Plazmatická membrána, buněčná stěna, kompartmentalizace
Termíny přednášek • • • • • • • • • •
doc. Mgr. Jiří Drábek, PhD. Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice LF UP a FN Olomouc
[email protected]
1
4.10. Transport 11.10. Energie 25.10. Signalizace 1.11. Cytoskelet 8.11. Jádro 15.11. Transkripce, translace 22.11. Buněčný cyklus 29.11. Chromosomy, mitóza, meióza 6.12. Stárnutí buněk 13.12. Adaptace, závěr
Další zdroje
Alberts • Johnson • Lewis • Raff • Roberts • Walter
Molecular Biology of the Cell Fifth Edition
Knihy: Základy buněčné biologie – Alberts et al. Biochemie – Voet &Voetová Molecular Cell Biology – Lodish Přednáška: MUDr.Petr Džubák, PhD.
Chapter 12 Intracellular Compartments and Protein Sorting Copyright © Garland Science 2008
3
Biomembrány Dnešní přednáška • • • •
• Strukturální základ většiny buněčných organel • Podílí se na buněčných funkcích:
Biomembrány Kompartmentalizace buněk Peroxisomy Endoplazmatické retikulum (ER)
• • • •
Ohraničení Kompartmentalizace Kontakt Transport látek do buňky a z buňky
• Mají tloušťku kolem 7,5 nm, jsou tvořeny dvojvrstvou fosfolipidů
5
6
Model biologické membrány
Chemické komponenty membrán • Lipidy • Fosfolipidy • Glycerofosfatidy (glycerol, cholin, etanolamin, serin, inositol) • Sfingofosfatidy (sfingosin)
• Steroly • Cholesterol • Ergosterol
• Bílkoviny – – – –
Přenašeče Spojníky Receptory Enzymy
• Cukry – Glykoproteiny (proteiny s navázanými sacharidy) • Proteoglykany (sacharidy jsou tvořeny glykosaminoglykany)
8
Fyzikální vlastnosti membrán
Fosfolipid
• Polarita molekul
– hydrofilní konce (PO4, COOH, OH, NH3) – hydrofobní konce (řetězce mastných kyselin)
• Autoorganizace
– Liposomy – Myelinové struktury
• Asymetrické uspořádání • Tekutý charakter, bod přechodu – laterální migrace – flip-flop pohyb
• Stabilita dvojvrstvy
– hydrofobní interakce mezi řetězci mastných kyselin
9
10
Micely vs. liposomy • Amfifilní molekuly (z části hydrofilní, představované polární skupinou, a z části hydrofobní) • Micela - jednovrstevná • Liposom (vezikl) - dvouvrstevná
Liposomy
Fluidita membrány
Mobilita membránových složek • Pohyb molekul:
Tekutost dvouvrstvy dána: – Pohyblivostí molekul – Teplotou – Podílem nasycených a nenasycených mastných kyselin – Podílem cholesterolu v lipidové dvojvrstvě
– Rotační – Laterální – Flip-flop (flipasa, flopasa, skramblasa)
13
cholesterol
Relativní propustnost lipidové dvojvrstvy
Funkce proteinů plazmatické membrány
Na+ pumpa
Integrin
Receptor pro PDGF
Adenylát cyklasa
16
Bílkoviny biomembrán •
Asymetrické rozdělení mb proteinů, polarizace.
Uspořádání proteinů ve fosfolipidové dvouvrstvě: Transmembránové domény proteinů jsou tvořeny hydrofobními aminokyselinami: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Tyr, Trp a Phe
17
Glykokalyx
Glykolipidové molekuly
• Oligosacharidový ochranný plášť buňky
NANA N-acetylneuraminic acid
20
Krevní skupiny ABO systému Mezibuněčné spoje
Těsné spoje (tight junctions) • Komplexy proteinů těsného spoje • • • • •
okludin klaudin-1 E-kadherin katenin aktin
• Funkce • neprodyšnost epithelů • polarita epitheliálních buněk.
Mechanické spoje - kadheriny
Adhezní pásy – pásové desmosomy
Desmosomy-bodové spoje • pevnost v tahu, exponovaná místa
schopnost měnit tvar, embryonální vývoj
Hemidesmosom
• Někdy ani hemidesmosomy nestačí!
Integriny
• Funkce • vazba buněk na extracelulární matrix • signalizace • migrace buněk
Mezerové spoje
Plasmodesmata Mezerový spoj u rostlin
.
• Úzké průchody pro malé molekuly – umožňují přímý přestup z cytoplasmy jedné buňky do druhé – elektrické a metabolické propojení buněk.
