MAKROMOLEKULÁRIS GYÓGYSZERHORDOZÓ, KONJUGÁTUMAI ÉS MULTIDROG REZISZTENCIA ELLENES PEPTIDEK VIZSGÁLATA NAGY HATÉKONYSÁGÚ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREKKEL PHD. ÉRTEKEZÉS
Győrffy Erika
Témavezető:
Prof. Dr. Kéri György
Programvezető:
Prof. Dr. Mandl József
Budapest, 2002. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola
Tudományági Doktori Iskola: Molekuláris Orvostudományok Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet
Szigorlati Bizottság:
Dr. Staub Mária Dr. Mészáros György Dr. Dibó Gábor
Hivatalos Bírálók:
Dr. Kremmer Tibor Dr. Csermely Péter
1
TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÓ ............................................................................................................................i Summary ......................................................................................................................................... ii Rövidítések jegyzéke...................................................................................................................... iii I. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................................1 I.1. AZ ALKALMAZOTT ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ISMERTETÉSE...3 I.1.1. kapilláris elektroforézis (CE = Capillary Electrophoresis).............................................3 I.1.2. Nagy nyomású folyadékkromatográfia (HPLC = High Pressure / Performance Liquid Chromatography) ...................................................................................................................30 I.1.3. Gélszűrő kromatográfia (GPC = Gel Permeation Chromatography)............................33 I.2. A VIZSGÁLT VEGYÜLETCSOPORTOK ISMERTETÉSE ............................................34 I.2.1. Makromolekuláris hordozók jelentősége a modern gyógyszertervezésben..................34 I.2.2. Tirozin kinázok és tirozin kináz inhibitorok.................................................................37 I.2.3. Multidrog rezisztencia és multidrog rezisztencia ellenes hatóanyagok ........................39 II. CÉLKITŰZÉSEK......................................................................................................................44 III. KÍSÉRLETI RENDSZER ........................................................................................................45 III.1. Anyagok és eszközök ........................................................................................................45 III.1.1. Vegyszerek .................................................................................................................45 III.1.2. Vizsgált anyagok ........................................................................................................46 III.1.3. Eszközök ....................................................................................................................49 III.1.4. Pufferek ......................................................................................................................50 III.2. Az alkalmazott vizsgálati módszerek leírása.....................................................................52 III.2.1. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumai vizsgálata .......................52 III.2.2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidekkel végzett vizsgálatok.............................54 III.2.3. A k” módosított retenciós faktor jellemzése ..............................................................56 IV. EREDMÉNYEK ......................................................................................................................58 IV.1. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumai vizsgálati eredményei ...........58 IV.1.1. A szabad zónás kapilláris elektroforézissel végzett vizsgálatok eredményei (II)......58 IV.1.2. A micelláris elektrokinetikus kromatográfiával végzett vizsgálatok eredményei (II) ................................................................................................................................................66 IV.1.3. A gélkromatográfiás vizsgálatok eredményei (I).......................................................72 IV.1.4. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) titrálási görbéje (II) ...................................80 IV.2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidek vizsgálati eredményei ....................................81 IV.2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidek vizsgálati eredményei ....................................82 IV.2.1. A micelláris elektrokinetikus kromatogáfiával végzett vizsgálatok eredményei (III) ................................................................................................................................................82 IV.2.2. A fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatok eredményei (III) .........................................................................................................................................86 IV.3. A k” módosított retenciós faktor jellemzése .....................................................................90 IV.3.1. A homológ sorok k” módosított retenciós faktorainak jellemzése (IV) ....................90 IV.3.2. A hidrofób peptidek k” módosított retenciós faktorainak jellemzése (IV) ................97 IV.3.2. A hidrofób peptidek k” módosított retenciós faktorainak jellemzése (IV) ................98 V. AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ...............................................................................105 V.1. A polimer gyógyszerhordozó és konjugátumai vizsgálata (I, II) .....................................105 V.2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidek vizsgálata (III) ...............................................106 V.3. A k” módosított retenciós faktor jellemzése (IV) ............................................................108 2
VI. KÖVETKEZTETÉSEK .........................................................................................................110 VII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ..............................................................................................113 VIII. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................................114 IX. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ...............................................................................134
3
ÖSSZEFOGLALÓ Kutatómunkám egy makromolekuláris gyógyszerhordozó és daganatterápiás célra előállított tirozin kináz gátló hatóanyagokat tartalmazó konjugátumai, illetve multidrog rezisztencia ellen tervezett hidrofób peptidek nagy hatékonyságú elválasztástechnikai módszerekkel történő analízisére irányult. Szabad zónás kapilláris elektroforézis, micelláris elektrokinetikus kromatográfiás és gélkromatográfiás módszereket dolgoztam ki a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) szabad gyógyszerhordozó és konjugátumainak elválasztására. Kimutattam, hogy a polimer láncok a monomereknél nagyobb saverősségű karboxil csoportokat is tartalmaznak. Bizonyítottam, hogy bár elvileg kétféle saverősségű karboxil csoport épül be a makromolekulákba, a polimerek nem kétféle, hanem sokféle saverősségű karboxil csoportok sorozataival rendelkeznek, ami befolyásolhatja a gyógyszerhordozó és konjugátumai viselkedését az élő szervezetben, illetve magát a konjugálás folyamatát. Kimutattam a makromolekulák polidiszperz jellegét is. Micelláris elektrokinetikus kromatográfiás és fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszereket dolgoztam ki potenciális multidrog rezisztencia ellenes hatással rendelkező hidrofób peptidek elválasztására, hidrofóbicitásuk jellemzésére és összefüggést mutattam ki hidrofóbicitásuk mértéke és biológiai hatékonyságuk között. Ez elsősorban molekulakönyvtárak tesztelése esetén előnyös. Két homológ sor és az általam vizsgált hidrofób peptidek micelláris elektrokinetikus kromatográfiás mérési adatai alapján tanulmányoztam a k” módosított retenciós faktor tulajdonságait
és alkalmazhatóságát
Bebizonyítottam,
hogy
k”
a molekulák hidrofóbicitásának számszerűsítésére.
módosított
retenciós
faktor
sikeresen
alkalmazható
a
mintakomponensek hidrofóbicitásának és hidrofóbicitásbeli különbségeinek a becslésére. Elért eredményeim hozzájárultak a micelláris elektrokinetikus kromatográfia elméleti hátterének a fejlesztéséhez.
i
The analysis of a macromolecular drug carrier, its conjugates and multidrug resistance reversal peptides by high-performance separation techniques
SUMMARY The aims of my research has been to analyse a macromolecular drug carrier and its tyrosin kinase inhibitor-containing conjugates, as well as particular multidrug resistance reversetargeted hydrophobic peptides by high-performance separation techniques. Free zone capillary electrophoresis, micellar electrokinetic chromatographic and gel permeation chromatographic methods have been elaborated and optimised for the separation of the poly-(N-vinylpyrrolidone-co-maleic acid) drug carrier macromolecule and its conjugates. As a result, the presence of extremely strong carboxyl groups on the polymer chain has been demonstrated. A series of carboxyl groups with a wide range of acidity has also been recognised on the polymer chain. These carboxyl groups can influence the behaviour of the free drug carrier and its conjugates in organisms, and the conjugation process itself. Polydispersity of all the investigated macromolecules has also been proved. Micellar electrokinetic chromatographic and reversed phase high performance liquid chromatographic methods have been developed and optimised for the analysis of potential multidrug resistance reversal hydrophobic peptides and for the characterisation of their hydrophobicity. A relationship has been recognised between their hidrophobicity and their biological activity. This relationship can be used in the prescreening of multidrug resistance reversal capacity of entire molecule libraries, before biological testing. The behaviour of the k” normalised retention factor and its applicability to estimate the hydrophobicity have also been investigated based on the micellar electrokinetic chromatographic experimental data of two homolog series from the literature and of the multidrug resistance reversal hydrophobic peptides. This investigation contributed to the development of the theoretical background of micellar electrokinetic chromatography.
ii
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACE ACN BOC Bzl CE CEC CGE CIEF CITP CMC CZE D Dmc E EOF fi FMOC GPC HPLC K k’ k” k’HPLC Ld Lt MDR MEKC MS N NaDS NBD P qi r ri RP-HPLC Rs
affinitás kapilláris elektroforézis (Affinity Capillary Electrophoresis) acetonitril t-butiloxikarbonil benzil kapilláris elektroforézis (Capillary Electrophoresis) kapilláris elektrokromatográfia (Capillary Electrochromatography) kapilláris gélelektroforézis (Capillary Gel Electrophoresis) kapilláris izoelektromos fókuszálás (Capillary Isoelectric Focusing) kapilláris izotachoforézis (Capillary Isotachophoresis) kritikus micellakoncentráció (Critical Micelle Concentration) szabad zónás kapilláris elektroforézis (Capillary Zone Electrophoresis) diffúziós állandó micella diffúzós állandója elektromos térerő elektroozmótikus áramlás (Electroosmotic Flow) korrekciós faktor 9-fluorenilmetiloxikarbonil gélszűrő kromatográfia (Gel Permeation Chromatography) nagy nyomású folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chromatography) megoszlási hányados retenciós faktor a MEKC-ben módosított retenciós faktor a MEKC-ben retenciós faktor a HPLC-ben kapilláris hossza a detektorig kapilláris teljes hossza multidrog rezisztencia (Multidrug Resistance) micelláris elektrokinetikus kromatográfia (Micellar Electrokinetic Cromatography) tömegspektrometria (Mass Spectometry) elméleti tányérszám nátrium dodecilszulfát nukleotidkötő domén (Nucleotide Binding Domain) poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) „i” mintakomponens iontöltése kapilláris sugara „i” mintakomponens ionrádiusza fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfia (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography) felbontás (Resolution)
iii
S t0 tBu TEA TEAP TK1 TK2 tm tappm, i tion tr V V0 Ve VM VS Vt vapp, i veo vep, i Z α α i σt ε ζ η µ0,i µact,i µapp, i µapp, mc µeff, i µeo µep, i µmc
számolt hidrofóbicitás holtidő (HPLC), elektroozmótikus áramlással mozgó semleges mintakomponensek migrációs ideje (CE) t-butil trietilamin trietilamin foszfát 2-ciano-3-hidroxi-5-amino-2-pentenil (4’-trifluorometil anilid) (6’, 7’ dimetil-1’-quinoxalinil) 4-(2’ amino) acetanilid migrációs idő „i” mintakomponens látszólagos migrációs ideje ion migrációs ideje retenciós idő feszültség kizárási térfogat elúciós térfogat mozgó fázis térfogata micelláris fázis térfogata teljes térfogat „i” mintakomponens látszólagos („apparent”) elektroforetikus sebessége elektroozmótikus áramlás sebessége „i” mintakomponens elektroforetikus sebessége benziloxikarbonil szelektivitás disszociációfok standard deviáció dielektromos állandó zeta potenciál viszkozitás „i” mintakomponens abszolút elektroforetikus mobilitása „i” mintakomponens aktuális elektroforetikus mobilitása „i” mintakomponens látszólagos mobilitása micellák látszólagos mobilitása „i” mintakomponens effektív elektroforetikus mobilitása elektroozmótikus áramlás mobilitása „i” mintakomponens elektroforetikus mobilitása micellák elektroforetikus mobilitása
iv
I. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Kutatómunkám egy makromolekuláris gyógyszerhordozó és daganatterápiás célra előállított tirozin kináz gátló hatóanyagokat tartalmazó konjugátumai, illetve multidrog rezisztencia ellen tervezett hidrofób peptidek nagy hatékonyságú elválasztástechnikai módszerekkel történő analízisére irányult. Gyógyszerjelölt molekulák esetében nagyon fontos a nagy hatékonyságú, gyors, szelektív és kis anyagigényű analitikai módszerek kidolgozása. Különösen hasznosak lehetnek azok az elválasztástechnikai módszerek, amelyek alkalmazásával olyan adatok birtokába is juthatunk, amelyekkel egyben a vizsgált komponens tulajdonságait is jellemezhetjük, pl. hidrofil / hidrofób jellegét, szerkezet-hatás összefüggését, saverősségét. A minél teljesebb értékű jellemzés érdekében indokolt, hogy a molekulákat több szempontból, több analitikai módszerrel is megvizsgáljuk.
A gyógyszerkutatás egyik modern tendenciája a polimer gyógyszerhordozók felhasználása a különböző kismolekulájú hatóanyagok szervezetbe való bejuttatására. Makromolekulákhoz való konjugálásuk által megnő a hatóanyagok felezési ideje, kémiai stabilitásuk, javul a bioelérhetőségük, szelektivitásuk, csökken a citotoxicitásuk és enyhébb immunválaszt eredményezhetnek, tehát az esetleges mellékhatások visszaszorulhatnak. Gyógyszeranalitikai szempontból a polimerek és konjugátumaiknak vizsgálata kihívásnak bizonyul, mivel szemben a hagyományos hatóanyagokkal, a polimer-hatóanyagok polidiszperz jellegűek, vizsgálatukhoz tehát nagy hatékonyságú, nagy érzékenységű elválasztástechnikai módszerek kidolgozása szükséges. A daganatellenes terápia egyik perspektíváját a tirozin kináz gátlók kifejlesztése jelenti, mivel a tirozin kináz molekulák számos olyan folyamatban játszanak szerepet, amelyek összefüggésben állnak a daganatok kifejlődésével, mint pl. a sejtosztódás szabályozása, apoptózis, angiogenezis, stb. Munkacsoportunk a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) polimert alkalmazta makromolekuláris gyógyszerhordozóként és ehhez két tirozin kináz gátló molekulát konjugált. Ez azt a feladatot állította elénk, hogy a makromolekuláris gyógyszerhordozó és konjugátumai jellemzésére alkalmas elválasztástechnikai módszereket dolgozzunk ki.
1
Daganatos betegek citosztatikus terápiája során gyakran előforduló jelenség a multidrog rezisztencia, amely nagymértékben meggátolhatja a kezelés eredményességét. A multidrog rezisztenciáért felelős membrántranszporter család egyik fontos tagja az MDR1 fehérje, melynek inhibitorai általában erősen toxikus mellékhatásokkal is rendelkeznek. Ezzel szemben a nagyon hidrofób, L-aminosavakból álló, a C és N végeken nagytérfogatú aromás, vagy alkil vegyületekkel védett di- és tripeptid származékok (reverzinek) alacsony toxicitású, a szervezetben könnyen bomló MDR1 fehérje modulátorok és néhányuk szubsztrátja is a transzportfehérjének. Munkacsoportunk ilyen kisméretű hidrofób peptideket (reverzineket) állított elő az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitásának gátlására. Ennek kapcsán olyan elválasztástechnikai módszereket kellett kidolgozni, amelyek lehetővé teszik a rendkívül hidrofób molekulák analízisét, hidrofóbicitásuk jellemzését és rávilágítanak a hidrofóbicitásuk és biológiai hatékonyságuk közti esetleges összefüggésre. A modern gyógyszerkutatásban egyre erősebben hidrofób molekulák kerülnek elő, amelyeknek hidrofóbicitása
meghatározó
jellegű
lehet
a
biológiai
hatékonyságukban,
molekuláris
hatásmechanizmusukban. Ezzel együtt jelentkezik az az igény is, hogy olyan elválasztástechnikai módszereket dolgozzunk ki, amelyek alkalmasak az egyre apolárosabb molekulák elválasztására és hidrofóbicitásuk jellemzésére. A fordított fázisú folyadékkromatográfiát és a micelláris elektrokinetikus kromatográfiát hagyományszerűen használják gyógyszerjelölt molekulák hidrofóbicitásának meghatározására a szerkezet-hatás összefüggések tanulmányozása folyamán. A víz-oktanollal történő kirázáshoz viszonyítva ezek az eljárások számos előnnyel rendelkeznek: sokkal kisebb mintamennyiséget igényelnek, automatizálható módszerek és nem szükséges a minták előtisztítása, mert az eljárások során egyidejűleg végbemegy a vizsgált komponens elválasztása is. A hidrofóbicitás mértékének a számszerűsítésére a migrációs idők, illetve az elúciós idők alapján számolt retenciós faktorokat használják. 1984-ben Terabe és munkatársai bevezették a k’ retenciós faktort a micelláris elektrokinetikus kromatográfiába. Egy 1996-os közleményben kutatócsoportunk bevezette a k” módosított retenciós faktort a micelláris elektrokinetikus kromatográfiába, amely a k’ retenciós faktorhoz viszonyítva véges tartományban mozgó, lineáris jellegű függvény. Kutatási munkám során két homológ sor szakirodalomból vett mérési adatai és az általam vizsgált hidrofób peptidek mérési adatai alapján tanulmányoztam a
2
k”
módosított
retenciós
faktor
tulajdonságait
és
alkalmazhatóságát
a
molekulák
hidrofóbicitásának a számszerűsítésére. A kutatási munkámban alkalmazott nagy hatékonyságú elválasztási módszerek más-más szempontból teszik lehetővé a polimer gyógyszerhordozó, konjugátumai és a hidrofób peptidek vizsgálatát és jellemzését: a szabad zónás kapilláris elektroforézis elsősorban fajlagos töltésbeli különbségek alapján tud szeparálni; a micelláris elektrokinetikus kromatográfia
és
a
fordított
fázisú
folyadékkromatográfia
a
mintakomponensek
hidrofóbicitásbeli különbségeit észlelik; a gélkromatográfia pedig a látszólagos mólsúly alapján választ el.
I.1. AZ ALKALMAZOTT ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ISMERTETÉSE I.1.1. kapilláris elektroforézis (CE = Capillary Electrophoresis) I.1.1.1. TÖRTÉNELMI HÁTTÉR A kapilláris elektroforézis a hagyományos elektroforézis módszereiből fejlődött ki az 1970-es években és bár korábbi próbálkozások is történtek, ennek az elválasztási technikának a kidolgozása J.W. Jorgenson, S. Hjerten és K.D. Lukacs nevéhez fűződik (96, 114, 121, 138). Az első szabad zónás elektroforézist kisméretű (3 mm belső átmérőjű) kapillárisban Hjerten végezte 1967-ben. 1974-ben Virtenen leírta a kis belső átmérőjű oszlopok használatának az előnyeit az elválasztásban. Mikkers és munkatársai 1979-ben 200 µm belső átmérőjű politetrafluoroetilén kapillárisban végeztek szabad zónás elektroforézist. 1981-ben Jorgenson és Lukacs kidolgozták a 100 µm-nél kisebb belső átmérőjű kapillárisban végzett elektroforetikus elválasztás elméleti hátterét. A nyolcvanas években kezdték bevezetni a különböző kapilláris elektroforézis technikákat: 1983ban Hjerten kidolgozta a kapilláris gélelektroforézis módszert, amelynek előnyeit Cohen és Karger 1987-ben írták le (40). 1984-ben Terabe és munkatársai bevezették a micelláris elektrokinetikus kromatográfiát és kidolgozták az elméleti hátterét (208, 209). 1989-ben jelentek
3
meg az első kereskedelmi kapilláris elektroforézis készülékek. A kilencvenes években egyre újabb kapilláris elektroforézis technikák jelentek meg, mint például a kapilláris izoelektromos fókuszálás, kapilláris izotachoforézis, kapilláris elektrokromatográfia, affinitás kapilláris elektroforézis. I.1.1.2. A KAPILLÁRIS ELETROFORÉZIS KÉSZÜLÉK FELÉPÍTÉSE A készülék alapvető alkotóelemei: mintaadagoló egység; két puffertartály amelyekbe belemerülnek az elektródák és a kapilláris két vége; kapilláris; detektor; termosztát; magasfeszültségű tápegység és számítógépes vezérlő-, adatgyűjtő és adatfeldolgozó rendszer. Mindezt kiegészítheti frakciószedő, több detektor, automatizált mintaadagoló [1. ábra].
vezérlő és adatgyűjtő
kapilláris
+
detektor
puffer
_
puffer
mintatartó tápegység
1. ábra. A kapilláris elektroforézis készülék vázlatos felépítése (52) Mintaadagoló egység (injektor) Változtatható osztásarányú mintaosztón (splitteren) keresztüli adagolás A mintabevitel HPLC típusú fecskendővel, mechanikus úton történik. Mintaadagolás közben a nagy térfogatú (általában µl nagyságrendű) minta adott arányban megoszlik az analizáló és az elvezető (megosztó) kapilláris között, így a mintának csak egy bizonyos hányada kerül az analizáló kapillárisba. Az analizáló kapillárisba juttatott minta mennyiségét a megosztó kapilláris hosszának változtatásával és az injektálási térfogattal lehet szabályozni. Tipikus megoszlási arány például az 1:1000, vagyis 1 µl mintából 1 nl kerül az analizáló kapillárisba.
4
Elektroozmótikus (elektrokinetikus) adagolás Ebben az esetben a mintabevitel feszültség hatására történik: a mintakomponensek saját elektroforetikus mozgékonyságuk és az elektroozmótikus áramlás hatására kerülnek a kapilláris végébe, ezért az elektroozmótikus áramlás létrejöttét biztosító körülmények között alkalmazható. Az adagolt minta mennyiségét az injektálási feszültség és az injektálási idő határozza meg. Az eljárás hátránya, hogy a nagyobb mozgékonyságú molekulák nagyobb számban kerülnek be a kapillárisba az adott injektálási időn belül, mint a kisebb mozgékonyságúak. Hidrodinamikus adagolás Három főbb típusa ismeretes: - hidrosztatikus adagolás („gravity flow injection”) – a mintaadagoló edénykét a belemerített kapillárisvéggel magasabb szintre emelik a másik kapillárisvéghez viszonyítva a mintabevitel idejére. A bejuttatott mintamennyiséget a mintaadagolás időtartamával és a szintkülönbséggel lehet szabályozni. - pneumatikus mintabevitel – a mintaadagolás külső nyomás hatására történik. - vákuumos mintabevitel – vákuum hatására történik a mintaadagolás. Elválasztó egység: a kapilláris Legelterjedtebbek a poliimid külső védőréteggel ellátott, ömlesztett („fused”) kvarc kapillárisok, amelyek belső felülete lehet szabad (nem borított), vagy kémiailag módosított. Népszerűségüket alátámasztja hajlékonyságuk, jó hőleadó képességük és optikai áteresztőképességük az UV tartományban. Néhány esetben alkalmaztak polietilén, illetve teflon kapillárist is. A 20-100 cm hosszúságú kapillárisok belső átmérője általában 10-100 µm közötti és kör keresztmetszetű. A nemborított kvarc kapillárisok szabad szilanol csoportjai kölcsönhatásba léphetnek a mintakomponensek molekuláival és adszorpciót idézhetnek elő a fal felületén. Ennek visszaszorítása érdekében a kapillárisok belső felületét különböző borítóréteggel szokták ellátni, például: poli-(akrilamid), poli-(etilénglikol), poli-(etilénimin), poli-(vinilpirrolidon) réteggel (20, 21, 59, 99, 151, 191, 199, 241). Kapilláris gélelektroforézisben a kapillárisokat különböző gélekkel, például a poli-(akrilamid), agaróz gélekkel töltik fel (15, 53, 64, 88, 94, 97, 178, 234). Napjainkban már a kapilláris elektroforézisre alkalmas chipek gyártása is megvalósult (46, 97, 182).
5
Detektor A kapilláris elektroforézisben, hasonlóan a HPLC-hez, sokféle detektálási módszert alkalmaznak. A leggyakrabban alkalmazott módszerek, módszercsoportok: ultraibolya (UV)-, látható (VIS)- és fluoreszcens- vagy lézer indukált fluoreszcens-, elektrokémiai-, refraktometriás-, lángionizációs detektálás, indirekt detektálás, tömegspektrometriás-, illetve nukleáris mágneses rezonancián alapuló detektálási módszerek. A módszerek egy része lehetővé teszi a mintakomponensek folyamatos, az analízissel egyidejű („on-line”, „on column”) detektálását, de előfordul az analízist követő („off-line”) detektálás is, amikor az elválasztott komponenseket kinyerik a kapillárisból, majd a kinyert frakciókat analizálják. Legelterjedtebb módszer az ultraibolya detektálás melynek előnye, hogy a mintakomponenseket az elválasztás megszakítása nélkül, egyenesen a kapillárisban képes detektálni, külön detektorcella nélkül (174, 234). Mivel a fényút hosszát a kapilláris átmérője határozza meg, a kapilláris átmérője nem csökkenthető tetszőleges
buborék alakú kapilláris toldat
Z alakú kapilláris
szögletes keresztmetszetű kapilláris
2. ábra. Speciális alakú kapillárisok és kapilláris toldatok (52) mértékben, mert így automatikusan a fényút hossza és a kapott jel intenzitása is csökken. Az érzékenység növelésére elektronikus módszereket (zajszűrés, jel-zaj arány javítása), illetve speciális alakú kapillárisokat alkalmaznak, amelyekkel a fényút hossza növelhető. Ilyenek például a buborék alakú kapilláris toldatok, a Z-alakú kapillárisok, vagy a szögletes keresztmetszetű kapillárisok (52, 86) [2. ábra].
6
1989-ben kísérleteztek először egy HPLC diódasoros detektor átalakításával úgy, hogy alkalmazhatóvá tegyék kapilláris elektroforézises detektáláshoz is. Azóta az utraibolya elnyelésen alapuló detektorok között egyre terjed a diódasoros detektorok alkalmazása (44, 87). Ez utóbbi berendezés nemcsak egy hullámhosszon képes detektálni az elnyelést, hanem az egyes komponensek UV spektrumát is képes felvenni. A spektrum alapján segítséget kaphat az analitikus az egyes komponensek kémiai azonosításában és a kapott csúcsok tisztaságának (egységességének) ellenőrzésében. Az UV detektáláshoz viszonyítva érzékenyebb módszereknek bizonyulnak a fluoreszcencia (érzékenységi határ: 10-8-10-5 M) és a lézer indukált fluoreszcencia (érzékenységi határ: 10-9-10-7 M) detektálási technikák (172, 234, 239). Az elválasztást megelőzően, vagy azt követően gyakran kell származékképzéshez folyamodni (239). Rendkívül jelentős a tömegspektrometriás (MS) detektálásnak az alkalmazása a kapilláris elektroforézisben, mivel nemcsak rendkívül érzékeny (mérési határ: 10-9-10-5 M), hanem lehetőséget ad a kémiai szerkezet meghatározására is. A kapilláris elektroforézis készülék tömegspektrométerhez való kapcsolása például a következő esetekben volt kivitelezhető: elektrospray tömegspektrometria (CE/ES-MS = Capillary Electrophoresis/Electrospray Mass Spectometry) (64, 221), elektrospray ionizációs tömegspektrometria (CE/ESI-MS = Capillary Electrophoresis/Electrospray lézerdeszorpciós/ionizációs
Ionization
Mass
„time-of-flight”
Spectometry)
tömegspektrometria
(222),
mátrix-asszisztált
(CE/MALDI-TOF-MS
=
Capillary Electrophoresis/Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectometry) (113, 240), egyenletes folyású, gyorsított atombombázó tömegspektrometria (CE/CF-FAB MS = Capillary Electrophoresis/Continuous Flow-Fast Atom Bombardment Mass Spectometry) (230).
7
TÁPEGYSÉG Szabályozható, állandó feszültség, vagy állandó áram kiadására alkalmas berendezés. Újabban programozható tápegységeket is használnak, ahol a feszültség vagy az áramerősség az analízis során programozottan változtatható. A ma alkalmazott tápegységek 0-30 kV tartományban képesek dolgozni. Nemzetközi megegyezés szerint a polaritás pozitív előjelű, ha az anód az injektor felöli elektróda és negatív, ha a katód az injektorhoz közel eső elektróda. TERMOSZTÁLÓ EGYSÉG A kapilláris nagy fajlagos felülete lehetővé teszi, hogy az elválasztás alatt fejlődő Joule-hőt a termosztáló rendszer hatékonyan el tudja vezetni. A kapilláris termosztálása nagyon lényeges, mert az analizált komponensek mobilitása 1 ºC hőmérsékletingadozás hatására kb. 2%-kal változik (161, 224). VEZÉRLŐ, ADATGYŰJTŐ, ADATFELDOLGOZÓ EGYSÉG E vezérlő, adatgyűjtő, adatfeldolgozó rendszerek ugyanazokat a funkciókat látják el, mint a HPLC-ben alkalmazott hasonló rendszerek. Alkalmasak az elválasztás során kapott adatok gyűjtésére, tárolására és feldolgozására, a kapott elektroferogramok mennyiségi kiértékelésére (integrálás), elektroferogramok összeadására, kivonására, alkalmasak külső- és belső standardos mennyiségi
meghatározások
elvégzésére,
a
mintakomponensek
standardokkal
történő
azonosítására, dokumentáció készítésére. A vezérlőrendszerek a berendezés meghatározott program szerinti működtetését végzik (mintaadagolás, analízis, kapillárisöblítés, adatgyűjtő rendszer indítása, automatikus analízis). FRAKCIÓSZEDŐ Bár a kapilláris elektroforézis – éppen a minta kis mennyiségénél fogva - nem kifejezetten preparatív módszer, számos megoldást fejlesztettek ki az elválasztott komponensek frakcionált gyűjtésére. A kapilláris végén kilépő komponenseket a kapilláris alatt egyenletes sebességgel elhaladó hordozóra (pl. szűrőpapír, nitrocellulóz lap, polivinilidén difluorid membrán) juttatják, amelyről az elválasztott komponensek kioldhatók (38). Másik megoldásban a kapilláris detektor oldali végét minden egyes új komponens megjelenésekor a detektorjelet figyelő rendszer új pufferedénybe lépteti. Az egyes komponensek a pufferedényekből nyerhetők ki (153).
