th percentile: 289,5000
Variable : Sample size : Lowest value : Highest value : Median : 25th percentile: 75th percentile:
Variable : Sample size : Lowest value : Highest value : Median : 25th percentile: 75th percentile:
MI 41 111,0000 447,0000 204,0000 177,5000 264,7500
Variable : Sample size : Lowest value : Highest value : Median : 25th percentile: 75th percentile:
dyslipidemia 14 146,0000 450,0000 223,0000 202,0000 276,0000
UAP 20 107,0000 471,0000 219,0000 155,5000 255,0000
V souboru pacientů • po CMP mělo 80% pacientů hodnotu Lp-PLA2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 27% hodnotu vyšší než 300 ng/ml • po IM mělo 58% pacientů hodnotu Lp-PLA2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 15% hodnotu vyšší než 300 ng/ml • s dyslipidémií mělo 79% pacientů hodnotu Lp-PLA2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 21% hodnotu vyšší než 300 ng/ml • s nestabilní anginou pektoris mělo 55% pacientů hodnotu Lp-PLA2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 15% hodnotu vyšší než 300 ng/ml Pro posouzení korelací mezi hodnotou Lp-PLA2 a ostatními parametry v hodnocených souborech byl zvolen výpočet procentuálního vyhodnocení shody (concordance). Za shodu bylo považováno, pokud hodnota Lp-PLA2 i srovnáného parametru byla v referenčním rozmezí nebo hodnota Lp-PLA2 a srovnáného parametru dosahovala zvýšených hodnot, tedy byla mimo referenční rozmezí. Výsledky shody ovlivňuje vždy nejistota měření. Pro výpočty byly však striktně hodnoceny hodnoty Lp-PLA2 vyšší než 200 ng/ml jako zvýšené. Příklad
výpočtu shody mezi Lp-PLA2 a cholesterolem je v tabulce č. 3. Shoda vypočítaná mezi LpPLA2 ostatními parametry je uvedena v tabulce č.4.
CHOL [mmo/l]
Lp-PLA2 [ng/ml] within above ref. int. ref. int. do 200
>200
total
27
36
54
above ref. int. >5,2 8
18
37
total
54
within ref. int. 3,1-5,2
35
91 x= 62%
Table 3. The concordance between Lp-PLA2 and cholesterol was 62%
Concordance Lp-PLA2 [%] [ng/ml] CHOL [mmo/l] 62
ApoB [g/l]
53
TG [mmol/l]
46
Lp(a) [g/l]
37
HDL [mmol/l]
43
CRP [mg/l]
58
LDL [mmo/l]
57
NT- proBNP [pg/ml]
48
Concordance [%]
Lp-PLA2 [ng/ml]
Table 4. The concordance between Lp-PLA2 and other parameters
Hodnocení dosažených výsledků Z popisu souborů pacientů vyplývá, že významné procento má koncentraci Lp-PLA2 vyšší, než je doporučeno, což ukazuje na potřebu intenzivnější léčby. Shoda mezi Lp-PLA2 a jednotlivými parametry je 40 - 60%, což odpovídá údajům z odborné literatury a potvrzuje roli Lp-PLA2 jako nezávislého parametru pro posouzení rizika aterosklerózy. Významné je porovnání Lp-PLA2 s Lp(a) a HDL cholesterolem, což v dosud publikovaných pracích chybělo. V těchto případech bylo dosaženo nejnižší shody ze všech sledovaných parametrů (37% Lp(a), 43% HDL cholesterol). Při srovnání Lp-PLA2 s dalšími parametry jsme vypozorovali zajímavou skutečnost: největší neshody způsobovala vždy skupina pacientů, u nichž byla hodnota Lp-PLA2 zvýšená a ostatní parametry nabývaly hodnot v referenčním rozmezí. Důvodem může být to, že za zvýšené byly považovány všechny výsledky s hodnotou Lp-PLA2 vyšší než 200 ng/ml, což je cut off navržený pro rizikové pacienty. Při srovnávání lipidů však byly využity běžné referenční meze, ne hodnoty doporučované společností AHA/CDC. Domníváme se, že u pacientů se zvýšenou hladinou Lp-PLA2, kteří mají současně dva a více rizikových faktorů aterosklerózy, by měla být ordinována agresivnější léčba. S tím koresponduje doporučení kardiologické společnosti AHA/CDC snížit hladinu LDL cholesterolu v rámci sekundární prevence až na hodnotu 2,6 mmol/l, zatímco při výpočtu shody jsme počítali u LDL cholesterolu s referenčním rozmezím 3,6 mmol/l.