Pojivová tkáň
Proteoglykanový agregát v chrupavce
Kolagen Kyselina hyaluronová • tuhá trojřetězcová helikální struktura – superhelix • pevnost v tahu
Uspořádání kolagenových fibril
Elastin
Hlavní intracelulární kompartmenty živočišné buňky Jaterní buňka v elektronovém mikroskopu
Figure 12-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Kompartmenty – organely (enzymy, specializované mlk, distribuční systém)
Lokalizace ER a Golgi závisí na neporušených mikrotubulích
Proteiny – strukturální a funkční vlastnosti, 20 000 druhů, 10na10 mlk Biochemické procesy na mb (lipidovvý metabolismus, oxidativní fosforylace, fotosyntéza Přes lipidovou dvouvrstvu neprojdou hydrofilní Cytoplazma – cytosol + organely
37
38
Na topologické vztahy membránových organel můžeme pohlížet z evolučního hlediska
Vývoj thylakoidu
Figure 12-3a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-3b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Eukaryotická buňka a podíl povrch/objem (1000 krát větší než E.coli)
Invaginace, thylakoidy rostou a dělí se autonomně
Specializace mb funkce Vnitřní mb mt a plastidů odpovídá původní plazmatické mb bct Proplastidy se dědí spolu s cytoplazmou rostlinného vajíčka Brambora, tuková semínka, okvětní lístek
39
40
Evoluce mitochondrií (mt) a plastidů
Evoluce jádra a endoplazmatického retikula (ER)
Figure 12-4a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-4b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Připojení, invaginace, obálka, komunikační kanály – nuclear pore complex
Pohlcení bct, autonomie
Jaderný kompartment je ekvivalentní cytosolu 4 intracelulární kompartmenty: - jádro a cytosol - Sekretorní a endocytické (ER, Golgi, lyzo) - Mt - plastidy
41
42
Póry v jaderné membráně Jaderná membrána (schránka, obálka)
Figure 12-8 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Jaderná mb (obálka) – 2 koncentrické mb penetrované póry Vnitřní mb – vazba k chromatinu
Jaderné pórové komplexy (125 mil Da, 50 různých proteinů nukleoporinů, oktagonální symetrie)
Vnější – propojená s ER
Průměr 4000 pórů na jaderné mb, při aktivní transkripci více
Perinukleární prostor mezi nimi (propojený s lumenem ER)
Každý pór přenese 100 histonů a 6 ribozomálních podjednotek za minutu
Histony, polymerázy, gene regulační proteiny, proteiny RNA sestřihu - do jádra z cytosolu
Annular - prstencový
tRNA a mRNA ven Ribozomální proteiny – z cytosolu do jádra a zpět
43
44
Jaderná mb za mitózy
Jaderná lamina oocytu Xenopus
Figure 12-19 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Jaderná lamina je tvořena proteinovými podjednotkami, intermediárními filamenty, které dávají jaderné mb tvar a interagují s chromatinem
Depolymerizace pomocí fosforylace cyklindependentními kinázami Prolomení bariéry mezi cytosolem a jádrem Anafáze – jaderná obálka se znovu vytváří na povrchu chromozomů, ER mb zabalí část, fúzuje s další částí, jaderné póry začínají přenášet dovnitř specifické proteiny Jaderné lokalizační signály nejsou odštěpeny – protože jsou potřebné při každém dělení buňky
45
46
Sub-kompartmenty mt a ct
Page 713 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Dvojitá mb Většina proteinů je jaderných Mt – matrix a mezimb prostor, vnitřní mb tvoří kristy Ct – navíc mají thylakoidní prostor jako další kompartment (není spojený s vnitřní mb)
47
48
Tři peroxisomy v krysím hepatocytu
Page 721 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-30 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Peroxisomy mají jen 1 mb, nemají DNA ani ribosomy Obsahují katalázu a urát oxidázu (inkluze) Využití kyslíku Evoluční příchod mt snížil důležitost některých fcí peroxisomů, protože mt dělají totéž a ještě produkují E
49
50
Peroxisom v mezofylu tabákového listu
Reakce v peroxisomech • RH2 + O2 Æ R + H2O2 (oxidativní reakce) • H2O2 + R´H2 Æ R´+ 2H2O (katalasa, peroxidativní reakce, játra a ledviny) • 2H2O2 Æ 2H2O + O2 (katalasa při nadbytku peroxidu) • Beta oxidace tuků • Tvorba plasmalogenů (v myelinových pochvách neuronů, izolují axony) • Fotorespirace v rostlinách • Glyoxalátový cyklus v semíncích rostlin
Figure 12-32a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Peroxidativní reakce: např. 25% ethanolu na acetaldehyd
3 ak na C konci – peroxizomový signál
Beta oxidace – zkracování alkylových řetězců až na acetylCoA (ten do cytosolu, kde použit)
Asociace s chloroplastem Peroxiny za účasti ATP se podílejí na transportu foldovaných (poskládaných do konečné konformace) proteinů do peroxisomu
Adaptace peroxisomů za změněných podmínek Fotorespirace – fixace CO2 na polysacharid (spotřeba O2)
Dědičný Zellwegerův syndrom – defekt importu do peroxisomů (prázdné peroxisomy) – smrt po narození
Glyoxalátový cyklus – přeměna tuků na cukry
51
52
Peroxisom v kotyledonové buňce čtyřdenního rajčatového semínka
Vznik nových peroxisomů
Figure 12-32b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-33 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Peroxisom glyoxysom
Růst a dělení, peroxisom z peroxisomu
glukoneogeneze
