PLATELIA™Candida Ag Plus 96
62784
DETEKCE ANTIGENU MANNANU KVASINKY CANDIDA V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ IMUNO-ENZYMATICKOU METODOU
1- ÚČEL TESTU Platelia™ Candida Ag Plus je imuno-enzymatická technika sendvičového typu na mikrodestičkách pro detekci antigenu mannanu kvasinky Candida v lidském séru nebo plazmě.
2- INDIKACE K POUŽITÍ Diagnostika invazivní kandidózy musí být založena na kombinaci detekce protilátek a cirkulujících antigenů. 13 Platelia™ Candida Ag Plus (Kód 62784) je test, který při použití spolu s Platelia™ Candida Ab Plus (kód 62785) pomáhá zlepšit včasnost11 a senzitivitu této diagnostiky v rámci kompletního diagnostického postupu, který zahrnuje faktory vnitřního a iatrogenního rizika, klinické a mykologické údaje10,13,14. Kombinace testů je také součástí jednotného systému klinického a laboratorního monitorování pacientů a napomáhá při rozhodování o léčbě. 8
3- KLINICKÝ VÝZNAM Infekce kvasinkou Candida jsou nejhlavnější příčinou nosokomiálních mykotických infekcí, přičemž kandidémie představují čtvrtou nejčastější příčinu nosokomiálních infekcí krevního řečiště. 12, 15 16 Z klinického hlediska jsou invazivní kandidózy nejzávažnějšími formami, u nichž se úmrtnost pohybuje mezi 30 a 70 % u pacientů s oslabenou imunitou. Jejich diagnóza se těžko stanovuje z toho důvodu, že specifičnost klinických symptomů je slabá a senzibilita hemokultury je také slabá. Nejčastěji je možné zjistit invazivní kandidózu až na základě souboru nálezů a následně zavést vhodnou léčbu 2. V tomto kontextu musí diagnostika systémových kandidóz bezpodmínečně vycházet jak ze serologických postupů, tak i z přímých mykologických metod. Detekce cirkulujících antigenů v séru nebo plazmě se jeví jako prostředek umožňující zlepšit stanovení diagnózy u pacientů s rizikem invazivní kandidózy 10, 13, 14. Hlavní rizika zahrnují neutropenii po chemoterapii nebo po léčbě imunosupresivama (při rakovině, onkologicko-hematologické léčbě, transplantaci) 4, 10, léčbě širokospektrými antibiotiky, přítomnost žilních katétrů, parenterální výživu, renální dialýzu, implantaci protéz (lékařskou a chirurgickou reanimaci). 5, 13, 16 Z antigenů kvasinky Candida je mannan polysacharidem, který je nekovalentně vázán ke stěně a představuje více než 7 % sušiny C. albicans. Tento antigen se jeví jako jeden z hlavních ukazatelů invazivních kandidóz. 9, 10, 13 Pravidelné sledování rizikových pacientů kombinující detekování cirkulujícího antigenu mannanu a protilátek proti mannanu napomáhají stanovení diagnózy invazivních kandidóz.
4- PRINCIP VYŠETŘENÍ Platelia™ Candida Ag Plus je jednostupňová imuno-enzymatická technika sendvičového typu prováděná na mikrodestičkách a umožňující detekci cirkulujícího antigenu mannanu kvasinky Candida v lidském séru nebo plazmě. Test využívá monoklonální potkaní protilátku (MAb) EBCA-1, která je zaměřená proti α 1-5 oligomannosidům kvasinky Candida, charakterizovaná v předchozích pracích 13, 14, se používá pro: • senzibilaci jamek mikrodestičky a spojení s antigenem mannanu, • detekci antigenu, který je fixován k senzibilizované mikrodestičce (konjugát: MAb značený peroxidázou). Vzorky séra nebo plazmy se zpracovávají za vysoké teploty za přítomnosti EDTA, aby se oddělily imunnokomplexy a vyprecipitovaly se proteiny séra, které by případně mohly interferovat s imuno-enzymatickou reakcí. Zpracované a konjugované vzorky séra nebo plazmy se rozmístí do jamek mikrodestičky, které byly senzibilizovány monoklonální protilátkou proti mannanu. Po inkubaci při 37°C se stripy promyjí, aby se odstranily veškeré nefixované látky. Pokud v lidském vzorku bude přítomný cirkulující mannan, vytvoří se komplex: MAb antimannan – mannan Ag - MAb antimannan / peroxidáza. Přidání chromogenu obsahujícího substrát peroxidázy a inkubace při okolní teplotě umožní detekci případně vytvořených komplexů. Enzymatická reakce se zastaví přidáním 1N kyseliny sírové. Měření absorbance (optické hustoty) se provádí pomocí spektrofotometru nastaveného na 450/620 nm.
