Poruchy funkce krevních destiček laboratorní vyšetření pomocí agregometrie Vypracoval: Mgr. Michaela Kneiflová
Trombocyty Bezjaderné krevní elementy, tvar disků o průměru 2– 4 μm, objem 4–8 fl Vznikají v KD fragmentací nebo odštěpováním periferní cytoplazmy megakaryocytů – 5 dní Dvě třetiny celkového počtu kolují v periferní krvi, 1/3 je deponována ve slezině Regulace – nejdůležitější růstový faktor trombopoetin, cytokininy – IL-1,3,6,11, EPO, …. Zánik po 8–12 dnech - pohlceny endotelem cév
Megakaryopoéza 8 - 10 dní
Morfologie Mitochondrie, Golgiho aparát, Denzní tubulární systém, lysozomy, Destičková granula alfa granula obsahují: von Willebrandův faktor (vWF), destičkový faktor 4, fibrinogen, trombospondin,, faktor V,… denzní granula obsahují: ADP, ATP, Ca2+, serotonin… Cytoplazma – aktin, myozin (konstrikce destiček má význam pro uvolnění obsahu granul). Membrána je tvořena lipoproteinovou dvojvrstvou s negativně nabitými fosfolipidy na „rubové straně“. V zevní vrstvě jsou umístěny specifické glykoproteiny (GP). Na povrchu destiček se nacházejí antigeny skupiny ABO, antigeny HLA I. třídy a specifické destičkové antigeny (HPA)
Fyziologické parametry a jejich význam
v periferní krvi dospělého člověka rozmezí 150- 400 x10 exp 9/l Střední objem MPV v rozsahu 7,8 - 11,0 fl - mikrotrombocyty, makrotrombocyty Distribuční šíře destiček PDW v rozsahu 9,0-17,0 fl – anisocytóza trombocytů Destičkový hematokrit PCT – poměr Plt v celkovém objemu krve 0,12 - 0,35 % - trombocytémie, trombocytopenie IPF (frakce nezralých trombocytů) jsou mladé 1-2 dny staré destičky, větší se zbytky RNA , informace o rychlosti trombopoezy v KD, velký diagnostický význam pro diagnostiku trombocytopenií způsobených zvýšenou spotřebou nebo při útlumu KD 1,1-6,1%
Funkce trombocytů Trombocyty mají významnou úlohu při HEMOSTÁZE Aktivace - proces mnoha intracelulárních pochodů, při nichž se uplatňuje vliv trombinu, TXA2, ADP, adrenalinu, serotoninu, kolagenu Adheze – Interakce mezi kolagenem a destičkami je zprostředkována glykoproteinovými receptory na povrchu destiček, cirkulujícími plazmatickými proteiny (vWF a Fbg) a reologickými vlastnostmi krve. Agregace – destičky agregují prostřednictvím fibrinogenu, pro který exprimují receptory. Konstrikce – díky kontraktilním bílkovinám dochází ke změně tvaru destiček a uvolnění účinných látek. Tvorba trombu → vzniká bílý neboli destičkový trombus (provizorní hemostatická zátka). Jeho další přeměny jsou součástí procesu hemokoagulace Hojení – trombocyty obsahují látky jako např. PDGF (Platelet Derived Growth Factor, destičkový růstový faktor), které mají proliferativní účinky a uplatňují se při regeneraci poraněné tkáně.