Závěr Byla zavedena a s úspěchem používána metoda na stanovení fosfolipázy A2 asociované s lipoproteiny. Výsledky změřených souborů pacientů zaujaly klinické lékaře ve FN Brno. Bylo dohodnuto, že zvýšené koncentrace Lp-PLA2 budou využívány při léčbě pacientů. V současné době neexistuje terapie přímo ke snížení Lp-PLA2, ale léčba statiny její hodnotu ovlivňuje. Budeme hledat cestu pro pokračování celého projektu tak, aby mohlo být u rizikových pacientů prováděno opakované měření hladin Lp-PLA2 a sledován vývoj této koncentrace v závislosti na léčbě. Dojde-li ke snížení koncentrace Lp-PLA2, lze očekávat, že se zvýší stabilita aterosklerotického plátu pacienta. Výsledky léčebné strategie s využitím monitorování Lp-PLA2 budou vyžadovat delší sledování. Příslibem do budoucnosti v této problematice se jeví studie zabývající se použitím inhibitoru enzymu Lp-PLA2, jak je uvedeno v první části této práce. To by mohlo velmi výrazně ovlivnit léčbu koronárního a ischemického onemocnění.
Literatura 1. Anderson, J.L. Lipoproteid - Associated Phospholipase A2: An Independent Predictor of Coronary Artery Disease Events in Primary and Secondary Prevention. Am. J.Cardiol 2008, 101, p. 23-33. 2. Lerman, A., McConnell, J.P. Lipoproteid - Associated Phospholipase A2 : A Risk Marker or Risk Factor? Am. J.Cardiol. 2008, 101, p. 11-22. 3. Davidson, M.H., Corson, M.A., Alberts, M.J., Anderson, J.L., Gorelick, P.B., Jones,
P.H., Lerman, A.,
McConnell, J.P., Weintraub, H.S. Consensus Panel Recommendation for Incorporating Lipoprotein – Associated Phospholipase A2 Testing into Cardiovascular Disease Risk Assesment Guidelines. Am. J.Cardiol. 2008, 101, p. 51-57. 4. Gorelick, P.B. Lipoproteid – Associated Phospholipase A2 and Risk of Stroke. Am. J.Cardiol. 2008, 101, p. 34-40. 5. Weintraub, H.S. Identifying
the Vulnerable Patient with Rupture - Prone Plaque. Am. J.Cardiol. 2008,
101, p. 3-10. 6. Ballantyne, C.M., Hoogeveen, R.C., Bang, H., Coresh, J., Folsom, A.R., Chambless, L.E. et al. Lipoproteid - associated phospholipase A2, high sensitivity C- reactive protein, and risk for incident ischemic stroke in modele - aged men and women in the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) study. Arch Intern Med. 2005, 165. p. 2479-2484. 7. Corson, M.A., Jones, P.H., Davidson, M.H. Review of the Evidence for the Clinical Utility of Lipoprotein Associated Phospholipase A2 as a Cardiovascular Risk Marker. Am. J.Cardiol. 2008, 101, p. 41-50. Adresa pro koresponcenci: RNDr. Miroslava Beňovská OKBH FN Brno Jihlavská 20 625 00 Brno e-mail:
[email protected]