1
5- REAGENCIE Reagencie se dodávají v dostatečném množství, aby bylo možné provést 96 stanovení maximálně v 9 sériích. Viz údaje uvedené na kufříku ohledně podmínek skladování a data expirace činidel. Před použitím nechejte všechna činidla vytemperovat na pokojovou teplotu (+18-30°C) . Po použití ihned reagencie ochlaďte na teplotu +2-8°C. Nepoužité stripy vra ťte zpět do původního sáčku a pečlivě uzavřete. Vysoušedlo nevyjímejte. Složka R1
R2
R3
R4a
R4b
R4c
R4d
R0
R5
R6
R7 R9 R10
Microplate
Concentrated Washing Solution (20x)
Calibrator 0
Calibrator 62.5
Calibrator 125
Calibrator 250
Calibrator 500
Negative control
Positive Control
Conjugate
Sample Treatment Solution Chromogen TMB Stopping Solution
Obsah Mikrotitrační destička: - 96 jamek (12 stripů po 8 jamkách každá) senzibilizovaných monoklonální protilátkou anti-Mannan EBCA-1. Koncentrovaný promývací roztok (20 x): - TRIS-NaCl pufr (pH 7,4) - 2%Tween® 20 - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Kalibrátor 0 pg/ml (připravený k použití): - Tris-NaCl-Trehalózový pufr, neobsahující mannan z kvasinky Candida albicans - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Kalibrátor 62,5 pg/ml (připravený k použití): - Tris-NaCl-Trehalózový pufr - purifikovaný mannan z kvasinky Candida albicans - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Kalibrátor 125 pg/ml (připravený k použití): - Tris-NaCl-Trehalózový pufr - purifikovaný mannan z kvasinky Candida albicans - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Kalibrátor 250 pg/ml (připravený k použití): - Tris-NaCl-Trehalózový pufr - purifikovaný mannan z kvasinky Candida albicans - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Kalibrátor 500 pg/ml (připravený k použití): - Tris-NaCl-Trehalózový pufr - purifikovaný mannan z kvasinky Candida albicans - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Negativní kontrola - Lidské sérum negativní pro mannan - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Pozitivní kontrola: - Lidské sérum obsahující mannan - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Konjugát (připravený k použití): - Monoklonální protilátka antimannan značená peroxidázou - Brómkrezolová červeň - Konzervant: < 1,5% ProClin™ 300 Roztok na zpracování vzorků (připravený k použití): - Kyselý roztok EDTA bez konzervantu
Množství 1
1 x 70 ml
1 x 2,0 ml
1 x 2,0 ml
1 x 2,0 ml
1 x 2,0 ml
1 x 2,0 ml
2 x 1,5 ml
2 x 1,5 ml
1 x 17 ml
1 x 10,5 ml
Roztok TMB chromogenu (připravený k použití): - Roztok 3,3’,5,5’-tetrametylbenzidinu (< 0,1%), H2O2 (<1,0%)
1 x 28 ml
Zastavovací roztok (připravený k použití): - Roztok kyseliny sírové 1N
1 x 28 ml
Adhezní tenké fólie
4
2
6- HYGIENICKÉ A BEZPEČNOSTNÍ POKYNY 1. Pouze pro diagnostiku in vitro . 2. Jen pro profesionální použití. 3. Použití tohoto testu s jinými vzorky nežli sérem nebo lidskou plazmou se nedoporučuje. 4. Negativní kontrola R0 a pozitivní kontrola R5 se připravují z lidského séra, které bylo testováno testy označenými CE a shledáno jako negativní na protilátky anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV, jakož i na antigen HBs. Avšak se všemi činidly musí být zacházeno, jako by potenciálně byly infekční. Všechny testy musí být realizovány v souladu s normou OSHA o patogenních činidlech předávaných hematogenní cestou, úroveň biobezpečnosti 2, nebo v souladu s jinou vhodnou praxí biobezpečnosti. 5. Používejte ochranné oděvy zahrnující laboratorní plášť, ochranu očí a obličeje a rukavice na jednorázové použití (doporučují se rukavice ze syntetického materiálu bez latexu) a zacházejte s reagenciemi, jakož i se vzorky pacientů podle požadované Správné laboratorní praxe (SLP). Po provedení testu je třeba si pečlivě umýt ruce. 6. Nepipetujte ústy. 7. V zónách manipulace se vzorky nebo činidly nekuřte, nepijte ani nejezte. 8. Zabraňte možnému rozlití vzorků nebo roztoků. 9. Plochy znečištěné kontaminující tekutinou, která neobsahuje kyselinu, musí být pečlivě očištěny za pomoci účinného dezinfekčního prostředku. Jako dezinfekční prostředek je možné použít (avšak není to limitující) 10 % roztok bělidla (roztok s 0,5 % chlornanu sodného), etanolu 70 % nebo Wescodynu Plus™ 0,5 %. Materiál použitý pro toto čištění je nutno vyhodit do speciálního kontejneru na kontaminovaný odpad. UPOZORNĚNÍ: Roztoky obsahující bělidlo nikdy nedávejte do autoklávu. 10. Pokud je kontaminující tekutinou kyselina, je třeba znečištěné plochy utřít nebo neutralizovat bikarbonátem sodným a příslušná zóna musí být opláchnuta a vysušena; v případě, že by kontaminující tekutina obsahovala biologicky nebezpečnou látku, umyjte zónu chemickým dezinfekčním prostředkem. 11. Všechny vzorky a činidla použité pro test likvidujte jako by potenciálně byly infekční. Likvidace chemických a biologických odpadů je nutné provádět v souladu s platnými předpisy. 12. UPOZORNĚNÍ: Zde dále je uveden seznam možných chemických rizik u některých složek kitu (viz kapitola 5 - REAGENCIE) Některá činidla obsahující ProClin™ 300 < 1,5%: R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. S24-37-60: Zamezte styku s kůží. Používejte vhodné ochranné rukavice. Tento materiál a jeho obal musí být odstraněny jako nebezpečný odpad. Xi - Dráždivý
13. Na vyžádání vám bude poskytnut bezpečnostní list.
7- POKYNY PRO POUŽITÍ 1. VZORKY ZMRAŽENÉHO SÉRA NEBO PLAZMY, KTERÉ JSOU SKLADOVÁNY V NEZNÁMÝCH PODMÍNKÁCH, MOHOU VÉST K FALEŠNĚ POZITIVNÍM VÝSLEDKŮM Z DŮVODU KONTAMINACE HOUBOU A/NEBO BAKTERIÍ. 2. Nepoužívejte kit a po datu expirace. 3. S výjimkou koncentrovaného promývacího roztoku (R2), roztoku chromogenu (R9) a zastavovacího roztoku (R10) nemíchejte činidla z různých sad a různých čísel šarží. POZNÁMKA: Je možné používat jiné šarže proplachovacího roztoku (R2), chromogenu (R9), a zastavovacího roztoku (R10) než ty, které jsou obsaženy v sadě, s výhradou, že budou použita striktně ekvivalentní činidla z jedné jediné šarže během jedné série testů. POZNÁMKA: promývací roztok (R2,) není možné míchat s promývacím roztokem (R2) dodávaným v sadách činidel Bio-Rad. 4. Před použitím počkejte 30 minut, než se činidla vytemperují na pokojovou teplotu (+18-30°C). 5. Používejte přednostně vybavení na jednorázové použití. V opačném případě použijte bezvadně umyté sklo opláchnuté destilovanou vodou. 6. Zkontrolujte správnost pipet a řádné fungování použitých přístrojů. 7. Pečlivě rozpusťte nebo rozřeďte činidlo R2 a dbejte, aby nedošlo k žádné kontaminaci. 8. Enzymatická reakce je velmi citlivá na veškeré kovy nebo kovové ionty. V důsledku toho se nesmí žádná kovová součást dostat do kontaktu s jednotlivými roztoky obsahujícími konjugát nebo substrátový roztok. 9. Při pipetování kalibrátorů, kontrol a vzorků používejte vždy novou špičku pro každé sérum, aby nedošlo k jakékoliv kontaminaci. 10. Pro zajištění náležitého promytí jamek dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a ujistěte se, že všechny jamky jsou zcela zaplněné a pak zcela vyprázdněné. Promývání je nutno provádět v promývacím přístroji pro mikrotitrační destičky. 11.Nedovolte, aby mikrodestička vyschla v období mezi ukončením promývacího cyklu a přidáním činidel.. 12. Nepoužívejte stejnou nádobku pro konjugát a pro roztoky substrátu. 13. Nevystavujte roztok chromogenu nebo roztok substrát-chromogen plnému světlu při skladování nebo inkubaci. Dávejte pozor, aby se roztoky obsahující chromogen nedostaly do styku s oxidačním činidlem. 14. Chromogen (R9) musí být bezbarvý. Pokud se objeví modré zabarvení, znamená to, že činidlo již není použitelné a je třeba je nahradit novým. 15. Dávejte pozor, aby se zastavovací roztok nedostal do styku s jakýmkoliv oxidačním činidlem, kovem nebo kovovými ionty. 16. Zbytek konjugátu, který jste nepoužili, již do původní lahvičky zpět nevracejte.
