®
PLAC Test ELISA Kit Enzymová imunoassay pro kvantitativní stanovení Lp-PLA2 v lidském séru nebo plasmě
REF REF
90123
DiaDexus, Inc. 343 Oyster Point Blvd. South San Francisco, CA 94080 USA Tel: 1-877-PLACTEST (1-877-752-2837) Fax: 1-650-246-6499 www.plactest.com
mdi Europa GmbH Langenhagener Str. 71 D-30855 Hannover-Langenhagen, Germany MEDISTA, spol. s r.o. U Krčské vodárny 939/1a 140 00 Praha 4 Tel.: +420 444 526, 241 444 637 Fax: +420 241 445 980 www.medista.cz
Distributor:
SYMBOLY REF
Katalogové číslo Destička potažená konjugátem
PLATE
IVD
Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro
LOT
Číslo šarže
CAL
CONTROL CONTROL
LOW HIGH
Kalibrátor
Datum exspirace
Kontrola - nízká
Skladovat při 2 až 8°C
Kontrola - vysoká
Dráždivá látka
WASH
Promývací pufr
Postupujte dle návodu k použití
CONJ
Konjugát
Výrobce
Substrát TMB
Zplnomocněný zástupce pro Evropské společenství
Roztok pro ukončení reakce (Stop Solution)
značka CE
TMB STOP
Před použitím produktu si pozorně přečtěte tento příbalový leták. Při provádění testu důsledně dodržujte stanovený postup. Nedodržení předepsaných instrukcí může vést k nesprávným výsledkům. Tento produkt je kryt U.S. patenty č.: 5532152 5641669, 5698403, 5847088, 5968818, 5981252, 6177257, 7045329, 7416853 a evropskými patenty č.: 658205 a 673426. Další patenty se připravují.
1
a PLAC jsou obchodními známkami firmy diaDexus, Inc., registrované v USA ©
Copyright 2009 diaDexus, Inc. All rights reserved
P/N 30035-03 2009-12-17
URČENÝ ÚČEL POUŽITÍ ®
PLAC Test ELISA Kit je enzymatická imunoassay pro kvantitativní stanovení Lp-PLA2 (lipoproteinassociated phospholipase A2) v lidské plasmě nebo séru. Společně s klinickým hodnocením a stanovením rizika pro pacienta je určen jako pomůcka k predikci rizika koronární srdeční nemoci a ischemické cévní mozkové příhody spojených s aterosklerózou.
SOUHRN A VYSVĚTLENÍ Lp-PLA2 je serinová lipáza nezávislá na kalciu, čímž se odlišuje od jiných fosfolipáz, jako jsou cPLA2 a sPLA2 (2). V lidské plasmě nebo séru je asociovaná s lipoproteiny LDL a v menší míře i s HDL (1). Lp-PLA2 je produkována makrofágy i jinými inflamatorními buňkami a v pokročilých aterosklerotických lézích je exprimována ve vyšších koncentracích než v lézích časnějších stadiích (3,4). Několik nezávislých linií důkazů ukazuje oxidaci LDL jako kritický krok ve vývoji a progresi aterosklerózy (5,6). Lp-PLA2 se podílí na oxidativní modifikaci LDL hydrolýzou oxidovaného fosfatidylcholinu, která generuje lysofosfatidylcholin a oxidované volné mastné kyseliny. Oba typy látek jsou potentní prozánětlivé produkty, které významně přispívají k tvorbě aterosklerotických plátů (7,8,9). Lp-PLA2 ve srovnání s jinými kardiovaskulárními lipidovými márkry, vykázala jen mírnou intra- a inter-individuální variabilitu, která je podstatně menší než u C-reaktivního proteinu (CRP). Navíc, Lp-PLA2 není zvýšena za podmínek systémového zánětu a může být specifičtějším márkrem vaskulární inflamace. Relativně malá biologická variace Lp-PLA2 a specificita ji činí hodnotným márkrem pro detekci a monitorování kardiovaskulárního rizika (10,11). Hladiny Lp-PLA2,naměřené pomocí imunoassay, byly zvýšené u pacientů s angiograficky prokázanou koronární nemocí ve srovnání s věkově odpovídajícími kontrolními osobami (1). V retrospektivní „case-control“ studii (WOSCOPS – West of Scotland Coronary Prevention Study), při použití vzorků hypercholesterolemických mužů (n = 1740), byl rozdíl rizika koronární nemoci mezi nejnižší a nejvyšší z pěti tříd úrovní hladiny Lp-PLA2 až dvojnásobný (12). Navíc se ukázalo, že riziko koronárního onemocnění asociované s Lp-PLA2 je nezávislé na LDL i jiných inflamačních márkrech: C-reaktivním proteinu, na počtu bílých krvinek i na fibrinogenu. V závěru autoři studie konstatují „Zvýšené hladiny lipoprotein-asociované fosfolipázy A2 se ukazují být výrazným rizikovým faktorem pro koronární nemoci. Jde o zjištění, které má implikace pro aterogenezi a hodnocení rizika“. V jiné studii (ARIC – Atherosclerosis Risk in Comunities), ve které bylo po dobu šesti let sledováno 12819 zjevně zdravých mužů a žen středního věku (45 – 64 let), se úroveň Lp-PLA2 ve vzorcích projevila jako důležitý prediktor rizika koronárních nemocí. U jedinců s hladinou LDL nižší než 130 mg/dL, Lp-PLA2 byla signifikantně a nezávisle asociovaná s dvojnásobně vyšším rizikem kardiovaskulárních nemocí, včetně infarktu myokardu, revaskularizace a úmrtí na koronární nemoci (13). Data ze studie ARIC byly opakovaně analyzovány s cílem zjištění rizika mozkové mrtvice spojeného se zvýšenou hladinou Lp-PLA2. Ve skupině studovaných jedinců se objevilo 223 případů mozkové mrtvice, z nich 194 (87%) případů bylo ischemické povahy spojené s aterosklerosou. Poměr ischemických případů k celkovému množství je v souladu s poměrem nalezeným v běžné populaci (14). Výsledky této studie indikují, že Lp-PLA2 byl silným predátorem ischemických případů s více než dvojnásobným rizikem, a to i po adjustaci na krevní tlak, lipidy, diabetes, BMI a další inflamatorní márkery (15).