8
I.1.1.3. RÖVID ÖSSZEHASONLÍTÁS MÁS ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREKKEL Lényeges különbség a kapilláris elektroforézis és a klasszikus elektroforézis között a kapilláris méretében van. A mai készülékekben általában 10 és 100 µm közötti belső átmérőjű kapillárisokat alkalmaznak és ennek a kis átmérőnek rendkívül jelentős, a módszer tulajdonságait alapvetően meghatározó következményei vannak: a). A felület / térfogat arányt felírva láthatjuk, hogy minél kisebb a kapilláris sugara, annál nagyobb a felület / térfogat arány: 1 2 · r · π · Lt A / V = ———— = 2 · — r2 · π · Lt r
[1]
r = kapilláris sugara; Lt = kapilláris teljes hossza Az A / V
függvény értéke tart a ∞ - hez, ha r tart nullához. A kapilláris sugarának
csökkentésével a kapillárist kitöltő molekulák egyre nagyobb hányada található a kapilláris falának a közelében és így a felületi jelenségek rendkívül nagy szerepet kapnak. b). A nagy fajlagos felület miatt az elválasztás folyamán fejlődő Joule-hőt a termosztáló rendszer hatékonyan tudja elvezetni. Ennek következtében valóban nagy térerő alkalmazható (akár 1000 V/cm is) az elválasztás folyamán. c). Az elektroozmótikus áramlás jelentőssé, meghatározóvá válik a rendszerben. Ennek következtében - eltérően a HPLC-re jellemző parabolikus áramlási profiltól – nemparabolikus, dugószerű áramlási profil alakul ki. Ez nagymértékben hozzájárul ahhoz, hogy az elválasztás során rendkívül nagy elméleti tányérszámokat (106 N/m) érhetünk el.
9
I.1.1.4. SZABAD ZÓNÁS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS (CZE = CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS) I.1.1.4.1. Az elválasztás elve, elektroozmótikus áramlás A szabad zónás kapilláris elektroforézis a legelsőként bevezetett kapilláris elektroforézis technika és a legelterjedtebb a mai napig. Kivitelezése a legegyszerűbb a többi kapilláris elektroforézises módszerhez viszonyítva. A kapillárist homogén puffer (háttér elektrolit) tölti ki. A mintaadagolást követően a rendszerre rákapcsolják a feszültséget, amely egy adott erősségű, hosszanti irányultságú elektromos teret (E) eredményez. Az elektromos tér hatására elkezdődik a mintakomponensek vándorlása, amely töltés/molekulaméret arányában vezet a komponensek szétválásához. Minden esetben figyelembe kell vennünk azonban, hogy az elválasztás elektroozmótikus áramlás (elektroozmózis) hiányában, vagy jelenlétében is végbemehet, a kísérleti körülmények függvényében. Elektroforetikus mobilitások Adott térerő hatására a töltéssel rendelkező komponensek adott elektroforetikus sebességgel (vep, i)
mozognak a kapilláris belsejében, amely a feszültség rákapcsolását követően egy másodperc
töredéke alatt elér egy állandó értéket. Az elektroforetikus sebesség arányos a térerővel és jellemző az adott komponensre: →
→ vep, i = µep, i · E
vep, i = „i” mintakomponens elektroforetikus sebessége; µep, elektroforetikus mobilitása
[2] i
= „i” mintakomponens
A fenti egyenlet értelmében az elektroforetikus ionmobilitás a térerőegységre vonatkoztatott elektroforetikus sebesség. Mértékegysége m2/Vs, kisméretű szervetlen és szerves ionok esetében általában 20-80 · 10-9 tartományban mozog. Kationok esetében pozitív előjelű, anionok esetében negatív. Az elektroforetikus mobilitás függ az ion töltésétől, méretétől, a pufferoldat minőségétől és viszkozitásától.
10
qi µep, i = —————— 6 · π · η · ri
[3]
q = „i” mintakomponens iontöltése; η = pufferoldat viszkozitása; ri = ionrádiusz A [3] egyenletből egyértelműen kitűnik, hogy a nagyobb fajlagos töltésű ionok nagyobb mobilitással rendelkeznek. Végtelenül hígított oldatok esetében, adott hőmérsékleten az ionmobilitás egy adott ionra jellemző állandó, amelyet abszolút mobilitásnak (µ0,i) neveznek. A gyakorlatban az elválasztás során használt oldatok véges koncentrációval rendelkeznek, így az ionkomponensek nem állandó, hanem az oldat koncentrációjától függő mobilitással mozognak. Az erős elektrolitok ionjai a gyakorlatban un. aktuális mobilitással rendelkeznek (µact,i), amelyek kisebbek az abszolút mobilitásoknál (µ0,i). A végtelen hígítású oldatoktól való eltérést egy korrekciós faktor (fi) fejezi ki: µact,i = fi · µ0, i
[4]
Az fi korrekciós faktor függ az oldatok ionerősségétől. A gyakorlatban egy nagy töltéssel rendelkező ion aktuális mobilitása akár fele értéke lehet az abszolút mobilitásának, ha a puffer ionerőssége 0,1 mol/l nagyságrendű, vagyis magas (121). Ha a mintakomponensek gyenge elektrolitok, akkor a töltésüket és ennek kapcsán az effektív mobilitásukat (µeff, i) a disszociációfokuk (α i), illetve a puffer pH-ja nagymértékben befolyásolja. Egy „i” komponens effektív mobilitása arányos az aktuális mobilitásával, illetve az abszolút mobilitásával: µeff,i = µact,i · α i = µ0,i · fi · α i
[5]
Monovalens gyenge sav esetén a disszociációfok a következőképpen függ a puffer pH-tól: 1 α i = ——————— 1 + 10 ( pKa, i – pH ) Ennek következtében a monovalens gyenge sav effektív mobilitása pH – függő:
11
[6]
µact, i µeff, i = µact, i · α i = ——————— 1 + 10 ( pKa, i – pH )
[7]
Monovalens gyenge bázisok esetén a fenti képletekbe a ( pKa, i – pH ) a ( pH – pKa, i ) – val helyettesíthető be. Ha a minta egyik komponense egy „i” polianionos gyenge sav, amely „j” disszociációs állapotokban lelhető fel a pufferben, amelyeket különböző pKa,j értékek jellemeznek, akkor ezek a speciesek különböző µact,j aktuális mobilitásokkal rendelkeznek. Ebben az esetben az „i” mintakomponens effektív mobilitását az egyes „j” speciesek effektív mobilitásainak az összege adja (121): j µact, j – µact, ( j – 1 ) µeff, i = ∑ ——————— 1 + 10 ( pKa , i – pH )
[8]
A puffer minőségétől függően változhat az egyes mintakomponensek pKa értéke, tehát nemcsak egy adott puffer pH-nak a módosításával befolyásolhatjuk a komponensek effektív mobilitásait, illetve az elválasztást magát, hanem egy másik pufferrel való helyettesítése által is. A mintakomponensek abszolút mobilitásai követik a puffer viszkozitásának ingadozását is (121): µ0, i · ri · η = const
[9]
Az elektroozmózis keletkezése, jellemzése Az elektroozmótikus áramlás (EOF = Electroosmotic Flow) a kapilláris elektroforézis egyik legfontosabb jelensége, amely nagymértékben befolyásolja az elválasztást. A szakirodalomban ritkábban, de használatos az elektroendoozmótikus áramlás megnevezés is. Az elektroozmótikus áramlás a kapilláris belsejét kitöltő folyadék egyirányú áramlását jelenti.
12
Az ömlesztett szilikából készült kapilláris belső fala szabad szilanol csoportokkal rendelkezik, amelyek bizonyos pH érték felett deprotonálódnak és ezáltal a kapilláris belső felülete negatívan töltődik. A fal negatív töltését anionadszorpció is előidézheti (121). Ehhez a negatív töltésű felülethez a pufferből kationok társulnak, egy kötött és egy mozgékony (diffúz) réteget alkotva. Ezáltal a fal felületének közvetlen közelében egy zeta (ζ) potenciálkülönbséggel jellemezhető, pár száz nanométeres vastagságú (138) kettősréteg alakul ki [3, 4. ábrák].
fal 3. ábra. Töltéseloszlás az ömlesztett szilika kapilláris belső fala mentén, a ζ potenciál kialakulása (52)
potenciál
fal
4. ábra. A ζ potenciál csökkenése a kapilláris falától a puffer belseje felé haladva (52)
a: adszorbeált ionokból álló kötött réteg; b: mozgékony (diffúz) ionréteg; c: puffer Helmholtz egyenlete (138) szerint: 4· π · η · µeo ζ = —————— ε
[10]
µeo = elektroozmótikus áramlás mobilitása (hányadosa); ε = dielektromos állandó A zeta potenciál pH-függő, mivel az ömlesztett szilika szilanol csoportjai gyenge savak. Magas pH-n, amikor a szilanol csoportok teljes mértékben deprotonálódnak, a zeta potenciál elérheti a – 120 mV értéket (121). A feszültség rákapcsolása arra kényszeríti a diffúz kationos réteget, hogy elmozduljon a katód felé. A diffúz kationos réteg magával vonja a pufferoldat teljes tömegét és ez a katód felé irányuló áramlás a tulajdonképpeni elektroozmótikus áramlás, amely a következő egyenletes sebességgel (veo) jellemezhető (138):
13
ε·ζ ·E veo = ────── η
[11]
Az elektroozmótikus áramlás hatása az elválasztásra: a). Nemparabolikus, dugószerű áramlási profil Az elektroozmótikus áramlás nemparabolikus, dugószerű áramlási profilt eredményez, lévén, hogy az elektroozmótikus hajtóerő egyenletesen oszlik meg a kapilláris fala mentén, nincs nyomásesés a kapilláris belsejében és az áramlás megközelítőleg egyenletes a folyadék teljes tömegére vonatkoztatva [5. ábra].
lamináris áramlási profil (HPLC)
dugószerű áramlási profil (CE)
5. ábra. Lamináris és dugószerű áramlási profilok (138) Ezzel szemben a HPLC-re jellemző áramlási profil parabolikus, lamináris jellegű, mivel a falhoz közelebb eső folyadék kisebb áramlási sebességgel halad a kapilláris közepéhez viszonyítva. A kapilláris elektroforézisre jellemző lapos áramlási profil 1-2 nagyságrenddel is megnövelheti az elválasztás során elérhető elméleti tányérszámot a HPLC-hez viszonyítva (121).
b). Mintakomponensek vándorlási iránya, látszólagos elektroforetikus sebessége Az elektroozmótikus áramlás nagymértékben befolyásolja minden egyes mintakomponens vándorlási sebességét, migrációs idejét, sőt, egyes esetekben a vándorlásuk irányát is meghatározza. Az egyes mintakomponensek vándorlási sebességét a következő képletek adják: →
→ → vapp, i = veo + vep, i
14
[12]
→ vapp, i = „i” mintakomponens látszólagos („apparent”) elektroforetikus sebessége → veo = elektroozmótikus áramlás sebessége → vep, i = „i” mintakomponens elektroforetikus sebessége A [12] képlet alapján, elektroozmótikus áramlás hiányában a mintakomponensek látszólagos sebessége megegyezik saját elektroforetikus sebességükkel (vapp, i = vep, i ). A megfelelő mobilitásokkal behelyettesítve: → → → vapp, i = ( µeo + µeff, i ) · E
[13]
→ µeo = elektroozmótikus mobilitás → µeff, i = „i” mintakomponens effektív elektroforetikus mobilitása A [13] képlet alapján láthatjuk, hogy az egyes mintakomponensek vándorlási irányát és sebességét tulajdonképpen effektív elektroforetikus mobilitásuk és az elektroozmótikus áramlás mobilitásának vektoriális összege határozza meg. A kationok, anionok és a semleges molekulák sorsa az elválasztás körülményeinek függvényében a következők szerint alakul: A kationok a feszültség hatására a katód felé vándorolnak, tehát elmozdulásuk iránya megegyezik az
elektroozmótikus
áramlás
irányával.
Ennek
következtében
saját
elektroforetikus
mobilitásukhoz hozzáadódik az elektroozmótikus mobilitás és gyorsabban haladnak a katód irányába, mint az elektroozmótikus áramlás hiányában. Szétválásuk elektroforetikus mobilitásuk alapján történik, tehát a nagyobb fajlagos töltésű kationok vándorolnak át elsőkként a kapillárison. A semleges molekulák elektroforetikus mobilitása nulla, tehát kizárólag az elektroozmótikus áramlás hatására, azonos sebességgel haladnak a katód felé. A kationokhoz képest lassabban vándorolnak, és mivel azonos sebességgel mozognak, nem válnak szét, homogén zónát alkotnak.
15
Az anionok negatív töltésük miatt a feszültség hatására az anód felé vándorolnának, tehát elektroforetikus mobilitásuk ellentétes előjelű az elektroozmótikus mobilitáshoz viszonyítva. Ha µeo > µeff,
i,
vagyis ha az elektroozmótikus áramlás mobilitása nagyobb, mint az anionok
elektroforetikus mobilitásai, akkor az elektroozmótikus áramlás az anionokat magával sodorja a katód irányába. A többi mintakomponenshez képest ők haladnak a leglassabban a kapillárisban: a nagy fajlagos töltéssel rendelkező anionok utolsókként vándorolnak át a kapillárison. Ha µeo = µeff, i, az anionok gyakorlatilag képtelenek elmozdulni a kapilláris belsejében. Ha µeo < µeff, i, tehát abban az esetben, ha az anionok nagy töltéssel rendelkeznek, ellenállnak az elektroozmótikus áramlásnak és az anód felé vándorolnak. Ebben az esetben a detektálásuk csak fordított polaritással lehetséges, vagyis ha az anód a detektor felöli kapillárisvégnél található. A fentiek alapján látható, hogy megfelelően erős elektroozmótikus áramlás jelenlétében az összes mintakomponens migrációja kizárólag egyirányú [6. ábra], ami lehetővé teszi kationok, anionok egyidejű analízisét. A semleges molekulák szétválasztása nem valósítható meg szabad zónás kapilláris elektroforézises eljárással, de a micelláris elektrokinetikus kromatográfia kiváló kapilláris elektroforézis alternatívát nyújt a semleges mintakomponensek analízisére.
6. ábra. A mintakomponensek detektálási sorrendje az elektroozmótikus áramlás hatására, pozitív polaritás esetén (86) Az elektroozmótikus áramlás szabályozása Az elválasztás során szükséges lehet az elektroozmótikus áramlás szabályozása, esetenkénti visszaszorítása, vagy fokozása. Alapjában véve az elektroozmótikus áramlást két eljárással lehet
16
szabályozni: a kapilláris fal töltésviszonyainak, illetve a puffer viszkozitásának a módosítása által. Ezt a két lehetőséget a gyakorlatban több módszer biztosíthatja. a). A puffer (háttér elektrolit) pH változtatása A puffer pH változtatása az egyik legáltalánosabban alkalmazott és könnyen kivitelezhető módszer az elektroozmótikus áramlás szabályozásában. Alacsony pH érték esetében a kapilláris fala protonálódik és az elektroozmótikus áramlás lelassul, vagy megszűnik. A pH fokozatos növelése a kapilláris falának a fokozatos deprotonálódását és az elektroozmótikus áramlás megjelenését, illetve fokozatos felgyorsulását váltja ki. Ömlesztett kvarc kapillárisok esetében az elektroozmótikus áramlás átlag pH = 3-4 körül kezd jelentőssé válni, de ez nagymértékben függ a kapilláris kémiai minőségétől, a gyártó cégtől, stb. A módszer hátránya, hogy nemcsak a kapilláris falának a töltésviszonyait változtatjuk meg ezáltal, hanem a puffer és a mintakomponensek protonálódását-deprotonálódását is előidézzük, módosítva ezáltal a puffer és a minta töltését, akár a szerkezetét is. A puffer megválasztásakor figyelembe kell venni a puffer pI értékét, illetve azt a pH tartományt, amelyen belül módosíthatjuk a pH-t a módszerkidolgozás során. b). A puffer ionerősségének és koncentrációjának a változtatása Az elektroozmózis mértéke függ a puffer ionerősségétől és koncentrációjától. Nagy ionerősség, vagy magas koncentráció esetén a fal mentén kialakuló kettősréteg vastagsága csökken, csökken a ζ potenciálkülönbség, ami gyengébb elektroozmózist eredményez. Ugyanakkor a magasabb ionerősség, vagy koncentráció meggátolják a mintakomponensek falhoz történő adszorpcióját is, de egy bizonyos értéket meghaladva magas áramerősséget okoznak, és ezáltal fokozódik a Joule hőgenerálódás. Alacsony ionerősségű és koncentrációjú pufferek alkalmazásakor fokozottabb az elektroozmótikus áramlás, de ilyenkor előfordulhat a mintakomponensek falhoz történő adszorpciója, illetve ha nagy a minta és a puffer konduktivitás különbsége, akkor a kapott csúcsok torzulása is. A kapilláris elektroforézis eljárásoknál használatos pufferek koncentrációja általában 10-50 mM tartományban mozog, de felmehet 100-500 mM-ig is (87).
17
c). A puffer viszkozitásának változtatása A viszkozitás növelésével csökken az elektroozmótikus áramlás sebessége. A puffer viszkozitását a hőmérséklet módosításával, vagy szerves adalékok hozzáadásával lehet módosítani. 1 ˚C-os hőmérsékletingadozás 2-3%-ban változtatja meg a puffer viszkozitását (138). Szerves adalékok lehetnek pl. aminok (162), alkoholok (22, 204), hexán (22). d). A kapilláris falának a módosítása (borítása) A kapilláris falának a borítása által az elektroozmótikus áramlás visszaszorítható, fokozható, vagy megfordítható az iránya. A felületmódosítás lehet állandó: a kapilláris falához kovalensen kötött (20, 21, 59, 99, 151, 191, 199, 241), vagy lehet dinamikus borítás: adalékok a pufferben (7, 39, 42, 71, 83, 139, 179). A fal borítása meggátolja a mintakomponensek falhoz történő adszorpcióját is. Migrációs idő A szabad zónás kapilláris elektroforézis különböző elektroforetikus sebességű, illetve különböző migrációs idővel (tm) rendelkező mintakomponensek szétválasztására alkalmas módszer. A migrációs idő alatt a mintakomponensek az Ld útat teszik meg a kapilláris belsejében, amely a kapilláris injektálási végétől a detektálás pontjáig terjed. A kapilláris teljes hossza az adott feszültségre létrejövő térerősséget határozza meg: E = V / Lt
[14]
Lt = kapilláris teljes hossza Egy „i” mintakomponens migrációs idejét a következő képletek adják (121): Ld · Lt app t m, i = ————————
[15]
(µeo + µeff, i) · V
Ld Ld Ld · Lt tm, i = ——— = ———— = ———— vep, i µeff, i · E µeff, i · V
18
[16]
tappm, i = „i” mintakomponens látszólagos migrációs ideje; Ld = kapilláris hossza a detektorig I.1.1.4.2. A rendszer működését jellemző paraméterek Az elválasztást a szelektivitás, az elméleti tányérszám és a felbontás jellemzik (86). SZELEKTIVITÁS A szelektivitás számszerűleg két mintakomponens mobilitáskülönbségének és az átlag mobilitásuknak a hányadosa: _ α=∆µ/µ
[17]
Elméleti tányérszám µ eff · E N = ————— 2·D
[18]
D = diffúziós állandó Felbontás (rezolúció) A felbontás (R s) számszerűen fejezi ki két egymást követő mintakomponens (i és j) elválasztásának a mértékét. Az egyik legelterjedtebb meghatározása: tm, j – tm, i R s = —————— 2 · ( σt, i + σt, j )
[19]
tm, j és tm, i = „i” és „j” mintakomponensek migrációs idői; σt, i és σt, j = „i” és „j” mintakomponensek standard deviációi (a Gauss görbe félszélessége a teljes csúcsmagasság 63 % - nak megfelelő pontban) (121) Kapilláris elektroforézisben a következő összefüggést kapjuk az elválasztás paramétereire: __ 1 µi – µj √ L 1 ∆µ __ R s = ― · ——— · ——— = ― · ——— · √ N 4 √H 4 µ µ __
___ 19
[20]
∆ µ / µ = szelektivitás; √ N = hatékonyság, az átlagolt elméleti tányérszámok négyzetgyöke. I.1.1.4.3. Alkalmazási területek A szabad zónás kapilláris elektroforézis egyre nagyobb népszerűségre tesz szert a klinikai analízisek területén. A módszer egyik előnye, hogy az analízishez rendkívül kis mintamennyiség is elegendő, másrészt pedig a vizsgált vérszérum, vagy vizeletminta minimális mintaelőkészítést ígényel (pl. szűrés, hígítás) (27, 44, 98, 112). A gyógyszerkutatásban és a gyógyszeriparban a szabad zónás kapilláris elektroforézis jó alternatíva a gyógyszer hatóanyagok mennyiségi meghatározására vérplazmában (46), a gyógyszerkészítmények minőségi ellenőrzésében (54, 174, 176), a gyógyhatású anyagok szervezeten belüli felszívódásának és eloszlásának vizsgálatára (137), gombaellenes szerek elválasztására (100, 233), kísérleti fázisban levő potenciális hatóanyagok tisztaságvizsgálatára (13, 159). Királis adalékok (pl. ciklodextrin) felhasználásával a szabad zónás elektroforézis lehetőséget nyújt enantiomerek elválasztására is (98, 159, 160, 217, 233). A szabad zónás kapilláris elektroforézist alkalmazzák továbbá az élelmiszeriparban, pl. élelmiszerminőségi vizsgálatok során (240). Szabad aminosavak mennyiségi meghatározása révén alkalmazható az anyagcsere megbetegedések diagnosztikájában (27). A biokémiai kutatások terén elsősorban peptidek (142) és fehérjék (135, 191) analízisére alkalmas módszer. I.1.1.5. MICELLÁRIS ELEKTROKINETIKUS KROMATOGRÁFIA (MEKC = MICELLAR ELECTROKINETIC CHROMATOGRAPHY) I.1.1.5.1. Az elválasztás elve, retenciós faktorok A micelláris elektrokinetikus kromatográfiát Terabe és munkacsoportja vezette be 1984-ben (208, 209) és az egyik legelterjedtebb elválasztási módszerré vált. Népszerűségét elsősorban annak köszönheti, hogy lehetővé teszi a semleges molekulák elválasztását. A micelláris elektrokinetikus kromatográfia metodikailag abban különbözik a többi kapilláris elektroforézis technikától, hogy a pufferhez micellaképző anyagot adagolnak, amely a kritikus micellakoncentrációnak (CMC = critical micelle concentration) megfelelő koncentráció esetén micellákat képez. A keletkezett micellák gömb alakúak, külső felületük negatív vagy pozitív töltésű, belsejük hidrofób és dinamikus egyensúlyban vannak a pufferoldatban maradt monomerekkel, melyek a kritikus 20
micellakoncentrációt megközelítő koncentrációban vannak jelen. A mintakomponensek hidrofób, vagy elektrosztatikus kölcsönhatásba léphetnek a micellákkal és ezáltal a klasszikus kromatográfiához hasonlóan, a mintakomponensek megoszlanak a puffer vizes fázisa és a micellák hidrofób belseje között. Az elválasztás során a micellák szerepe hasonló a kromatográfiás álló fázisokéhoz, ezért a micellákat gyakran nevezik pszeudostacioner fázisnak.
kapilláris fala
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - - - - ++++++++++++++++++++++++++++++
→ µeo
→ µapp, mc → µmc → µapp, i detektor
injektor
tR
tmc
t0
7. ábra. A micelláris elektrokinetikus kromatográfia elválasztásának elve (52) Feszültség rákapcsolásakor a micellák µapp, mc látszólagos micelláris mobilitással vándorolnak a kapillárisban, amely a micellák elektroforetikus mobilitásának (µmc) és az elektroozmótikus áramlás mobilitásának (µeo) vektoriális összegével egyenlő: →
→ → µapp, mc = µmc + µeo
21
[21]
Anionos micellák esetében a két vektor ellentétes irányú, de mivel az elektroozmótikus áramlás mobilitása általában meghaladja a micellák elektroforetikus mobilitását (µeo > µmc), a micellák a gyors elektroozmózis hatására a katód felé mozognak és hosszú migrációs idővel ugyan, de áthaladnak a detektoron [7. ábra]. A
semleges
mintakomponensek
elválasztása
hidrofóbicitásuk
alapján
történik,
a
következőképpen: -
azok a hidrofil molekulák, amelyek egyáltalán nem lépnek kölcsönhatásba a micellák hidrofób belsejével, hanem végig vizes fázisban (pufferben) maradnak, kizárólag az elektroozmótikus áramlás hatására mozognak a kapillárisban (µapp,i = µeo) és migrációs idejük t0
-
az állandóan a micellák belsejében tartózkodó, erősen hidrofób molekulák a micellákkal együtt mozognak a kapillárisban (µapp,i = µapp,
mc),
ezért migrációs idejük megegyezik a
micellák migrációs idejével: tmc -
a többi mintakomponens hidrofóbicitásuk által meghatározott arányban oszlanak meg a puffer vizes és a micellák hidrofób fázisában és ezáltal tm migrációs idő alatt haladnak át a kapillárison. Anionos micellák esetében t0 ≤ tm ≥ tmc [7. ábra].
A legáltalánosabban használt felületaktív anyagok (I. táblázat) az anionos micellaképzők, ezen belül pedig a nátriumdodecil szulfát (NaDS) (1, 67, 123, 142, 205). Egy bizonyos koncentrációt meghaladva a kationos felületaktív anyagok akár az elektroozmótikus áramlás irányát is megváltoztathatják, úgy, hogy pozitív töltésű részükkel elektrosztatikus kölcsönhatásba lépnek a kapilláris negatív töltésű falával, míg hidrofób láncukkal a kapilláris belseje felé fordulnak. Az újabb micellaképző molekulák hidrofób kölcsönhatásokat létesítenek a kapilláris fala mentén kialakult réteggel és ezáltal egy kettősréteg jön létre, amelynek a kapilláris belseje felé néző oldala pozitív
I. táblázat. Micelláris elektrokinetikus kromatográfiában gyakran használt micellaképzők, a CMC értékek vizes oldatra vonatkoznak (86)
22
Micellaképző
Micellaképző
típusa
CMC
Aggregációs
(mM)
szám
Anionos
Nátrium dodecilszulfát (NaDS)
8,2
62
Kationos
Dodecil trimetilammónium bromid (DTAB) 14
50
Cetil trimetilammónium bromid (CTAB)
1,3
78
Nemionos
Triton X-100
0,24
140
Ikerionos
3-[(3-cholamidopropil)-dimetilammonio]-1- 8
10
propánszulfonát (CHAPS)
Epesavak
3-[(3-cholamidopropil)-dimetilammonio]-2- 8
11
hidroxi-1-propánszulfonát (CHAPSO) Kólsav
14
2-4
Dezoxikólsav
5
4-10
Taurokólsav
10-15
4
töltéssel endelkezik. Tehát gyakorlatilag a kationos felületaktív anyagok hatására a kapilláris falának a negatív töltése pozitív töltésre vált át. A ζ potenciál előjelváltása miatt megváltozik az elektroozmótikus áramlás iránya is (67, 138). A nemionos és ikerionos micellaképzők enyhébb hatással vannak az elektroozmótikus áramlásra, ugyanakkor kíméletesebbek a fehérjék szerkezetére is (1, 41). Az epesavak sói gyakran használt biológiai felületaktív anyagok. Rendelkeznek mind hidrofil, mind hidrofób csoportokkal és vizes oldatokban királis micellákat képeznek, tehát optikai izomerek elválasztását is lehetővé teszik. Előfordul, hogy más, pl. NaDS pufferoldatokhoz adagolják az elválasztás jobb felbontása érdekében (90, 237). Kevert micellás rendszerrel tovább lehet fokozni az elválasztás szelektivitását és hatékonyságát (118). Retenciós faktorok Micelláris elektrokinetikus kromatográfiában a semleges mintakomponensek elválasztása hidrofóbicitásuk függvényében történik, ezért gyakran alkalmazzák a mintakomponensek hidrofóbicitásának meghatározására (72, 110, 213, 232). Klasszikus folyadékkromatográfiában a mintakomponensek megoszlását az álló és a mozgó fázis között a k’ retenciós faktor számszerűsíti a következőképpen (200):
23
tr = retenciós idő; t0 = holtidő
tr – t0 k’HPLC = ——— t0
[22]
Micelláris elektrokinetikus kromatográfiában mindkét fázis mozog a kapilláris belsejében, ezért a mintakomponensek retenciós faktorát megfelelőképpen korrigálni kell. Terabe és munkatársai 1984-ben vezették be a következő képletet (208): VS tm – t0 k’ = ——————— = K · —— [23] t0 · (1 – tm / tmc ) VM K = megoszlási hányados; VS = micelláris fázis térfogata; VM = mozgó fázis térfogata Az adott mérési körülmények t0 és tmc értékeit metanollal, illetve Szudán III injektálásával szokták meghatározni (208, 209). A [23] képlet értelmében, ha tmc végtelen, vagyis a micellák fázisa stacionárusssá válik, akkor a Terabe által bevezetett retenciós faktor képlete azonossá válik a klasszikus retenciós faktor képletével. Ha egy mintakomponens az elválasztás során állandóan a puffer vizes fázisában tartózkodik, akkor tm = t0 és ebből következik, hogy a retenciós faktora: k’ = 0. Ha egy mintakomponens állandóan a micellák belső, hidrofób zsebében tartózkodik az elválasztás során, akkor tm = tmc, tehát k’ = ∞. Következtetésképpen a Terabe által bevezetett k’ retenciós faktor a nulla és végtelen tartományban mozoghat. A 8. ábrán látható hogy a migrációs idő függvényében a k’ retenciós faktor függvényének meredeksége folyamatosan nő és ezért egy adott migrációs idő különbségnek (∆tm) egyre nagyobb retenciós idő különbségek (∆k’) felelnek meg a migrációs ablak második felében, ami nagyon megnehezítheti a különböző mintakomponensek k’ retenciós faktorral jellemzett hidrofóbicitásainak az összehasonlítását.