3
8- PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ ČINIDEL Mikrotitrační destička (R1) Každý rámeček obsahující 12 stripů je zabalen v sáčku. Nůžkami odstříhněte sáček těsně pod svarem. Otevřete sáček a vyjměte rámeček. Rámeček s nepoužitými stripy vraťte zpět do původního sáčku. Pečlivě uzavřete sáček a dejte ho opět do teploty +2-8°C. Po otevření vakuově baleného sáčku zůstanou stripy při uchovávání za teploty +2-8°C v jejich p ůvodním pečlivě uzavřeném sáčku stabilní po dobu 8 týdnů. Zkontrolujte přítomnost vysoušedla. Promývací roztok (R2) Připravte si Promývací roztok tak, že 20 krát zředíte koncentrovaný promývací roztok destilovanou vodou: 50 ml R2 na 950 ml destilované vody. (Počítejte s 400 ml naředěného promývacího roztoku na celou desku s 12 stripy mimo mrtvý objem způsobený použitými přístroji). Po zředění může být promývací roztok skladován po dobu 14 dnů při teplotě +2-30°C. Po otevření je koncentrovaný promývací roztok, který je skladovaný při teplotě +2-30°C a pokud není kontaminovaný, stabilní až do data expirace uvedeného na štítku. Kalibrátor 0 (R3), Kalibrátor 62,5 (R4a), Kalibrátor 125 (R4b), Kalibrátor 250 (R4c), Kalibrátor 500 (R4d): Kalibrátory jsou připraveny k použití. Po otevření jsou tato činidla, skladovaná při teplotě +2-30°C a pokud nejsou kontaminovaná, stabilní po dobu 8 týdnů. Negativní kontrola (R0), Pozitivní kontrola (R5): Negativní kontrola a Pozitivní kontrola musí být tepelně ošetřeny kyselým roztokem EDTA (R7) stejně jako vzorky pacientů, aby také mohla sloužit jako kontrola léčby. Po otevření jsou tato činidla, skladované při teplotě +2-8°C a pokud nedojde k kontaminaci, stabilní po dobu 8 týdnů. Konjugát (R6), Roztok na zpracování vzorků (R7), Roztok TMB chromogen (R9): Tato činidla jsou připravena k použití. Po otevření jsou tato činidla, skladovaná při teplotě +2-8°C a pokud nejsou kontaminovaná, stabilní po d obu 8 týdnů. Zastavovací roztok (R10): Toto činidlo je připraveno k použití. Po otevření je toto činidlo, skladované při teplotě +2-8°C a pokud není kontaminované, stabilní až do data expirace uvedeného na štítku.
9- VZORKY 1. Testy se provádí na vzorcích séra nebo plazmy odebraných na antikoagulační látku typu EDTA, heparin nebo citrát. 2. Dodržujte následující pokyny pro odběr, zpracování a uchovávání těchto vzorků krve: • Odeberte vzorek krve podle běžné praxe. • U sér počkejte, aby se před odstředěním zcela vytvořila sraženina. • Zkumavky uchovávejte zavřené. • Po odstředění extrahujte sérum nebo plazmu a uchovávejte je v zavřené zkumavce. • Vzorky se uchovávají při teplotě +2-8°C, pokud je test uskute čněn do 5 dnů. • Pokud test není uskutečněn do 5 dnů, musí se vzorky zmrazit na -20°C (nebo -80°C). • Doporučuje se, aby se neprovádělo více jak pět cyklů zmrazení / rozmrazení. Vzorky je třeba po rozmrazení a před provedením testu pečlivě homogenizovat (Vortex). 3. Výsledky neovlivní vzorky, které obsahují 60g/l lidského albuminu nebo 120 g/l celkových proteinů nebo 200 mg/l nekonjugovaného bilirubinu nebo 200 mg/l konjugovaného bilirubinu, lipemické vzorky obsahující ekvivalent 30 g/l trioleidu (triglycerid) nebo 5 g/l cholesterolu nebo hemolyzované vzorky obsahující 2 g/l hemoglobinu. 4. Vzorky nezahřívejte.
10- POSTUP Dodávaný materiál Viz kapitola REAGENCIE Potřebné vybavení, které není dodáno 1. Destilovaná nebo sterilní demineralizovaná voda pro zředění koncentrovaného promývacího roztoku. 2. Absorpční papír. 3. Rukavice na jednorázové použití. 4. Ochranné brýle. 5. Chlornan sodný (bělidlo) a bikarbonát sodný. 6. Pipety nebo multipipety, automatické nebo polo-automatické, nastavitelné nebo pevné, které mohou měřit a vydávat 10 µl až 1000 µl, 1 ml, 2 ml a 10 ml.