PRINCIP TESTU PLAC Test ELISA Kit je sendvičová enzymová imunoassay využívající dvou vysoce specifických monoklonálních protilátek, která je určená pro přímé měření koncentrace Lp-PLA2 v lidském séru nebo plasmě. Pevnou fázi systému tvoří monoklonální protilátka anti-Lp-PLA2 (2C10) cílená proti Lp-PLA2 , imobilizovaná v mikrojamkách destičky.
2
Vzorek se přidává do jamek a inkubuje se po dobu 10 minut při 20 -26°C. Druhá anti-Lp-PLA2 monoklonální protilátka (4B4) s navázaným enzymem, křenovou peroxidázou (HRP), se následně přidá a inkubuje se při 20-26°C po dobu 180 min. Výsledkem je zakotvení molekul Lp-PLA2 mezi pevnou fází a enzymem označenými protilátkami. Jamky jsou následně promyty pufrem, který je součástí kitu, aby se odstranily nenavázané antigeny. Po přidání substrátu tetrametylbenzidinu (TMB) a další inkubaci při 20-26°C po dobu 20 minut dochází k tvorbě modrého zbarvení. Vývin barvy je zastaven přidáním roztoku pro ukončení reakce (Stop Solution), který změní barvu na žlutou. Enzymatická změna substrátu je přímo úměrná koncentraci Lp-PLA2 ve vzorku a stanovuje se spektrofotometricky měřením absorbance při 450 nm. Koncentrace Lp-PLA2 ve vzorku se vypočítá na základě kalibrační křivky sestavené pomocí kalibrátorů. Pro monitorování správného průběhu assay jsou přiloženy kontrolní vzorky o dvou úrovních v klinickém rozmezí assay.
REAGENCIE A MATERIÁL Materiál dodaný s kitem (Pro 96 jamek) ČÍSLO SOUČÁSTI
60001
SYMBOL
POPIS SOUČÁSTI KITU
MNOŽSTVÍ
Antibody Coated Plate PLATE
Mikrodestička s jamkami pokrytými protilátkou.
1
Myší monoklonální protilátka anti-Lp-PLA2 (2C10) imobilizovaná na povrchu jamek mikrodestičky
Calibrators
60006 60007
CAL
Kalibrátory (0, 50, 100, 250, 500 a 100 ng/ml) diaDexus rekombinantní Lp-PLA2 antigen (DDXRA) ve stabilizovaném roztoku
60008
1 sada, 0,25 ml každé koncentrace
60009 60010 60011 60002
WASH
20xWash Buffer
20 krát koncentrovaný promývací pufr. Neionický detergent v pufrovaném roztoku 60003
CONJ
Conjugate
Konjugát. Myší monoklonální protilátka anti-LpPLA2 (4B4) konjugovaná s křenovou peroxidázou v pufrovaném roztoku s myšími a bovinními proteiny
60004
TMB
STOP
23 ml
TMB Reagent
3,3´,5,5´-tetrametylbenzidin pufru
60005
50 ml
v
mírně
kyselém
11 ml
Stop Solution
3
Roztok pro ukončení reakce
11 ml
1 N HCl
65009
Control Low (~ 150 ng/ml) CONTROL
LOW
diaDexus rekombinantní Lp-PLA2 antigen (DDXRA v roztoku, pufrovaná proteinová (BSA) matrix
65010
CONTROL
HIGH
0,5 ml
Control Low (~ 350 ng/ml)
diaDexus rekombinantní Lp-PLA2 antigen (DDXRA v roztoku, pufrovaná proteinová (BSA) matrix
Fmd-01026
1 lahvička,
1 lahvička, 0,5 ml
Certificate of Analysis – Control Range
Kontrolní rozsah pro danou šarži je indikován na certifikátu o analýze
1
DALŠÍ POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ KITU -
Přesné jedno- a multikanálové automatické pipety: 0.02, 0.1, 0.2 ml. Jednorázové špičky pro automatické pipety (pro každé přidání různých vzorků nebo reagencií musí být použita nová špička) Vortexový mixer nebo ekvivalent Deionizovaná voda Reader mikrodestiček s šířkou paprsku 10 nm nebo menší a rozsahem optické denzity (OD) 3 nebo více při 450 nm Počítačový software pro výpočet koncentrace analytu z optické denzity a kalibrační křivky (ne nezbytný)
UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ -
-