8. ábra. A k’ retenciós faktor a migrációs idő függvényében (106)
24
t0 = 4 perc, tmc = 40 perc
25
1996-os közleményünkben munkacsoportunk (106) bevezette a módosított, k”-vel jelölt retenciós faktort: tm – t0 k” = ———
[24]
tmc – t0 Ha egy mintakomponens az elválasztás során végig a puffer vizes fázisában tartózkodik, akkor tm = t0 és a módosított retenciós faktora: k” = 0. Ha egy mintakomponens állandóan a micellák belső, hidrofób zsebében tartózkodik az elválasztás során, akkor tm = tmc és k” = 1. Következtetésképpen a munkacsoportunk által bevezetett k” módosított retenciós faktor véges tartományban, a 0-1 skálán mozog [9. ábra].
9. ábra. A k” módosított retenciós faktor a migrációs idő függvényében (106) t0 = 4 perc, tmc = 40 perc Szimulált adatok és hét szomatosztatin analóg peptidből álló sorozat mérési adatainak felhasználásával munkacsoportunk kimutatta, hogy az újonnan bevezetett k” módosított retenciós faktor meredeksége állandó a migrációs idő függvényében, tehát adott migrációs idő különbségnek (∆tm) ugyanaz a k” retenciós faktor különbség (∆k”) felelt meg a migrációs ablak teljes hosszában.
26
Töltéssel rendelkező mintakomponens esetében a k'ion retenciós faktor számolásakor figyelembe kell venni az ion saját elektroforetikus mobilitását is, ezért Vindevogel és Sandra (219) az alábbi képlet használatát javasolták: tm – tion k'ion = ——————— tion · (1 – tm / tmc)
[25]
tion = az ion migrációs ideje ugyanabban a pufferben, de micellaképző hiányában. I.1.1.5.2. A rendszer működését jellemző paraméterek: A micelláris elektrokinetikus elválasztást a szelektivitás, az elméleti tányérszám és a felbontás jellemzik (138). α = k2’ / k1’
Szelektivitás:
[26]
k1’, k2’ = két egymást követő mintakomponens retenciós faktorai Elméleti tányérszám: µapp · Ld · E N = ———————— 2 · Dmc
[27]
Dmc = micella diffúziós állandója Felbontás: 1 α– 1 __ k2’ 1 – t0 / tmc RS = —— · —— · √N · ———— · ———————— α k2’ + 1 1 + ( t0 / tmc ) · k1’
[28] 4
Ha tmc tart a végtelen felé, azaz a micellák állófázisként viselkednek, akkor a felbontóképesség egyenletének utolsó tényezője tart az 1 felé és a [28] képlet azonosul a klasszikus kromatográfiában használatos képlettel (138). A [28]
képlet alapján a felbontóképességet a
hatékonyság, szelektivitás és a retenciós faktorok révén lehet optimalizálni.
27
Jó felbontást eredményez, ha széles a migrációs idő ablak, vagyis a t0 és a tmc által határolt időintervallum, amit az elektroozmótikus áramlás visszaszorításával, vagy nagy elektroforetikus mobilitással rendelkező anionos micellákkal lehet elérni. Az elválasztást a micellák méretének, töltésének, térszerkezetének változtatása révén lehet befolyásolni. A retenciós faktorok általában lineárisan nőnek a micellaképzők koncentrációjával (86), a micellaképzők koncentrációjának növelését azonban korlátozza a feszültség arányos emelkedése, amely felmelegedéshez vezet. Az elválasztás szempontjából legmegfelelőbb micellaképző kiválasztása után a szelektivitást a puffer koncentrációja, pH-ja, vagy más adalékok (pl. urea, metanol, királis szelektorok: ciklodextrinek, epesavak) használata révén lehet fokozni. Az adalékokkal szabályozni lehet az elektroozmótikus áramlás mértékét, meg lehet akadályozni a fal felületére történő adszorpciót, illetve be lehet vezetni egy újabb elválasztási mechanizmust (31, 138, 141, 237, 238, 239). A szabad zónás kapilláris elektroforézishez hasonlóan polimeres falborítással is lehet optimalizálni az elválasztást, mint pl. poli-(akrilamid), polibrén és poli-(vinilszulfonát) felhasználásával (23, 122). I.1.1.5.3. Alkalmazási területek A micelláris elektrokinetikus kromatográfiás módszert gyakran alkalmazzák különböző vegyületek hidrofóbicitásának meghatározására (72, 110, 213, 232). Ez a módszer ugyancsak alkalmas peptidek és analógjaik (67, 142, 239), számos gyógyszerhatóanyag (159, 175), nukleozidok (123), szénhidrátok (105, 205), vitaminok (237), aminosavak (238), fehérjék (132), enantiomerek (31, 90, 237, 238), DNS adduktok (108) analízisére is. I.1.1.6. MÁS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS TECHNIKÁK RÖVID ISMERTETÉSE I.1.1.6.1. Kapilláris gélelektroforézis (CGE = Capillary Gel Electrophoresis) A klasszikus gélelektroforézishez viszonyítva a kapillárisban végzett gélelektroforézis során 10100-szor magasabb térerővel lehet dolgozni minimális felmelegedés mellett. A detektálás közvetlenül
a
kapillárisban
automatizálhatósága.
Az
történik
agarózzal,
(„on-line”) dextránnal,
és
ugyancsak
poli-(akrilamid)-dal,
előnyös
az
eljárás
poli-(akrilamid/bis-
akrilamid)-dal és más gélekkel töltött kapillárisokban elsősorban nagyméretű biomolekulák:
28
oligonukleotidok, DNS restrikciós fragmensek, PCR termékek, RNS fragmensek és fehérjék méret szerinti elválasztását szokták megvalósítani (15, 53, 64, 88, 94, 97, 178, 234). I.1.1.6.2. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF = Capillary Isoelectric Focusing) Az elválasztás megkezdése előtt a kapillárist feltöltik különböző pI értékekkel rendelkező amfolitok és a mintakomponensek keverékével. A katód felőli puffertartályba lúgos, az anód felől savas oldatot töltenek és a feszültség rákapcsolásakor a kapilláris belsejében elkezdődik az amfolitok és a mintakomponensek vándorlása, amíg el nem érik a pI értéküknek megfelelő zónát, ahol megáll a vándorlásuk. Fókuszálás után a mintakomponenseket nyomás, vagy a puffertartályba történő sóadagolás hatására juttatják át a detektoron. Az elválasztás során az elektroozmótikus áramlás teljes visszaszorítása szükséges, amit leggyakrabban a fal kovalens vagy dinamikus borítása révén szoktak elérni. Kapilláris izoelektromos fókuszálással már a 0,005 pI egységnyi különbséggel rendelkező mintakomponensek elválasztása is megvalósítható (86). Igen jó eredményeket értek el peptidek és fehérjék elválasztásában, illetve pI értékük meghatározásában (95, 145, 195, 196, 203). I.1.1.6.3. Kapilláris izotachoforézis (CITP = Capillary Isotachophoresis) Az elválasztás során a vezető („leading”) puffer nagy mobilitású, a záró („terminating”) puffer pedig kis mobilitású ionokat tartalmaz. A mintaelegyet a két puffer közé injektálják. Feszültség rákapcsolásakor a mintakomponensek mobilitásuk csökkenő sorrendjében sorakoznak fel a vezető puffer ionjai mögött, a mintakomponens sávokat pedig a záró puffer ionjai zárják. Az egymást követő sávok ugyanazon, a vezető ionok sebességével haladnak át a kapillárison. Az izotachoforézises eljárást gyakran használják mintaelőkészítés során dúsító lépésként szabad zónás
kapilláris
elektroforézist,
micelláris
elektrokinetikus
kromatográfiát,
gélelektroforézist, vagy más elválasztásokat megelőzően (30, 44, 86, 186). I.1.1.6.4. Kapilláris elektrokromatográfia (CEC = Capillary Electrochromatography)
29
kapilláris
A
kapilláris
elektrokromatográfiás
eljárás
tulajdonképpen
a
nagy
nyomású
folyadékkromatográfia (HPLC) és a kapilláris elektroforézis ötvözetéből keletkezett elválasztási módszer. A kapillárist feltöltik előzetesen a HPLC-ben használt, általában 1µm-nél kisebb szemcseméretű töltetek egyikével (6, 78, 236). Elválasztáskor a mintakomponensek az elektromos tér hatására vándorolnak, migrációs sebességüket meghatározza saját elektroforetikus mobilitásuk, az elektroozmótikus áramlás sebessége és az állófázissal történő kölcsönhatás. A kapilláris elektrokromatográfiát sikerrel alkalmazzák a gyógyszerkutatásban és a minőségi ellenőrzésben (159), biomolekulák: fehérjék, nukleinsavak, peptidek, antitestek elválasztásában és analízisében (130, 223), királis elválasztások területén (35, 55), DNS adduktok analízisében (48). I.1.1.6.5. Affinitás kapilláris elektroforézis (ACE = Affinity Capillary Electrophoresis) Az affinitás kapilláris elektroforézis módszer esetében az elválasztás úgy valósul meg, hogy a mintakomponensek specifikus, nagy affinitású kölcsönhatásokba (pl: antigén-antitest, hatóanyagfehérje, enzim-szubsztrát, enzim-inhibitor) lépnek célszerint kiválogatott molekulákkal, amelyek szabadon mozoghatnak a pufferben, vagy a kapilláris falához vannak rögzítve. Ez a módszer lehetőséget nyújt a mintakomponensek rendkívül hatékony tisztítására, dúsítására, a kialakult kötések állandójának tanulmányozására. Rendkívül elterjedt a gyógyszerkutatásban, elsősorban kisméretű molekulák (hatóanyagok, hormonok, peptidek) jellemzésére alkalmas, de biopolimerek (pl. immunoglobulinok) vizsgálatára is sikerült alkalmas módszert beállítani (11, 77, 85, 158, 172, 220 ).
I.1.2. Nagy nyomású folyadékkromatográfia (HPLC = High Pressure / Performance Liquid Chromatography) A nagy nyomású folyadékkromatográfia gyökerei az ötvenes évekig nyúlnak vissza és több terület fejlődésének eredményeként alakult ki: a nagy nyomású és kis holttérfogatú berendezések megjelenésére, az érzékeny detektorok és a speciális oszloptöltetek kifejlesztésére, valamint az elmélet kidolgozására egyaránt szükség volt. Az elválasztás zárt, megfelelő töltetű oszlopban megy végbe, a minta fecskendővel, vagy mintaadagoló szelepekkel pontosan és gyorsan injektálható. Az eluenst nagy nyomású szivattyúk áramoltatják át a viszonylag kis permeabilitású 30
oszlopon. A komponensek detektálását és mennyiségi meghatározását különféle detektorokkal végzik, pl: UV, látható, diódasoros, fluoreszcens (111), tömegspektrometriás (5, 70, 84), nukleáris mágneses rezonancia (171), elektrokémiai (14, 89). Az oszlopban a mintakomponensek vándorlási sebessége e komponensek az állófázis (oszloptöltet szemcséi) és a mozgófázis (eluens) közötti egyensúlyi megoszlásától függ. A mozgási sebességeket az egyensúlyi megoszlást meghatározó kísérleti paraméterek szabják meg: a mozgó- és az állófázis összetétele, az elválasztás hőmérséklete. A nagy nyomású folyadékkromatográfiában elterjedten használt oszloptöltetek (200): -
porózus hordozók: diatomaföld, szilikagél, porózus szilikagél gyöngy
-
kémiailag kötött fázisok és állófázissal bevont hordozók, ahol a funkciós csoportok lehetnek: oktán, oktadecil, poli-(etilénglikol), alifás éter, alkil-nitril, primer alkil-amin, poli-(amid).
A minta injektálása és detektálása között eltelt időt retenciós, vagy elúciós időnek nevezzük és trrel jelöljük. Az eluens, vagy más vissza nem tartott molekula t0, azaz holtidő alatt halad át a kromatográfiás oszlopon. Lényeges folyadékkromatográfiás paraméter a k’HPLC retenciós faktor, amely egy komponens állófázisban és mozgófázisban levő mólszámainak a hányadosa. E három fenti fogalmat a következő képlet kapcsolja össze: tr = t0 · (1 + k’HPLC)
[29]
A fenti képlet alapján tr értéke t0, ha k’HPLC = 0, és bármilyen nagy érték között változhat (k’HPLC > 0). A fenti egyenlet átrendezésével a k’HPLC számítását lehetővé tevő egyenlethez jutunk [22]. A rendszer működését jellemző paraméterek: Az elválasztást a szelektivitás, az elméleti tányérszám és a felbontás jellemzik. Felbontás (R s):
1 ___ k’HPLC R s = ― · (α – 1) · √ N · ――― 4 1 + k’HPLC (I.)
(II.)
31
(III.)
[30]
(I.)
= az elválasztás szelektivitását jellemző tényező; a mozgó- és (vagy) állófázis cseréjével változtatható; α
az elválasztási tényező, amelyet két mintakomponens retenciós
faktorának hányadosa defineál az alábbiak szerint: k’2, HPLC α = ―――― k’1, HPLC (II.)
[31]
= az elválasztás hatékonyságát jellemző tényező, az oszlop hosszának, vagy az eluens áramlási sebességének változtatásával változtatható
(III.)
= k’HPLC-től függő tényező, amely az eluens oldószererősségének módosításával változtatható.
A megoszlásos folyadékkromatográfiában az inert hordozót általában poláris állófázissal impregnáljuk,
mozgófázisként
pedig
apoláris
fázist
használunk.
Fordított
fázisú
folyadékkromatográfiás eljárás esetén (RP-HPLC = Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography) a kevésbé poláris fázis az álló-, a polárisabb folyadék pedig a mozgófázis. Alkalmazási területek A normál és a fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfia igen elterjedt eljárások a gyógyszerkutatás és gyógyszeripar területén (32, 62, 84, 171). A hatóanyagok minőségi analízisén és a tisztaságellenőrzésen kívül alkalmas módszerek a hatóanyagok koncentrációjának meghatározása vérszérumban, plazmában (73, 154) és más klinikai kivizsgálásokra (184, 218). A fordított fázisú folyadékkromatográfiát hagyományszerűen használják gyógyszerjelölt molekulák hidrofóbicitásának meghatározására a szerkezet-hatás összefüggések tanulmányozásakor (115, 117). A biokémiai kutatások terén is elterjedt, népszerű elválasztástechnikai módszerek, pl. nukleozidok, nukleotidok, oligonukleotidok (210), DNS fragmensek (101, 125), szénhidrátok (14, 184), aminosavak (57), peptidek, polipeptidek, fehérjék (2, 37, 129) analízisére és elválasztására. Nagy nyomású folyadékkromatográfiával kimutathatók bizonyos DNS sérülések (5, 173) és fehérje szekvenáláskor megállapítható az aminosav sorrend (197). Megfelelő oszloptöltetek
használatával,
illetve
az
elválasztást
megelőző,
vagy
az
azt
követő
származékképzés segítségével enantiomerek elválasztása is lehetséges (32, 63, 80, 225). A nagy
32
nyomású folyadékkromatográfia ugyancsak elterjedt
analitikai módszer az élelmiszeriparban
(28, 149), toxikológiában (70, 111), környezettisztasági vizsgálatokban (25).
I.1.3. Gélszűrő kromatográfia (GPC = Gel Permeation Chromatography) A gélkromatográfiát gyakran gélszűrésnek, vagy gélpermeációs kromatográfiának is nevezik. Technikailag abban különbözik a hagyományos nagy nyomású folyadékkromatográfiától, hogy az oszloptöltet különféle méretű pórusokat tartalmazó porózus anyag. Az elválasztás a mintakomponensek molekulaméretének függvényében történik, a következőképpen: -
a nagyméretű mintakomponensek nem tudnak belépni a pórusokba, a szemcsékből teljesen kizáródnak, ezért kis elúciós térfogattal, elsőkként mosódnak le az oszlopról
-
a kis molekulák majd minden pórusba behatolnak és nagy elúciós térfogattal mosódnak le az oszlopról
-
a köztes méretű molekulák a pórusok egy részébe be tudnak hatolni, más részébe nem, tehát köztes elúciós térfogattal mosódnak le az oszlopról (Ve)
Gélkromatográfiában a retenciót a K megoszlási hányadossal is megadhatjuk: Ve – V0 K = ———— Vt – V0
[32]
V0 = kizárási térfogat, Vt = teljes térfogat Amennyiben Ve = V0, akkor a K értéke 0, ha viszont Ve = VT, akkor K = 1. Ez két lehetséges szélső érték, amikor a molekula a „kizárt”, illetve „teljes” térfogattal eluálható. Az oszlop azon molekulák elválasztására alkalmas, amelyek elúciós térfogata 0 és 1 közé esik. A kereskedelemben kaphatóak pl. félkemény gélek (Sephadex, Bio-Gel-P,), lágy gélek (Sepharose, Bio-Gel-A), polisztirolgélek (Poragel), porózus szilikagél vagy üveg (Porasil, Bio-Glass).
33
Alkalmazási területek A gélkromatográfiát előnyösen lehet használni nagy mólsúlyú anyagok (M>2000) elválasztására, vagy mólsúlyuk megállapítására, különösen, ha ezek az anyagok nem ionosak. A makromolekulák, például fehérjék (47, 227, 229) és nukleinsavak (58, 119, 152) elválasztásán kívül a gélkromatográfiát gyakran alkamazzák a szintetikus polimerek molekulatömegeloszlásának meghatározására is (82, 116). A gélkromatográfia igen alkalmas ismeretlen összetételű minták alkotóinak első, tájékozódó jellegű elválasztására, mert ezzel az elválasztási módszerrel gyorsan általános képet kaphatunk a minta összetételéről és ennek alapján gyakran eldönthetjük, hogy a további elválasztást milyen folyadékkromatográfiás módszerrel kell végezni (200).
I.2. A VIZSGÁLT VEGYÜLETCSOPORTOK ISMERTETÉSE I.2.1. Makromolekuláris hordozók jelentősége a modern gyógyszertervezésben A polimer tartalmú gyógyszerkészítmények kutatása és alkalmazása nagy jelentőségre tett szert már a 80-as évek elejétől. Az 1990-es évek közepén néhány fejlett országban engedélyezték klinikai bevezetésüket. E vegyületekre a „polimer terapeutikumok” kifejezés 1996-tól terjedt el a szakirodalomban (102). Az első polimer terapeutikum, amelyet a humán gyógyászatban alkalmaztak, poli-(etilénglikol) láncokat és adenozin-dezamináz enzimet foglalt magába. Ha az enzimet önmagában juttatták enzimhiányos betegek szervezetébe, a fehérjével szemben immunreakció alakult ki és már a második kezelés veszélyessé vált. Az ADAGEN néven forgalomba került módosított fehérje esetében a polimer láncok csökkentették az enzimmel szemben fellépő immunválaszt, többszöri kezelést tettek lehetővé, a hatóanyag hosszabb ideig volt jelen a vérkeringésben, ami jelentős hatásnövekedést eredményezett (91). A polimer molekulák önmagukban is rendelkezhetnek gyógyhatással, például a sclerosis multiplex gyógyítására bevezetett egyenes láncú polipeptid (65), a kemoterápia és a sugárzás immunszupresszív hatását ellensúlyozó, elágazó láncú polipeptidek (68), a génterápiában perspektivikus „molekuláris fa” (dendrimer) típusú polimerek (26). Szerkezetüket tekintve legelterjedtebbek a két komponensből álló polimer terapeutikumok, amikor a polimer molekula tulajdonképpen hordozó szerepet lát el. Ebbe a családba tartoznak a 34
polimer mikrokapszulákba (60), vagy polimer micellákba (131) zárt hatóanyag-kombinációk és a polimer-hatóanyag konjugátumok, mint például a tumorellenes poli-(sztirén-co-maleinsav)neocarcinostatin (SMANCS) (143), vagy a poli-(etilénglikol)-hoz kapcsolt interferonok (128). A polimer terapeutikumok három összetevőből is állhatnak, például liposzómák felhasználásával. A liposzómák burkát polimer molekulákkal módosítják, a hatóanyag a belső zsebben található (24, 69). Az első antraciklin-liposzóma készítmény rutinszerű alkalmazását 1996-ban engedélyezték (102). A polimer terapeutikumok polimer komponense lehet a szervezetben lebomló vegyület (pl. polipeptid, politejsav, albumin, transzferrin) (124, 144), de a szervezetben lebomlani nem képes makromolekulákkal is kísérleteztek, pl.: poli-(sztirol), poli-(etilénglikol), poli-(hidroxipropilmetakrilamid), poli-(propilénglikol), poli-(sztirén-co-maleinsav/n-butilészter), stb. Ezek a szervezetből lebomlás nélkül távozhatnak a vesén keresztül (102, 144). A makromolekulákhoz kovalensen kötött hatóanyagok kémiai, vagy biokémiai reakció útján fokozatosan szabadulnak fel a szervezetben. Ennek az a feltétele, hogy a hatóanyag és a hordozó polimer között olyan kötést biztosítsunk (pl. észter-, vagy savamidkötést), amely fiziológiás körülmények között, illetve enzimatikusan (pl. kimotripszin hatására) fel tud hasadni (8). Maeda és munkacsoportja leírták és számos kísérleti adattal bizonyították a tumoros szövetekben tapasztalt „fokozott áteresztőképesség és retenció” („enhanced permeability and retention”) jelenségét (143, 144). A fokozott angiogenezis hatására nő a tumorszövetek vérellátottsága, ugyanakkor a véredények fala gyakran hiányos felépítésű. Emellett a tumorsejtekben számos vaszkuláris mediátor (bradikinin, nitrogénmonoxid, prosztaglandinok, citokinek, kollagenáz) fokozott szintézisének hatására megnő a vérfalak áteresztőképessége az 50 kDa-t meghaladó makromolekulákra nézve. Ehhez társul a daganatos szövetekben a nyirokáramlás gyengülése, aminek következtében a makromolekulák lassabban távoznak a sejtközötti állományból, tehát hosszútávon (akár hónapokig) feldúsulhatnak a tumorszövetben. 24 órával az intravénás injekciót követően a polimer terapeutikumok koncentrációja a tumorszövetben átlag 5-10-szer magasabb a vérplazmához viszonyítva és 10-szer magasabb a normál szövetekhez képest. A fokozott áteresztőképesség és retenció jelenségén alapulnak a polimer-hatóanyag konjugátumok számos gyógyászati vonatkozású előnyei, mint pl.:
35
-
a kemoterápia szempontjából hatékonyabb szervezetbeli eloszlás (feldúsulás a szolid tumorban) aminek következtében nemcsak terápiás, hanem diagnosztikai jelentőségük is lehet (102, 143, 144),
-
hosszabb felezési idő (144),
-
csökkent citotoxicitás, ezáltal enyhébb mellékhatások érhetők el (103),
-
enyhébb immunválasz (91).
A kisméretű szabad hatóanyagokat ezzel szemben minden sejt felveheti szabad diffúzió által (24, 102, 144, 207). A betegek kezelésére engedélyezett polimer terapeutikumok megjelenését jelentős mértékben segítették azok a szintetikus és szerkezetvizsgálati módszerek, amelyek e vegyületek reprodukálható előállítását és megbízható jellemzését lehetővé tették. I.2.1.1. A POLI-(N-VINILPIRROLIDON-CO-MALEINSAV) MAKROMOLEKULÁRIS GYÓGYSZERHORDOZÓ Kutatási munkám során a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és két tirozin kináz gátló hatóanyaggal létrehozott konjugátumainak analízisét végeztem kapilláris elektroforézises és gélszűrő kromatográfiás módszerekkel. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) olyan tulajdonsággal rendelkezik, amelyek lehetővé teszik gyógyszerhordozói minőségben való felhasználását: vizes oldatban polielektrolit, polianion jellegű, ami fontos szempont a gyógyszerhordozó makromolekulák megválasztásakor (144), akut toxicitási vizsgálatok szerint a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav), illetve nátrium sója (vizes oldatban adagolva) intraperitoneálisan 800 mg/kg, intravénásan pedig 200 mg/kg dózisnál sem okoz elhullást fehér egereknél (43), felszívódásáról kimerítő adatok állnak rendelkezésünkre (167). Az N-vinilpirrolidon homopolimerét régóta alkalmazzák vérplazma pótlására (164). A poli-(Nvinilpirrolidon-co-maleinsav) polimert liposzómás gyógyszerhordozók előállításához is felhasználták (212).
36
A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav)-hoz eddig számos hatóanyagot konjugáltak: -
2-metoxi-fenil-glicerint (43, 165) - a Relaxil-G gyógyszer hatóanyagát, amely görcsoldó, az izmok elernyedését okozza. A szervezetből azonban igen gyorsan, túlnyomó része változatlan formában ürül ki, s ez korlátozza a gyógyszer hatékonyságát;
-
kinidint (43, 165) - antiaritmiás szer, természetes eredetű alkaloid;
-
melphalant (165) - rákellenes hatóanyag, önmagában toxikus (LD50: 8-20 mg/kg7-9) és nem vízoldékony. Konjugált formában a vízoldékonysága a nyolcszorosára nő fiziológiás körülmények között. Akut toxicitási tesztek kimutatták, hogy míg a szabad melphalan intraperitoneálisan már 32 mg/kg-s dózisban letálisnak bizonyult fehér egereknél, addig a kojugált hatóanyag dupla mennyiségben sem okozott elhullást 10 napon belül;
-
gonadotropin releasing hormon analógokat: GnRH-III, MI-1544, MI-1892. Tumorsejtes tenyészetekben a hormon analógok antiproliferatív, apoptótikus hatása erőteljesebbé vált a konjugálást követően (170);
-
amiloridot ([3,5-diamino, 6-kloropyrazin-2-karbonil] guanidin) - in vivo kísérletekben kimutatták antimetasztatikus hatását (120). Konjugálás következtében in vitro rendszerben csökkentette a tumorsejtek inváziójának mértékét (169).
Konjugálás során a hatóanyagokat általában közvetlenül (pl. észter-, vagy savamid kötéssel) kapcsolták a makromolekuláris hordozó karboxil csoportjaihoz, de előfordult, hogy un. „spacer” csoportot is felhasználtak erre a célra, mint például a 6-aminokapronsavat (166), vagy oligopeptideket (170). A konjugátumokból a hatóanyag a kimotripszin aktivitása révén szabadult fel (155).
I.2.2. Tirozin kinázok és tirozin kináz inhibitorok A
tirozin
kinázok
azon
proteinkináz
család
fontos
tagjai,
amelyek
a
fehérjék
tirozinfoszforilációját katalizálják. Sejten belüli eloszlásukat, szerkezetüket és funkciójukat tekintetbe véve két nagy csoportra oszthatók (104): -
a sejtmembránba ágyazódott receptor tirozin kinázok, amelyek ligand (pl. számos növekedési faktor) által aktiválódnak. Fontosabb alcsaládok: EGFR (epidermiális növekedési faktor
37
receptor alcsalád), IR (inzulin receptor alcsalád), PDGFR (vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor alcsalád), HGFR (hepatocita növekedési faktor receptor alcsalád) -
nem receptor tirozin kinázok: lehetnek citoplazmatikus, sejtmembrán-asszociált, vagy nukleáris elhelyezkedésű fehérjék, fontos szerepük van az intracelluláris jeltovábbításban. Fontos alcsaládjaik: Src (Rous madár sarcoma), Jak (Janus arcú kináz), stb.