4
7. 1,5ml polypropylenové mikrocentrifugační zkumavky se vzduchotěsnými zátkami, které snesou ohřev až na 120 °C (topný blok) nebo 100 °C (láze ň s vařící vodou). a. Zkumavky se šroubovým uzávěrem: 1,5 ml kónické zkumavky, Bio Rad kat. č. 224-0100 nebo ekvivalentní. b. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem: Mikrozkumavky EZ, 1,5 ml, Bio Rad kat. č. 223-9480 nebo ekvivalentní. 8. Aretační uzávěry zkumavek (VWR kat. č. 6054001 nebo ekvivalentní). Tyto aretační systémy bezpečně uzavřou zkumavky s nasazovacím uzávěrem a zabrání otevření během teplotních a tlakových změn, a také umožní jejich snadné vytažení z elektrického ohřívače bloku nebo lázně z vařící vodou. 9. Laboratorní centrifuga až na 10 000g pro polypropylenové zkumavky 10. Při použití ohřívacího bloku pro zpracování sér: • Ohřívací blok. Doporučují se následující typy ohřívacích bloků: - typ s 1 blokem: Grant katalogové číslo QBD 1 (VWR katalogové číslo 460-0074) - typ se 2 bloky: Grant katalogové číslo QBD2 (VWR katalogové číslo 460-0076) • Blok pro ohřívací blok: oba dva ohřívací bloky (QBD1, QBD2) je nutné používat s blokem Grant katalogové číslo QB-E1 (VWR katalogové číslo 460-8517). • Samostatný stojánek na mikrotitrační zkumavky pro mikrocentrifugaci • Vroucí vodní lázeň s možným nastavením termostatu až na 100°C. 11. Zkumavky opatřené stupnicí na 25 ml, 50 ml, 100 ml a 1000 ml. 12. Kontejner na kontaminovaný odpad. 13. Třepačka typu "Vortex". 14. Inkubátor mikrotitračních destiček s možným nastavením termostatu na 37°C ± 1°C (*) . 15. Poloautomatická nebo automatická promývačka mikrotitračních destiček(*). 16. Čtečka mikrotitračních destiček vybavená filtry o 450 a 620 nm(*). (*) Obraťte se na nás pro přesné informace ohledně přístrojů schválených našimi technickými službami. Zpracování vzorků Negativní kontrola (R0) a Pozitivní kontrola R5 musí být zpracována současně se všemi vzorky pacientů přidáním 100 µl činidla R7. Kalibrátory R3, R4a, R4b, R4c a R4d, které jsou připraveny k použití, nesmí projít tímto zpracováním. 1. Napipetujte 300 µl každého testovaného séra, negativní (R0) a pozitivní kontrolu (R5) do jednotlivých 1,5 ml polypropylenových zkumavek. 2. Do každé zkumavky přidejte 100 µl roztoku pro úpravu séra (R7). 3. Zkumavky důkladně promíchejte intenzivním mícháním nebo vortexovým míchadlem. Zkumavku těsně uzavřete, aby se během ohřevu neotevřela. U zkumavek s nasazovacím uzávěrem: použijte aretaci víčka. Zátku nepropichujte.. 4. Ohřívací blok: Zkumavky zahřívejte v tepelném bloku po dobu 6 minut při teplotě 120 oC. Zkumavky je nutné vložit do bloku pouze po dosažení předepsané teploty (*). NEBO Vodní lázeň: Pokud používáte lázeň s vařící vodou: zkumavky zahřívejte po dobu 3 minut při teplotě 100 °C. (*) 5. Horké zkumavky opatrně vyjměte z tepelného bloku nebo vařící vody a umístěte do centrifugy. Odstřeďujte při 10 000 g po dobu 10 minut. 6. Supernatant se používá k detekci antigenu mananu. Otestujte supernatanty podle následujícího postupu.Test je nutné provést do dvou hodin po zpracování séra nebo plazmy. (*) Zásadními faktory pro úspěšnost testu je přísné dodržování pokynů ohledně doby trvání a teploty, jakožto i použití doporučeného vybavení. Bude tedy vhodné nespoléhat se pouze na teplotu, kterou budou ukazovat přístroje, ale ověřit si, že teplota souhlasí se specifikacemi za použití tepelné sondy umístěné v mikrotitrační zkumavce obsahující minerální olej: 120°C musí b ýt naměřeno uvnitř mikrotitrační zkumavky v ohřívacím bloku a 100°C uvnit ř mikrotitrační zkumavky ve vroucí vodní lázni. Poznámka: • Všechny zpracované vzorky podle tohoto postupu mohou být použity pro test Platelia™ Aspergillus EIA, protože postupy zpracování vzorků jsou pro oba dva testy stejné. • Po zpracování vzorky (negativní a pozitivní kontrolu a vzorky) neuchovávejte. Postup EIA Důsledně dodržujtepřipravený protokol. Dodržujte správnou laboratorní praxi: • 1.Před použitím nechte všechna činidla vytemperovat na pokojovou teplotu (+18-30 °C ) na dobu nejméně 30 minut • Používejte všechny kalibrátory, negativní a pozitivní kontrolu při každém provádění dávkování pro potvrzení kvality testu.