Použití pro in vitro diagnostiku S krevními vzorky zacházejte jako s potencionálně infekčním materiálem Vystavení vzorků pokojové teplotě musí být minimalizováno na méně než 6 hodin (včetně odběru, krve, zpracování, transportu a doby laboratorní analýzy). Nezahrnuje inkubaci mikrodestičky ELISA Nedoporučuje se skladování vzorků pří -20°C po dobu delší než je 24 hodin Některé součásti kitu jsou označeny bezpečnostními upozorněními. Podívejte se do odstavce Bezpečnostní informace o produktu. S reagenciemi manipulujte dle příslušných předpisů Nepoužívejte reagencie po datu exspirace Nemíchejte reagencie z kitů různých šarží. Pokud zjistíte příznaky kontaminace, nepoužívejte Hemolýza může ovlivnit výsledky. Nepoužívejte hemolyzované vzorky. Doporučuje se používat obě kontroly, vysokou i nízkou, v každém běhu. Pokud kontrolní hodnoty nejsou v akceptovatelných hranicích, opakujte assay. Lokální nebo státní předpisy mohou stanovit dodatečné kontroly kvality. K zamezení chybných výsledků je nezbytné skladování materiálu podle předpisu. Poskytnuté rozmezí kontrol bylo odvozeno z opakovaných testů specifických kontrolních šarží za použití PLAC Test ELISA kitů a musí být použito podle předpisu. Individuální laboratorní 4
průměry se mohou lišit od stanovených hodnot. Variace mezi laboratořemi může být způsobeno technickými rozdíly nebo variabilitou reagencií. Doporučuje se, aby si každá laboratoř stanovila své vlastní akceptovatelné rozmezí.
PŘÍPRAVA A SKLADOVÁNÍ REAGENCIÍ Reagencie jsou dodávány přímo k použití. Skladujte reagencie dle návodu při 2-8°C. Neotevřené reagencie jsou stabilní až do uvedeného data exspirace pokud jsou skladovány při 2-8°C. Testování na jednotlivých analyzátorech pro klinickou chemii indikovalo, že reagencie uskladněné v chlazené části analyzátoru by měly být stabilní po dobu 2 týdnů. Informace specifické pro váš analyzátor si prosím najděte na odpovídajících aplikačních listech pro jednotlivé analyzátory pro klinickou biochemii.
ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ -
Pacient nemusí být před odběrem vzorků nalačno
-
Krevní vzorky odebírejte do: o zkumavek s gelem pro separaci séra nebo plasmy o zkumavek pro uchovávání plasmy s EDTA nebo heparinem o jakýchkoliv zkumavek pro uchovávání séra
-
Vzorky krve zpracovávejte standardními separačními postupy o vzorky musí být centrifugovány a separovány během čtyř hodin od odběru jak doporučuje správná laboratorní praxe, ale ne později než 36 hodin od odběru. Vzorky musí být skladovány chlazené (2-8°C)
-
Nezpracované krevní vzorky o Uskladněte a transportujte na chladících vložkách (2-8°C) a zpracujte do 36 hodin od odběru.
-
Zpracované vzorky: Je několik možností, jak se zpracovanými vzorky manipulovat a jak je skladovat. Vyberte si ten, který nejvíce vyhovuje provozu vaší laboratoře. o
o
Postup ♯1: Převážejte a skladujte vzorky při 2-8°C Testování lze zahájit až poté, co vzorky byly uloženy v chladu při 2-8°C, minimálně po dobu tří dnů od odběru. Vzorky mohou být testovány mezi třetím a desátým dnem od odběru (pokud jsou skladovány při 2-8°C). Příklad: vzorky odebrané v pondělí mohou být testovány kterýkoliv den od čtvrtka po další čtvrtek v následujícím týdnu, pokud jsou skladovány při 2-8°C. Den 0
Den 1-2
Den 3-10
Den 11
Den odběru vzorků Uložení při 2-8°C
NETESTOVAT
TESTOVÁNÍ JE MOŽNÉ
NETESTOVAT
Postup ♯2: Transportujte vzorky při 2-8°C. Zmrazte vzorky při nebo pod -20°C, minimálně na dobu 16 až 24 hodin. Vzorky mohou být zamrazeny při nebo pod -20°C po dobu minimálně 16 hodin, až do 24 hodin, kdykoliv v průběhu 3 dnů (≤ 72 hod.) od odběru. Vzorky neskladujte při -20°C déle než 24 hodin Vzorky mohou být testovány ihned po rozmrazení, ale ne déle než 10 dnů poté, co je vzorek odebrán a skladován při 2-8°C.