Szerkezetileg a receptor tirozin kináz molekulákon több domén is elkülöníthető: az extracelluláris rész a ligand megkötéséért felelős, a transzmembrán domén funkciója a receptor rögzítése a membránban, valamint szerepe lehet a jelátvitelben is. Az intracelluláris, 400-600 aminosavból álló kináz domén szekvenciája a legkonzervatívabb és a ligandkötés hatására létrejövő biológiai válaszok kialakításáért felelős (50, 242). A kináz domént 12 aldomén építi fel: az N-terminális részen található az első négy aldoménből álló Mg-ATP komplex kötőhelye, ezt követi az összekötő aldomén, majd a C terminális részen a további hét aldoménből álló szubsztrátkötő hely (81). Az extracelluláris doménen kötődő ligand két receptormolekula dimerizációját hozza létre. Ezt követően a dimerizált receptorok intracelluláris doménjein található tirozin oldalláncaik autofoszforiláció hatására foszforilálódnak, a foszforilált tirozin oldalláncokhoz pedig különböző fehérjék kötődnek, amelyek a jelet intracellulárisan továbbítják (190). A nem receptor tirozin kinázok a katalitikus doménen kívül több fontos doménnel rendelkeznek, ezek közül a legismertebbek: SH2 (src homológia domén 2), amely segítségével tirozin oldalláncukon foszforilált fehérjékhez tudnak kapcsolódni, illetve az SH3 (src homológia domén 3), amely prolinban gazdag aminosavszekvenciákat képes felismerni, és azokhoz kötődni. E két domén segítségével a nem receptor tirozin kinázok bonyolult fehérje-fehérje kapcsolatokat tudnak kialakítani, amelyeknek nagy szerepük van a növekedési faktorok jelpályarendszerének kialakulásában (3). A receptor tirozin kinázok autofoszforilációja olyan bonyolult szignáltranszdukciós kaszkádokat indít el, amelyek a sejt számos élettani folyamatát, például a sejtciklus és a sejtnövekedés szabályozását, a sejt osztódását, differenciálódását, apoptózisát, adhézióját is befolyásolhatják, ezenkívül pedig részt vesznek a T és B sejtek aktiválásában, az onkogenezisben, angiogenezisben, szabályozzák a glukóz felvételét (163). A tirozin kináz molekulák rendellenes
38
működése összefüggésben áll egyes daganatos megbetegedésekkel, illetve más kórokkal, mint például az atherosclerosis, psoriasis, immundefficiencia, diabetes (3, 163). A tirozin kinázok rendellenes működésének hátterében állhat a fehérjék túltermelődése, vagy kódoló génjeik amplifikációja (126) (pl. EGFR glioblastoma, Src vastagbél és mellrák esetén), kromoszóma transzlokáció (75), vagy olyan génmutáció, ami a receptor dimerizációját idézi elő (215), vagy a katalitikus helyét érinti (192). Mindkét utóbbi esetben megnő az érintett tirozin kinázok enzimaktivitása. Tirozin kináz inhibitorok A tirozin kinázok gátlása lehetőséget nyújt a daganatos megbetegedések terápiájához. Az utóbbi egy évtized
során
számos
tirozin
kináz
inhibitort
fedeztek
fel:
ATP
analógokat,
peptidomimetikumokat, biszubsztrát analógokat, SH2 domén-, vagy szubsztrátblokkolókat (133). Kémiai szerkezetüket tekintve a tirozin kináz gátló molekulák roppant változatosak, pl. vannak közöttük quinozalinok, quinoxalinok, quinolinok, pirimidinek, kumarinok, dianilinoftalimidek, benzquinonok, naftoquinonok, antraquinonok, diindolmaleimidek, tirfosztinok és mindezeknek a származékai (4, 29, 133, 136). A tirozin kináz gátló molekulák tervezési stratégiája több lépésből tevődik össze. Elsősorban a célmolekula szerkezeti feltérképezéséből (az aktív ágensek szerkezete, az enzim ligandkötő helyének geometriai szerkezete, stb.) kell kiindulni. A kétdimenziós és
a háromdimenziós szimulációk (hasonlóságon alapuló algoritmusok,
bioizoszterikus megközelítés) során lehetőség nyílik a potenciális gátlószerek számítógépes modellezésére. Végül sor kerül a kiválasztott, megfelelő szerkezettel és fiziko-kémiai paraméterekkel rendelkező vegyületekből álló kombinatórikus könyvtárak laboratóriumi szintézisére (12).
I.2.3. Multidrog rezisztencia és multidrog rezisztencia ellenes hatóanyagok Már az 1960-as években kimutatták, hogy bizonyos membránfehérjék képesek arra, hogy különböző vegyületeket juttassanak át a sejthártyán, a koncentráció grádiens ellenében (201). Ezeknek a transzporter fehérjéknek nagyon népes alcsaládját képezik az ABC fehérjék, amelyek elnevezésüket a szerkezetükben közös és konzervatív („highly conserved”) ATP-kötő
39
doménjükről kapták (ABC = ATP Binding Cassette) (92). Kemoterápiás kezelések során gyakran előfordul, hogy a tumoros sejtek ellenállnak a citotoxikus hatóanyagok széles skálájának és meghiúsítják ezáltal a terápia hatékonyságát. Egyes esetekben a tumoros sejtek eleve multidrog rezisztensek, de akár a kezelés során is kialakulhat a multidrog rezisztencia, tehát az eredetileg érzékeny sejtek rezisztenssé válhatnak az ismételten alkalmazott terápia során (198). A multidrog rezisztencia jelenségét az 1970-es években írták le először, amikor egér tumoros sejtekben az antraciklin, vinca alkaloidok és később a daunomicin aktív, kifelé irányuló transzportját észlelték (45). 1979-ben ugyanerre a jelenségre hívták fel a figyelmet humán leukémiás limfoblasztok esetében is (18). A multidrog rezisztencia kialakulása minden esetben egy MDR gén által kódolt, 170 kDa membrán glikoprotein fokozott termelődéséhez kötődött, amelyet MDR1 fehérjének, vagy P-glikoproteinnek neveztek el (P-gp, P = permeabilitás). Humán sejtekben az MDR gén két típusát: MDR1 és MDR2 (MDR3-nak is nevezik helyenként) klónozták és szekvenálták (36). Míg az MDR1 fehérje részt vesz a multidrog rezisztencia kialakulásában (76, 214) és elsősorban a bélben, agyban, szívben és vesében termelődik (134), addig az MDR2 fehérje foszfatidil transzlokáz funkciót lát el elsősorban a májban, de előfordul lépben, mellékvesében, szívben és izomban (185). Az 1990-es években újabb ABC membránfehérjéket fedeztek fel, amelyek összefüggésben állnak a multidrogrezisztenciával: MRP (MDR-related protein), MXR (mitoxantrone resistance) (134, 140). Ugyanakkor a multidrog rezisztencia kialakulásában a különböző transzporter funkcióval rendelkező ABC fehérjék mellett fontos szerepet játszik a tumor vérellátottsága, a véredények falának áteresztőképessége, a kemoterápiás hatóanyagok diffúziója a sejtközötti állományban, tehát a kemoterápia hatékonysága tulajdonképpen az összes tényező együttes kölcsönhatásától függ (140).
40
Az MDR1 fehérje szerkezete Az MDR1 fehérje két azonos szerkezetű alegységből és az ezeket összekötő régióból épül fel. Mindkét alegység egy-egy amino terminális hidrofób doménből áll, melyet 6-6 transzmembrán egység alkot és egy-egy citoplazmában elhelyezkedő, hidrofil doménből, mely egy-egy ATP-kötő hellyel rendelkezik (56). Az egyik, vagy mindkét ATP-kötő helyen
sejtmembrán citoplazma
10. ábra. Az MDR1 fehérje szerkezete (140) előidézett mutáció a multidrog rezisztencia megszűnését vonta maga után, ami arra utalt, hogy a különböző szubsztrátok kifelé irányuló szállításában mindkét ATP-kötő helynek van szerepe (183). A fehérje első extracelluláris hurkához három glikozid lánc kötődik, amelyeknek úgy tűnik, nincs szerepük a fehérje transzport funkciójában (19). Az MDR1 fehérjét több helyen is foszforilálják (79) a cAMP-függő proteinkináz A és a proteinkináz C (34, 148). A foszforiláció kísérletes stimulálása a multidrog rezisztencia felerősödését váltotta ki (61), míg protein kináz inhibitorok jelenlétében a kemoterápiás hatóanyagok felhalmozódását figyelték meg a korábban rezisztens sejtekben. (16). Mindez arra utalt, hogy az MDR1 fehérje transzporter funkcióját foszforiláció-defoszforiláció útján is lehet befolyásolni. Az MDR1 fehérje funkciója, szubsztrátjai, hatásmechanizmusai Funkcióját tekintve az MDR1 fehérje sokféle testidegen vegyület kifelé irányuló, aktív transzportját végzi, ezáltal védelmezi a sejteket a citotoxikus hatóanyagoktól és fontos szerepe van a vér-agygát, illetve a vér-heregát fenntartásában (51, 188). Egereken végzett kísérletekben
41
az MDR1 gének kiiktatása nem volt letális hatású, de az egerek érzékenyebbekké váltak a toxikus vegyületekkel szemben (216). Az MDR1 fehérje szubsztrátjainak száma akár több százra is tehető (189). Ezek általában hidrofób, amfolit, vagy gyenge pozitív töltésű molekulák, mint például: antraciklinek (daunorubicin, doxorubicin, epirubicin), antracének, vinca alkaloidok (vinblasztin, vinkrisztin), kolchicin, actinomycin D, HIV-1 proteáz inhibitorok, fluoroforok (calcein-AM, fura-2 AM, rhodamin) (140). Az MDR1 fehérje szubsztráttranszportjának pontos molekuláris mechanizmusa még egyelőre nem teljesen tisztázott, az irodalomban több elmélet is létezik (228). Az egyik legnépszerűbb modell az un. „hidrofób porszívó” („hydrophobic vacuum-cleaner”) (177), mely szerint az MDR1 fehérje két alegysége egy transzmembrán csatornát képez és képes kipumpálni a hidrofób molekulákat a citoplazmából, vagy akár még mielőtt elérnék a citoplazmát, miközben átdiffundálnak a membrán kettős lipidrétegén. Ennek a modellnek másik változata az un. „membrán porszívó” („membrane vacuum-cleaner”) (202), mely szerint mindkét alegység rendelkezik egy-egy szubsztrátkötő hellyel, az ATP hidrolízise pedig olyan konformációs változást idéz elő, mely lehetővé teszi, hogy a szubsztrátkötő helyhez kapcsolódott molekulák bekerüljenek az MDR1 fehérje belső csatornájába. Egy újabb ATP molekula megkötése révén a szubsztrát molekulák kilökődnek a belső csatornából a sejtmembrán külső részén. A Higgins által javasolt modell (93) szerint az MDR1 fehérje „flippázként” („flippase”) működik: a szubsztrátot akkor köti meg, amikor az már beágyazódott a membrán belső lipidrétegébe, átjuttatja a külső lipidrétegbe és ott szabadon engedi. Sok adat az irodalomban azt bizonyítja, hogy az MDR1 fehérje molekulapárokat is képes megkötni, mégpedig más-más szubsztrátkötő helyeken (228). Ayesh és munkatársai például leírták (9), hogy az MDR1 fehérje legalább két szubsztrátkötő hellyel rendelkezik. Míg az egyikhez elsősorban vinblasztin, tamoxifen és mefloquin kötődik, a másikhoz verapamil, dipiridamol, kinidin, ugyanakkor a ciklosporin A mindkét szubsztrátkötő helyhez képes kötődni. Újabb feltételezések szerint az MDR1 fehérjének csak közvetett szerepe van a multidrog rezisztencia kialakulásában azáltal, hogy a fehérje túltermelése miatt megváltozik a sejtek intracelluláris pH-ja és a membránpotenciál (226).
42
Multidrog rezisztencia ellenes stratégiák A multidrog rezisztencia ellenes stratégiák egy része az MDR1 fehérje szintézisét veszik célba: transzkripciós, transzlációs inhibitorok alkalmazásával, a poszttranszlációs módosítások (foszforiláció) gátlása által, vagy szignáltranszdukciós úton, például a proteinkináz C gátlása révén próbálják szabályozni a fehérje működését (198). A másik célpont a fehérje funkciójának a gátlása,
amelyre
szubsztrát
analógokat,
ATP-kötőhely
inhibitorokat,
vagy
specifikus
monoklonális ellenanyagokat fejlesztenek ki (188, 198). Az MDR1 fehérje aktivitását szabályzó vegyületek például kálciumcsatorna blokkolók (verapamil, diltiazem), kalmodulin antagonisták (pimozid, klórpromazin), antiaritmiás szerek (kinidin, propafenon), vérnyomáscsökkentők (rezerpin, propranolol), hormonok (progeszteron, tamoxifen), antihisztamin szerek (terfenadin, prometazin), maláriaellenes szerek (quinin, mefloquin) (140). A felsorolt vegyületeknek a pontos hatásmechanizmusa nem minden esetben ismert, de a legtöbb vegyület a következő kategóriákba sorolható: kompetitív inhibitorok, nemkompetitív (allosztérikus) inhibitorok, vagy gyorsan diffundáló molekulák (9, 10, 140). Ez utóbbiak lipofil jellegüknek köszönhetően gyorsan bediffundálnak a sejtbe, majd az MDR1 fehérje aktív, kifelé irányuló transzportját követően ismét gyorsan bediffundálnak a sejtbe, ezáltal gyakorlatilag „lefoglalják” az MDR1 fehérjéket. Gyorsan diffundáló vegyület, pl. a verapamil (10). A kezdetben kipróbált MDR1 fehérje inhibitorok többsége toxikus mellékhatásokkal is rendelkezik (188). Ezzel szemben a nagyon hidrofób, L-aminosavakból álló, a karboxil és az amino végeken nagytérfogatú aromás, vagy alkil vegyületekkel védett di- és tripeptid származékok (reverzinek) alacsony toxicitású, a szervezetben könnyen bomló MDR1 fehérje modulátorok, néhányuk ugyanakkor szubsztrátja is a transzportfehérjének (188, 193, 194).
43
II. CÉLKITŰZÉSEK Kutatási
programom
általános
célkitűzése
az
volt,
hogy olyan
nagy hatékonyságú
elválasztástechnikai módszereket dolgozzak ki és optimalizáljak, amelyeknek mindegyike másmás
szempontból
teszi
lehetővé
a
vizsgált,
daganatellenes
terápiában
alkalmazható
gyógyszerjelölt molekulák analízisét és bizonyos fiziko-kémiai paramétereiknek a jellemzését. A k” módosított retenciós faktor jellemzése során a függvény tulajdonságainak a tanulmányozását és a hidrofóbicitás számszerűsítésére való alkalmazhatóságát tűztem ki célul. Kutatási programom tételes célkitűzései a következők voltak: 1.
A
gyógyszerhordozó
polimer:
a
poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav)
és
konjugátumainak vizsgálata 1a. Az analízisekhez alkalmas
- szabad zónás kapilláris elektroforézis - micelláris elektrokinetikus kromatográfiás - gélkromatográfiás módszerek kidolgozása és optimalizálása.
1b. A polimer molekulák jellemzése a három elválasztástechnikai módszerrel kapott eredmények összevetése alapján. 2. A potenciálisan multidrog rezisztencia ellenes peptidek vizsgálata 2a. Az analízisekhez alkalmas
- micelláris elektrokinetikus kromatográfiás - fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszerek kidolgozása és optimalizálása.
2b. A peptidek hidrofóbicitásának meghatározása mindkét elválasztástechnikai módszerrel és a multidrog rezisztencia ellenes aktivitásukkal való összehasonlítása. 3. A k” módosított retenciós faktor jellemzése
44
3a. Az alkilbenzol és alkilfenon homológ sorok a szakirodalomból átvett, micelláris elektrokinetikus kromatográfiás mérési adatai alapján számolt k” módosított retenciós faktorok jellemzése. 3b. Az általam vizsgált hidrofób peptidek micelláris elektrokinetikus kromatográfiás mérési adatai alapján számolt k” módosított retenciós faktorok jellemzése.
III. KÍSÉRLETI RENDSZER Kutatási munkám során a következő módszereket alkalmaztam: -
szabad zónás kapilláris elektroforézist, micelláris elektrokinetikus kromatográfiát és gélszűrő kromatográfiát
a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumai vizsgálatára;
felvettem a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) titrálási görbéjét is; -
micelláris
elektrokinetikus
kromatográfiát
és
fordított
fázisú
nagy
nyomású
folyadékkromatográfiát a multidrog rezisztencia ellen tervezett peptidek vizsgálatára és a mérési eredmények alapján számolt retenciós faktorokat összehasonlítottam a peptidek MDR1 fehérje ATP-áz gátló aktivitásával; -
szakirodalmi adatok alapján és a saját mérési adatokból kiszámoltam két homológ sor és az általam vizsgált peptidek k’ és k” retenciós faktorait és számítógépes program segítségével meghatároztam a kémiai szerkezetük alapján számolt hidrofóbicitásukat.
III.1. Anyagok és eszközök III.1.1. Vegyszerek A kísérletekhez a következő analitikai tisztaságú vegyszereket használtam fel: nátriumborátot, nátriumhidroxidot, sósavat, nátriumkloridot, (Reanal, Budapest, Magyarország); foszforsavat, trietilamint (TEA) és nátriumdodecilszulfátot (NaDS) (Fluka, Buchs, Svájc); acetonitrilt (ACN), 45
metanolt (Chemolab, Budapest, Magyarország); Szudán III-t (Merck, Darmstadt, Németország). Az oldatok elkészítéséhez minden alkalommal ioncserélt, baktérium- és szerves szennyező mentes vizet használtam, amelyet az Elgastat UHP (Elga Ltd, Bucks, Anglia) víztisztító rendszerrel nyertem ki. Az eluenseket, puffereket, mintákat felhasználásuk előtt Spartan (Schleicher and Schüell, Dassel, Németország) 0,45 µm-es szűrővel szűrtem át. III.1.2. Vizsgált anyagok Kísérleteim során egy polimer gyógyszerhordozó molekula és két konjugátuma, valamint hidrofób peptidek analízisét végeztem. III.1.2.1. POLI-(N-VINILPIRROLIDON-CO-MALEINSAV) ÉS KONJUGÁTUMAI A makromolekuláris hordozó: poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav): P A gyógyszerhordozó polimert N-vinilpirrolidon és maleinsavanhidrid heterogén fázisú kopolimerizálásával állították elő. A monomerektől és oligomerektől megtisztított kopolimer elemanalízise alapján 1:1 összetételű (43) volt, átlagos molekulasúlya 10 kDa, polimerizációfoka DPn = 45.
11. ábra. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) monomerének kémiai szerkezete, „X” a konjugált molekula A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) előállítása benzolban, azo-(bisz izobutiro nitril) iniciátor jelenlétében történt. 58 mM maleinsav, 58 mM N-vinilpirrolidon, valamint 0,6 mM azo-(bisz izobutiro nitril) 40 ml benzolban való oldása után az oldott oxigén eltávolítása (30 perces
46
argonnal való átbuborékoltatással), a reakcióelegy argon atmoszférában 60 ºC-on 5 órán át történő folyamatos kevertetése, majd a keletkező termék szűrése, kloroformos mosása következett. A szintézist a makrolekuláris hordozó ultraszűrése követte Amicon YM 02 membránon
(Amicon,
Witten,
Németország,
amelynek
kizárási
határa
10
kDa),
a
polimerizációból kimaradt monomerek és oligomerek eltávolítása végett. A keletkezett termék minősítése
elemanalízissel,
tömegspektroszkópiával,
NMR,
valamint
infravörös
spektroszkópiával történt. A tirozinkináz gátló molekulák: TK1 és TK2 A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) makromolekuláris hordozóhoz az alábbi két tirozinkináz gátló molekulát kapcsoltuk, savamid kötésekkel:
TK1: 2-ciano-3-hidroxi–5-amino- 2pentenil (4’-trifluorometil anilid) pKa = 10,3
TK2:
(6’,
quinoxalinil)
7’
dimetil-1’-
4-(2’
amino)
acetanilid pKa = 4,4
12. ábra. A makromolekuláris hordozóhoz kapcsolt tirozinkináz gátló molekulák kémiai szerkezete A két tirozin kináz gátló molekula szintézise a (168) szerint történt.
47
A konjugátumok: P-TK1 és P-TK2 A P-TK1 konjugátum előállítása a TK1 molekula P hordozóhoz való kötésével, a P-TK2 konjugátum előállítása pedig a TK2 molekula P hordozóhoz kötésével történt. A P-TK1, illetve P-TK2 konjugátumok szintézise a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és a TK1, illetve TK2 molekula
dimetilformamidban való oldásával és trietilamin
jelenlétében
3
órán
át
szobahőmérsékleten való kevertetésével történt. A keletkezett konjugátum etanolos lecsapása után a nem konjugálódott tirozinkináz gátló molekulák eltávolítása céljából a konjugátumokat 10 kDa-os molsúlyú kizárásos határértékkel rendelkező Amicon YM 02-es membránon szűrtük át. A szubsztitúció foka (UV spektrofotometriával) 12,3 ± 0,2 % volt a P-TK1, illetve 13,8 ± 0,2 % volt a P-TK2 esetében. A keletkezett termék minősítése elemanalízissel, tömegspektrometriával, NMR, valamint infravörös- és UV spektroszkópiával történt. III.1.2.2. A MULTIDROG REZISZTENCIA ELLENES PEPTIDEK Az alábbiakban felsorolt 1-8-as számú di-, tri- és tetrapeptidek a munkacsoportunk által szintetizált hidrofób, multidrog rezisztencia ellenes hatásra tesztelt, tehát potenciális reverzin molekulák. A peptideket hagyományos vizes fázisú módszerrel szintetizáltuk, a peptidszintézist követően a szabad karboxil- és amino- végződéseket védő csoportokat nem választottuk le. 1. [BOC-Pro-Glu(OH)]2-Lys-OMe 2. (Z-Pro)2-Lys-OMe 3. [BOC-Pro-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe 4. [BOC-Asp(OBzl)]-Lys(Z)-OtBu 5. [BOC-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe 6. [BOC-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe 7. [BOC-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe 8. FMOC-Glu[Lys(Z)OtBu]2 A védőcsoportok rövidítései: BOC: t-butiloxikarbonil; tBu: t-butil; Z: benziloxikarbonil; FMOC: 9-fluorenilmetiloxikarbonil; Bzl: benzil; Me: metil.
48
A
petidkötések
létrehozásához
az
aminosavak
karboxil
csoportját
egyenértékű
diciklohexilkarbodiimiddel aktiváltuk dimetilformamidban, egyenértékű N-hidroxibenztriazol jelenlétében. Az uretánnal védett aminocsoportokkal rendelkező aminosavak rendre a C terminális peptidlánc szabad aminocsoportjaihoz kapcsolódtak. A reakcióelegy pH-ját trietilaminnal 7 és 8 közötti értékre állítottuk be. Az elegyet 24 óra
hosszat kevertük
szobahőmérsékleten. A párolgás után visszamaradt törzsoldatot etilacetátban vettük fel, majd rendre 2 M KHSO4 oldattal, telített NaHCO3 oldattal, végül pedig telített sóoldattal mostuk át. A szerves fázist nátriumszulfát segítségével szárítottuk, majd szűrés után elgőzölögtettük, mígnem egy olajos jellegű elegyet nem kaptunk. A továbbiakban a keveréket etanol-víz, vagy metanol-víz összetételű oldatokból kristályosítottuk, illetve szükségszerűen újrakristályosítottuk. Befejezésül a peptideket szilikagél oszlopon (Merck szilikagél, 50´0,9 cm-es oszlop, BST, Magyarország) választottuk el, etilacetát:piridin:ecetsav:víz (480:20:6:11) összetételű eluens segítségével. A hidrolizált minták aminosav szekvenciájának meghatározását Beckman 6300 (Beckman, PaloAlto, CA, USA) aminosav elemzővel végeztük.
III.1.3. Eszközök III.1.3.1. A KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS KÉSZÜLÉK A szabad zónás kapilláris elektroforézis és a micelláris elektrokinetikus kromatográfiás vizsgálatok alkalmával ISCO Model 3850 Capillary Electropherograph (Lincoln, NE, USA) készüléket alkalmaztam. Az elválasztásokat nem módosított belső felületű, 50 µm belső átmérőjű és 375 µm külső átmérőjű öntött kvarc kapillárisban (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) végeztem, amelynek teljes hossza 60 cm, a detektorablakig pedig 40 cm. A minták injektálása a gyárilag beépített, változtatható osztásarányú mintaosztón (split) keresztül történt, a mérések során minden esetben az 1:1000 osztásarányt alkalmaztam, vagyis minden esetben az osztófejbe injektált minta 1/1000 része (1 µl mintából 1 nl) jutott a kapillárisba. Méréseim során mindkét: pozitív (anód az injektor felől), illetve negatív (katód az injektor felől) polaritást alkalmaztam.
A
feszültséget
5-30
kV-os
tartományban
változtattam.
A
detektálást
spektrofotométerrel végeztem. Az adatgyűjtést és feldolgozást az ISCO ChemResearch vezérlő, adatgyűjtő és adatfeldolgozó rendszerével végeztem.
49
III.1.3.2. A FOLYADÉKKROMATOGRÁF A gélkromatográfiás és a fordított fázisú nagy nyomású kromatográfiás analíziseket Varian HPLC berendezéssel (Varian, Zug, Svájc) végeztem, amelynek alkotórészei a Varian 9012 pumparendszer, Varian 9065 diódasoros detektor, Rheodyne 7125 injektor. A gélszűrést Biosil TSK 125: 300 mm ´ 7,5 mm oszlopon végeztem, 50 mm ´ 7,5 mm előoszloppal (BioRad, Pharmacia, Uppsala, Svédország). A fordított fázisú nagyhatékonyságú kromatográfiához Varian SP 5 ODS: 150 mm ´ 4 mm oszlopot használtam. III.1.3.3. A PH MÉRŐ A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) potenciometrikus titrálását Radelkis OP-208 digitális pH mérővel
(Radelkis,
Budapest)
és
Radelkis
OP-8083
típusú
kombinált
üvegelektród
alkalmazásával végeztem.
III.1.4. Pufferek Az elválasztások során alkalmazott pufferek pontos összetételét és jelölésüket a II. táblázat tartalmazza. A módszerkidolgozások során az analíziseket több pH-n is elvégeztem: kapilláris elektroforézis esetén a teljes pH skálát átfedő puffereket, folyadékkromatográfiás vizsgálatok elvégzésekor pedig az oszlop által megengedett pH tartományt átfedő puffereket alkalmaztam. A pH változtatása egyrészt lehetőséget adott a módszerek optimalizálására, másrészt pedig ezáltal hasznos információkhoz jutottam arra nézve, hogy az általam vizsgált molekulák hogyan viselkednek különböző pH értékeken, ami a molekulák egyes fiziko-kémiai paramétereinek a jellemzését tette lehetővé. A szakirodalomban a puffereket kapilláris elektroforézis analízisek során háttér elektrolitoknak, míg folyadékkromatográfiás elválasztások során eluenseknek nevezik.
50
II. táblázat A szabad zónás kapilláris elektroforézis, micelláris elektrokinetikus kromatográfia, valamint folyadékkromatográfia során alkalmazott háttér elektrolitok, illetve eluensek összetétele és jelölései
Foszfát eluensek / háttér elektrolitok: A1: 0,084 mól foszforsavat és 0,042 mól trietilamint oldottam vízben, végtérfogat: 1 liter, pH=2,25 A2: 75 mM nátriumdodecilszulfát A1 pufferben ---------------------------------------------------------------------------------------------------------B1: 0,084 mól foszforsavat és 0,084 mól trietilamint oldottam vízben, végtérfogat: 1 liter, pH=4,7 B2: 75 mM nátriumdodecilszulfát B1 pufferben ---------------------------------------------------------------------------------------------------------C1: 0,084 mól foszforsavat és 0,105 mól trietilamint oldottam vízben, végtérfogat: 1 liter, pH=6,0 C2: 75 mM nátriumdodecilszulfát C1 pufferben Borát háttér elektrolitok: A D1 és E1 jelű borát puffereket (157) alapján készítettem az alábbi törzsoldatok felhasználásával: 0,1 M HCl oldat; 0,1 M NaOH oldat, valamint nátriumborát törzsoldat (0,2 mól bórsav + 0,1 mól NaOH 1 liter vízben). D1: nátriumborát törzsoldat és 0,1 M HCl oldat 52,5:47,5 térfogatarányban, pH=7,7 D2: 75 mM nátriumdodecilszulfát D1 pufferben ---------------------------------------------------------------------------------------------------------E1: nátriumborát törzsoldat és 0,1 M NaOH oldat 50,1:49,9 térfogatarányban, pH=11,0 E2: 75mM nátriumdodecilszulfát E1 pufferben
51
III.2. Az alkalmazott vizsgálati módszerek leírása III.2.1. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumai vizsgálata III.2.1.1. A SZABAD ZÓNÁS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS ÉS MICELLÁRIS ELEKTROKINETIKUS KROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATOK A mintákból 2 mg/ml koncentrációjú vizes oldatokat készítettem az analízisekhez, majd 0,45 µmes szűrőn szűrtem át. Az analízishez 20 µl térfogatot injektáltam (osztásarány 1/1000). A detektálást spektrofotométerrel, 205 nm-en végeztem, 0,01-es érzékenységgel. Az egyes analízisek között a kapillárist pufferrel öblítettem 5 percig. A kapillárist naponta regeneráltam az analízisek megkezdése előtt 0,1 N nátriumhidroxiddal, vízzel és 0,1 N sósavval, egyenként negyedórás öblítéssel. A szabad zónás kapilláris elektroforézis és micelláris elektrokinetikus kromatográfiás módszerkidolgozások során az elválasztási körülmények optimalizálása és a polimer molekulák különböző pH-n való viselkedésének jellemzése céljából az analízisekhez rendre az alábbiakban felsorolt, gyakorlatilag a teljes pH skálát átfedő háttér elektrolitokat használtam. Míg alacsony pH-n az elektroozmótikus áramlás teljes mértékben visszaszorult, a pH emelése következtében egyre növekedett, tehát az alábbi háttér elektrolitok használata révén az elválasztásokat elvégeztem az elektroozmótikus áramlás hiányában és jelenlétében is: A1: TEAP puffer, pH =2,25 B1: TEAP puffer, pH =4,7 C1: TEAP puffer, pH =6,0 D1: nátriumborát puffer, pH = 7,7 E1: nátriumborát puffer, pH = 11,0 Micelláris rendszerben a felsorolt pufferekhez 25-150 mM tartományban adagoltam a nátrium dodecilszulfátot (NaDS) az optimális tenzidkoncentráció meghatározásának céljából. Az elválasztás hatékonyságának szempontjából a 75 mM-os NaDS koncentráció bizonyult a
52
legmegfelelőbbnek. Ennek megfelelően micelláris elektrokinetikus kromatográfiás rendszerben az analíziseket a következő háttér elektrolitokkal végeztem, az elektroozmótikus áramlás hiányában és jelenlétében: A2: TEAP puffer, pH=2,25; 75 mM NaDS B2: TEAP puffer, pH=4,7 ; 75 mM NaDS C2: TEAP puffer, pH =6,0; 75 mM NaDS D2: nátriumborát puffer, pH= 7,7; 75 mM NaDS E2: nátriumborát puffer, pH= 11,0; 75 mM NaDS A módszerkidolgozások során pozitív és negatív polaritásokat alkalmaztam, a feszültséget 5-30 kV-os tartományban változtattam. A feszültség változtatásával ugyancsak arra törekedtem, hogy jó felbontású, gyors elválasztást végezhessek, ugyanakkor viszont a Joule hő következtében történő felmelegedés ne okozza buborékok keletkezését a pufferben. Szabad zónás kapilláris elektroforézis és micelláris elektrokinetikus kromatográfiás elválasztások során az egyes analíziseknél minden mérési pontban négy injektálásból határoztam meg a migrációs időket. III.2.1.2. A GÉLKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATOK A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) makromolekuláris gyógyszerhordozó és a P-TK1, PTK2 konjugátumok gélkromatográfiás vizsgálatához használt Biosil TSK 125 oszlop holttérfogata V0 = 7ml volt. A mintákból 1mg/ml koncentrációjú vizes oldatokat készítettem, majd 0,45 µm-es szűrőn szűrtem át. Az előkészített mintákból minden alkalommal 20 µl-t injektáltam. Az analíziseket izokratikus körülmények között készítettem, az átfolyási sebesség optimalizálását követően egységesen 1 ml/perc átfolyási sebességgel, a következő eluensek felhasználásával: A1: TEAP, pH =2,25 B1: TEAP, pH = 4,7 C1: TEAP, pH = 6,0
53
A kapilláris elektroforézis módszerekhez hasonlóan az analíziseket több pH értéken is elvégeztem, egyrészt az elválasztási paraméterek optimalizálásának céljából, másrészt a makromolekulák különböző pH-n való viselkedésének jellemzése céljából. Az általam használt gélkromatográfiás oszlop esetében az eluens pH-ja nem haladhatta meg a 6-os pH értéket. A detektálást diódasoros spektrofotométerrel végeztem. Az egyes kromatográfiás analíziseknél minden mérési pontban négy injektálásból határoztam meg a retenciós időket. III.2.1.3. A POTENCIOMETRIKUS TITRÁLÁSI GÖRBE FELVÉTELE Az elektródot Radelkis K-21 (pH = 2,16) és Radelkis K-91 (pH = 9,1) standard oldatokkal kalibráltam. Mérőoldatként 0,2 N NaOH oldatot alkalmaztam, a titrált poli-(N-vinilpirrolidon-comaleinsav) koncentrációja 1,074 mM volt.