5
Postupujte následujícím způsobem: 1. Stanovte si pečlivě plán rozdělení a identifikace kalibrátorů, kontroly a vzorků podle následujícího schématu: - A1: Pozitivní kontrola R5 (supernatant zpracované kontroly) - B1: Kalibrátor 500 pg/ml (R4d) - C1: Kalibrátor 250 pg/ml (R4c) - D1: Kalibrátor 125 pg/ml (R4b) - E1: Kalibrátor 62,5 pg/ml (R4a) - F1: Kalibrátor 0 pg/ml (R3) - G1: Negativní kontrola (R0) (supernatant zpracované kontroly)
A B C D E F G H
1 R5 R4d R4c R4b R4a R3 R0 S1
2 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9
3 S10 S11
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2. Z obalu na destičky vyjměte rámeček a mikrotitrační stripy (R1). Stripy, které nepoužijete, vraťte do obalu s desikantem a obal pečlivě uzavřete. 3. Napipetujte 100 µl supernatantu zpracovaného vzorku a kontroly R0 a R5 do odpovídajících jamek. 4. Potom napipetujte 100 µl R4d, R4c, R4b, R4a a R3 podle schématu desky. Poznámka: Distribuce kalibrační řady může být kontrolována v tomto stádiu manipulace. Odpovídající jamky totiž vykazují barevné tónování od oranžové (R4d) po světle žlutou (R3). 5. Před použitím homogenizujte obsah lahvičky R6 jejím přetáčením. Při použití multikanálové pipety odeberte pouze takový objem, který potřebujete pro realizaci série: počítejte 2,5 ml na dva stripy o 8 jamkách. 6. Napipetujte 100 µl konjugovaného roztoku (R6) do každé jamky. 7. Zakryjte mikrotitrační destičku adhézní fólií, kterou je potřeba dobře přitlačit na celou plochu, aby těsnila. 8. Okamžitě inkubujte mikrotitrační destičku v suchém inkubátoru mikrodestiček po dobu 90 ± 10 minut při teplotě 37°C (± 1°C). 9. Připravte si zředěný promývací roztok (viz kapitola 8). 10. Sejměte adhezní fólii. Odsajte obsah každé jamky do kontejneru na kontaminovaný odpad (obsahující chlornan sodný). Promyjte mikrotitrační destičku 5 krát pomocí promývačky na mikrotitrační destičky (s 800 µl zředěného promývacího roztoku). Po posledním promytí mikrotitrační destičku otočte na absorpční papír a lehce na ni poklepejte, aby se zbavila zbývající kapaliny. 11. Napipetujte rychle a za nepřítomnosti přímého světla, 200 µl roztoku chromogenu TMB (R9) do každé jamky. 12. Inkubujte mikrotitrační destičku v temnu při teplotě +19-25°C po dobu 30 ± 5 minut. Během tohoto inkubačního kroku nepoužívejte adhézní fólii. 13. Přidejte 100 µl zastavovacího roztoku (R10) do každé jamky, přitom použijte stejné pořadí a stejný rytmus, jako pro přidávání vyvíjecího roztoku. Dobře promíchejte. 14. Pečlivě otřete každou mikrotitrační destičku ze spoda. 15. Odečtěte optickou hustotu každé jamky při 450 nm (referenční filtr při 620 nm) po 30 minutách po přidání zastavovacího roztoku (přičemž stripy musí být vždy před odečtením uchovávány chráněné před světlem). 16. Před zapsáním výsledků se ujistěte, zda je soulad mezi odečtem a plánem rozdělení destičky.
11- KONTROLA KVALITY (KRITÉRIA PLATNOSTI) Používejte kontroly a kalibrátory na každou mikrodestičku pro každou zkoušku. Pro schválení testu musí být dodržena následující kritéria: • Hodnoty optické hustoty: OD R4a > 0,280 OD R0 < OD R4a • Poměry: OD R4a /OD R3 > 1.25 OD R4b / OD R4a > 1.15 OD R4c / OD R4b > 1.15 OD R4d / OD R4c > 1.20
6
• Koncentrace mannanu v pozitivní kontrole R5: Koncentrace R5 se musí rovnat koncentraci uvedené na lahvičce ± 30 %.
12- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Sestrojení kalibrační křivky Kalibrační křivka se vynáší pomocí 5 kalibračních bodů 0 pg/ml, 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml a 500 pg/ml. Sestrojte kalibrační křivku [OD = funkce (pg/ml)] tak, že přenesete na vertikální osu (osa Y) OD kalibrátorů R3, R4a, R4b, R4c a R4d a poté na horizontální osu (osa X) přenesete jejich příslušnou koncentraci v pg/ml. Zvolte si průběh bod za bodem spojující jednotlivé body řady. Určení koncentrace mannanu (pg/ml) v testovaných vzorcích Podle takto zaznamenané křivky můžeme určit u každého z testovaných vzorků, jakou má koncentraci mannanu, vyjádřenou v pg/ml. Interpretace výsledků • Vzorky, jejichž koncentrace jsou nižší než 62,5 pg/ml (c < 62,5) jsou považovány za "negativní" z hlediska přítomnosti antigenu mannanu. • Vzorky, jejichž koncentrace se pohybují v rozmezí od 62,5 do 125 pg/mL (62,5 ≤ c < 125) jsou považovány za "intermediální" z hlediska přítomnosti antigenu mannanu. • Vzorky, jejichž koncentrace jsou rovny nebo vyšší než 125 pg/ml (c ≥ 125) jsou považovány za "pozitivní" z hlediska přítomnosti antigenu mannanu. • Kalibrátory použité pro sestrojení kalibrační křivky neumožňují titraci koncentrací, které jsou vyšší než 500 pg/ml. Bude třeba provést test znovu po předchozím naředění 1/5 supernatantu zpracovávaného vzorku (nové zpracování) s ředěným promývacím roztokem (R2) (viz kapitola 8), aby se dala přesněji zjistit koncentrace vzorků, které jsou silně pozitivní. Takto obdržená koncentrace se musí vynásobit koeficientem 5. "Intermediální" výsledek může být ještě potvrzen z nového vzorku odebraného pacientovi v následujících týdnech po odběru, který vykázal intermediální koncentraci.
13- LIMIT POUŽITELNOSTI 1. Negativní test na mananové antigeny formálně nevylučuje diagnózu invazivní kandidózy vzhledem k velmi nízké koncentraci a rychlému vylučování mananu během infekce. Diagnózu invazivní kandidózy je možné určit pouze až po konfrontaci klinických, terapeutických, rentgenových, cytologických, přímých mykologických a serologických nálezů, přičemž každý prvek sám o sobě musí být interpretován s opatrností. 2. Negativní test na mananový antigen musí být rovněž interpretován s přihlédnutím k výsledkům testu ke stanovení protilátek proti mananům: detekce antigenu je obtížnější u pacientů testovaných pozitivně na protilátky proti mananům, a to dokonce i v případě invazivní kandidózy (viz kapitola 15 – Charakteristiky účinnosti). 3. Účinnost detekce mananu v séru souvisí s četností testů prováděných u daného pacienta. Doporučuje se pravidelné monitorování vysoce rizikových pacientů a screening protilátek proti mananům pro zvýšení citlivosti a včasné zjištění pozitivity testu. 4. Postup a interpretace výsledků, popsané pro test Platelia™ Candida Ag Plus, musí být dodržován při testování vzorků na přítomnost antigenu mannanu. Uživateli sady doporučujeme, aby si pečlivě přečetl návod před tím, než bude test provádět. Zvláště pak musí být řádně dodržován protokol při pipetování vzorků a činidel, promývání mikrotitrační destičky a době trvání inkubačních kroků. 5. V případě, že vzorky a činidla nejsou přidány dle pokynů v návodu, může vyjít falešně negativní výsledek. Je nutné provést další test nového vzorku stejného pacienta v případě klinického podezření na invazivní kandidózu nebo v případě chyby v postupu. 6. Ke kontaminaci jamek obsahujících vzorky negativních pacientů jamkami obsahujícími pozitivní kontrolu, kalibrátory nebo vzorky pacientů může dojít, pokud obsah některé jamky přeteče do druhé nešikovným zacházením s mikrotitrační destičkou nebo špatnou technikou pipetování při přidávání činidel. 7. Účinnost testu Platelia™ Candida Ag Plus nebyla vyhodnocována ze vzorků séra nebo plazmy novorozeců ani pediatrických pacientů. 8. Účinnost testu Platelia™ Candida Ag Plus nebyla vypracována pro manuální čtení a/nebo vizuální určení výsledků. 9. Při externí studii byla konstatována zkřížená reakce u pacientů s infúzí u některých sérií kapalných náplní, sloučenin hydroxyetylškrobu (typu Hesteril 6%), používaných při léčbě poruch krevního oběhu: hypovolemie, hemoragický šok, septický šok. 10. Byly pozorovány falešně pozitivní výsledky, jestliže vzorky obsahovaly množství lidských gamaglobulinů ≥ 60 g/l, jakož i u některých vzorků pozitivně testovaných na přítomnost protilátek anti-Toxoplasma.