Den 0
Den 0-3
Den 1-10
Den 11
5
Den odběru vzorků NETESTOVAT
o
o
Zamrazit po dobu 16-24 hodin; poté rozmrazit a skladovat při 28°C
TESTOVÁNÍ JE MOŽNÉ po cyklu ZMRAZENÍ/ROZMRAZENÍ
NETESTOVAT
Postup ♯3: Transport zmrazených vzorků (na suchém ledu) Vzorky mohou být zamrazeny na suchém ledu 16 až 24 hodin. Vzorky mohou být testovány po rozmrazení až do desátého dne od odběru, pokud jsou skladovány při 2-8°C.
Den 0
Den 1
Den 2-10
Den 11
Den odběru vzorků Zmrazit během transportu (16-24 hodin)
Rozmrazit a skladovat při 2-8°C TESTOVÁNÍ JE MOŽNÉ
TESTOVÁNÍ JE MOŽNÉ
NETESTOVAT
Postup ♯4: Pro dlouhodobější skladování zamrazit vzorky při -70°C nebo nižší teplotě Vzorky musí být zamrazeny při nebo pod -70°C minimálně po dobu 16 hodin. Vzorky mohou být testovány ihned po rozmrazení, ale až po minimálně 16 hodinách zamrazení při -70°C. Jednou rozmrazené vzorky mohou být testovány v průběhu 7 dnů, pokud jsou uloženy při 2-8°C. Vzorky mohou být zamrazené při -70°C nebo méně a následně dvakrát rozmrazeny bez ovlivnění kvantifikace Lp-PLA2.
TESTOVÁNÍ Kalibrace Test musí být kalibrován s použitím úplné (pětibodové) kalibrační křivky ( REF 90108 nebo 10-0108). Standardní křivka se generuje s použitím odpovídajícího modelu křivky indikovaném v Aplikačním listě. Podle požadavků laboratoře verifikujte kalibrační křivku alespoň se dvěma hladinami kontrolních vzorků. Opakujte kalibraci a proveďte měření kontrolních vzorků pro každou novou šarži reagencií. Pokud se hodnoty kontrolních vzorků pohybují mimo laboratoří akceptovaný rámec hodnot, proveďte rekalibraci.
Kontrola kvality REF 90109 nebo 10-0109) Proveďte měření alespoň dvou kontrolních vzorků různé úrovně ( minimálně jednou každý den provádění testů. Provádějte kontrolní měření po každé kalibraci. Doporučuje se do každého běhu testování vzorků zařadit kontroly s vysokou (High Control) a nízkou (Low Control) hladinou Lp-PLA2. Pokud nejsou kontrolní hodnoty v akceptovatelném rozmezí, testování opakujte. Další kontroly kvality mohou být vyžadovány místními, státními nebo akreditačními předpisy.
Postup testování Testování vzorků pomocí PLAC Testu musí být prováděno na správně nastaveném analyzátoru. Podrobné instrukce a nastavení pro jednotlivé analyzátory lze nalézt v odpovídajícím aplikačním listu. Zde je popsán běžný postup pro analyzátor Hitachi 917. 1. 6µl vzorku přidat do reakční kyvety a naředit jej 185 µl pufru 2. Inkubovat vzorek s reagencií
R1
R1 .
pět minut při 37°C. 6
3. Do reakční kyvety přidat 60µl reagencie
R2 .
4. Kontinuálně měřit absorbanci při 570 nm po dobu 5 minut.
R2 5. Rozdíl v absorbanci, začínající přidáním reagencie do konce měření, se použije pro výpočet koncentrace Lp-PLA2 interpolací ke standardní křivce.
Nastavení klinického analyzátoru Hitachi 917 Kód testu Čas testu Testovací bod Objem vzorku Reagencie T1 Reagencie T3 Vlnová délka Metoda kalibrace Rozsah měření Reportovaný rozsah vzorku pacienta
2 point end 10 minut 18 až 34 6µl 185 µl reagencie R1 (pozice R1) 60 µl reagencie R2 (pozice R2) 1° 570 nm, 2° 800 nm Spline 5 bodů 0 – 500 ng/ml 7-360 ng/ml
POZNÁMKY K POSTUPU -
-
Doporučujeme, aby si každá laboratoř stanovila frekvenci kalibrací. Nová kalibrační křivka by měla být vytvořena pokaždé, kdy dojde ke změně šarže nebo pokud hodnoty kontrolních vzorků přesáhnou akceptovatelnou míru. V případě, že vzorky byly zamrazeny, ponechejte je roztát při 2-8°C nebo na ledu. Pokud koncentrace Lp-PLA2 ve vzorku přesáhne hodnotu 360 ng/ml nereportujte výsledky pacienta a neřeďte vzorek kvůli tomu, aby bylo možné výsledek reportovat. Nezaměňujte víčka reagenčních roztoků, mohlo by dojít ke kontaminaci.