53
54
Endoplasmatické retikulum (ER) v savčí a rostlinné buňce
Figure 12-34b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Page 723 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-34a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Zabarvení pomocí protilátky
55
56
Drsné ER
Transport
Figure 12-35 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-36a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Rozdíl mezi kotranslační a posttranslační translokací
Pankreatická exokrinní buňka
U ER je posttranslační transport výjimečný
57
58
Hladké a drsné ER v jaterní buňce
Hladké ER v Leydigových buňkách testes
Figure 12-36b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-36c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Hladké ER je ve specializovaných buňkách, zvláště lipidového metabolismu
3D rekonstrukce
Např.: -Leydigovy bb (sekrece testosteronu) -Hepatocyty (tvorba lipoproteinů, detoxifikace převodem na vodu rozpustnou formu pomocí enzymového systému cytochromu P450, ER indukováno podle potřeby a pak autofagocytováno) -Sarkoplastické retikulum – ER ve svalech, kde pomocí Ca2+ zabezpečuje signalizaci relaxace a kontrakce; sekvestrace Ca2+ je důležitou fcí ER
59
60
Směrování ribozomů do ER pomocí signální sekvence a SRP
Signální hypotéza
Figure 12-38 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Vedoucí sekvence proteinu (sled prvních ak proteinu) nese signál pro ER
SRP a jeho receptor jsou synchronizováni: SRP se váže k ER signální sekvenci a k ribosomu a tím zastaví translaci Pak se váže SRP receptor a směruje protein k translokátoru Spotřeba GTP
61
62
Polyribosom v mikroskopu
Cyklus volného a vázaného ribosomu
Figure 12-41a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-41b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Robozomální podjednotky v cytosolu slouží pro vázaný i volný ribosom
63
64
Šev a zátka
Strukturálně podobné translokátory
Figure 12-42 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-44 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Protein se nedostane do styku s cytosolem – uzavření švem a zátkou
A) kotranslační, Sec61, není potřeba E, jediná cesta pro rostoucí řetězec je skrz mb
Uzavření nutné, aby neunikal Ca2+ do cytosolu
B) posttranslační, Sec61 a další, E ATP, BiP binding protein vazba a uvolnění (podobnost s hsp70 u mt) C) posttranslační, SecA, ATP, jako pístem po 20 ak (podobnost s thylakoidem ct)
65
66
Přenos rozpustného proteinu přes mb ER
Inzerce rhodopsinu do ER
Figure 12-45 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-49 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Ribosomy nejsou zobrazeny pro zjednodušení
Příklad multipass proteinu
ER signální sekvence znamená „začni transport“
Rhodopsin je světločivný protein v fotoreceptorových čípcích v savčí sítnici
Po vazbě ER signální sekvence se otevře pór translokátoru, přenos
Vlevo diagram hydrofobicity, který rozpozná 7 hydrofobních úseků
Po přenosu uzavření póru, signální sekvence difunduje do mb a degraduje se
Modře vyznačeny oligosacharidy Šipky zobrazují části, vcházející do translokátoru
Proteiny, které zůstávají v mb (jednoprůchodové single pass, dvouprůchodové double pass nebo multipass) využívají navíc k ER signální sekvenci také stop transfer sekvence
67
68
Proteinová glykosylace v drsném ER Připojení prekurzorového oligosacharidu na asparagin proteinu v drsném ER
Figure 12-50 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-51 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Většina proteinů v drsném ER je glykosylována připojením prekurzorového Nlinked oligosacharidu
Jakmile polypeptid vstoupí do lumenu ER je gylkosylován na cílových Asn Ribosomy nejsou zobrazeny pro zjednodušení
Prekurzorový oligosacharid je - za pomoci enzymu oligosacharyltransferázy připojován vcelku; sestává z Nacetylglukosaminu, manózy a glukózy - vytvářen připojováním cukr po cukru a zaparkován v tukové mlk dolicholu (polyisoprenoid) a přenesen na cílový asparagin
69
70
Export a degradace špatně složených proteinů v ER
Role glykosylace ve skládání proteinů v ER
Figure 12-53 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 12-54 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Glykosylace je značkou pro nesložený protein
Návrat špatně složeného proteinu do cytosolu - retrotranslokace, dyslokace
Kalnexin se váže k nesprávně složenému proteinu, označenému terminální glukózou a N-linked oligosacharidem
Až 80% proteinů je špatně složených
Pokud glukosyltransferáza odstraní koncovou glukózu, tak se kalnexin uvolní
Deglykosylace, ubikvinace, degradace v proteasomu
Využití Sec61
71
72
Připojení glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy k proteinu v ER
Děkuji vám za pozornost!
Figure 12-56 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Některé mb proteiny kovalentně připojují glykosylfosfatidylinositolovou kotvu, která upevňuje protein v mb a může být rychle uvolněna v odpovědi na stimul (Trypanosoma změní „kabát“ při rerakci s imunitním systémem)
73