7
14- OČEKÁVANÉ HODNOTY Prevalence antigenu mannanu specifického pro kvasinku Candida měřená pomocí testu Platelia™ Candida Ag Plus byla vyhodnocována na souboru 613 vzorků 51 nizozemských pacientů (Místo 1 - Nizozemsko) hospitalizovaných kvůli léčbě rakoviny (maligní hemopatie u 49 pacientů a nehematologická malignita u 2 pacientů) intenzivní chemoterapií. Z 613 vzorků jich 88 bylo pozitivních a 51 středních, tj. prevalence 88/613 = 14,4% [CI 95%: 11,7-17,4%] při posuzování středních výsledků jako negativních a 139/613 = 22,7% [CI 95%: 19,4-26,2%] při posuzování středních výsledků jako pozitivních. Z hlediska pacientů, z 51 testovaných pacientů u 23 byl minimálně jeden vzorek pozitivní a u 14 byl minimálně jeden vzorek střední bez žádného pozitivního, tj. prevalence 23/51 = 45,1% [CI 95%: 31,1-59,7%] při posuzování středních výsledků jako negativních a 37/51 = 72,6% [CI 95%: 58,3-84,1%] při posuzování středních výsledků jako pozitivních. Z těchto 51 pacientů, 30 (388 vzorků) nevykazovalo klinicky podloženou invazivní kandidózu. Z těchto bylo 20 kolonizováno kvasinkami (12 kvasinkou Candida albicans, 7 Candida albicans ve spojitosti s jiným druhem kvasinky Candida a 1 kolonizovaná minimálně 1 druhem Candida , který není albicans). Čtyři z těchto pacientů vykazovali klinické symptomy a plošnou infekci kvasinkou Candida prokázanou mikrobiologicky. Vážná poškození sliznicových bariér se vyskytovala u 24 z těchto pacientů. Z 388 odpovídajících vzorků se jich 41 ukázalo být pozitivních a 43 středních, tj. prevalence 41/388 = 10,6% [CI 95%: 7,7-14,1%] při posuzování středních výsledků jako negativních a 84/388 = 21,7% [CI 95%: 17,7-26,1%] při posuzování středních výsledků jako pozitivních. Z hlediska pacientů, z 30 testovaných pacientů u 10 byl minimálně jeden vzorek pozitivní a u 11 byl minimálně jeden vzorek střední bez žádného pozitivního, tj. prevalence 10/30 = 33,3% [CI 95%: 17,3-52,8%] při posuzování středních výsledků jako negativních a 21/30 = 70,0% [CI 95%: 50,6-85,3%] při posuzování středních výsledků jako pozitivních.
15-CHARAKTERISTIKY ÚČINNOSTI A. Studie reprodukovatelnosti • Přesnost intra-analýzy (opakovatelnost): Aby bylo možné hodnotit opakovatelnost intra-analýzy, bylo pět vzorků (dva negativní a tři pozitivní) testováno 32 krát za sebou v jedné sérii. Koncentrace v pg/ml byla určena pro každý vzorek. Průměr koncentrací, standardní odchylka (SD) a variační koeficient (CV%) pro každý vzorek jsou uvedeny v následující tabulce: Přesnost intra-analýzy (opakovatelnost): N=32 Průměr koncentrací (pg/ml) SD CV%
Vzorek Negativní
Vzorek silně negativní
Vzorek mírně pozitivní
Vzorek středně pozitivní
Vzorek silně pozitivní
25,1 4,11 16,3%
54,8 5,20 9,5%
63,7 4,27 6,7%
154,1 8,01 5,2%
261,8 16,93 6,5%
• Přesnost inter-analýzy (reprodukovatelnost): Aby bylo možné vyhodnotit reprodukovatelnost inter-analýzy, byl každý z pěti vzorků (dva negativní a tři pozitivní) testován dvojmo, ve dvou sériích za den během období celkem 20 dnů. Koncentrace v pg/ml byla určena pro každý vzorek. Průměr koncentrací, standardní odchylka (SD) a variační koeficient (CV%) pro každý vzorek jsou uvedeny v následující tabulce: Přesnost inter-analýzy (reprodukovatelnost): Vzorek N=80 Negativní Průměr koncentrací (pg/ml) 24,1 SD 6,99 CV% 29,0%
Vzorek silně negativní
Vzorek mírně pozitivní
Vzorek středně pozitivní
Vzorek silně pozitivní
55,0 11,47 20,8%
70,0 14,50 20,7%
161,6 30,07 18,6%
264,9 38,62 14,6%
B. Zkřížené reakce Patologie Aspergillus Protilátky anti-ds-ADN ANA pozitivní IgG a IgM Myelom IgG anti-Toxoplasma Lidské protilátky protimyší Revmatoidní faktor
Počet testovaných vzorků 10 10 10 20 10 10 10
Počet pozitivních
Počet středních
0 0 0 0 3 0 0
1 0 0 1 1 0 0
8
C. Linearita Oblast linearity testu Platelia™ Candida Ag Plus byla stanovena mezi 20 a 470 pg/ml na základě studií roztoků realizovaných na 4 pozitivních vzorcích. D. Klinické studie Charakteristiky účinnosti sady Platelia™ Candida Ag Plus byly vyhodnocovány ve 3 místech s celkovým počtem 852 vzorků od 505 pacientů. SENZITIVITA Senzitivita sady Platelia™ Candida Ag Plus byla určena na základě souboru 436 vzorků od 89 pacientů hospitalizovaných ve 2 místech nacházejících se v Nizozemsku a ve Francii. Rozvržení vzorků je následující: • Místo 1 (Nizozemsko): 225 vzorků od 21 nizozemských pacientů, kteří byli hospitalizováni na onkologicko-hematologickém oddělení k léčbě maligní hemopatie (19 případů) nebo nehematologické malignity (2 případy) intenzivní chemoterapií, po níž případně následovala transplantace kmenových hematopoetických buněk. Všichni tito pacienti vykazovali invazivní kandidózu prokázanou mikrobiologicky na základě minimálně jedné pozitivní kultury na kvasinku Candida (hemokultura nebo kultura normálně sterilního odběru tkáně). 