PŘÍKLAD KALIBRAČNÍ KŘIVKY Výsledky typické standardní kalibrační křivky odečtu absorbance při 570 nm na analyzátoru Hitachi 917 jsou zobrazeny na ose y proti koncentraci Lp-PLA2 (ng/ml) na ose x. Uvedená kalibrační křivka slouží pouze k ilustraci. Standardní kalibrační křivku si musíte vytvořit v laboratoři. Lp-PLA2 (ng/ml)
Absorbance 4 (∆abs x 10 )
0
1
50
113
100
246
250
692
500
1306
7
OMEZENÍ Procedura -
-
Odpovídající a reprodukovatelné výsledky budou získány pokud testování bude prováděno s úplným pochopením instrukcí příbalového letáku a dodržováním správné laboratorní praxe. Jako i u jiných systémů imunoassay, obzvláště těch, které využívají myších monoklonálních protilátek, existuje možnost interference s lidskými protilátkami proti myším proteinům (HAMA) nebo může docházet k jiným heterofilním interferencím ve vzorku, které mohou falešně zvyšovat nebo snižovat hodnoty. Jako v případě každé jiné analytické procedury existuje možnost, že netestované látky nebo faktory (např. technické nebo procedurální) mohou interferovat s testem a vést k nesprávným výsledkům. Výsledky musí být zvažovány ve spojení s jinými klinickými a analytickými metodami.
Klinická interpretace -
Hladiny Lp-PLA2 musí být interpretovány ve spojení s klinickým nálezem a jinými diagnostickými testy. Tento test nenahrazuje krevní test na cholesterol nebo jiné tradiční rizikové faktory identifikované pro koronární onemocnění srdce nebo ischemickou cévní příhodu.
OČEKÁVANÉ HODNOTY Vzorky odebrané zjevně zdravým mužům (n=251) a zjevně zdravým ženám (n=174) v klinicky relevantním věkovém rozmezí od 40 do 70 let byly vyhodnoceny pomocí PLAC Testu firmy diaDexus. Referenční populace byla reprezentována následujícím etnickým složením: afro-američané n=26, kavkazský typ n=390, hispánci n=8 a nespecifikový typ n=1. Distribuce hodnot Lp-PLA2 v uvedené populaci a rozdělené podle pohlaví jsou znázorněny v následující tabulce:
Lp-PLA2 ng/ml Percentily
Všichni (n=425)
Ženy (n=174)
Muži (n=251)
5
126
120
131
20
174
169
179
33
201
188
205
8
50
235
228
244
67
262
252
268
80
289
285
293
95
369
342
376
Tyto referenční rozsahy jsou uváděny pouze jako doporučení a není účelem je používat jako „kritické hodnoty“ nebo rozhodovací medicínské limity. Každá laboratoř si musí stanovit vlastní referenční interval. Návod pro ustavení referenčních intervalů je možné nalézt v CLSI Standard C28-A2 (How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved guideline – Second Edition). Na základě mediánu koncentrace Lp-PLA2 v populaci bylo navrženo použít jeho hodnoty 235 ng/ml jako hranici pro klinická rozhodnutí (16). Později se panel expertů, na základě významného množství publikované literatury věnované hodnocení rizika pomocí Lp-PLA2, shodnul na doporučení používat pro klinická rozhodnutí hodnoty 200 ng/ml (17).
PROVOZNÍ PARAMETRY Provozní parametry byly nastaveny použitím analyzátoru Hitachi 917, reprezentativního analyzátoru pro klinickou chemii. Testovaný rozsah byl v rozmezí od 7 do 500 ng/ml. Současný rozsah pro reportování pacientských výsledků je od 7 do 360 ng/ml.
Senzitivita Klinická senzitivita testu je 7 ng/ml. Byla stanovena limitem kvantifikace (nejnižší koncentrací s akceptovatelnou přesností). Analytická senzitivita testu je 4 ng/ml. Byla vypočítána extrapolací ze standardní křivky a z průměru a dvou standardních odchylek dvaceti opakování měření nulového kalibrátoru Lp-PLA2 0 ng/ml.