III.2.2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidekkel végzett vizsgálatok III.2.2.1. A MICELLÁRIS ELEKTROKINETIKUS KROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATOK A mintákból 1 mg/ml koncentrációjú oldatokat készítettem 1:1 térfogatarányú acetonitril és víz eleggyel, majd 0,45 µm-es szűrőn szűrtem át. Az analízishez 10 µl térfogatot injektáltam (osztásarány 1/1000). A detektálást spektrofotométerrel 205 nm-en végeztem, 0,02-es érzékenységgel. Az egyes analízisek között a kapillárist pufferrel öblítettem 5 percig. A kapillárist naponta regeneráltam az analízisek megkezdése előtt 0,1 N nátriumhidroxiddal, vízzel és 0,1 N sósavval, egyenként negyedórás öblítéssel. Az elválasztási paraméterek optimalizálása során a minták analízisét rendre a teljes pH skálát átfogó háttér elektrolitokkal végeztem, amelyekhez 25-150 mM tartományban adagoltam a NaDS-t, a feszültséget pedig 5-30 kV-os tartományban alkalmaztam. Mivel a pufferek 75 mM-os NaDS tartalma bizonyult optimálisnak, az analíziseket az alábbi háttér elektrolitok felhasználásával végeztem el:
A2: TEAP puffer, pH=2,25; 75 mM NaDS
54
B2: TEAP puffer, pH=4,7 ; 75 mM NaDS C2: TEAP puffer, pH =6,0; 75 mM NaDS D2: nátriumborát puffer, pH=7,7; 75 mM NaDS E2: nátriumborát puffer, pH=11,0; 75 mM NaDS Micelláris elektrokinetikus kromatográfiában a mintakomponensek k', k” és k’ion retenciós faktorait a [23], [24], valamint a [25] képletek szerint számoltam. A t0 értékét 1 µl aceton injektálásával, a tmc értékét pedig 10 µl Sudan III (1mg/ml acetonitrilben) injektálásával határoztam meg. Az egyes analíziseknél minden mérési pontban négy injektálásból határoztam meg a migrációs időket. III.2.2.2. A FORDÍTOTT FÁZISÚ NAGY NYOMÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATOK A hidrofób peptidek analíziséhez alkalmazott Varian SP 5 ODS oszlop holt ideje t0=1,1 perc volt, melyet víz injektálásával határoztam meg. A mintákat 1mg/ml eluensben oldottam, majd 0,45 µm-es szűrőn szűrtem át, a detektáláshoz diódasoros detektort használtam. Az optimális eluens összetétel meghatározásának céljából a módszerkidolgozás során az analíziseket A1: 0,25 N TEAP puffer (pH 2,25) és acetonitril grádiensekkel, 0,5-2ml/perc átfolyási sebességekkel végeztem. Az optimalizálást követően az analíziseket 0,7 ml/perc átfolyási sebességgel, izokratikus körülmények között készítettem a következő összetételű eluenssel: 36% A1 (TEAP puffer, pH 2,25) : 64% ACN (v/v) A k’HPLC retenciós faktort a [22] képlet alapján számoltam ki. Az egyes kromatográfiás analíziseknél minden mérési pontban négy injektálásból határoztam meg a retenciós időket.
III.2.2.3. A MULTIDROG REZISZTENCIA ELLENES AKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA
55
Az általam vizsgált peptidek multidrog rezisztencia ellenes hatását együttműködésünk keretében Dr. Sarkadi Balázs munkacsoportja határozta meg az Országos Hematológiai és Immunológiai Intézetben, Sf9 rovar sejtvonalból izolált sejtmembrán preparátumokon. A sejtmembránokban humán MDR1 fehérjéket expresszáltattak és ATP-áz aktivitását mérték a hidrofób peptidek jelenlétében, illetve hiányában (17, 187). Ez az eljárás gyors „in vitro” szűrőmódszer, amellyel kiszűrhetők az MDR1 fehérje szubsztrátjai, illetve modulátorai. Az ED50-es érték azt a peptid koncentrációt jelenti (nM), amely felére csökkenti az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitását. A koncentráció-hatás összefüggés támpontot nyújt a molekula hatékonyságának megállapítására: alacsony ED50 érték esetében fokozott biológiai hatás várható a potenciális reverzin molekula részéről.
III.2.3. A k” módosított retenciós faktor jellemzése III.2.3.1. AZ ALKILBENZOL ÉS ALKILFENON HOMOLÓG SOROK K’ ÉS K” RETENCIÓS FAKTORAINAK KISZÁMOLÁSA A következő két homológ sor micelláris elektrokinetikus kromatográfiás analíziseinek mérési adatait a szakirodalomból (156) vettük át és ezeknek alapján, a [23] és [24] képletekkel számoltuk ki az egyes vegyületek k’ és k” retenciós faktorait. A homológ sorok tagjai: Alkilbenzol sorozat: benzol, toluol, etilbenzol, propilbenzol, butilbenzol; Alkilfenon sorozat: acetofenon, propiofenon, butirofenon, valerofenon, hexanofenon.
III.2.3.2. A HIDROFÓB PEPTIDEK K’ ÉS K” RETENCIÓS FAKTORAINAK KISZÁMOLÁSA
56
A III.1.2.2. pontban felsorolt és ismertetett multidrog rezisztencia ellenes peptidek közül a 2-8-as számú hidrofób peptidek k’ és k” retenciós faktorait a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával kapott mérési adataink alapján számoltuk ki a [23] és [24] képletekkel. A peptidek kémiai szerkezetét a III.1.2.2. alfejezetben, a mérési körülményeket pedig a III.2.2.1. alfejezetben ismertettem. III. 2.3.3. A SZÁMOLT HIDROFÓBICITÁSOK (S) MEGHATÁROZÁSA A szakirodalomból vett két homológ sor és az általam vizsgált hidrofób peptidek számolt hidrofóbicitását a KOWWIN számítógépes programmal határoztuk meg, amely a molekulák szerkezete alapján, az un. „fragmens állandó” módszerrel számol (150). A számolt hidrofóbicitásokat a továbbiakban S-el jelölöm.
57
IV. EREDMÉNYEK Az eredmények ismertetése során zárójelben a római számokkal jelölt, az értekezés témájához kapcsolódó saját közleményekre hivatkozok.
IV.1. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumai vizsgálati eredményei Kutatási munkám során a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumai vizsgálatát szabad zónás kapilláris elektroforézis, micelláris elektrokinetikus kromatográfiás és gélszűrő kromatográfiás módszerekkel végeztem és felvettem a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) titrálási görbéjét.
IV.1.1. A szabad zónás kapilláris elektroforézissel végzett vizsgálatok eredményei (II) IV.1.1.1. A POLI-(N-VINILPIRROLIDON-CO-MALEINSAV) (P) VIZSGÁLATI EREDMÉNYEI A P makromolekuláris hordozó különböző pH-n való viselkedésének jellemzése és a módszer optimalizálásának céljából a szabad zónás kapilláris elektroforézis vizsgálatát a következő háttér elektrolitokkal végeztem: A1: TEAP puffer, pH = 2,25 B1: TEAP puffer, pH = 4,7 C1: TEAP puffer, pH = 6,0 D1: nátriumborát puffer, pH = 7,7 E1: nátriumborát puffer, pH = 11,0 A 13. ábrán a pH = 2,25; pH = 6,0 és pH = 11,0 , tehát az A1, C1 és E1 háttér elektrolitokkal végzett vizsgálatok elektroferogramjai láthatóak.
58
b
c
ABS 205 nm
a
migrációs idő, perc 13.ábra. A P makromolekuláris gyógyszerhordozó szabad zónás kapilláris elektroforézissel végzett vizsgálatainak elektroferogramjai a: pH = 2,25; A1 háttér elektrolit, feszültség: -23 kV, b: pH = 6,0; C1 háttér elektrolit, feszültség: -23 kV c: pH = 11,0; E1 háttér elektrolit, feszültség: +19 kV
59
2,25-ös pH-n az elektroozmótikus áramlás teljes mértékben elhanyagolható volt (t0=120 perc), ezért az ionok kizárólag saját elektroforetikus mobilitásuk hatására vándoroltak a kapillárisban. Fordított polaritás (anód a detektor felőli kapillárisvégnél) alkalmazásakor nagy felbontású elválasztást kaptam: egy különösen éles csúcsot 3,4 perces migrációs idővel és egy kissé szélesebbet 8,4 perces migrációs idővel [13. ábra]. Ugyanakkor a makromolekuláris hordozó pozitív polaritással (anód az injektor felőli kapillárisvégnél) végzett analízisekor nem kaptam csúcsokat. Az a tény, hogy a P makromolekuláris hordozó analízisekor csak negatív polaritással kaptam csúcsokat arra utalt, hogy a polimer pozitív és negatív polaritás esetében is az anód felé vándorolt, tehát negatív töltéssel rendelkezett. Mivel a P polimer számos szabad karboxil csoporttal rendelkezik, a negatív töltés jelenlétét csak az magyarázhatta, hogy a polimer láncon voltak olyan karboxil csoportok, amelyek már ezen az alacsony pH-n (pH = 2,25) is disszociáltak. Következtetésképpen a P makromolekula polianionként viselkedett a nagyon alacsony pH ellenére és ez olyan erős karboxil csoportok jelenlétére utalt, amelyek már 2,25-ös pH-n disszociáltak. Abban az esetben, ha a polimer karboxil csoportjainak savi erőssége megegyezne a borostyánkősav két karboxil csoportjának pKa értékeivel: pK1 = 4,16 és pK2 = 5,61 (146), akkor pH = 2,25 háttér elektrolit alkalmazásakor a P szabad hordozó karboxil csoportjai nem disszociálhattak volna és töltés hiányában egyáltalán nem mozoghattak volna a kapilláris belsejében, mivel ezen a pH értéken az elektroozmótikus áramlás is teljesen visszaszorul. Rios és munkatársai leírták, hogy polimerek esetében a karboxil csoportok savasabb jelleggel rendelkezhetnek a monomerek karboxil csoportjainál (180, 181). A szerzők felvették a maleinsavból és a vinilpirrolidonból előállított kopolimerek potenciometrikus titrálási görbéjét és arra a következtetésre jutottak, hogy a polimer molekulák savi erősségét nem lehet adott pKa értékekkel jellemezni, ehelyett a polimerláncon különböző savi erősségű karboxilok sorozatát találták. A maleinsavból és a vinilpirrolidonból készült kopolimer titrálási görbéje például szélesen elhúzódó, kismeredekségű volt, hiányoztak a két különböző savi erősségű karboxil csoportokra utaló lépcsők, amit a közeli savi erősségű karboxil csoportok jelenléte okozott. Dippy és munkatársai (49) leírták, hogy a karboxil csoportok saverősségét jelentősen befolyásolta a molekula konformációja, tehát a karboxil csoportok saverőssége és a makromolekulák konformációi szorosan összefüggnek és kölcsönösen befolyásolják egymást.
60
Az elektroferogramon kizárólag negatív polaritással megjelenő csúcsok a szakirodalmi adatokkal és a későbbi vizsgálatok eredményeivel összhangban azt bizonyították, hogy a makromolekula az elválasztás alatt polianionként viselkedett az alacsony pH ellenére, tehát olyan nagy savasságú karboxil csoportokkal rendelkezett, amelyek már ezen a pH-n is képesek voltak disszociálni. Az elválasztás során nem egy, hanem két csúcsot kaptam. A két csúcs megjelenését okozhatta egyrészt a makromolekula polidiszperzitása, másrészt a második csúcs jelenléte arra utalt, hogy a szakirodalmi adatokkal, az általam felvett titrálási görbének és a gélkromatográfiás vizsgálatok eredményeivel összhangban a P polimer molekulák olyan kevésbé erős karboxil csoportokkal is rendelkeztek, amelyeknek csak egy része disszociált 2,25-ös pH-n, ezért ezek a makromolekulák hosszabb (8,4 perces) migrációs idő alatt haladtak át a detektoron. A polimerek polidiszperz jellege miatt a különböző elválasztástechnikai módszerek alkalmazása során gyakori a több csúcs, vagy szélesen elhúzódó csúcsok jelenléte a kromatogramokon, vagy elektroferogramokon. A polidiszperzitás a polimerek egyik legáltalánosabb jellemzője, elsősorban a polimerizációs fok és a makromolekulák konformációjának különbözőségeiből ered. Az általam vizsgált poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) esetében mindehhez hozzáadódnak a különböző saverősségű karboxil csoportok jelenlétének köszönhető eltérések is. Monomerek és oligomerek jelenlétének a lehetőségét gyakorlatilag azért zárhatjuk ki, mivel a minták előkészítésekor a polimereket ultraszűrésnek vetettük alá, így eltávolítottuk az esetlegesen nem reagált monomereket és az oligomereket. 2,25-ös pH-hoz hasonlóan pH = 6,0 esetében a fordított polaritással kapott elektroferogram ismét két csúcsot ábrázolt, ezúttal 3,4 és 7,2 perces migrációs időkkel [13. ábra]. A pozitív polaritással végzett analízisek során a mintakomponensek ismét nem voltak detektálhatóak. A pH 6,0-ra való növelése már nem befolyásolhatta a nagy saverősségű karboxil csoportok disszociációs állapotát a 2,25-ös pH-ra jellemző állapothoz viszonyítva, következtésképpen az első csúcs migrációs ideje változatlan maradt. Ezzel szemben a pH emelése fokozta a gyengébb saverősségű karboxil csoportok disszociációs fokát, a nagyobb negatív töltés hatására megnőtt a P polimer molekulák elektroforetikus mobilitása, tehát már rövidebb migrációs idővel vándoroltak át a kapillárison. Mindez a két csúcs közeledését váltotta ki. pH = 11,0 esetében egyetlen, széles csúcsot kaptam 7,6 perces migrációs idővel és ellentétben az eddigi vizsgálati körülményekkel, pozitív polaritással [13. ábra].
61
11-es pH-n a P polimer összes karboxil csoportja disszociált, ugyanakkor az elektroozmótikus áramlás teljes mértékben felerősödött és mobilitása feltehetőleg meghaladta a P polianion elektroforetikus
mobilitását.
Ennek
következtében
az
elektroozmótikus
áramlás
arra
kényszerítette a makromolekulákat, hogy negatív töltésük ellenére a katód felé vándoroljanak és ezáltal lehetővé tette a detektálásukat pozitív polaritás (anód az injektor felől) esetén. Mivel 11-es pH értéken a P polimer összes karboxil csoportja disszociált, a rendszer képtelen volt megkülönböztetni az erős és kevésbé savas jellegű karboxil csoportokat tartalmazó makromolekulákat. Ezzel magyarázható, hogy 11,0-es pH-n az eddigiekben kapott két csúcs összemosódott és egyetlen, szélesen elhúzódott csúcsot eredményezett. Az elválasztás felbontása szempontjából a makromolekuláris hordozó analíziséhez a 2,25-ös pH bizonyult a legmegfelelőbbnek. IV.1.1.2. A P-TK1 ÉS P-TK2 KONJUGÁTUMOK VIZSGÁLATI EREDMÉNYEI A P makromolekuláris hordozóhoz hasonlóan a P-TK1 és P-TK2 konjugátumok szabad zónás kapilláris elektroforézis módszer kidolgozása során is a következő háttér elektrolitokkal végeztem az analíziseket: A1: TEAP puffer, pH = 2,25 B1: TEAP puffer, pH = 4,7 C1: TEAP puffer, pH = 6,0 D1: nátriumborát puffer, pH = 7,7 E1: nátriumborát puffer, pH = 11,0 A 14. és a 15. ábrán a pH = 2,25 és pH = 6,0, tehát az A1 és C1 háttér elektrolitokkal végzett vizsgálatok elektroferogramjai láthatóak. pH = 2,25-ös értéken a konjugátumok esetében is csak fordított polaritással kaptam csúcsokat, pozitív polaritással a makromolekulák nem voltak detektálhatóak. Az elektroferogramok több, széles csúcsot tartalmaztak és a szabad polimer gyógyszerhordozó vizsgálatához viszonyítva lényegesen hosszabb migrációs időket kaptam [14. és 15. ábrák]. Az a tény, hogy a konjugátumok detektálása csak fordított polaritással volt kivitelezhető, ismét polianionra jellemző viselkedésre utalt. Mivel a konjugálás csak 12,3%-os, illetve 13,8%-s szubsztitúciós fokkal ment végbe, a P hordozónak maradtak szabad karboxil csoportjai, amelyek
62
már 2,25-ös pH-n is deprotonálódhattak. Ezeknek a száma nyilván kevesebb volt, mint a P szabad hordozónak, ezért a konjugátumok kisebb negatív össztöltéssel rendelkeztek és ezzel magyarázható, hogy az analízis során hosszabb migrációs időket kaptunk a P szabad polimer migrációs idejéhez viszonyítva. A P-TK1 és P-TK2 molekulák vizsgálatakor kapott több és szélesebben elhúzódó csúcsok a konjugátumok fokozottabb polidiszperzitására utaltak. A P szabad polimerhez viszonyítva a PTK1 és P-TK2 konjugátumok fokozottabb polidiszperzitással rendelkeztek, mivel a már említett különbségeken kívül (polimerizációs fok, konformáció, szabadon maradt karboxil csoportok eltérő saverősségei), eltérhet a konjugálás szubsztitúciós foka, a kapcsolt molekulák és a szabadon maradt karboxil csoportok elrendezése a polimer láncon belül. A fokozottabb polidiszperzitás miatt gyengült az elválasztás felbontása és a két élesen elvált csúcs helyett több kisebb, vagy szélesen elhúzódó csúcs jelent meg mindkét konjugátum esetében. Ez a megfigyelés összhangban van a gélkromatográfiás vizsgálatok eredményeivel is.
63
b
ABS 205 nm
a
migrációs idő, perc 14. ábra. A P-TK1 konjugátum szabad zónás kapilláris elektroforézissel végzett vizsgálatainak elektroferogramjai a: pH = 2,25; A1 háttér elektrolit, feszültség: -23 kV b: pH = 6,0; C1 háttér elektrolit, feszültség: -23 kV
64
b
ABS 205 nm
a
migrációs idő, perc
15. ábra. A P-TK2 konjugátum szabad zónás kapilláris elektroforézissel végzett vizsgálatainak elektroferogramjai a: pH = 2,25; A1 háttér elektrolit, feszültség: -23 kV, b: pH = 6,0; C1 háttér elektrolit, feszültség: -23 kV
65
pH = 6,0 esetében a P-TK1 és P-TK2 konjugátumok ugyancsak fordított polaritással voltak detektálhatóak. Az elektroferogramokon egy-egy széles csúcsot kaptam 7,2 (P-TK1) és 7,5 (PTK2) perces migrációs időkkel, tehát a felbontás jelentősen csökkent a 2,25-ös pH-n végzett analízishez viszonyítva [14. és 15. ábrák]. pH > 6 értékeken nem kaptam megfelelő elválasztást a P-TK1 és P-TK2 konjugátumok analízise során (nincs mellékelt ábra). A konjugátumok analízisére is a 2,25-ös pH bizonyult a legmegfelelőbbnek a szabad zónás kapilláris elektroforézis elválasztás esetében.
IV.1.2. A micelláris elektrokinetikus kromatográfiával végzett vizsgálatok eredményei (II) A módszer optimalizálása során megállapítottam, hogy a 75 mM-os NaDS koncentráció bizonyult a legmegfelelőbbnek az elválasztás szempontjából, tehát a következőkben a 75 mM-os NaDS tartalmú, különböző pH-jú pufferekkel végzett analízisek eredményét ismertetem, mind a szabad gyógyszerhordozó, mind a konjugátumok esetében. IV.1.2.1. A POLI-(N-VINILPIRROLIDON-CO-MALEINSAV) (P) VIZSGÁLATI EREDMÉNYEI A P gyógyszerhordozó makromolekula analízisét a micelláris elektrokinetikus kromatográfiás módszerkidolgozás során az alábbi háttér elektrolitokkal végeztem: A2: TEAP puffer, pH =2,25; 75 mM NaDS B2: TEAP puffer, pH = 4,7 ; 75 mM NaDS C2: TEAP puffer, pH = 6,0; 75 mM NaDS D2: nátriumborát puffer, pH = 7,7; 75 mM NaDS E2: nátriumborát puffer, pH = 11,0; 75 mM NaDS A 16. ábrán a pH = 2,25 és pH = 11,0, tehát az A2 és az E2 háttér elektrolitokkal végzett vizsgálatok elektroferogramjai láthatóak. 2,25-ös pH-n, az elektroozmótikus áramlás hiányában, mind a negatív felületi töltéssel rendelkező NaDS micellák, mind a polianionként viselkedő P makromolekulák az anód felé vándoroltak, ezért a detektálhatóság érdekében fordított polaritást kellett alkalmazni. Gyenge felbontású csúcsok keletkeztek és a szabad zónás kapilláris rendszerben kapott migrációs időkhöz viszonyítva hosszabb: 17,6 és 32,2 perces migrációs időket regisztráltam [16. ábra].
66
A szabad zónás kapilláris elektroforézishez viszonyítva lényegesebben hosszabb migrációs idők arra utaltak, hogy a P polimer hordozó molekulák kölcsönhatásba léptek a NaDS micellákkal. Irodalmi adatok (74, 206, 231) azt bizonyítják, hogy bár a polimert nagy mérete meggátolja abban, hogy teljességében beleférhessen egy micellába, kölcsönhatás alakulhat ki a makromolekula bizonyos régiói, illetve a nátriumdodecilszulfát hidrofób szénlánca között. A kölcsönhatások „gyöngyfüzéreket” eredményeznek: egy polimer lánc hosszán akár több helyen is csoportosulhatnak nátriumdodecilszulfát molekulák, jelentősen lelassítva a makromolekula vándorlását, egyrészt a nagyobb negatív töltés, másrészt a megnövekedett molsúly következtében. 4,7-11-es pH tartományban pozitív polaritást alkalmaztam a makromolekuláris hordozó analíziséhez és ismét gyenge felbontású csúcsokat kaptam (nincs mellékelt ábra). pH = 11,0 esetében pozitív polaritással jó felbontású elválasztást kaptam, bár ismét nagyon hosszú migrációs időkkel: 12,7; 14,6; 15,4 és 39,8 perc [16. ábra]. Az elektroferogramokon ismét tapasztalható volt a polimer molekulák polidiszperz jellege: több csúcs, illetve uszályos csúcsok megjelenése. A polimerizációs fokból, konformációs eltérésekből és a karboxil csoportok különböző saverősségeiből eredő polidiszperzitáson kívül ebben az esetben a micellákkal való kölcsönhatásban való eltérések is fokozhatták a makromolekulák polidiszperzitását.
67
b
ABS 205 nm
a
migráció idő, perc 16. ábra. A P makromolekuláris gyógyszerhordozó micelláris elektrokinetikus kromatográfiával végzett vizsgálatainak elektroferogramjai a: pH = 2,25; A2 háttér elektrolit, feszültség: -5 kV b: pH = 11,0; E2 háttér elektrolit, feszültség: +5 kV
68
Bár nagyon hosszú migrációs időket eredményezett, a legjobb elválasztást micelláris rendszerben 11,0-es pH-n kaptam a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) vizsgálata során. IV.1.2.2. A P-TK1 ÉS P-TK2 KONJUGÁTUMOK VIZSGÁLATI EREDMÉNYEI A szabad P makromolekuláris gyógyszerhordozó vizsgálatához hasonlóan a P-TK1 és P-TK2 konjugátumok micelláris elektrokinetikus kromatográfiás analízisét is a következő háttér elektrolitokkal végeztem: A2: TEAP puffer, pH =2,25; 75 mM NaDS B2: TEAP puffer, pH = 4,7 ; 75 mM NaDS C2: TEAP puffer, pH = 6,0; 75 mM NaDS D2: nátriumborát puffer, pH = 7,7; 75 mM NaDS E2: nátriumborát puffer, pH = 11,0; 75 mM NaDS A 17. és 18. ábrán a P-TK1, illetve P-TK2 konjugátumok pH = 7,7 és pH = 11,0, tehát az D2 és az E2 háttér elektrolitokkal végzett vizsgálatok elektroferogramjai láthatóak. pH = 2,25 esetében széles és gyenge felbontású csúcsokat kaptam (nincs mellékelt ábra). A konjugátumok
detektálása
ismét csak fordított
polaritással
volt
lehetséges,
tehát
a
makromolekulák ismét polianionokként viselkedtek az alacsony pH ellenére. Mivel a konjugálás során a szubsztitúció csak részleges (TK1: 12,3% és TK2: 13,8%-os) volt, a konjugátumok rendelkeztek olyan szabad karboxil csoportokkal, amelyek nagy saverősségüknek köszönhetően már ezen az alacsony pH értéken is disszociálhattak és ezáltal negatív töltést kölcsönöztek a makromolekuláknak. pH = 7,7 esetében pozitív polaritással, aránylag rövid vizsgálati idő (< 20 perc) alatt jó felbontású elektroferogramokat kaptam mind a P-TK1, mind a P-TK2 estében [17. és 18. ábrák]. pH = 11,0 értéken ismét nagyon hosszú migrációs időket (44,9 és 48,4 perces) kaptam és gyakorlatilag egy-egy széles sávban elhúzódó csúcsot [17. és 18. ábrák]. A P-TK1 és P-TK2 konjugátumok
micelláris elektrokinetikus kromatográfiával végzett
vizsgálata során a pH = 7,7 érték bizonyult a legmegfelelőbbnek az elválasztás szempontjából. Az elektroferogramokon látható több csúcs megjelenését a konjugátumok fokozott polidiszperz jellege okozta. A konjugátumok polidiszperzitása több tényező: a különböző polimerizációs és a szubsztitúciós fokokból, a szubsztituensek eltérő elrendezőséből a polimer láncon, a szabadon
69
maradt karboxilcsoportok különböző saverősségeiből, a micellákkal való kölcsönhatásokból és a konformációs eltérésekből eredtek.
b
ABS 205 nm
a
migrációs idő 17. ábra. A P-TK1 konjugátum micelláris elektrokinetikus kromatográfiával végzett vizsgálatainak elektroferogramjai a: pH = 7,7; D2 háttér elektrolit, feszültség: +25 kV b: pH = 11,0; E2 háttér elektrolit, feszültség: +5 kV
70
b
ABS 205 nm
a
migrációs idő, perc 18. ábra. A P-TK2 konjugátum micelláris elektrokinetikus kromatográfiával végzett vizsgálatainak elektroferogramjai a: pH = 7,7; D2 háttér elektrolit, feszültség: +25 kV b: pH = 11,0; E2 háttér elektrolit, feszültség: +5 kV
71
IV.1.3. A gélkromatográfiás vizsgálatok eredményei (I) IV.1.3.1. A POLI-(N-VINILPIRROLIDON-CO-MALEINSAV) (P) VIZSGÁLATI EREDMÉNYEI A P makromolekuláris gyógyszerhordozó gélkromatográfiás vizsgálatát izokratikus rendszerben, rendre a következő eluensekkel végeztem: A1: TEAP puffer, pH = 2,25 B1: TEAP puffer, pH = 4,7 C1: TEAP puffer, pH = 6,0 A fenti eluensekkel kapott kromatogramok a 19. ábrán láthatóak. A módszer optimalizálása során az 1ml/perc átfolyási sebesség bizonyult a legmegfelelőbbnek az elválasztás szempontjából. pH = 2,25 esetében két, részlegesen egymásba olvadó főcsúcs jelent meg 14,0 és 14,8 perces elúciós időkkel [19. ábra]. pH = 4,7 esetében ugyancsak két főcsúcs jelent meg a kromatogramon. A második főcsúcs elúciós ideje nem változott a pH emelkedés dacára: 4,7-es pH-n is 14,8 perc maradt. Ezzel ellentétben, az első csúcs elúciós ideje jelentősen lerövidült: a kromatogramon a 6-14 perces tartományban szélesen elhúzódó alakban láthatjuk. Továbbá, 4,7-es pH-n a második csúcs aránya (amit a csúcsterületek értékeiből számoltam ki) kisebb volt a 2,25-ös pH esetéhez viszonyítva [19. ábra]. pH = 6,0 esetében a két csúcs teljesen szétvált. Az eddigiekben megfigyelhető irányzat tovább erősödött: a második csúcs aránya fokozottabban csökkent a 2,25-ös illetve 4,7-es pH-n kapott arányokhoz képest, míg elúciós ideje továbbra is 14,8 perc maradt. Az első csúcs továbbra is a 614-es tartományban húzódott, de már kevésbé uszályosan [19. ábra].