17 • Místo 2 (Francie): 211 vzorků od 68 francouzských pacientů hospitalizovaných na různých rehabilitačních nebo onkologickohematologických odděleních a u nichž byla mikrobiologicky prokázána invazivní kandidóza na základě minimálně jedné hemokultury pozitivní na kvasinku Candida spp. Poznámka: Soubory použitých vzorků pro tyto dvě studie pocházejí od pacientů, jejichž krevní vzorky byly odebrány v letech 1999 až 2007. Relativní stabilita antigenu mannanu a protilátky proti mannanu v těchto vzorcích během doby zmražení, jakož i po každém cyklu zmražení a rozmražení, způsobují závislost výsledků na stavu skladování testovaného souboru. Hodnoty senzitivity testu určené v rámci starších klinických studií tak mohou být nižší než ty, které byly zjištěny při novějších klinických studiích, realizovaných na vzorcích odebraných teprve nedávno. Výsledky z místa 1 Uvedených 21 holandských pacientů zahrnutých do této studie bylo přijato do nemocnice k léčbě maligní hemopatie (akutní myeloblastická leukémie, aktuní lymfoblastická leukémie, chronická lymfoidní leukémie, myelom, myelo-dysplastický syndrom, aplastická anémie nebo non-Hodgkinův lymfom) nebo nehematologické malignity invazivní chemoterapií následovanou případně transplantací hematopoetických kmenových buněk 17. U těchto 21 pacientů se projevila invazivní kandidóza mikrobiologicky prokázaná na základě minimálně jedné kultury pozitivní na kvasinku Candida spp. (hemokultura nebo kultura normálně sterilního odběru tkáně). Statut těchto pacientů z hlediska přítomnosti specifického antigenu mannanu kvasinky Candida, zjištěného pomocí testu Platelia™ Candida Ag Plus, se považuje za pozitivní, jestliže minimálně jeden ze vzorků pacienta je pozitivní. Pokud žádný vzorek není pozitivní, považuje se statut jako intermediální, jestliže minimálně jeden ze vzorků pacienta jeintermediální, a jako negativní, jestliže všechny vzorky pacienta jsou negativní. 17 Výsledky testu Platelia™ Candida Ag Plus Počet pacientů (počet vzorků) Kategorie pacientů
21 pacientů (225 vzorků) vykazujících minimálně jednu kulturu pozitivní na Candida spp.
Pozitivní
Intermediáln í
Negativní
13 (47)
3 (8)
5 (170)
Senzitivita (intermediální považované za negativní) 61,9%
Senzitivita (intermediální považované za pozitivní) 76,2%
95% CI [38,4-81,9%]
95% CI [52,8-91,8%]
Paralelně s testem Platelia™ Candida Ag Plus byly ty samé vzorky testovány na přítomnost protilátek proti mannanu se sadou Platelia™ Candida Ab Plus 9. Statut pacienta z hlediska přítomnosti antigenu mannanu nebo specifických protilátek proti mannanu Candida se považuje za pozitivní, pokud minimálně jeden z obou testů je pozitivní. Pokud žádný test není pozitivní, statut se považuje za intermediální, jestliže minimálně jeden z obou testů je intermediální, a za negativní, pokud oba dva testy jsou negativní. Kombinace výsledků testu Platelia™ Candida Ag Plus a PlateliaTM Candida Ab Plus Kategorie pacientů
21 pacientů (225 vzorků) vykazujících minimálně jednu kulturu pozitivní na Candida spp.
Počet pacientů (počet vzorků) Pozitivní
Intermediáln í
Negativní
15 (98)
4 (34)
2 (93)
Senzitivita (intermediální považované za negativní) 71,4%
Senzitivita (intermediální považované za pozitivní) 90,5%
95% CI [47,8-88,7%]
95% CI [69,6-98,8%]
9
Výsledky z místa 2 68 francouzských pacientů zahrnutých do této studie bylo přijato na různá oddělení rehabilitace (chirurgie, transplantace, popáleniny, traumatologie, plicní, atd...) nebo onkologicko-hematologické oddělení (maligní hemopatie). Všichni vykázali invazivní kandidózu prokázanou mikrobiologicky na základě minimálně jedné hemokultury pozitivní na kvasinku Candida ( albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei nebo tropicalis)6, 7, 14 během dnů předcházejících nebo následujících po odběru vyšetřované krve. Vzorky krve byly odebrány v průměru 6 dní po první hemokultuře, která byla pozitivní na kvasinku Candida (minimálně 61 den před, maximálně 67 dnů po). Statut těchto pacientů z hlediska přítomnosti specifického antigenu mannanu kvasinky Candida, zjištěného pomocí testu Platelia™ Candida Ag Plus, se považuje za pozitivní, jestliže minimálně jeden ze vzorků pacienta je pozitivní. Pokud žádný vzorek není pozitivní, považuje se statut jako intermediální, jestliže minimálně jeden ze vzorků pacienta je intermediální, a jako negativní, jestliže všechny vzorky pacienta jsou negativní. Výsledky testu Platelia™ Candida Ag Plus Počet pacientů (počet vzorků) Kategorie pacientů Pozitivní
Intermediáln í
Negativní
35 (86)
7 (14)
26 (111)
22 (55)
6 (12)
6 (46)
- z toho 15 na C. parapsilosis (37 vzorků)
2 (3)
1 (1)
12 (33)
- z toho 12 na C. glabrata (32 vzorků)
7 (13)
0 (0)
5 (19)
- z toho 4 na C. tropicalis (19 vzorků)
4 (15)
0 (1)
- z toho 2 na C. krusei (8 vzorků)
0 (0)
- z toho 1 na C. norvegensis (2 vzorky)
0 (0)
68 pacientů (211 vzorků) vykazujících minimálně jednu hemokulturu pozitivní na Candida spp. - z toho 34 na C. albicans (113 vzorků)
Senzitivita (Intermediální považované za negativní) 51,5% 95% CI [39,0-63,8%]
Senzitivita (intermediální považované za pozitivní) 61,8% 95% CI [49,2-73,3%]
64,7%
82,5%
95% CI [46,5-80,3%]
95% CI [65,5-93,2%]
13,3%
20,0%
95% CI [1,7-40,5%]
95% CI [4,3-48,1%]
58,3%
66,7%
95% CI [27,7-84,8%]
95% CI [34,9-90,1%]
0 (3)
100,0% *
100,0% *
0 (0)
2 (8)
0,0% *
0,0% *
0 (0)
1 (2)
0,0% *
0,0% *
* : 95% interval spolehlivosti nemohl být vypočten z důvodu nedostatečného množství vzorků. Paralelně s testem Platelia™ Candida Ag Plus byly ty samé vzorky testovány na přítomnost protilátek proti mannanu se sadou Platelia™ Candida Ab Plus 9. Statut pacienta z hlediska přítomnosti antigenu mannanu nebo specifických protilátek proti mannanu kvasinky Candida se považuje za pozitivní, jestliže minimálně jeden z obou testů je pozitivní. Pokud žádný test není pozitivní, statut se považuje za intermediální, jestliže minimálně jeden z obou testů je intermediální a za negativní, pokud oba dva testy jsou negativní. Kombinace výsledků testu Platelia™ Candida Ag Plus a PlateliaTM Candida Ab Plus Kategorie pacientů