Přesnost testu Variabilita v rámci souboru měření (intra-assay) a mezi soubory měření (inter-assay) byla stanovena testováním vzorku lidského séra dvou kontrol s koncentracemi Lp-PLA2 distribuovanými v rozsahu celého kalibračního spektra. Vzorky byly testovány v duplikátech, jsou uvedeny v následující tabulce a slouží jako reprezentativní výsledky testů: Průměrná koncentrace LpPLA2 (ng/ml)
Intra-assay %CV n=80
Inter-assay %CV n=20
Celkem %CV N=80
Sérum
68,5
2,4
2,1
3,2
Kontrola 1
143.9
2,0
1,6
2,5
Kontrola 2
449,8
1,6
0,8
1,8
Vzorek
Linearita Pro stanovení linearity bylo připraveno šest párů ředících řad vzorků séra se známými, vysokými a nízkými hladinami Lp-PLA2. Stanovením poměru naměřených a očekávaných hodnot, násobených stem bylo u kombinovaných vzorků určeno procento výtěžnosti. Průměrná výtěžnost 97% demonstruje linearitu naředěných vzorků v rozmezí od 0 do 472 ng/ml Lp-PLA2. Současný rozsah reportovatelných pacientských vzorků je od 7 do 360 ng/ml. Interferující látky Byla vyhodnocena míra interference endogenních látek vyskytujících se v krvi a některých exogenních látek (běžné léky). Tři individuální vzorky séra s hodnotami Lp-PLA2 v rozmezí od 160 do 470 ng/ml byly doplněny o potenciální interferující látky. Nebyla pozorována žádná významná interference s testem u následujících látek v uvedených hodnotách dodaných do vzorků. 9
ENDOGENNÍ Potenciální interferent Testovaná koncentrace
EXOGENNÍ Potenciální interferent Testovaná koncentrace
Bilirubin
20 mg/dl
Acetaminophen
1,66 µmol/l
Cholesterol*
500 mg/dl
Aspirin
3330 µmol/l
Hemoglobin
500 mg/dl
Atorvastatin
20 µmol/l
Triglyceridy
3000 mg/dl
Clopidogrel bisulfát
100 µmol/l
Diphenylhydramin
19,6 µmol/l
Fenofibrát
125 µmol/l
*Humánní lipidy
Lisinopril
0,74 µmol/l
** 5 g/dl albuminu bylo přidáno do plasmy s předpokládaným množstvím albuminu 4g/dl
Metformin
310 µmol/l
Niacin
4800 µmol/l
Pravastatin
100 µmol/l
Tolbutamin
2400 µmol/l
Vitamin C
227 µmol/l
Warfarin
64,9 µmol/l
Celkový albumin**
Cca 9000 mg/dl
Až do koncentrace 1500 ng/ml nebyl pozorován žádný „hook effect“
Srovnání metod Byly prováděny srovnávací studie mezi PLAC Test turbidimetrickým imunoassay a mikrodestičkovou metodu PLAC Test ELISA. Testovány byly vzorky lidského séra s koncentrací Lp-PLA2 v rozmezí od 0 do 499 ng/ml. Níže jsou uvedeny výsledky regresní analýzy. Lineární regrese Sklon = 1.02 γ-intercept = - 24,5 Korelační koeficient r=0,93 Počet vzorků = 794
KLINICKÉ STUDIE Koronární onemocnění Pro stanovení účinnosti PLAC Test (diaDexus) jako prediktoru rizika koronárního onemocnění (KO), byly změřeny hladiny Lp-PLA2 v 1348 vzorcích plasmy uložených v bance, z velké, multicentrické, epidemiologické studie „The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC), sponzorované národními zdravotními institucemi. Po dobu 6-8 let byl u účastníků sledován výskyt KO. Vzorky použité pro testováním PLAC Test byly odebrány účastníkům studie ve věkovém rozmezí 47 až 69 let, kteří v době odběru nejevili žádné známky KO. Šlo o kohortovou studii, kde všechny vzorky pacientů s KO (607) byly testovány společně se vzorky od 741 vhodně spárovaných účastníků, kteří v okamžiku kontroly byli zdraví*. Pro vyhodnocení asociace KO a Lp-PLA2 byl použit Coxův regresní model v univariantní analýze (model 1), v univariantní analýze adjustované na demografii (model 2) a v multivariantním modelu adjustovaném na demografické a další prognostické faktory (model 3). Použitím vysoké a nízké mezní hodnoty Lp-PLA2 mezi tercily, vygenerovanými na základě údajů ze studie ARIC (420 a 310 ng/ml, 67. respektive 33. percentil), poměry rizik z Coxovy regresní analýzy ukázaly, že Lp-PLA2 je u všech účastníků signifikantním prediktorem rizika KO pro střední a nejvyšší hladiny, pokud se srovnají s nejnižší úrovní Lp-PLA2 (Tab. 1). Je nutné poznamenat, že pro různé klinické populace mohou být vhodné jiné mezní hodnoty. *POZNÁMKA: 86 výsledků (5,5%) bylo mimo přijatelná kritéria měření a byly vyřazeny z analýzy.