Proces Agregace • • • • • •
cesta k místu poškození adheze aktivace uvolňovací reakce agregace tvorba destičkového trombu
Poruchy počtu trombocytů TROMBOCYTOPENIE pokles počtu pod 150x10exp9/l A. Vrozené - porucha megakaryopoezy v kostní dřeni, krvácivé stavy B. Získané – různé etiopatogenetické mechanismy C. Pseudotrombocytopenie – tvorba shluků fenomén EDTA, destičkový satelismus D. ITP – zvýšená destrukce v monocyto –makrofágovém systému E. TTP, HUS, HELLP syndrom, HIT TROMBOCYTÉMIE zvýšená tvorba krevních destiček Trombóza, okruh tzv. myeloproliferací léčba cytostatiky, interferonem, aferézou destiček, antiagregační léky
Poruchy funkce trombocytů TROMBOCYTOPATIE A. Vrozené - adheze, aktivace, agregace, sekrece a prokoagulačních
mechanismů Bernard-Soulierův syndrom – porucha adheze, nedostatek GPIb Glanzmanova trombastenie – porucha agregace, defekt GPIIb/IIIa receptroru Porucha sekrece – Wiskott- Aldrichův s., Chediak – Higashi s., Syndrom šedých destiček - nedostatek alfa granulí, Heřmanského - Pudlákův s. Von Willebrandova choroba – defekt vWF,FVIII, porucha adhezivity destiček, 3typy
B. Získané – spojené s myeloproliferativní onemocnění, MDS, ledviny, játra, MM, leukemie, lymfoproliferace, léky – ASA, kortikoidy, peniciliny, prostaglandiny aj.
Využití agregometrie Součástí komplexní hemostatické diagnostiky - sníženou i zvýšenou funkční aktivitu krevních destiček Testy agregace krevních destiček jsou nepostradatelné při všech procesech, kdy se krev dostavá mimo tělo do kontaktu s cizími povrchy (umělé srdce a plíce, dialýza, atd.), pro kontrolu kvality destičkových koncentrátů transfuziologie
Agregace trombocytů - Agregometr APACT 4004
Princip měření Stimulovaná agregace krevních destiček podle Gustava Borna - induktory Samovolná agregace – spontánní, bez induktorů Plazma bohatá na destičky PRP se michá magnetem při teplotě 37° rychlosti 700-1 000 rpm v kyvetě, paprsek fotometru měří a zaznamenavá změnu optické hustoty (extinkce) vyvolanou induktorem Agregometr APACT uloží naměřene hodnoty PPP a PRP pro každý vzorek a automaticky vypočítá výsledek % agregace minimalní i maximalní
APACT 4004 – schéma měření
Vyšetření • Citrátová krev ( ředění 1 : 10 ) • PRP - centrifugujeme 15 minut při 150 x g při pokojové teplotě (nesmi být žádné erytrocyty) • PPP - centrifugujeme 15 minut při 2000 x g • Rozsah měřeni PRP: 30 000-600 000 krevních destiček /μl • Rozsah měřeni PPP: < 5 000 krevních destiček /μl • Stabilita PRP a PPP: max. 2 hodiny při pokojové teplotě • V kyvetě – 200 μl PRP + 20 μl reagencie (použitý induktor příslušné koncentrace)
Přehled induktorů • Induktory Arachidonová kyselina,Ristocetin,Kolagen, ADP,CPG , Trombin, Epinefrin • Fyziologické hodnoty Ma - 60 -100% stimulovaná agregace 0 - 10% samovolná agregace Slope - monitorování ASA pomocí CPG nad 65%/min nedostatečná léčba pod 35%/min nadměrná léčba
ADP ADP se váže na dva Gproteinem spojené receptory: P2Y1 a P2Y12. Tato vazba vede k uvolnění intracelulárního vápníku a změně tvaru destičky a to má za následek primární vlnu agregace. Druhá vlna agregace odráží uvolnění dalšího ADP ze zásobních granulí destičky.
Adrenalin • Adrenalin se váže na alfa-2 adrenoreceptor na povrchu destiček, což vede k uvolnění intracelulárního Ca a změně tvaru destičky to má za následek a primární vlnu agregace. Druhá vlna trvalé agregace odráží uvolnění ADP ze zásobních granulí destičky.