72
b
c
ABS 205 nm
a
5
10
15
5
15
5
15
retenciós idő, perc 19. ábra. A P makromolekuláris gyógyszerhordozó gélkromatográfiával végzett vizsgálatainak kromatogramjai a: pH = 2,25; A1 eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség b: pH = 4,7; B1 eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség c: pH = 6,0; C1eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség
73
A három kromatogram összehasonlításakor megfigyelhető, hogy a pH fokozatos emelésével az első csúcs elúciós ideje egyre rövidült, a második csúcs elúciós ideje viszont változatlan maradt. Ez azt jelenti, hogy a pH változása befolyásolta egyes makromolekulák elúciós idejét, másokét pedig nem. Mivel a szabad hordozó számos szabad karboxil csoporttal rendelkezik, a pH növelésével elvárható, hogy egyre több karboxil csoport disszociált, ezáltal a makromolekulák egyre több negatív töltéssel rendelkeztek és ez befolyásolhatta az elúciós időt. Ezzel magyarázható, hogy az első csúcs elúciós ideje folyamatosan rövidült a pH növelésével. A második csúcs elúciós ideje ezzel szemben változatlan maradt a pH növelése ellenére. Ez csak abban az esetben lehetséges, ha a makromolekula olyan karboxil csoportokkal is rendelkezett, amelyek minden pH értéken disszociáltak kezdettől fogva. Ez azt jelenti, hogy olyan saverősségű karboxil csoportoknak is jelen kellett lenniük, amely már 2,25-ös pH-n képesek voltak disszociálni. Rios és munkatársai leírták (181), hogy az intramolekuláris elektrosztatikus kölcsönhatások jelentősen befolyásolhatják a polielektrolitok (pl. polikarbonsavak) konformációját. Alacsony pH-n, ahol a karboxil csoportok nem disszociálnak, az intramolekuláris taszító erők hiányában a makromolekulák
kis
Stokes-rádiusszal
rendelkező
globuláris
alakot
vesznek
fel.
Gélkromatográfiás elválasztáskor a polimerek úgy viselkednek, mintha kis látszólagos molsúllyal rendelkeznének és nagy elúciós térfogattal mosódnak le az oszlopról. A pH fokozatos növelésével a karboxil csoportok rendre disszociálnak, a makromolekulán belül megjelennek és egyre erősödnek a taszító erők. Ennek hatására megnő a polimer molekulák Stokes-rádiusza. Gélkromatográfiás analízis során a makromolekulák nagy látszólagos molsúlyú molekulákhoz hasonlóan
viselkednek
és
kisebb
elúciós
térfogattal
mosódnak
le
az
oszlopról.
Következtetésképpen, a konformációs változás hatására, alacsony pH értékeken a polianionos makromolekulák látszólagos molsúlya kisebb, mint magas pH értékeken. A Rios és munkacsoportja által leírt megfigyelések segítséget nyújtanak az általam tapasztalt jelenség: az első csúcs elúciós idejének és a csúcs arányának pH-függő változásának a magyarázatához. Az általam kapott kromatogramokon (19. ábra) a második csúcs elúciós ideje változatlan maradt a pH változtatása ellenére. Ez a jelenség arra utalt, hogy a pH növelése nem befolyásolta egyes makromolekulák látszólagos molsúlyát, Stokes rádiuszát, tehát karboxil csoportjainak a disszociációs fokát. Ezek a makromolekulák olyan nagy saverősségű karboxil csoportokkal rendelkezhettek, amelyek már alacsony (2,25-ös) pH-n disszociáltak és ezáltal a pH további
74
növelése már nem lehetett hatással a deprotonálódásukra. Megfigyelésünk megerősítette a makromolekuláris hordozó kapilláris elektroforézissel és a titrálási görbe felvételekor kapott eredményeket, illetve a szakirodalomban közölt adatokat (180). Ezzel szemben az első csúcs elúciós ideje fokozatosan csökkent a pH növelésével [19. ábra]. Ez azt jelenti, hogy a nagy savi erősségű karboxil csoportok mellett a makromolekulákon gyengébb savi erősségű karboxil csoportok is találhatóak, amelyek a pH növelésével rendre disszociáltak és ezáltal befolyásolták az elválasztást. 2,25-ös pH-n a makromolekuláris hordozó karboxil csoportjainak zöme még nem disszociált, a polimer molekulák a taszító erők majdnem teljes hiánya miatt relatív kis Stokes rádiusszal rendelkeztek és ezzel magyarázható, hogy a leghosszabb elúciós idővel (14 perc) mosódtak le az oszlopról. 4,7-es pH-n a karboxil csoportoknak
nagyobb
hányada
disszociált.
A
több
taszító
erő
fellépése
miatt
a
makromolekuláknak megnőtt a hidrodinamikai térfogatuk és rövidebb (6-14 perces) elúciós idővel mosódtak le az oszlopról, ugyanakkor megnőtt a csúcs aránya is a 2,25-ös pH-n kapott csúcshoz viszonyítva. 6,0-os pH-n a makromolekuláris hordozó szabad karboxil csoportjainak túlnyomó része disszociált. A fellépő intramolekuláris taszító erők hatására megnőtt a molekulák Stokes rádiusza és ennek megfelelően nagy látszólagos molsúlyú molekulákhoz hasonlóan viselkedtek az elválasztás során. Az elúciós idő még mindig 6-14 perces maradt, de a 4,7-es pH-n kapott csúcshoz viszonyítva csökkent a csúcs uszályossága, tehát a makromolekulák zöme a 6-14 perces tartomány elején mosódott le az oszlopról. A 6,0-os pH-n kapott első csúcs aránya volt a legnagyobb az alacsonyabb pH értékekhez viszonyítva. Az első csúcs elúciós idejének pH-függő változása ugyancsak teljes összhangban volt tehát a Rios és munkatársai által leírt megfigyelésekkel (181) és a kapilláris elektroforézissel, illetve a titrálási görbe felvételekor kapott eredményekkel. Mindhárom kromatogram két-két csúcsot, illetve szélesen elhúzódó csúcsokat tartalmazott, tehát a gélkromatográfiás vizsgálat során is kimutatható volt a makromolekuláris hordozó polidiszperz jellege, ami a polimerizáció természetes következménye. A polidiszperzitás adódhatott a makromolekulák különböző polimerizációs fokából, a különböző saverősségű karboxil csoportok jelenlétéből és konformációs eltérésekből. A módszer optimalizálása során a pH = 6,0 bizonyult a legmegfelelőbbnek a poli-(Nvinilpirrolidon-co-maleinsav) gélkromatográfiás elválasztására.
75
IV.1.3.2. A P-TK1 ÉS P-TK2 KONJUGÁTUMOK VIZSGÁLATI EREDMÉNYEI A makromolekuláris hordozó P-TK1 és P-TK2 konjugátumainak gélkromatográfiás vizsgálatát izokratikus rendszerben, rendre a következő eluensekkel végeztem: A1: TEAP puffer, pH = 2,25 B1: TEAP puffer, pH = 4,7 C1: TEAP puffer, pH = 6,0 A fenti eluensekkel kapott kromatogramok a 20. és 21. ábrán láthatóak. A módszer optimalizálása során az 1ml/perc átfolyási sebesség volt a legmegfelelőbb az elválasztás szempontjából. pH = 2,25 esetében a P-TK1 kromatogramja hasonló volt a P makromolekuláris hordozó 2,25-ös pH értéken kapott kromatogramjához, azzal a különbséggel, hogy az első csúcs elúciós ideje 13,6 percre csökkent, a második csúcs pedig szélesen elhúzódó alakú volt [20. ábra]. A P-TK2 konjugátum kromatogramjára ugyancsak az elúciós térfogatok csökkenése és a fokozottabb polidiszperzitás okozta csúcsszélesedés volt jellemző [21. ábra].
76
b
c
ABS 205 nm
a
5
10 15
5
15
5
15
elúciós idő, perc
20. ábra. A P-TK1 konjugátum gélkromatográfiával végzett vizsgálatainak kromatogramjai a: pH = 2,25; A1 eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség b: pH = 4,47; B1 eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség c: pH = 6,0; C1eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség
77
b
c
ABS 205 nm
a
elúciós idő, perc 21. ábra. A P-TK2 konjugátum gélkromatográfiával végzett vizsgálatainak kromatogramjai a: pH = 2,25; A1 eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség b: pH = 4,47; B1 eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség c: pH = 6,0; C1eluens, 1 ml/perc átfolyási sebesség
78
pH = 4,7 esetében a P-TK1 kromatogramja még mindig részben elvált csúcsokat mutatott, az elúciós idők csak nagyon enyhén csökkentek és a két csúcs aránya (alapterületük függvényében határoztam meg) sem változott jelentősen. Csökkent a második csúcs szélessége [20. ábra]. A PTK2 konjugátum vizsgálatakor egyetlen szélesen elhúzódó csúcsot kaptam, tehát az elválasztási rendszer felbontóképessége jelentősen csökkent ezen a pH értéken [21. ábra]. pH = 6,0 esetében mindkét konjugátum analízisekor a makromolekulák egyetlen elhúzódó csúcsban és jelentősen rövidebb elúciós idővel (7-15 perces tartományban) mosódtak le az oszlopról [20. és 21. ábrák]. A P-TK1 és P-TK2 konjugátumok analízise során ugyanaz a pH függő jelenség volt megfigyelhető, mint a P szabad hordozó analízisekor kapott első csúcs esetében: az elúciós idők fokozatosan csökkentek a pH növelésével. Mivel a TK1 és TK2 molekulák rákapcsolása a P makromolekuláris hordozóra csak kis szubsztitúciós fokkal történt (TK1: 12,3% és TK2: 13,8%), a konjugátum molekulák is tartalmaztak szabad karboxil csoportokat. A szabadon maradt karboxil csoportok rendre disszociáltak a pH növelésének függvényében, a keletkezett negatív töltések miatt intramolekuláris taszító erők léptek fel, melyeknek hatására megnőtt a konjugátumok Stokes rádiusza, illetve látszólagos mólsúlya és a pH növelésével egyre rövidebb elúciós időkkel mosódtak le az oszlopról. Ugyanakkor a P szabad hordozóhoz viszonyítva a konjugátumok kisebb elúciós térfogattal mosódtak le az oszlopról, ami azzal magyarázható, hogy a konjugátumok nagyobb molsúllyal rendelkeztek, mint a szabad gyógyszerhordozó molekula. A kromatogramokon a csúcsok csak részben váltak el egymástól, vagy összemosódtak, de mindenképpen jellemzőek voltak a szélesen elhúzódó, uszályos alakú csúcsok, ami a szabad zónás kapilláris elektroforézissel és a micelláris rendszerben kapott elektroferogramokhoz hasonlóan a konjugátumok fokozott polidiszperzitására utalt. Polidiszperzitást előidéző tényezők a polimerizációs és a szubsztitúciós fokok eltérései, konformációs különbözőségek, különböző saverősségű karboxil csoportok jelenléte és a konjugált molekulák és a szabadon maradt karboxil csoportok különböző elrendeződése a polimer láncon belül.
79
IV.1.4. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) titrálási görbéje (II) A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) titrálási görbéje a 22. ábrán látható. A kapott titrálási görbe széles, elhúzódó jellegű volt, a titrálási görbe deriváltja pedig több csúcsot is mutatott. Mindez arra utalt, hogy a makromolekula nem csupán a monomerek kétféle, jól elkülöníthető saverősségű karboxil csoportjait tartalmazta, hanem a polimer láncon különböző erősségű karboxil csoportok sorozatai voltak jelen, amelyek a pH növelésével rendre disszociáltak. Ez a megfigyelés összhangban állt a Rios és munkatársai szakirodalomban közölt adataival (180, 181). A titrálási görbe pH = 1,8 értékről indult, ami azt bizonyította, hogy a P makromolekula olyan fokozott saverősségű karboxil csoportokkal is rendelkezett, amelyek már 2,25-ös pH-n képesek voltak disszociálni és így lehetővé tették, hogy a hordozó már ilyen alacsony pH-n is polianionként viselkedhessen a kapilláris elektroforézis és a gélkromatográfiás vizsgálatok során. A titrálási görbe kiindulási pontjából számolt pK = 0,7 kisebb, mint a borostyánkősav, azaz a monomer két karboxil csoportjának a pK(1) = 4,16 és pK(2) = 5,61 értékei. Ugyanezt a jelenséget figyelték meg Rios és munkatársai (180, 181): a polimerek karboxil csoportjai savasabb karboxil csoportokkal rendelkeztek, mint a monomerek. A kapott titrálási görbe és első deriváltjának alakja alapján a P makromolekuláris hordozó különböző saverősségű karboxil csoportok széles skálájával rendelkezett, ezek között pedig igen nagy saverősségű karboxil csoportok is előfordultak. Ezek a megfigyelések teljes mértékben összhangban voltak a P hordozó bemutatott vizsgálatai során kapott eredményekkel és a Rios és munkatársai által közölt adatokkal is (180).
80
a b
pH
∆pH / ∆V
22. ábra. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) titrálási görbéje és deriváltja a: titrálási görbe, b: első derivált
81
IV.2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidek vizsgálati eredményei Kutatási munkám során a multidrog rezisztencia ellen tervezett hidrofób peptidek vizsgálatát micelláris
elektrokinetikus
kromatográfiával
és
fordított
fázisú
nagy
nyomású
folyadékkromatográfiával végeztem. A kapott mérési adatok alapján kiszámoltam a peptidek hidrofóbicitását számszerűsítő k’, k” és k’HPLC retenciós faktorokat és összehasonlítottam a peptidek MDR1 fehérje ATP-áz gátló aktivitásával.
IV.2.1. A micelláris elektrokinetikus kromatogáfiával végzett vizsgálatok eredményei (III) Az elválasztási módszer optimalizálása során a minták analízisére rendre kis, közepes és magas pH értékű háttér elektrolitokat használtam, amelyek gyakorlatilag átfedték a teljes pH skálát. A módszer kidolgozása során 5-30 kV tartományba eső pozitív polaritású feszültségekkel dolgoztam és a háttér elektrolitokhoz 25-150 mM koncentrációs tartományban adagoltam a nátriumdodecilszulfátot (NaDS). Az analízisek elvégzéséhez a +21 kV feszültség és a 75 mM NaDS bizonyultak optimálisnak. A továbbiakban a következő háttér elektrolitokat használtam a vizsgálatokhoz: A2: TEAP puffer, pH =2,25; 75 mM NaDS B2: TEAP puffer, pH = 4,7 ; 75 mM NaDS C2: TEAP puffer, pH = 6,0; 75 mM NaDS D2: nátriumborát puffer, pH = 7,7; 75 mM NaDS E2: nátriumborát puffer, pH = 11,0; 75 mM NaDS 2,25-4,5 pH tartományban az apoláros peptid molekulák analízisekor nagyon hosszú migrációs időket kaptam, mivel ebben az alacsony pH tartományban az elektroozmótikus áramlás visszaszorult és az elválasztásra gyakorolt hatása elhanyagolható volt. A hosszú migrációs idők miatt az elektroferogramok csúcsai is rendkívül széleseknek bizonyultak (nincs mellékelt ábra).
82
ABS205 nm
8 2
4
7
15
1
30 migrációs idő, perc
23. ábra. Az 1, 2, 4, 7 és 8-as számú peptidek elválasztása micelláris elektrokinetikus kromatográfiával pH = 7,7 D2 háttér elektrolit, feszültség: +21 kV
83
Nagyon magas: 8,0-11,0 pH tartományban az elektroozmótikus áramlás jelentősen felgyorsította az elválasztandó komponensek vándorlását, ám ebben az esetben is gyenge felbontású, összemosódott csúcsok születtek (nincs mellékelt ábra). A hidrofób peptidek analízisére a 7,7-es pH-jú, 75mM NaDS tartalmú borát puffer (D2) bizonyult a legmegfelelőbbnek. A 23. ábrán a nyolc peptid közül az 1, 2, 4, 7, 8-as peptidek együttes injektálával végzett elválasztás elektroferogramja látható. Az analízisek során meghatároztam az egyes peptidek migrációs idejét (tm) és a [23], [24] képletek alapján kiszámoltam a peptidek k’ és k” retenciós faktorait. Kísérleti rendszeremben az elektroozmótikus áramlással mozgó komponensek migrációs idejét acetonnal határoztam meg és t0 = 5,6 perc értéket kaptam. A micellák migrációs idejét Sudan III (1 mg/ml
ACN)
injektálásával mértem meg, tmc = 40,2 perc volt. III. táblázat. A 2-8-as peptidek micelláris elektrokinetikus kromatográfiával meghatározott migrációs ideje, k’és k” retenciós faktora és biológiai hatása (ED50) Peptid
tm (perc)
k’
k”
ED50 (nM)
2
13,9
2,265
0,239
1 650
4
14,8
2,600
0,266
50
5
15,9
3,043
0,298
45
3
16,1
3,128
0,303
100
6
16,3
3,214
0,309
25
7
16,6
3,345
0,318
20
8
25,4
9,602
0,572
10
A III. táblázatban a 2-8-as peptidek olvashatóak a migrációs idők növekvő sorrendjében. A migrációs idők relatív standard deviációja: RSD < 2%. Az ED50 értékek azokat a peptid koncentrációkat jelentik (nM), amelyek felére csökkentették az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitását. Az 1. számú peptid mérési eredményeit a későbbiekben ismertetem. A III. táblázat alapján az a tendencia volt megfigyelhető, hogy minél hosszabb volt egy adott peptid migrációs ideje, vagyis minél apolárosabb volt és minél nagyobb k’ és k” retenciós
84
faktorokkal rendelkezett, annál kisebb volt a biológiai teszttel kapott ED50 értéke, vagyis annál számottevőbb volt az MDR1 fehérje ATP-áz gátló hatása. Zamora és munkatársai (235) több multidrog rezisztenciát moduláló molekula fiziko-kémiai paraméterét tanulmányozták, köztük a molekulák hidrofóbicitását is, a kétfázisú: víz-oktanollal történő kirázásos módszerrel. Az általuk vizsgált molekulák is annál hatékonyabban gátolták a multidrog rezisztenciát humán leukémiás sejtekben, minél apolárosabb jelleggel rendelkeztek. Hasonló eredményeket ért el Castaing munkacsoportja (33). Az általam vizsgált 2-8-as peptidek micelláris elektrokinetikus kromatográfiával meghatározott hidrofóbicitása és az MDR1 fehérje ATP-áz gátló képessége közötti összefüggés megerősítette a Zamora és Castaing által közölt megfigyeléseket és a továbbiakban ismertetett fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszerrel kapott eredményeket. Minél apolárosabbak voltak a peptid molekulák, annál hatékonyabban gátolták az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitását, tehát annál hatékonyabb multidrog rezisztencia ellenes hatóanyagoknak (reverzineknek) bizonyultak. Az 1. számú peptid esetén ellentmondásos eredményt kaptam: bár a többi peptidhez viszonyítva a leghosszabb migrációs idő alatt vándorolt át a kapillárison (tm = 31,5 perc), ugyanakkor az MDR1 fehérje ATP-áz gátlása szempontjából inaktívnak bizonyult (ED50 = 50.000 nM). Az ellentmondásos viselkedés csak látszólagos volt, a magyarázatot az adta, hogy a többi peptiddel ellentétben, melyeknek karboxil- és amino csoportjaik védőcsoportokkal voltak ellátva, az 1. peptid két szabad karboxil csoporttal rendelkezett. A szabad karboxil csoportok 7,7-es pH-n disszociáltak, így az 1. peptid a micelláris elektrokinetikus kromatográfiás vizsgálatkor ezen a pH értéken két negatív töltéssel rendelkezett. A negatív töltések feltehetőleg meggátolták abban, hogy kölcsönhatásba lépjen az ugyancsak negatív felületi töltésű NaDS micellákkal, tehát feltehetőleg a vizes fázisban vándorolt. A hosszú migrációs idő tehát nem a peptid magas hidrofóbicitásából és a micellákkal való kölcsönhatásából eredt, hanem anionos jellegének volt köszönhető, hiszen a puffer vizes fázisában maradva feltehetőleg ellenállt az elektroozmótikus áramlásnak és ezért lassan haladt át a kapillárison. Mivel az 1. számú peptid iontöltéssel rendelkezett az analízis alatt, ezért a k’ion retenciós faktorát a szakirodalomban ionok esetén ajánlott [25] képlettel számoltam ki. Ehhez kimértem az 1. peptid migrációs idejét NaDS mentes pH = 7,7 nátriumborát pufferben (D1) is és a tion = 31,5 perc értéket kaptam. Mivel a micellák jelenlétében és hiányában is ugyanazt a migrációs időt kaptam (tm = tion), ez megerősítette azt a feltevésünket, hogy az 1. peptid micelláris rendszerben nem lépett kölcsönhatásba a micellákkal,
85
hanem úgy viselkedett, mint a micellák hiányában, tehát végig a vizes pufferben tartózkodott vándorlása közben. Abban az esetben, ha tm = tion, a [25] képlettel számolt retenciós faktor k’ion = 0. Következtetésképpen az 1. peptid hidrofilnek bizonyult, ehhez pedig biológiai inaktivitás társult, ami összhangban állt azzal a megfigyelésünkkel, hogy minél apolárosabbak voltak a vizsgált peptidek, annál hatékonyabban gátolták az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitását, vagyis annál hatékonyabb reverzin molekuláknak bizonyultak.
IV.2.2. A fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatok eredményei (III) Az 1-8-as számú peptidek fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatát a módszer kidolgozása során grádiens elúcióval és 0,5-2 ml/perc átfolyási sebességgel végeztem. Az optimalizálást követően izokratikus rendszerben, az alábbi összetételű eluenssel és 0,7 ml/perc átfolyási sebességgel végeztem az analíziseket: 64% ACN : 36% A1 (TEAP puffer: pH 2,25) A fenti elválasztási paraméterek a peptidek gyors és hatékony analízisét tették lehetővé. A rendszer holtideje t0 = 1,1 perc volt.
86
ABS 205 nm
8 2
elúciós idő, perc 24. ábra. A 2. és 8. számú peptidek elválasztása fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfiával 64% ACN : 36% A (0,25 N TEAP puffer, pH 2,25) átfolyási sebesség: 0,7 ml/perc
87
A 24. ábrán a legrövidebb (2. peptid) és leghosszabb (8. peptid) elúciós időkkel rendelkező peptidek elválasztásakor kapott kromatogram látható. A módszerkidolgozást követően az analízisek során kimértem az egyes peptidek retenciós idejét (tr) és a [22] képlet alapján kiszámoltam a peptidek k’HPLC retenciós faktorait. Akárcsak a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával kapott eredmények esetében, összehasonlítottam az egyes peptidek retenciós idejét, retenciós faktorát és multidrog rezisztencia ellenes hatását. IV. táblázat. Az 1-8-as számú peptidek fordított fázisú folyadékkromatográfiával meghatározott retenciós idejük, tr retenciós faktoraik és biológiai hatásaik (ED50) Peptid
tr (perc)
k’HPLC
ED50 (nM)
1
1,1
0,00
50 000
2
1,58
0,44
1 650
3
2,82
1,56
100
5
3,46
1,97
45
6
3,95
2,59
25
4
5,33
3,85
50
7
11,12
9,11
20
8
12,49
10,35
10
A IV. táblázatban az 1-8-as peptidek olvashatóak a migrációs idők növekvő sorrendjében. A migrációs idők relatív standard deviációja: RSD < 1%. Az ED50 értékek azokat a peptid koncentrációkat jelentik (nM), amelyek felére csökkentették az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitását. A micelláris elektrokinetikus kromatográfiás eredményekhez és a szakirodalomból már ismertetett eredményekhez hasonlóan, a fordított fázisú folyadékkromatográfiával végzett vizsgálatok eredményeinél is ugyanaz a tendencia volt megfigyelhető: minél erősebb volt egy adott peptid hidrofób jellege, tehát minél hosszabb retenciós idővel mosódott le az oszlopról és ennek következtében minél magasabb k’HPLC retenciós faktorral rendelkezett, annál kisebb volt az ED50 értéke, tehát annál hatékonyabban gátolta az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitását.
88
Következtetésképpen, minél apolárosabb jellegűek voltak a vizsgált molekulák, annál hatékonyabb multidrog rezisztencia ellenes hatóanyagoknak (reverzineknek) bizonyultak. Az 1. számú peptid esetében kapott k’HPLC = 0 azzal volt magyarázható, hogy az adott mérési körülményekben az 1. peptid ismét negatív töltéssel rendelkezett. Ennek következtében feltehetőleg nem léphetett kölcsönhatásba az oszlop hidrofób jellegű állófázisával és gyakorlatilag holtidő alatt mosódott le: tr = t0. Ez az eredmény megerősítette azt a megfigyelésünket, amit a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával kapott eredmény alapján vontuk le: az 1. peptid hidrofil molekulaként viselkedett az elválasztások során és ugyanakkor a biológiai tesztek során is inaktívnak bizonyult.
89
IV.3. A k” módosított retenciós faktor jellemzése A k” módosított retenciós faktor jellemzésének céljából szakirodalmi adatok (156) alapján kiszámoltam egy alkilbenzol és egy alkilfenon homológ sor és a saját mérési adataim alapján kiszámoltam az általam vizsgált peptidek k’ és k” retenciós faktorait. Számítógépes program segítségével meghatároztam a molekulák kémiai szerkezete alapján számolt S hidrofóbicitási értékeket is.
IV.3.1. A homológ sorok k” módosított retenciós faktorainak jellemzése (IV) Az alkilbenzol és az alkilfenon homológ sorok egyes vegyületeinek micelláris elektrokinetikus kromatográfiával kapott mérési adatait a Muijselaar és munkatársai közleményéből (156) vettem át és a migrációs idők alapján, a [23] és [24] képletekkel számoltam ki a k’ és k” retenciós faktorokat. A KOWWIN számítógépes program segítségével meghatároztam a vegyületek S hidrofóbicitásait is. V. táblázat. A homológ sorok vegyületei, migrációs idők, k’ és k” retenciós faktorok és az S
homológ sor homológ sor
Alkilfenon
Alkilbenzol
számolt hidrofóbicitási értékek Vegyület
tm (perc)
k’
k”
S
Benzol
5,7
1,088
0,231
1,99
Toluol
7,89
3,167
0,467
2,54
Etilbenzol
9,94
7,948
0,687
3,03
Propilbenzol
11,63
23,994
0,869
3,52
Butilbenzol
12,44
78,478
0,956
4,01
Acetofenon
6,32
1,890
0,361
1,59
Propiofenon
7,87
4,157
0,554
2,08
Butirofenon
9,41
9,803
0,745
2,57
Valerofenon
10,53
25,618
0,884
3,06
Hexanofenon
11,12
77,804
0,958
3,55
90
Az V. táblázatban az egyes homológ sorok vegyületei a migrációs idők növekvő sorrendjében találhatóak. Az alkilbenzol homológ sor analízisekor t0 = 3,55 perc, tmc = 12,85 perc volt, az alkilfenon homológ sor vizsgálatakor pedig t0 = 3,42 perc és tmc = 11,46 perc volt (156). Azért esett a választásunk alkilbenzol és alkilfenon homológ sorok mérési adataira, mert ezek átlátható szerkezetű vegyületek és a hidrofóbicitásukról is vannak ismereteink: minden egyes metilén csoport beépítése az alkil láncba növeli a molekulák hidrofóbicitását, de minél hosszabb már az alkil lánc, a hidrofóbicitás egyre kisebb mértékben nő. Vizsgálataim során azt követtem nyomon, hogy a hidrofóbicitás növekedése hogyan tükröződött a micelláris elektrokinetikus kromatográfiás rendszerben mért migrációs időkben, a kémiai szerkezet alapján számolt S hidrofóbicitás értékekben és ezeket az eredményeket milyen mértékben követték a k’ és a k” retenciós faktorok értékei. IV.3.1.1. A MIGRÁCIÓS IDŐK VÁLTOZÁSA AZ ALKIL LÁNCHOSSZ FÜGGVÉNYÉBEN Elsőként megvizsgáltam, hogy az alkil lánchossz növelésével milyen mértékben változnak a homológ sor vegyületeinek a migrációs idői. A 25. ábrán láthatóak a homológ sorok szomszéd vegyületeinek a migrációs idő különbségei (∆tm) az alkil lánc szénatom számainak függvényben. Az ábra alapján azt figyeltük meg, hogy minél hosszabb volt az alkil lánc, annál kisebb mértékben nőttek a micelláris elektrokinetikus kromatográfiás rendszerben mért migrációs idők mindkét homológ sor esetében. Az újabb meg újabb metilén csoportok beépítése a molekulákba fokozta ugyan a molekulák hidrofóbicitását, de valóban egyre kisebb mértékben és ezt az alkalmazott kísérleti rendszer is pontosan észlelte.