Tabulka 1. Rizikové poměry pro KO u subjektů se všemi hladinami LDL
10
Poměr rizik Lp-PLA2 (95% CI, hodnota p)* Lp-PLA2 Počet KO/celkový počet subjektů v kategorii
1.tercila
2.tercila
3.tercila
127/366 (34,7%)
199/444 (43,2%)
288/538 (53,5%)
Model 1
1,0
1,49 (1,11 až 1,99, p=0,008)
2,5 (1,89 až 3,31, p<0,001)
Model 2
1,0
1,24 (0,92 až 1,66, p=0,154)
1,76 (1,32 až 2,36, p<0,001)
Model 3
1,0
1,71 (1,06 až 2,75, p=0,029)
2,12 (1,29 až 3,48, p<0,003)
*Jako referenční skupina byla použita nejnižší tercila s hodnotami Lp-PLA2 <360ng/ml Model 1: univariantní analýza Model 2: adjustováno na věk, rasu a pohlaví Model 3:Model 2 + adjustace na diabetes, LDL, HDL, tlak, kouření BMI a CRP a Lp-PLA2 – LDL interakce
Byla zjištěna statistická interakce mezi Lp-PLA2 a LDL. Z tohoto důvodu bylo vhodné zhodnotit poměr rizik Lp-PLA2 v podskupinách s vysokým a nízkým LDL. Medián pro LDL v kohortové populaci byl 130 mg/dl. To definovalo podskupiny s vysokou a nízkou hodnotou LDL. Tabulky 2a a 2b představují univariantní analýzu poměrů rizik v těchto podskupinách. Poměr rizik byl vypočítán z Cox –regrese s využitím vážené „case-cohort“ metody s Barlowovou adjustací, n=1348. Tabulka 2a. Poměr rizik pro KO u subjektů s LDL <130 mg/dl Lp-PLA2 poměr rizika (95% CI)* Lp-PLA2 **
Tercila 1
Tercila 2
Tercila 3
Poměr rizik
1,0
2,17 (1,41 – 3,36)
3,52 (2,25-5,49)
51/215 (23,7%)
75/195 (38,5%)
77/163 (47,2%)
Počet případů KO/celkový počet subjektů v kategorii
*Jako referenční skupina byla použita nejnižsí tercila s Lp-PLA2 hodnotami <310 ng/ml ** Mezní hodnoty tercil Lp-PLA2 založeny na populační studii ARIC v plném rozsahu hladin LDL
Tabulka 2b. Poměr rizik pro KO u subjektů s LDL ≥130 mg/dl Lp-PLA2 poměr rizika (95% CI)* Lp-PLA2 **
Tercila 1
Tercila 2
Tercila 3
Poměr rizik
3,15 (2,08 – 4,77)
3,66 (2,43 – 5,51)
5,10 (3,43/7,57)
110/234 (47,0%)
126/247 (51,0%)
169/294 (57,5%)
Počet případů KO/celkový počet subjektů v kategorii
*Jako referenční skupina byla použita nejnižsí tercila s Lp-PLA2 hodnotami <310 ng/ml ** Mezní hodnoty tercil Lp-PLA2 založeny na populační studii ARIC v plném rozsahu hladin LDL
V podskupině s vysokým LDL, byly specifické mezní hodnoty pro tercily na hodnotách 350 a 460 ng/ml; poměr rizik se zvýšoval s vyšší hodnotou Lp-PLA2. Z toho vyplývá, že u jedinců s vyšší hladinou LDL by měla být zvážena o vyšší mezní hodnota. Z toho také vyplývá potřeba dalšího výzkumu pro hodnocení interakcí mezi Lp-PLA2 a LDL u podskupiny jedinců s vysokým LDL. V celé populaci byl Lp-PLA2 významným prediktorem rizika pro KO pro střední a vysokou skupinu porovnávanou s referenční skupinou s nízkou úrovní Lp-PLA2.
11
Cévní mozková příhoda (CMP) Ve studii ARIC byly hodnoceny hladiny Lp-PLA2 pro zjištění, zda lze Lp-PLA2 využít jako prediktoru rizika pro CMP. Ve studované skupině bylo identifikováno 223 případů CMP; podle klasifikace výzkumného týmu projektu ARIC, bylo 194 (87%) ischemického původu spojených s aterosklerózou. Byla sestavena podobná „case-kohortová“ studie, kde vzorky ze všech dostupných případů CMP (194) byly testovány společně s 762 přibližně odpovídajícími účastníky bez KO nebo CMP v čase kontroly. Podobně jako ve studii pro stanovení rizika KO, pro hodnocení spojení Lp-PLA2 a CMP byl použit Coxův regresní model v univariantní analýze (Model 1), univariantní analýze adjustované na demografická data (Model 2), multivariantní model adjustovaný na demografii a další prognostické faktory (Model 3) a všechny faktory včetně KO (Model 4). Stejně jako u dřívějších analýz byly na studii aplikovány stejné mezní hodnoty tercil (420 a 310 ng/ml, šedesátá sedmá respektive třiatřicátá percentile). Samotný status KO byl v plně adjustovaném modelu shledán prediktorem rizika s poměrem rizik 2,26 . Poměry rizik Coxovy regresní analýzy prokázaly, že Lp-PLA2 byl signifikantním a nezávislým prediktorem rizika pro ischemickou CMP v tercile s nejvyšší hladinou, pokud se porovnávala s tercilí s nejnižší hladinou. Pro všechny účastníky studie bylo toto zvýšení rizika téměř dvojnásobně, dokonce i po adjustaci na diabetes, lipidy, krevní tlak, kouření, BMI, další zánětlivé márkery a status KO (viz. Tabulka 3). Tabulka 3. Poměry rizik ischemických CMP pro všechny subjekty