68 pacientů (211 vzorků) vykazujících minimálně jednu hemokulturu pozitivní na Candida spp. - z toho 34 na C. albicans (113 vzorků)
Počet pacientů (počet vzorků) Pozitivní
Intermediáln í
Negativní
48 (122)
8 (40)
12 (49)
28 (74)
2 (22)
4 (17)
5 (7)
6 (15)
4 (15)
- z toho 12 na C. glabrata (32 vzorků)
11 (24)
0 (3)
1 (5)
- z toho 4 na C. tropicalis (19 vzorků)
4 (17)
0 (0)
- z toho 2 na C. krusei (8 vzorků)
0 (0)
- z toho 1 na C. norvegensis (2 vzorky)
0 (0)
- z toho 15 na C. parapsilosis (37 vzorků)
Senzibilita (Intermediální považované za negativní) 70,6% 95% CI [58,3-81,0%]
Senzibilita (Intermediální považované za pozitivní) 82,4% 95% CI [71,2-90,5%]
82,4%
88,2%
95% CI [65,5-93,2%]
95% CI [72,6-96,7%]
33,3%
73,3%
95% CI [11,8-61,6%]
95% CI [44,9-92,2%]
91,7%
91,7%
95% CI [61,5-99,8%]
95% CI [61,5-99,8%]
0 (2)
100,0% *
100,0% *
0 (0)
2 (8)
0,0% *
0,0% *
0 (0)
1 (2)
0,0% *
0,0% *
* : 95% interval spolehlivosti nemohl být vypočten z důvodu nedostatečného množství vzorků.
10
SPECIFICITA Specificita byla určena na souboru 416 vzorků pocházejících ze 2 objektů nacházejících se ve Francii a rozvržených následovně: • Místo 1: 200 vzorků od 200 francouzských pacientek sledovaných na serologii toxoplazmózy během jejich těhotenství a jež nevykazovaly žádný klinický symptom infekce kvasinkou Candida. • Místo 2: 216 vzorků od 216 francouzských pacientů - dárců krve Výsledky testu Platelia™ Candida Ag Plus Počet pacientů (počet vzorků) Kategorie pacientů Pozitivní
Intermediáln í
Negativní
200 těhotných žen (200 vzorků) sledovaných z hlediska sérologie toxoplazmózy
3
2
195
216 dárců krve (216 vzorků)
1
1
214
Specificita (intermediální považované za pozitivní)
Specificita (intermediální považované za negativní)
97,5%
98,5%
95% CI [94,3-99,2%]
95% CI [95,7-99,7%]
99,1%
99,5%
95% CI [96,7-99,9%]
95% CI [97,5-100%]
16- KONTROLA KVALITY VÝROBCE Všechny výrobky vyrobené a prodávané společností Bio-Rad jsou součástí systému zajištění kvality od příjmu surovin až po prodej hotových výrobků. Každá šarže hotového výrobku je kontrolována z hlediska kvality a je dána do prodeje, jen pokud je v souladu se schvalovacími kritérii. Dokumentace o výrobě a kontrole každého čísla šarže je uložena u výrobce.
17- LITERATURA 1-
Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U. 2007. Comparative evaluation of (1,3)-beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candidaspecies-specific snPCR in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103): p. 1-9.
2-
Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F.,Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D.,Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag,D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p. 7–14.
3-
Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J. 2005. Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43 (No. S): p. 6584.
4-
Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom,U. 2009. Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candida infections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p. 606-615.
5-
Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M.,Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti,M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J. 2009. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p.55–62.
6-
Nucci, M., Colombo, A.L. 2007. Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p. 77– 82.
7-
Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G. 2008. Experience with the Platelia™ Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p. 377-397.
8-
Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F.,Edwards, J.E. Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner,L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D. 2009. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p. 503–535.
9-
Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S. 2002. Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p. 455–460.
10- Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T.,Marchetti, O. 2005. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology andInfectious Disease 51: p. 95– 101. 11- Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R. 1998. The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p. 781–788.
11
12- Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R. 2009. Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p. 443–451. 13- Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D.,Poulain, D. 2002. Combined detection of mannanaemia and anti mannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433–442. 14- Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M.,Bonnin, A., Poulain, D. 2003. Contribution of the Platelia™ Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalis infection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p.4551–4558. 15- Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure,O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R. 2004. Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p. 317–322. 16- Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P.,Samonis, G., Falagas, M. E. 2009. Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immuno competent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p. 289–292. 17- Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A.,Verweij, P. E. 2009. Circulating Candidaspecific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p. 380-386.
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 www.bio-rad.com
11/2011 881082
12