Trombin
• Trombin je nejúčinnější aktivátor destiček a receptorů aktivovaných proteázami. PAR1 a PAR4 jsou aktivovány trombinem. PAR1 a PAR4 patří do skupiny transmembránových G proteinem spojených receptorů, které jsou aktivovány jedním štěpením na N-konci, tím se vytvoří nové N zakončení a aktivuje se G podjednotka a dochází k signalizaci do buňky
Kolagen • Kolagen se váže na GpIV a GpIa/IIa receptory indukující uvolňovací reakci, TXA2 generaci a pak trvalou GPIIb-IIIa aktivaci. • Po přídavku kolagenu k PRP se dá pozorovat lag fáze na agregační křivce, obvykle do jedné minuty od přidání
Ristocetin
• Ristocetin pokud je navázaný na destičkový GPIb protein způsobí aglutinaci destiček tím, že iniciuje navázání vWF přes GPIb-IX-V komplex. • Agregace vyžaduje navázání fibrinogenu na destičku přes GpIIb-IIIa komplex • Ristocetin je antibiotikum
AA • Arachidonová kyselina je prekurzorem TXA2 uvnitř destiček. • Arachidonová kyselina je převedena na TXA2 cyklooxygenázou a tromboxansyntetázou. • TXA2 je potenciálním induktorem agregace, jednak se TXA2 uvolní granulí a navíc tvorba TXA2 následně trvale aktivuje GpIIb-IIIa
z
Hodnocení kalibrační křivky Maximální amplituda Ma – maximální možná agregační odpověď, výpočet rozdíl transmise PPP a PRP v % Maximální sklon Ms – rychlost nárůstu transmise světla v důsledku tvorby agregátů, výpočet - tangenta úhlu, který svírá křivka s hodnotou transmise PRP Doba latence T lat – čas od přidání induktoru do doby změny transmise světla Druhá vlna agregace ( ADP - chybí porucha sekrece ) Deagregace ( porucha uvolňovací reakce )
Kalibrační křivka • Baseline – PRP - 0% agregace • Přídavek agonisty – ten má za následek změnu tvaru destiček a tím dojde k poklesu absorbance. • Primární agregační vlna • Uvolnění nukleotidů • Druhá vlna agregace • Adrenalin a malé dávky ADP klasicky poskytují dvoufázové křivky zatímco u ostatních agonistů bývá vidět pouze jedna vlna a je nemožné rozlišit primární a sekundární vlnu.
Kalibrační křivka
Procento maximální agregace
Slope – Strmost křivky
Interference Počet destiček Ideálně v rozmezí mezi 200 – 300 x 109/L Počet destiček nižší než 100 x 109/L může vést k zmenšení agregační odpovědi Hladina fibrinogenu Potraviny (česnek, kurkuma, ananas, ženšen, jinan, kofein,….) chylózní plazma - interferenci tukových kapének při světelné transmisi
Léky mohou ovlivnit funkci destiček - ASA, léky proti zánětu, specifické léky proti destičkám léky jejichž prvotní rolí není inhibovat funkci destiček antibiotika, antidepresiva, betablokátory Pacient by neměl být na léčbě 7-14 dní před odběrem.
Pacient bez léčby agregace ve fyziologickém rozmezí
Pacient - antiagregační léčbě ASA 100mg denně, trombofilní stav( trombosa vena centralis rethinae) FVL heterozygot
Přehled vybraných defektů Defekty funkce destiček Defekt Trombasthenia Trobocytopatie VW choroba Nesteroidní a protizánětlivé léky
ADP ↓ N ( 1 vlna ) N N (1 vlna )
Colagen ↓ ↓ N ↓
Ristocetin N N Abnormální Abnormální
Agregační odpovědi u vybraných abnormalit
Reagencie
koncentrace
Aspirin efekt
VW + BSS
Glansmanova thrombastenie
N N
Skladovací pool/sekreční defekt N,R ( inhibice 2vlny) N N
ADP
5-10µM
N
AA Colagen
0,5mM 2-5µg/ml
Ristocetin
0,25 1,5mg/ML
N,R (inhibice 2vlny) ↓↓ 2µg/ml –R 5µg/ml - N Kvalitativní defekt
↓↓,R,H
N
N
↓↓( absent) ↓↓ ↓↓
Závěr – využití agregometrie
Děkuji za pozornost