Poměr rizik Lp-PLA2 (95% CI, hodnota p)* Lp-PLA2 Počet iCMP/celkový počet subjektů
1.tercila
2.tercila
3.tercila
47/283 (16,6%)
44/305 (14,4%)
103/368 (28,0%)
Model 1
1,0
0,85 (0,57 až 1,29, p=0,45)
1,79 (1,27 až 2,52, p<0,001)
Model 2
1,0
0,89 (0,59 až 1,35, p=0,58)
2,09 (1,46 až 3,01, p<0,0001)
Model 3
1,0
0,89 (0,58 až 1,36, p=0,59)
1,81 (1,22 až 2,69, p<0,0034)
Model 4
1,0
0,86 (0,56 až 1,31, p=0,48)
1,75 (1,18 až 2,60, p<0,0057)
*Jako referenční skupina byla použita nejnižší tercila s hodnotami Lp-PLA2 <360ng/ml Model 1: univariantní analýza Model 2: adjustováno na věk, rasu a pohlaví Model 3:Model 2 + adjustace na diabetes, LDL, HDL, tlak, kouření BMI a CRP Model 4: Model 3 + adjustace na KO
Byly prováděny další analýzy s cílem zjistit, zda Lp-PLA2 je prediktivním márkerem pro cévní mozkové příhody v populaci pro všechny úrovně systolického krevního tlaku a zda systolický krevní tlak a LpPLA2 jsou při vyhodnocování rizika CMP aditivní. Mezní hodnoty tercil pro systolický krevní tlak byly stanoveny pro třicátou třetí a šedesátou sedmou percentili populace (113 resp. 130 mm Hg). Studovaná populace byla rozdělena do tercil s nízkým, středním a vysokým tlakem a podle Lp-PLA2 na skupinu s nízkou nebo vysokou hodnotou (pod nebo nad mediánem hodnot Lp-PLA2 ze studie ARIC, 377 ng/ml). Relativní riziko každé skupiny bylo porovnáno s rizikem případů CMP v kategorii s první tercilí krevního tlaku a s nízkou hladinou Lp-PLA2 , pod mediánem studie (Tabulka 4). Tabulka 4. Poměry rizik CMP: Aditivní efekt Lp-PLA2 a systolického krevního tlaku. Lp-PLA2 Pod mediánem
Nad mediánem
12
Systolický krevní tlak (mm Hg)
Počet CMP/počet subjektů v kategorii
68/478 (14,2%)
126/478 (26,4%)
<113
29/270 (10,7%)
1,00
2,29 (p=0,03)
113 a6 130
60/337 (17,8%)
2,05 (p=0,06)
3,53 (p=0,0004)
>130
105/349 (30,1%)
3,52 (p=0,0005)
6,75 (p<0.0001)
Jedinci s koncentrací Lp-PLA2 nad mediánem ve studii ARIC a ve třetí tercile systolického krevního tlaku (<130 mm Hg), měli ve srovnání s jedinci pod mediánem Lp-PLA2 a nízké tercile krevního tlaku poměr rizika 6,75 (p <0,0001). Tyto výsledky ukazují, že ve schopnosti předpovídat riziko CMP mají systolický krevní tlak a Lp-PLA2 aditivní efekt, a že jedinci v nejvyšší skupině obou proměnných mají také nejvyšší (6,75x) riziko CMP spojených s aterosklerózou.
BEZPEČNOSTNÍ INFORMACE O PRODUKTU
R36 S24/25-26-46 R36 S24 S25 S26 S46
Dráždí oči Vyhnout se kontaktu s kůží Vyhnout se kontaktu s očima V případě kontaktu s okem, vymýt velkým množstvím vody a vyhledat lékařskou pomoc Pokud se dostane do trávícího ústrojí, ihned vyhledat lékařskou pomoc a ukázat tuto značku nebo obal
REFERENCE [1] Caslake MJ, Packard CJ, et al. (2000). Atherosclerosis 150: 413-9. [2] Kudo I and Murakami M. (2002). Prostaglandins Other Lipid Mediat 68-69: 3-58. [3] Hakkinen T, Luoma JS, et al. (1999). Arterioscler Thromb Vasc Biol 19: 2909-17. [4] Kolodgie FD, Burke AP, et al. (2006). Arterioscler Thromb Vasc Biol 26: 2523-9. [5] Chisolm GM and Steinberg D. (2000). Free Radical Biol Med 28: 1815-26. [6] Witztum JL. (1994). Lancet 344: 793-5. [7] Macphee CH, Moores KE, et al. (1999). Biochem J 338: 479-87. [8] Macphee CH. (2001). Curr Opin Pharmacol 1: 121-5. [9] Macphee CH and Suckling KE. (2002). Expert Opin Ther Targets 6: 309-14. [10] Wolfert RL, Kim NW, et al. (2004). Circulation 110: Suppl 3: 309. [11] Lerman A and McConnell JP (2008). Am J Cardiol 101 (Suppl): 11F-22F. [12] Packard CJ, O’Reilly DS, et al. (2000). N Engl J Med 343: 1148-55. [13] Ballantyne CM, Hoogeveen RC, et al. (2004). Circulation 109: 837-842. [14] Heart Disease and Stroke Statistics – 2006 Update, American Heart Association. [15] Ballantyne CM, Hoogeveen RC, et al. (2005). Arch Intern Med 165: 2479-84. [16] Lanman RB, Wolfert RL, et al. (2006). Prev Cardiol 9(3):138-43. [17] Davidson MH, Corson MA, et al. (2008). Am J Cardiol 101 (Suppl): 51F-57F.
13
