Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU – ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA E. coli
plasmidová DNA
chromosomální DNA
proteiny +
lyze buňky pH 12< (denaturace)
+
snížení pH (renaturace)
proteiny + vysrážená chromosomální DNA +
plasmidová DNA
centrifugace
chromosomální DNA + buněčné zbytky membrána
supernatant bakteriálního lyzátu
vazba DNA
RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ
promývání
eluce DNA
GELOVÁ ELEKTROFORÉZA neštěpený štěpený vzorek vzorek
restrikční místo
OC
štěpení DNA restrikčním enzymem
čistá plasmidová DNA
L
CCC
© ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Příprava inzertu IZOLACE ROSTLINNÉ DNA
PCR – amplifikace DNA 5´ 3´
primer F
3´ 5´
DNA lokus primer R
Taq polymeráza
lyze homogenizace
dsDNA
denaturace 92–96 °C
A
annealing 45–72 °C
primer F
DNA lokus
primer R
A A
A
kolonková izolace DNA
extenze 72 °C
A
A
A
A
PCR produkt (dsDNA)
IZOLACE AMPLIKONU Z GELU
separace amplikonů: gelová elektroforéza
vyříznutí vybraného amplikonu z gelu
kolonková izolace DNA © ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
TA klonování a transformace bakterií TRANSFORMACE TEPELNÝM ŠOKEM
LIGACE – TA klonování A A
lacZ gen
fragment DNA
ligáza/ topoizomeráza I
vektor
E. coli
CaCl2 + teplotní šok 4 °C/5 min. 42 °C/30 s 4 °C/2 min.
molekula rekombinantní DNA Ca2+
-
Ca2+
- Ca
-
-
Ca2+
2+
gen antibiotické rezistence
-
- transport plasmidu do hostitelské buňky
neúspěšná transformace
transformace plasmidu s inzertem
selekce buněk: růst v přítomnosti antibiotika
transformace plasmidu bez inzertu
detekce inzertu na základě modro-bílého testu
© ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Modro-bílý test (A) Vektor bez vloženého inzertu promotor RNA-polymeráza
operátor
klonovací místo (MCS = multiple cloning site) lacZ
kultivace na LB médiu s ampicilinem, X-gal, IPTG
další geny
represor
mRNA
β-galaktosidáza IPTG
buňky s plasmidem bez inzertu
X-Gal
(B) Vektor s vloženým inzertem promotor RNA-polymeráza
operátor represor
klonovací místo narušení exprese β-galaktosidázy lacZ
další geny
buňky s plasmidem s inzertem
vložený inzert mRNA
β-galaktosidáza IPTG X-Gal
inzert, který nenarušuje čtecí rámec © ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Imunodetekce proteinů PŘÍPRAVA VZORKU -S-S-
redukční činidlo (např. β-merkaptoethanol, dithiotreitol)
HS-SH
SDS
-
-
buňky, tkáně
-
lyze
tepelná denaturace v přítomnosti SDS
-
SDS-PAGE
TRANSFER PROTEINŮ NA MEMBRÁNU
IMUNODETEKCE
enzym
primární protilátka rozeznává protein filtrační papír rozdělené proteiny
gel membrána filtrační papír
enzymem značená sekundární protilátka rozeznává primární protilátku
substrát
produkt
chemiluminiscence © ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Příprava rekombinantního proteinu příprava vektoru E. coli
příprava inzertu restrikční endonukleáza
izolace vektoru
vektor/ plasmid
lyze homogenizace
selekční znak
ligace
kolonková izolace RNA
cDNA
vektor/ plasmid
cDNA
izolovaná RNA reverzně transkripční PCR
transformace E. coli
regenerace, selekce transformantů
izolace proteinů
detekce proteinů
© ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Transgenní zvířata injekce cizorodé DNA do jednoho z projader projádra
fertilizovaný myší oocyt před fúzí samčího a samičího projádra přenos injikovaných oocytů do pěstounských matek
přibližně 10–30 % potomstva obsahuje injikovanou cizorodou DNA
cizorodá DNA je přítomna ve stejném množství ve všech tkáních
myši, které exprimují cizorodou DNA jsou rozmnožovány a tak se rekombinantní DNA přenáší v zárodečné linii
© ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Knockoutované myši injekce embryonálních zárodečný buněk do dutiny blastocoelu časného embrya
chirurgický přenos embrya do pseudopregnantní myši
chimérické potomstvo homozygotní bílé potomstvo
křížení chimérické myši s myší homozygotní
černé potomstvo, které vzniklo z linie pohlavních buněk odvozených z embryonálních zárodečných buněk a je heterozygotní v poškozeném genu X © ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Formy buněčné smrti
preautofagozomální struktura svraštění buňky a rozpad cytoskeletu lysozóm
pyknóza chromatinu autofágní měchýřky lyze buňky
autolysozóm
fragmentace buňky a jádra
NEKRÓZA
apoptotická tělíska
APOPTÓZA
autolysozóm
AUTOFÁGIE © ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Apoptóza při vývoji mnohobuněčných organismů Vyřezání buněk
Odstranění struktur
Odstranění nebezpečných nebo poškozených buněk
Nastavení počtu buněk
© ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Molekulární signalizace v buňce přímým kontaktem
endokrinní
dutým spojem
synaptická
parakrinní
krevní řečiště
autokrinní: jedna signální buňka
autokrinní: skupina signálních buněk
© ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Southernův přenos (A) Přenos DNA z gelu na membránu DNA standard
štěpená DNA
filtrační papír nylonová membrána gel
pufr
nylonová membrána
agarózový gel
podložka
(B) Hybridizace DNA sonda
hybridizační pruhy nylonová membrána
autoradiograf © ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Modely replikace podle Meselson-Stahlova experimentu původní (rodičovské) molekuly DNA
konzervativní
disperzní
semikonzervativní původní DNA
nové (dceřiné) molekuly DNA
nová DNA
15 ( N)
14 ( N)
reálný výsledek
očekávané centrifugační zóny
1 zóna
druhá generace molekul DNA
očekávané centrifugační zóny
2 zóny
© ÚMBFB FaF VFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