91
∆ tm migrációs idő különbségek (perc)
Szén atomok száma 25. ábra. A homológ sorok egymást követő vegyületeinek a migrációs idő különbségei (∆tm) az alkil lánchossz függvényében (■) alkilbenzol homológ sor (●) alkilfenon homológ sor
92
IV.3.1.2. A MIGRÁCIÓS IDŐK ÉS A SZÁMOLT HIDROFÓBICITÁSOK KÖZÖTTI ÖSSZEFÜGGÉS A továbbiakban összehasonlítottam a homológ sorok vegyületeinek a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával kapott migrációs időit (156) a számítógépes programmal számolt S hidrofóbicitás értékeikkel [26. ábra].
Mindkét homológ sor esetében lineáris összefüggést
kaptunk az egyes vegyületek migrációs idői és a számolt hidrofóbicitási értékek között (alkilbenzol: r = 0,99; alkilfenon: r = 0,99). Következtetésképpen, a kémiai szerkezetek alapján számolt hidrofóbicitások tükrözték a kísérletesen meghatározott hidrofóbicitásokat. Ez lehetővé teszi, hogy a k’ és k” retenciós faktorok jellemzésekor összehasonlíthassuk a számolt hidrofóbicitási értékekkel is. IV.3.1.3. A K’ ÉS K” RETENCIÓS FAKTOROK VÁLTOZÁSA AZ ALKIL LÁNCHOSSZ FÜGGVÉNYÉBEN A következő lépésben azt vizsgáltuk, hogy a k’ és k” retenciós faktorok hogyan változnak az alkil lánc növekedésével, és milyen mértékben követik a migrációs idők alapján tapasztalt tendenciát. A 27. ábrán láthatóak az alkilbenzol és az alkilfenon homológ sorok szomszéd vegyületeinek a k’, valamint a k” retenciós faktorok különbségei (∆k’ és ∆k”) a szén atomok számának függvényében. A ∆k’ függvény egyre nőtt mindkét homológ sor esetében, vagyis az alkil lánc növekedésével a k’ retenciós faktor értékek egyre nagyobb mértékben nőttek. A k’ retenciós faktor viselkedése alapján arra lehetne következtetni, hogy az újabb metilén csoportok beépítése a molekulákba egyre nagyobb mértékben növeli a hidrofóbicitásukat. Ez a megállapítás ellentmond a kísérleti rendszerrel mért migrációs idők tendenciájának, amely szerint a hidrofóbicitás növekedésének mértéke egyre csökken az alkil lánc hosszabbodásával. A k’ retenciós faktor és a kísérleti adatok ellentmondása a k’ függvény nem lineáris alakjából [8. ábra] eredt, melyet munkacsoportunk egy korábbi közleményben (106) leírt.
93
S számolt hidrofóbicitás migrációs idő (perc) 26. ábra. A homológ sorok vegyületeinek migrációs idői és az S számolt hidrofóbicitásai közötti összefüggés (■) alkilbenzol homológ sor (●) alkilfenon homológ sor
94
szén atomok száma 27. ábra. A homológ sorok egymást követő vegyületeinek k’ és k” retenciós faktor különbségei az alkil lánchossz függvényében (●) alkilbenzol homológ sor ∆k’ értékei (○) alkilbenzol homológ sor ∆k” értékei (▲) alkilfenon homológ sor ∆k’ értékei (∆) alkilfenon homológ sor ∆k” értékei
95
Ezzel szemben a ∆k” függvény egyre csökkent mindkét homológ sor esetében, tehát a szén atomok számának növekedésével a k” módosított retenciós faktor értékek egyre kisebb mértékben nőttek. Következtetésképpen, a kísérleti eredményekkel összhangban a k” módosított faktor értékei is jelezték, hogy az alkil lánc hosszabbodásával az újabb metilén csoportok beépítése egyre kisebb mértékben növelte a molekulák hidrofóbicitását. A k” módosított retenciós faktor tükrözte ezekszerint a kísérleti rendszer által jelzett jelenséget és ezáltal pontos jellemzést adott a vegyületek hidrofóbicitásairól. IV.3.1.4. A k’, valamint k” retenciós faktorok összefüggései a számolt S hidrofóbicitás értékekkel Rendre megvizsgáltuk a homológ sorok vegyületeinek a k’ és k” retenciós faktorai és a számítógépes programmal számolt S hidrofóbicitás értékei közötti összefüggéseket. A 28. ábrán az alkilbenzol homológ sor esetén kapott összefüggések láthatóak. Hasonló összefüggéseket kaptunk az alkilfenon homológ sorra is (nincs mellékelt ábra). A k’ retenciós faktorok és az S számolt hidrofóbicitások között nem lineáris összefüggés jelentkezett, tehát a k’ retenciós faktor nem követte az S számolt hidrofóbicitási értékeket. Ez az eltérő viselkedés abból eredt, hogy míg az S számolt hidrofóbicitási értékek lineáris összefüggésben voltak a migrációs időkkel [26. ábra], addig a k’ retenciós faktor nem lineárisan nő a migrációs idő függvényében [8. ábra], ahogyan azt munkacsoportunk korábbi közleményében (106) leírta. Ugyanakkor a k” módosított retenciós faktor és az S számolt hidrofóbicitások között lineáris összefüggéseket kaptunk mindkét homológ sor esetében (alkilbenzol: r = 0,99; alkilfenon: r = 0,99). A vegyületek k” értékei tükrözték ezekszerint a számolt hidrofóbicitási értékeket, amelyek ugyancsak lineárisan függtek össze a kísérleti rendszerrel kimért migrációs időkkel [26. ábra]. Ezek a megfigyelések alátámasztják munkacsoportunk korábbi megállapítását (106) is arra nézve, hogy a k” módosított retenciós faktor lineárisan nőtt a migrációs idő ablak teljes hosszában [9. ábra].
96
k”
k’
S számolt hidrofóbicitás
28. ábra. Az alkilbenzol homológ sor vegyületeinek k’ és k” retenciós faktorai és az S számolt hidrofóbicitásai közötti összefüggés (▲) k’ retenciós faktor értékei (■) k” módosított retenciós faktor értékei
97
IV.3.2. A hidrofób peptidek k” módosított retenciós faktorainak jellemzése (IV) A retenciós faktorok jellemzéséhez az általam vizsgált peptidek közül csak a teljesen apoláris jellegű 2-8-as számú peptidekre meghatározott k’ és k” értékeket vettem figyelembe. Mivel az 1es számú peptid szabad karboxil csoportjai mindvégig disszociáltak az adott mérési körülményekben, a peptid nem lépett kölcsönhatásba a micellákkal, hanem mindvégig a puffer vizes fázisában vándorolt, tehát hidrofil molekulaként viselkedett. A hidrofób peptidek k” módosított retenciós faktorának jellemzése céljából a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával kimért migrációs idők alapján a [23] és [24] képletekkel kiszámoltam az egyes peptidek k’ és k” retenciós faktorait, illetve a KOWWIN számítógépes program segítségével meghatároztuk az S számolt hidrofóbicitás értékeket is. VI. táblázat. A hidrofób peptidek migrációs idői, k’ és k” retenciós faktorai és S számolt hidrofóbicitási értékei Peptidek kémiai szerkezete
tm (perc)
k’
k”
S
(Z-Pro)2-Lys-OMe
13,9
2,265
0,239
3,78
[BOC-Asp(OBzl)]-Lys(Z)-OtBu
14,8
2,600
0,266
5,58
[BOC-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe
15,9
3,043
0,298
5,75
[BOC-Pro-Pro-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe
16,1
3,128
0,303
6,60
[BOC-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe
16,3
3,214
0,309
4,99
[BOC-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe 16,6
3,345
0,318
6,66
25,4
9,602
0,572
9,82
FMOC-Glu[Lys(Z)OtBu]2
A védőcsoportok rövidítései: BOC: t-butiloxikarbonil; tBu: t-butil; Z: benziloxikarbonil; FMOC: 9-fluorenilmetiloxikarbonil; Bzl: benzil; Me: metil. A VI. táblázatban a peptidek a migrációs idők növekvő sorrendjében találhatóak. A migrációs idők relatív standard deviációja: RSD < 2%. A micelláris elektrokinetikus kromatográfiás kísérleti rendszeremben t0 = 5,6 perc és tmc = 40,2 perc volt.
98
Vizsgálataim során összehasonlítottam a hidrofób peptidek k’ és k” retenciós faktorai által meghatározott görbék meredekségét a migrációs idő függvényében és összefüggést kerestem a k’ és k” retenciós faktorok, valamint a számolt hidrofóbicitás értékek között. IV.3.2.1. A K’ ÉS K” RETENCIÓS FAKTOROK ÁLTAL MEGHATÁROZOTT GÖRBÉK ÖSSZEHASONLÍTÁSA Az általam vizsgált hidrofób peptidek mérési adatai alapján megvizsgáltuk a k’ és k” retenciós faktorok által kijelölt görbék alakját [29. ábra]. A k’ retenciós faktor nem lineárisan nőtt a migrációs idő növekedésével, míg a munkacsoportunk által bevezetett k” módosított retenciós faktor lineáris növekedést mutatott a migrációs ablak teljes hosszában. Ezek az eredmények összhangban állnak a kutatócsoportunk korábbi közleményében (106) leírt megfigyelésekkel. A k’ és k” függvények lineáris, illetve nem lineáris jellegét pontosabb matematikai megközelítéssel is tanulmányoztuk. Az első deriváltak: ∆k’/∆tm, és ∆k”/∆tm segítségével megvizsgáltuk a függvények meredekségének a változását a migrációs ablakban [30. ábra]. Ezek a görbék azt mutatják, hogy adott migrációs idő különbségre hogyan változnak a k’, illetve k” retenciós faktor különbségek a migrációs idő függvényében. A k’ függvény első deriváltja (∆k’/∆tm) folyamatosan nőtt a migrációs idő függvényében [30. ábra], ami arra utalt, hogy a k’ függvény meredeksége folyamatosan változott a migrációs ablakban, tehát matematikailag is bizonyítottuk, hogy a hidrofób peptidek k’ mérési adatai alapján számolt k’ függvény valóban nem lineáris jellegű.
99
k' retenciós faktor
10
A
5
0 10
20
migrációs idõ (perc)
k" retenciós faktor
0.6
B
0.3
0.0 10
20
migrációs idõ(perc) 29. ábra. A hidrofób peptidek k’ és k” retenciós faktorai a migrációs idő függvényében
100
k’ meredeksége (∆k’/∆tm)
k” meredeksége (∆k”/∆tm) migrációs idő (perc)
30. ábra. A hidrofób peptidek k’ és k” retenciós faktorai által kijelölt görbék meredeksége a migrációs idő függvényében (●) k’ retenciós faktor első deriváltja (∆k’/ ∆tm), szaggatott vonal (▲) k” módosított retenciós faktor első deriváltja (∆k”/ ∆tm), folyamatos vonal
101
A k’ nem lineáris jellege miatt a csúcsok elhelyezkedése a migrációs ablakban befolyásolja az egy adott migrációs idő különbségnek (∆tm) megfelelő k’ retenciós faktor különbséget (∆k’). A migrációs ablak első felében egy adott migrációs idő különbségnek (∆tm) adott k’ retenciós faktor különbség (∆k’) felel meg, de ez a ∆k’ retenciós faktor különbség egyre nő, ahogy haladunk a migrációs ablakban. A migrációs ablak második felében már kismértékű migrációs idő eltérések nagy retenciós faktor különbségeknek felelnek meg. Minél fokozottabban hidrofób molekulákat hasonlítunk össze egymással, bár a mintakomponensek valós hidrofóbicitásbeli különbségei kis migrációs időbeli eltéréseket eredményeznek, a k’ retenciós faktor értékek nagy eltéréseket mutatnak. Következtetésképpen a függvény nem lineáris jellege miatt a k’ retenciós faktor értékek nem tükrözik pontosan a nagyon hidrofób molekulák hidrofóbicitásának mértékét. A k” módosított retenciós faktor esetében a függvény első deriváltja (∆k’/∆tm) állandó értékkel rendelkezett a migrációs ablak teljes hosszában, tehát a k” retenciós faktor meredeksége állandónak bizonyult a teljes migrációs ablakban. Ezáltal matematikailag is bizonyítottuk a k” függvény lineáris jellegét a migrációs idő függvényében. A k” függvény linearitásának következménye, hogy az adott ∆tm migrációs időbeli különbségnek állandó retenciós faktor különbségek (∆k”) felelnek meg a migrációs ablak teljes hosszában. Ennek alapján a k” módosított retenciós faktorok különbségei torzításmentesen tükrözik a vizsgált molekulák hidrofóbicitásbeli eltéréseit, attól függetlenül, hogy nagyon hidrofób, vagy kevésbé hidrofób molekulákat hasonlítunk össze egymással. Az k’ és k” függvények linearitására vonatkozó eredményeink alátámasztják a munkacsoportunk által korábban közölt (106) megfigyelésekkel és megerősítik, hogy lineáris jellegénél fogva a k” retenciós faktor értékek pontosan tükrözik a kísérleti rendszer által, a migrációs időkben jelzett hidrofóbicitásbeli különbségeket. IV.3.2.2. A K’, VALAMINT K” RETENCIÓS FAKTOROK ÖSSZEFÜGGÉSEI A SZÁMOLT S HIDROFÓBICITÁS ÉRTÉKEKKEL A továbbiakban megvizsgáltuk a hidrofób peptidek k’ és k” retenciós faktorai és a számítógépes programmal számolt S hidrofóbicitás értékek közötti összefüggéseket [31. ábra]. A homológ sorok vegyületeihez hasonlóan a hidrofób peptidek k’ retenciós faktorai és az S számolt hidrofóbicitásai között is nem lineáris összefüggés jelentkezett, ami a k’ függvény nem
102
lineáris jellegéből eredt. Ezek szerint a k’ retenciós faktorok nem tükrözték a számolt hidrofóbicitási értékeket. Ezzel ellentétben a k” módosított retenciós faktor és az S számolt hidrofóbicitások között lineáris összefüggéseket kaptunk a hidrofób peptidek esetében is, tehát a peptidek k” értékei tükrözték a számolt hidrofóbicitási értékeket (r = 0,93). Ezek a megfigyelések összhangban állnak az alkilbenzol és az alkilfenon homológ sorok esetében kapott eredményekkel és megerősítik, hogy a k” függvény tükrözi a számolt hidrofóbicitási értékeket, tehát megbízható jellemzést ad a mintakomponensek hidrofóbicitásáról.
103
k’ retenciós faktor
k”módosított retenciós faktor
31. ábra. A hidrofób peptidek k’, k” retenciós faktorai és az S számolt hidrofóbicitásai közötti összefüggés (●) k’ retenciós faktor (szaggatott vonal) (▲) k” retenciós faktor (folyamatos vonal)
104
V. AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE V.1. A polimer gyógyszerhordozó és konjugátumai vizsgálata (I, II) Három nagy hatékonyságú elválasztási technikával: szabad zónás kapilláris elektroforézissel, micelláris elektrokinetikus kromatográfiával és gélkromatográfiával nagy felbontású, érzékeny módszereket dolgoztam ki és optimalizáltam a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) szabad gyógyszerhordozó és konjugátumai elválasztására, analitikai elemzésére. Míg a szabad zónás kapilláris elektroforézis alacsony: 2,25-ös pH-n biztosított jó minőségű elválasztást, addig a micelláris rendszerrel magas: 11,0-es és 7,7-es pH-n kaptam jó elválasztásokat, gélszűréssel pedig a szabad gyógyszerhordozó analízise 6,0-os pH-n adott alapvonal elválasztást. Az optimalizált módszerek nemcsak a polimer molekulák rutinszerű elválasztásához nyújtottak korszerű megoldást, hanem lehetővé tették a makromolekulák jellemzését is. A korszerű elválasztási módszerekkel elsősorban olyan nagy savi erősségű karboxil csoportok jelenlétét mutattam ki mind a hordozó, mind a konjugátumok esetében, amelyek már 2,25-ös pH-n disszociálnak, tehát erősebbek, mint a polimert alkotó monomerek karboxiljainak savi erőssége. Az alkalmazott elválasztástechnikai módszerekkel arra is rámutattam, hogy bár elvileg kétféle savi erősségű karboxil csoport épül be a makromolekulákba, a szabad hordozó, és a konjugátumai nem
kétféle,
hanem
sokféle
savi
erősségű
karboxil
csoportokkal
rendelkeznek.
Megfigyeléseimet alátámasztotta a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) titrálási görbéje is. Eredményeim elválasztástechnikai módszerekkel igazolják a polikarbonsav polimerek titrálási görbéi alapján Rios és munkatársai által közölt szakirodalmi adatokat. Szabad zónás elektroforézissel alacsony pH-n lehetséges volt a nagyon erős, illetve kevésbé erős karboxil csoportokat tartalmazó polianionok szétválasztása. Magasabb pH-n a rendszer képtelen volt megkülönböztetni az egymástól eltérő savi erősségű karboxil csoportokat, lévén, hogy többségük már disszociált. A gélkromatográfiás analízisek során megfigyelhető volt, hogy a pH értéke jelentősen befolyásolta a minták elúciós térfogatát, mivel a polimerláncok szabad karboxil csoportjainak a disszociációja miatt megváltozott a makromolekulák látszólagos molsúlya. Alacsony pH-n a disszociáció mértéke visszaszorult, a polimer molekulák kis Stokes rádiusszal rendelkeztek és látszólagos kis molsúlyuknak megfelelően nagyobb elúciós térfogatot igényeltek. A pH
105
növelésével a karboxil csoportok disszociációja miatt egyre több intramolekuláris taszító erő lépett fel, a polimerek Stokes rádiusza egyre nőtt, ennek megfelelően egyre nagyobb látszólagos molsúlyú molekulákhoz hasonlóan viselkedtek és egyre rövidebb elúciós idővel mosódtak le az oszlopról. Mindhárom nagy hatékonyságú elválasztási módszerrel általában több, szélesen elhúzódó csúcsot kaptam, ami polidiszperzitásra utalt. A polimerekre általában jellemző polimerizációs fokból és konformációs eltérésekből eredő polidiszperzitáshoz a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) esetében hozzáadódik a különböző savi erősségű karboxil csoportok sorozatainak a jelenlétéből eredő polidiszperzitás is. A konjugátumok esetében a polidiszperzitást fokozzák a szubsztitúciós fokok eltérései és a konjugált molekulák, illetve a szabadon maradt karboxil csoportok eltérő elrendeződése a polimerláncokon. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumainak jellemzésekor kapott új eredmények fontos információk gyógyszerjelölt molekulák esetében és újabb vizsgálatok kiindulópontjait jelentik. A nagy savi erősséggel és a kisebb, különböző savi erősséggel rendelkező karboxil csoportok egyrészt meghatározhatják a makromolekulák szervezetben való felszívódását, eloszlását, hatékonyságát és kiürülését, másrészt pedig befolyásolhatják, hogy mely karboxil csoportokhoz kötődnek a hatóanyagok a konjugálás során, illetve befolyásolhatják a kialakult kötések stabilitását is. A makromolekulák polidiszperzitásával ugyancsak számolni kell a polimer gyógyszermolekulák előállításakor és minőségellenőrzésekor.
V.2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidek vizsgálata (III) Kutatási munkám során a potenciális multidrog rezisztencia ellenes hatással rendelkező peptidek vizsgálatához olyan módszereket dolgoztam ki és optimalizáltam mindkét általam alkalmazott elválasztási technikával: a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával és a fordított fázisú folyadékkromatográfiával, amelyek lehetővé tették a hidrofób molekulák jó felbontású és viszonylag gyors analízisét. A migrációs és a retenciós idők alapján meghatároztam a molekulák retenciós faktorait, amelyek számszerűleg jellemezik a peptidek hidrofóbicitását és összehasonlítottam a biológiai tesztekkel meghatározott
multidrog
rezisztencia
ellenes
hatásaikkal.
Mindkét
módszer
esetében
összefüggést mutattam ki a hidrofóbicitás mértéke, illetve a biológiai aktivitás között: minél apolárosabbnak bizonyultak a molekulák, annál hatékonyabban gátolták az MDR1 fehérje ATP106
áz aktivitását, tehát annál hatékonyabb reverzin molekuláknak minősültek. Ezáltal korszerű elválasztástechnikai módszerekkel is megerősítettem a Zamora és munkacsoportja által közölt megfigyeléseket (235), amelyeket a kétfázisú: víz-oktanolos kirázásos módszerrel meghatározott hidrofóbicitások alapján tettek. Eredményeink közlése hozzájárult a vizsgált peptidek közül a [BOC-Asp(OBzl)]-Lys(Z)-OtBu (4.-es peptid) és a [BOC-Glu(OBzl)]2-Lys-OMe (6.-os peptid) kereskedelmi katalógusba való felvételéhez (Alexis Biochemicals 2001, Alexis Corporation, San Diego, USA). A Reversin 121 és Reversin 205 kódszámokkal jelzett peptidek a szelektív és nagy affinitású MDR1 fehérje gátló molekulák minősítést kapták. Az elválasztástechnikai módszerekkel meghatározott hidrofóbicitás és a biológiai hatékonyság közötti összefüggést nagyon előnyösen fel lehet használni, amikor nagyszámú minták (pl. egy peptid molekulakönyvtár komponensei) multidrog rezisztencia ellenes aktivitásának a meghatározása a feladat. A biológiai tesztekhez előtisztított peptidminták szükségesek, ugyanakkor a biológiai tesztek idő- és pénzigényesebbek az elválasztástechnikai módszerekhez viszonyítva. Ezzel szemben a hidrofóbicitás és a multidrog rezisztencia ellenes hatás közötti összefüggés lehetővé teszi, hogy a biológiai teszteket megelőzően kiválaszthassuk azokat a molekulákat, amelyek hidrofóbicitásuk alapján várhatóan magas biológiai aktivitással rendelkeznek. Erre a szűrésre kiválóan alkalmas és modern megoldást nyújtanak a micelláris elektrokinetikus kromatográfia és a fordított fázisú folyadékkromatográfia, amelyek a biológiai tesztekhez viszonyítva olcsóbbak, gyorsabbak és automatizálható módszerek. Az elválasztási technikákhoz nagyon kis mennyiségű minta is elegendő, ugyanakkor nem szükséges a minta előtisztítása, hisz a mérés során az esetleges komponensek, illetve szennyezők szétválnak. A micelláris elektrokinetikus kromatográfia további előnye, hogy mivel a micellaképző anyagok széles választéka ismeretes és felhasználható, az elválasztás folyamán létrejövő minta - micella kölcsönhatások leegyszerűsített modellként megközelíthetik a vizsgált molekulák és a sejtmembrán kettős lipidrétege közötti kölcsönhatásokat. Az elválasztástechnikai módszerek valójában nem helyettesíthetik a biológiai teszteket, de segítséget, támpontot nyújthatnak a biológiai tesztek hatékonyabb megtervezéséhez.
107
V.3. A k” módosított retenciós faktor jellemzése (IV) Kutatási programom megvalósítása során tanulmányoztam a munkacsoportunk által korábban bevezetett (106) k” módosított retenciós faktor tulajdonságait és alkalmazhatóságát a molekulák hidrofóbicitásának számszerűsítésére. Szakirodalmi adatokból (156) és a saját mérési adataim alapján (III, IV) kiszámoltam két homológ sor és a multidrog rezisztencia ellen tervezett hidrofób peptidek k’, k” retenciós faktorait és számítógépes programmal meghatároztuk a molekulák számolt hidrofóbicitás értékeit. Az alkilbenzol és az alkilfenon homológ sorok esetében a migrációs idők alapján kimutattam, hogy egy-egy újabb metilén csoport beépítése a molekulába egyre kisebb mértékben növelte a vegyületek hidrofóbicitását. Rámutattam arra is, hogy az S számolt hidrofóbicitások lineáris összefüggésben voltak a vegyületek migrációs időivel, tehát ugyanazt a tendenciát követték. A homológ sorok szomszédos vegyületeinek k” módosított retenciós faktor különbségei egyre csökkentek a szén atom szám növekedésével, tehát a migrációs időkhöz hasonlóan azt jelezték, hogy az alkil lánc hosszabbodásával egyre kisebb mértékben nőtt a molekulák hidrofób jellege. Ugyanakkor a k” értékek lineáris összefüggésben voltak az S számolt hidrofóbicitásokkal. Mindkét eredmény arra utal, hogy a k” retenciós faktor jól, torzításmentesen képzi le egyrészt a mérőrendszer (micelláris elektrokinetikus kromatográfia) által nyújtott mérési adatokat, másrészt pedig az elméleti hidrofóbicitási értékeket. A hidrofób peptidek k” retenciós faktorának tanulmányozása során matematikailag is bizonyítottam, hogy a k” retenciós faktorok által meghatározott függvény lineáris jellegű, állandó meredekségű függvény a migrációs ablak teljes hosszában. Ennek következtében adott migrációs idő különbségnek állandó k” retenciós faktor különbségek felelnek meg a teljes migrációs ablakban, tehát a k” módosított retenciós faktorok pontosan jellemzik a molekulák hidrofóbicitásbeli különbségeit is. A peptidek módosított k” retenciós faktorai lineáris összefüggést mutattak a számítógépes programmal számolt S hidrofóbicitási értékekkel. A homológ sorok és a hidrofób peptidek k” módosított retenciós faktorainak a vizsgálata során kapott eredmények arra utaltak, hogy a k” módosított retenciós faktorok jól tükrözik a molekulák kísérleti rendszerrel meghatározott és az elméleti számolásokkal kapott hidrofóbicitását és a függvény lineáris jellegének köszönhetően, jól tükrözik a hidrofóbicitásbeli különbségeket is. A fenti eredmények alapján bizonyítottam, hogy a k”
108
módosított
retenciós
faktor
sikeresen
alkalmazható
a
mintakomponensek
hidrofóbicitásának és hidrofóbicitásbeli különbségeinek a becslésére. A k” módosított retenciós faktor jellemzése hozzájárult a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával meghatározott hidrofóbicitás pontosabb számszerűsítéséhez és a micelláris elektrokinetikus
kromatográfia
elméleti
hátterének
a
fejlesztéséhez.
Egy
későbbi
közleményben (107) munkacsoportunk bevezette a k” módosított retenciós faktor alapján az egyes mintakomponensek a vizes fázisban és a micellák hidrofób belsejében elöltött részidejének, illetve az egyensúlyi állandó kiszámolását.
109
VI. KÖVETKEZTETÉSEK 1. A gyógyszerhordozó polimer: a poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumainak vizsgálata 2. 1.a. Mindhárom alkalmazott nagy hatékonyságú elválasztási technika: -
szabad zónás kapilláris elektroforézis,
-
micelláris elektrokinetikus kromatográfia
-
gélkromatográfia
esetében
nagy
felbontású,
érzékeny
módszereket
dolgoztam
ki
a
szabad
gyógyszerhordozó és konjugátumai rutinszerű elválasztására, analitikai elemzésére. 1.b. Az analízisek során kapott eredmények alapján jellemeztem a polimerek egyes fizikokémiai paramétereit: savi erősségét, polidiszperzitását. Korszerű
elválasztástechnikai
kimutattam,
hogy
az
módszerekkel, általam
a szakirodalmi adatokat
vizsgált
megerősítve
poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav)
makromolekuláris hordozó és konjugátumai polimer láncán nem kétféle, hanem sokféle savi erősségű karboxil csoportok sorozatai vannak jelen, annak ellenére, hogy a monomerek kétféle saverősségű karboxil csoportokat hordoznak. Bebizonyítottam, hogy a makromolekulákon olyan nagy savi erősségű karboxil csoportok is előfordulnak, amelyek erősebbek, mint a monomerek karboxil csoportjai. Mindhárom elválasztástechnikai módszerrel
kimutattam
a
poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav)
és
konjugátumai
polidiszperz jellegét is. A poli-(N-vinilpirrolidon-co-maleinsav) és konjugátumainak jellemzésekor kapott eredmények fontos ismeretek, mivel a sokféle saverősségű karboxil csoportok, illetve a nagy saverősségű karboxil csoportok jelenléte befolyásolhatják a konjugálást a gyógyszer előállítása során, másrészt pedig az élő szervezetben való felszívódását, makromolekulák
hatékonyságát
és
meghatározhatják
polidiszperzitásával
ugyancsak
a
számolni
gyógyszermolekulák előállításakor és minőségellenőrzésekor.
110
hatásmechanizmusát. kell
a
A
polimer
2. A multidrog rezisztencia ellenes peptidek vizsgálata 2.a. Mindkét alkalmazott nagy hatékonyságú elválasztási technika: -
micelláris elektrokinetikus kromatográfia
-
fordított fázisú folyadékkromatográfia
esetében jó felbontású, viszonylag gyors és a hidrofóbicitások meghatározására alkalmas módszereket dolgoztam ki a hidrofób peptidek vizsgálatára. 2.b. Összefüggést mutattam ki a peptidek hidrofóbicitása és multidrog rezisztencia ellenes hatása között: minél apolárosabbak voltak a peptid molekulák, annál hatékonyabban gátolták az MDR1 fehérje ATP-áz aktivitását, tehát annál hatékonyabb reverzineknek bizonyultak. Megfigyelésem modern elválasztástechnikai módszerekkel támasztotta alá a szakirodalomban korábban közölt adatokat. Eredményeim közlése hozzájárult az általam vizsgált peptid sorozatból két peptidnek a kereskedelmi forgalomba való bevonásához, szelektív és nagy affinitású reverzin molekula minősítésével. Az elválasztástechnikai módszerekkel meghatározott hidrofóbicitás és a biológiai hatás közötti összefüggés új lehetőségeket nyit meg molekulakönyvtárak multidrog rezisztencia ellenes hatásának a tesztelésében: a biológiai teszteket megelőzően a gyors, automatizálható elválastástechnikai módszerekkel megállapított hidrofóbicitás alapján megbecsülhetjük a molekulák várható biológiai hatékonyságát.
111
3. k” módosított retenciós faktor jellemzése A homológ sorok vegyületeinek és az általam vizsgált hidrofób peptidek micelláris elektrokinetikus kromatográfiával kapott mérési adatai alapján: -
bizonyítottam, hogy a k” módosított retenciós faktor torzításmentes, reális leképzést adott a mérési rendszer által jelzett tendenciákról,
-
a k” módosított retenciós faktorok értékei lineáris összefüggésben voltak a számolt hidrofóbicitási értékekkel,
-
matematikailag is bizonyítottam a k” függvény lineáris jellegét a migrációs ablak teljes hosszában, aminek köszönhetően a k” módosított retenciós faktor különbségek pontosan tükrözik a mintakomponensek hidrofóbicitásbeli valós különbségeit.
Eredményeim alapján kimutattam, hogy a k” módosított retenciós faktor sikeresen alkalmazható a mintakomponensek hidrofóbicitásának és hidrofóbicitásbeli különbségeinek a becslésére. A k” módosított retenciós faktor jellemzése hozzájárult a micelláris elektrokinetikus kromatográfiával ugyanakkor
a
meghatározott micelláris
hidrofóbicitás
elektrokinetikus
pontosabb
kromatográfia
számszerűsítéséhez,
elméleti
hátterének
a
fejlesztéséhez, a későbbiekben pedig a mintakomponensek fázis tartózkodási időinek a kiszámolásához.
112
VII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni: -
Dr. Idei Miklósnak, mentoromnak, hogy bevezetett a kapilláris elektroforézisre és más nagy hatékonyságú elválasztástechnikai módszerekre épülő kutatómunka alapjaiba, elősegítette szakmai fejlődésemet és értékes szakmai tanácsaival támogatta kutatómunkámat;
-
Prof. Dr. Kéri György témavezetőmnek, hogy tudományos pályafutásomat figyelemmel kísérte, tanácsaival segítette;
-
Prof. Dr. Mandl József programvezetőmnek, a SE Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet igazgatójának, hogy lehetőséget adott Doktori Iskolájában a képzésemhez, a tanfolyamok elvégzéséhez és a kutatómunkámhoz;
-
Dr. Pató Jánosnak, Dr. Sarkadi Balázsnak és Dr. Őrfi Lászlónak a kutatási programban való együttműködésükért;
-
Munkatársaimnak, az MTA Peptidkémiai Kutatócsoport tagjainak: Prof. Dr. Teplán István csoportvezetőnek, Dr. Seprődi Jánosnak, Dr. Hollósy Ferencnek, Dr. Horváth Anikónak, Dr. Vadász Zsoltnak, Dr. Mező Imrének, Dr. Vántus Tibornak, Dr. Érchegyi Juditnak, Verbényi Ágnesnek, Tanai Henriettenek, Szabó Editnek, Bökönyi Györgyinek, Tóvári Emőkének szakmai és emberi segítőkészségükért.
Köszönetemet szeretném kifejezni családomnak, hogy a magyarországi doktori ösztöndíjas tanulmányaimban nagy szeretettel, megértéssel támogattak és bátorítottak.
113
VIII. IRODALOMJEGYZÉK 1. Ahuja ES, Preston BP, Foley JP., Anionic-zwitterionic mixed micelles in micellar electrokinetic chromatography: sodium dodecyl sulfate-N-dodecyl-N,N-dimethylammonium3-propane-1-sulfonic acid, J Chromatogr B Biomed Appl., 657: 271-84, 1994 2. Aimoto S., Polypeptide synthesis by the thioester method, Biopolymers, 51: 247-65, 1999. 3. Al-Obeidi FA., Wu JJ., Lam KS., Protein tyrosine kinases: structure, substrate specificity and drug discovery, Biopolymers, 47: 197-223, 1998. 4. Al-Obeidi FA., Lam KS., Development of inhibitors for protein tyrosine kinases, Oncogene, 19: 5690-701, 2000. 5. Andrews CL., Vouros P., Harsch A., Analysis of DNA adducts using high-performance separation techniques coupled to electrospray ionization mass spectrometry, J Chromatogr A., 856: 515-26, 1999. 6. Asiaie R, Huang X, Farnan D, Horvath C., Sintered octadecylsilica as monolithic column packing
in
capillary
electrochromatography
and
micro
high-performance
liquid
chromatography, J Chromatogr A. 806: 251-63, 1998. 7. Assi KA., Altria KD., Clark BJ., Rapid resolution of drugs and related substances with an eCAP polyamine coated capillary, J Pharm Biomed Anal., 15: 1041-9, 1997. 8. Azori M., Pató J., Fehérvári F., Tüdős F., Polymeric prodrugs 4, In vitro study of the drug release on a model p-nitroanilide bound onto polyanionic carrier, Makromol. Chem., 187, 303-9, 1986. 9. Ayesh S., Shao YM., Stein WD., Co-operative, competitive and non-competitive interactions between modulators of P-glycoprotein, Biochim Biophys Acta., 1316: 8-18, 1996. 10. Ayesh S., Litman T., Stein WD., Drug accumulation in the presence of multidrug resistance pump: dissociation between verapamil accumulation and the action of P-glycoprotein, Receptors and Channels, 5: 175-83, 1997. 11. Baba Y., Capillary affinity gel electrophoresis: new technique for specific recognition of DNA sequence and the mutation detection on DNA, J Biochem Biophys Methods, 41: 91101, 1999.
114
12. Balakin K., Tkachenko S., Farley W., Development of target specific libraries of potential protein kinase inhibitors as anticancer agents, Research Bulletin, ChemDiv, Inc., 1.2-11, 2001. 13. Balayiannis G., Papaioannou D., Karamanos NK., Application of capillary electrophoresis in the analysis of novel synthetic dideoxynucleoside analogues with potential anti-HIV activity, Biomed Chromatogr., 15: 271-3, 2001. 14. Baldwin RP., Electrochemical determination of carbohydrates: enzyme electrodes and amperometric detection in liquid chromatography and capillary electrophoresis, J Pharm Biomed Anal., 19: 69-81, 1999. 15. Barta C., Ronai Z., Sasvari-Szekely M., Guttman A., Rapid single nucleotide polymorphism analysis by primer extension and capillary electrophoresis using polyvinyl pyrrolidone matrix, Electrophoresis, 22: 779-82, 2001. 16. Bates SE., Lee JS., Dickstein B., Spolyar M., Fojo AT., Differential modulation of Pglycoprotein transport by protein kinase inhibition, Biochemistry, 32: 9156-64, 1993. 17. Bates SE., Zhan Z, Dickstein B, Lee JS, Scala S, Fojo AT, Paull K, Wilson W., Reversal of multidrug resistance, J Hematother. 3: 219-23, 1994. 18. Beck WT., Mueller TJ., Tanzer LR., Altered surface membrane glycoproteins in Vinca alkaloid-resistant human leukemic lymphoblasts, Cancer Res., 39: 2070-6, 1979. 19. Beck WT., Cirtain MC., Continued expression of vinca alkaloid resistance by CCRF-CEM cells after treatment with tunicamycin and pronase, Cancer Res., 42: 184-9, 1982. 20. Belder D., Elke K., Husmann H., Influence of pH*-value of methanolic electrolytes on electroosmotic flow in hydrophilic coated capillaries, J Chromatogr A., 868: 63-71, 2000. 21. Belder D., Husmann H., Warncke J., Directed control of electroosmotic flow in nonaqueous electrolytes using poly(ethylene glycol) coated capillaries, Electrophoresis, 22:666-72, 2001. 22. Bellini MS., Manetto G., Devl Z., Tagliaro F., Miksik I., Capillary electrophoretic separation of vitamins in sodium dodecyl sulfate containing buffers with lower aliphatic alcohols and nhexane as organic modifiers, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 741: 67-75, 2000. 23. Bendahl L., Hansen SH, Gammelgaard B., Capillaries modified by noncovalent anionic polymer adsorption for capillary zone electrophoresis, micellar electrokinetic capillary chromatography and capillary electrophoresis mass spectrometry, Electrophoresis, 22: 256573, 2001.
115
24. Bendas G., Immunoliposomes – a promising approach to targeting cancer therapy, BioDrugs, 15: 215-24, 2001. 25. Bi SP., Yang XD, Zhang FP, Wang XL, Zou GW., Analytical methodologies for aluminium speciation in environmental and biological samples--a review, Fresenius J Anal Chem. 370: 984-96, 2001. 26. Bielinska A., Kukowska-Latallo JF, Johnson J, Tomalia DA, Baker JR Jr., Regulation of in vitro gene expression using antisense oligonucleotides or antisense expression plasmids transfected using starburst PAMAM dendrimers, Nucleic Acids Res., 24: 2176-82, 1996. 27. Boulat O., McLaren DG., Arriaga EA., Chen DD., Separation of free amino acids in human plasma by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence: potential for emergency diagnosis of inborn errors of metabolism, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 15;754: 21728, 2001. 28. Bovanova L., Brandsteterova E., Direct analysis of food samples by high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A, 880: 149-68, 2000. 29. Burke TR., Yao ZJ., Liu DG., Voigt J., Gao Y., Phosphotyrosyl mimetics in the design of peptide-based signal transduction inhibitors, Biopolymers, 60: 32-44, 2001. 30. Buzinkaiova T., Polonsky J., Skacani I., Determination of fendiline and gallopamil by capillary isotachophoresis, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 757: 215-20, 2001. 31. Camilleri P., Chiral surfactants in micellar electrokinetic capillary chromatography, Electrophoresis, 18: 2322-30, 1997. 32. Cancelliere G., D'Acquarica I I, Gasparrini F, Misiti D, Villani C., Synthesis and applications of novel, highly efficient HPLC chiral stationary phases: a chiral dimension in drug research analysis, Pharm. Sci. Technol. Today, 2: 484-492, 1999. 33. Castaing M., Brouant P, Loiseau A, Santelli-Rouvier C, Santelli M, Alibert-Franco S, Mahamoud A, Barbe J., Membrane permeation by multidrug-resistance-modulators and nonmodulators: effects of hydrophobicity and electric charge, J. Pharm. Pharmacol., 52: 289-96, 2000. 34. Chambers TC., Zheng B., Kuo JF, Regulation of phorbol ester and protein kinase C inhibitors and by a protein phosphatase inhibitor (okadaic acid) of P-glycoprotein phosphorilation and relationship to drug accumulation in multidrug-resistant human KB cells, Mol. Pharmacol., 41: 1008-15, 1992.
116
35. Chankvetadze B., Kartozia I, Breitkreutz J, Okamoto Y, Blaschke G., Effect of organic solvent, electrolyte salt and a loading of cellulose tris (3,5-dichlorophenyl-carbamate) on silica gel on enantioseparation characteristics in capillary electrochromatography, Electrophoresis, 22: 3327-34, 2001. 36. Chen CJ., Chin JE., Ueda K., Clark DP., Pastan I., Gottesman MM., Roninson IB., Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells, Cell, 47: 381-9, 1986. 37. Chen H., Horvath C., High–speed high-perfomance liquid chromatography of peptides and proteins, J. Chromatogr. A., 705: 3-20, 1995. 38. Cheng YF, Fuchs M, Carson W., Post-capillary Immobilon-P membrane fraction collection for capillary electrophoresis, Biotechniques, 14: 51-6, 1993 39. Chiari M., Cretich M., Damin F., Ceriotti L., Consonni R., New adsorbed coatings for capillary electrophoresis, Electrophoresis, 21: 909-16, 2000. 40. Cohen A., Karger BL., High-performance sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel capillary electrophoresis of peptides and proteins, J Chromatogr., 397: 409-17, 1987. 41. Collet J, Tribet C, Gareil P., Use of neutral surfactants for the capillary electrophoretic separation of hydrophobically modified poly(acrylic acids), Electrophoresis, 17: 1202-9, 1996 42. Cordova E., Gao J., Whitesides GM., Noncovalent polycationic coatings for capillaries in capillary electrophoresis of proteins, Anal Chem., 69: 1370-9, 1997. 43. Csákvári É., Azori M., Fehérvári F., Pató J., Biológiailag aktív polimerek előállítása és vizsgálata
II,
Poli-(N-vinil-pirrolidon-co-maleinsav)
hordozó-polimer
fizikai-kémiai
vizsgálata, Magyar Kémiai Folyóirat, 1: 38-48, 1984. 44. Dankova M., Strasik S., Molnarova M., Kaniansky D., Marak J., Capillary zone electrophoresis of orotic acid in urine with on-line isotachophoresis sample pretreatment and diode array detection, J. Chromatogr. A, 916: 143-53, 2001. 45. Dano K., Cross resistance between vinca alkaloids and anthracyclines in Ehrlich ascites tumor in vivo, Cancer Chemother Rep., 56: 701-8, 1972 46. Deng Y., Zhang Z., Henion J., Chip-based quantitative capillary electrophoresis / mass spectometry determination of drugs in human plasma, Anal. Chem., 73: 1432-9, 2001.
117
47. Deyl Z., Miksik I., Advanced separation methods for collagen parent alpha-chains, their polymers and fragments, J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl., 739: 3-31, 2000. 48. Ding J., Vouros P., Capillary electrochromatography-mass spectometry for the separation and identification of isomeric polyaromatic DNA adducts derived from in vitro reactions, J. Chromatogr. A., 887: 103-13, 2000. 49. Dippy JFJ., Hughes SRC., Rozanski A., The dissociation constants of some symmetrically disubstituted succinic acids, J. Chem. Soc., 48: 2492-8, 1959. 50. Downward J., Parker P., Waterfield MD., Autophosphorylation sites on the epidermal growth factor receptor, Nature, 311: 483-5, 1984. 51. Edwards RH., Drug delivery via the blood-brain barrier, Nat. Neurosci., 4: 221-2, 2001. 52. Engelhardt H., Beck W., Schmitt T., Capillary electrophoresis – methods and potentials, Friedr. Vieweg & Sohn Verlagsgesellschaft mbH, Braunschweig/Wiesbaden, 1996. 53. Eriksson HJ., Somsen GW, Hinrichs WL, Frijlink HW, de Jong GJ., Characterization of human placental alkaline phosphatase by activity and protein assays, capillary electrophoresis
and
matrix-assisted
laser
desorption/ionization
time-of-flight
mass
spectrometry, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 755: 311-9, 2001. 54. Fanali S, Pucci V, Sabbioni C, Raggi MA., Quality control of benserazide-levodopa and carbidopa-levodopa tablets by capillary zone electrophoresis, Electrophoresis, 21: 2432-7, 2000. 55. Fanali S., Catarcini P, Blaschke G, Chankvetadze B., Enantioseparations by capillary electrochromatography, Electrophoresis, 22: 3131-51, 2001. 56. Fardel O., Lecureur V., Guillozo A, The P-glycoprotein multidrug transporter, Gen. Pharmacol., 27: 1283-91, 1996. 57. Fekkes D., State-of-the-art of high-performance liquid chromatography analysis of amino acids in physiological samples, J. Chromatogr B Biomed. Appl., 682: 3-22, 1996. 58. Ferreira GN, Cabral JM, Prazeres DM., Purification of supercoiled plasmid DNA using chromatographic processes, J Mol Recognit. 11: 250-1, 1998. 59. Figeys D., Aebersold R., Capillary electrophoresis of peptides and proteins at neutral pH in capillaries covalently coated with polyethyleneimine, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 695: 163-8, 1997.
118
60. Filicorin M., Flanmigni C., Treatment with GnRH Analogs: Controversies and Perspectives, The Parthenon Publishing Group, London, 1996. 61. Fine RL., Patel J., Chabner BA., Phorbol esters induce multidrug resistance in human breast cancer cells, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 582-6, 1988. 62. Flanagan RJ., Harvey EJ., Spencer EP., HPLC of basic drugs on microparticulate strong cation-exchange materials – e review, Forensic Sci. Int., 121: 97-102, 2001. 63. Franco P., Senso A, Oliveros L, Minguillon C., Covalently bonded polysaccharide derivatives as chiral stationary phases in high-performance liquid chromatography, J Chromatogr A., 906: 155-70, 2001 64. Freudemann T., von Brocke A., Bayer E., On-line coupling of capillary gel electrophoresis with electrospray mass spectometry for oligonucleotide analyis, Anal. Chem., 73: 2587-93, 2001. 65. Fridkis-Hareli M., Teitelbaum D., Pecht I., Arnon R., Sela M., Binding of copolymer 1 and myelin basic protein leads to clustering of class II MHC molecules on antigen-presenting cells, Int Immunol., 9: 925-34, 1997. 66. Fujiwara S, Honda S., Determination of ingredients of antipyretic analgesic preparations by micellar electrokinetic capillary chromatography, Anal Chem., 59: 2773-6, 1987 67. Furtos-Matei A, Li J, Waldron KC., Micellar electrokinetic chromatographic study of the interaction between enkephalin peptide analogs and charged micelles, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 695: 39-47, 1997. 68. Gaál D., Hudecz F., Szekerke M., Immunomodulatory effect of synthetic branched polypeptides I., J. Biol. Response Mod. 3: 174-84, 1984. 69. Gabizon A., Chemla M., Tzemach D., Horowitz AT., Goren DJ., Liposome longevity and stability in circulation: effects on the in vivo delivery to tumors and therapeutic efficacy of encapsulated anthracyclines, J. Drug Target. 3: 391-8, 1996. 70. Gaillard Y., Pepin G., Poisoning by plant material: review of human cases and analytical determination of main toxins by high-performance liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 733(1-2):181-229, 1999 71. Gao Q., Yeung ES., A matrix for DNA separation: genotyping and sequencing using poly(vinylpyrrolidone) solution in uncoated capillaries, Anal Chem., 70: 1382-8, 1998.
119
72. Garcia-Ruiz, C, Garcia MA, Marina ML.,
Separation of a group of N-phenylpyrazole
derivatives by micellar electrokinetic chromatography: application to the determination of solute-micelle association constants and estimation of the hydrophobicity, Electrophoresis, 21: 2424-31, 2000. 73. George S., Gill L., Braithwaite RA., Simple high-performance liquid chromatographic method to monitor vigabatrin, and preliminary review of concentrations determined in epileptic patients, Ann Clin Biochem., 37: 38-42, 2000. 74. Gilányi T., Wolfram E., Microdomains in polymer solutions. Polymer Science and Technology, Vol. 30. Plenum Press, New York, Dubin,P. (Ed.), 383-405, 1985. 75. Golub TR., Barker GR., Lovett M.,Gilliland DG., Fusion of PDGF receptor beta to a novel ets-like gene, tel, in chronic myelomonocytic leukemia with t(5;12) chromosomal translocation, Cell, 77: 307-16, 1994. 76. Gros P., Croop J., Housman D., Mammalian multidrug resistance gene: complete cDNA sequence indicates strong homology to bacterial transport proteins, Cell, 47: 371-80, 1986. 77. Guijt-van Duijn RM., Frank J., van Dedem GW., Baltussen E., Recent advances in affinity capillary electrophoresis, Electrophoresis, 21: 3905-18, 2000. 78. Gusev I., Huang X, Horvath C., Capillary columns with in situ formed porous monolithic packing
for
micro
high-performance
liquid
chromatography
and
capillary
electrochromatography, J Chromatogr A. , 855: 273-90, 1999. 79. Hamada H., Hagiwara K., Nakajima T., Tsuruo T., Phosphorylation of the Mr 170,000 to 180,000 glycoprotein specific to multidrug-resistant tumos cells: effects of verapamil, trifluoperazine and phorbol esters, Cancer Res., 47: 2860-5, 1987 80. Han SM., Direct enantiomeric separations by high performance liquid chromatography using cyclodextrins, Biomed Chromatogr., 11: 259-71, 1997. 81. Hanks SK., Quinn AM., Protein kinase catalytic domain sequence database: identification of conserved features of primary structure and classification of family members, Methods Enzymol., 200: 38-62, 1991. 82. Hanton SD., Liu XG., GPC separation of polymer samples for MALDI analysis, Anal Chem. 72: 4550-4, 2000.
120
83. Harrell CW., Dey J., Shamsi SA., Foley JP., Warner IM., Enhanced separation of antidepressant drugs using a polymerized nonionic surfactant as a transient capillary coating, Electrophoresis, 19: 712-8, 1998. 84. He XG., On-line identification of phytochemical constituents in botanical extracts by combined
high-performance
liquid
chromatographic-diode
array
detection-mass
spectrometric techniques, J Chromatogr A.,880: 203-32, 2000. 85. Heegaard NH, Nilsson S., Guzman NA., Affinity capillary electrophoresis: important application areas and some recent developments, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 715: 29-54, 1998. 86. Heiger DN., High performance capillary electrophoresis - an introduction, Hewlett Packard Company, France, 1992. 87. Heiger DN., Kaltenbach P., Sievert HJ., Diode array detection in capillary electrophoresis, Electrophoresis, 15: 1234-1247, 1994. 88. Heller C., Principles of DNA separation with capillary electrophoresis, Electrophoresis, 22: 629-43, 2001. 89. Hensley K., Williamson KS., Floyd RA., Measurement of 3-nitrotyrosine and 5-nitro-gammatocopherol by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection, Free Radic Biol Med., 28: 520-8, 2000. 90. Herrero-Martinez JM, Fernandez-Marti M, Simo-Alfonso E, Ramis-Ramos G., Determination of alkylphenol ethoxylates by micellar electrokinetic chromatography with bile salts, Electrophoresis, 22: 526-34, 2001. 91. Hershfield MS., Mitchell BS., Metabolic and molecular bases of inherited disease, eds. Scriver CR., Beaduet AL., Valle VS., McGraw-Hill, New-York, 1725-68, 1995. 92. Higgins CF., Gallagher MP., Mimmack MM., Pearce SR., A family of closely related ATPbinding subunits from prokaryotic and eukaryotic cells, Bioessays., 8: 111-6, 1988 93. Higgins CF., P-glycoprotein. To flip or not to flip?, Curr Biol., 4: 259-60, 1994. 94. Hiraoka A., Tominaga I, Hori K., Sodium dodecylsulfate capillary gel electrophoretic measurement of the concentration ratios of albumin and alpha2-macroglobulin in cerebrospinal fluid and serum of patients with neurological disorders, J Chromatogr A., 895: 339-44, 2000.
121
95. Hiraoka A., Seiki K, Oda H, Eguchi N, Urade Y, Tominaga I, Baba K., Charge microheterogeneity of the beta-trace proteins (lipocalin-type prostaglandin D synthase) in the cerebrospinal fluid of patients with neurological disorders analyzed by capillary isoelectrofocusing, Electrophoresis, 22: 3433-7, 2001. 96. Hjerten S., Free zone electrophoresis, Chromatogr Rev., 2: 122-219, 1967. 97. Hong JW., Hosokawa K., Fujii T., Seki M., Endo I., Microfabricated polymer chip for capillary gel electrophoreis, Biotechnol. Prog., 17: 958-962, 2001. 98. Horstkotter C., Blaschke G., Stereoselective determination of ofloxacin and its metabolites in human urine by capillary electrophoresis using laser-induced fluorescence detection, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 754:1 69-78, 2001. 99. Horvath J., Dolnik V., Polymer wall coatings for capillary electrophoresis, Electrophoresis, 22: 644-55, 2001. 100. Hsiao YM., Ko JL., Lo CC., Determination of tetracycline and streptomycin in mixed fungicide products by capillary zone electrophoresis, J Agric Food Chem. 49: 1669-74, 2001. 101. Huber CG., Micropellicular stationary phases for high-performance liquid chromatography of double-stranded DNA, J. Chromatogr. A., 806: 3-30, 1998. 102. Hudecz F., Polimer terapeutikumok, Magyar Tudomány, 10: 1211-21, 1998. 103. Hudecz F., Pimm MV, Rajnavolgyi E, Mezo G, Fabra A, Gaal D, Kovacs AL, Horvath A, Szekerke M., Carrier design: new generation of polycationic branched polypeptides containing OH groups with prolonged blood survival and diminished in vitro cytotoxicity, Bioconjug. Chem. 10: 781-90, 1999. 104. Hunter T., A thousand and one protein kinases, Cell, 50: 823-9, 1987. 105. Hutterer KM., Birrell H, Camilleri P, Jorgenson JW., High resolution of oligosaccharide mixtures by ultrahigh voltage micellar electrokinetic capillary chromatography, J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 745: 365-72, 2000. 106. Idei M., Kiss É., Kéri Gy., Calculation of modified capacity factor in micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis, 17: 762-5, 1996. 107. Idei M., Kiss É., Hollósy F., Tamás B., Örfi L., Seprődi J., Mészáros Gy., Kéri Gy., Calculation of phase residence times in micellar electrokinetic chromatography, J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 24: 303-315, 2001.
122
108. Inagaki S., Esaka Y, Sako M, Goto M., Analysis of DNA adducts bases by capillary electrophoresis with amperometric detection, Electrophoresis, 22: 3408-12, 2001. 109. Inglis AS., Reid GE., Simpson RJ., Chemical techniques employed for the primary structural analysis of proteins and peptides, EXS., 73: 141-71, 1999. 110. Ishihama Y., Oda Y, Uchikawa K, Asakawa N., Correlation of octanol-water partition coefficients with capacity factors measured by micellar electrokinetic chromatography, Chem Pharm Bull 42: 1525-7, 1994 111. Jaimez J., Fente CA., Vazquez BI., Franco CM., Cepeda A., Mahuzier G., Prognon P., Application of the assay of aflatoxins by liquid chromatography with fluorescence detection in food analysis, J Chromatogr A., 882: 1-10, 2000. 112. Jellum E., Dollekamp H., Blessum C., Capillary electrophoresis for clinical problem solving: analysis of urinary diagnostic metabolites and serum proteins, J Chromatogr B Biomed Appl., 683: 55-65, 1996. 113. Johnson T., Bergquist J., Ekman R., Nordhoff E., Schurenberg A., Kloppel KD., Muller M., Lehrach H., Gobom J., A CE-MALDI interface based on the use of prestructured sample supports, Anal. Chem., 73: 1670-5, 2001. 114. Jorgenson JW., Lukacs KD., Free-zone electrophoresis in glass capillaries, Clin Chem. 27: 1551-3, 1981. 115. Jozwiak K., Szumilo H, Senczyna B, Niewiadomy A., Use of reversed-phase highperformance liquid chromatography in QSAR analysis of 2,4-dihydroxythiobenzanilide analogues, SAR QSAR Environ Res. 10: 509-32, 1999. 116. Juliano K., Champion WL Jr, Schreiber MA, Blackwell JA., Quantitation and determination of molecular weight distribution of residual water soluble extractable polyamines in DMP 504, a poly-alkylamine bile acid sequestrant, by aqueous high performance size exclusion chromatography, J Pharm Biomed Anal., 16: 499-506, 1997. 117. Kaliszan R., Quantitative structure-chromatographic retention relationship, WileyInterscience, New York, 1987. 118. Kang JW, De Reymaeker G, Van Schepdael A, Roets E, Hoogmartens J., Analysis of bacitracin by micellar electrokinetic capillary chromatography with mixed micelle in acidic solution, Electrophoresis., 22: 1356-62, 2001.
123
119. Kasai K., Size-dependent chromatographic separation of nucleic acids, J Chromatogr. 618: 203-21, 1993. 120. Kellen JA., Mirakian A., Kolin A., Antimetastatic effect of amiloride in an animal tumour model, Anticancer Res., 8: 1373-6, 1988. 121. Khaledi MG., High performance capillary electrophoresis, Chemical Analysis Series, Vol. 146, John Wiley & Sons, Inc., 1998. 122. Kim JB., , Otsuka K, Terabe S., On-line sample concentration in micellar electrokinetic chromatography with cationic micelles in a coated capillary, J Chromatogr A., 912: 343-52, 2001. 123. Kim KR, La S, Kim A, Kim JH, Liebich HM., Capillary electrophoretic profiling and pattern recognition analysis of urinary nucleosides from uterine myoma and cervical cancer patients, J Chromatogr B Biomed Sci Appl.., 754: 97-106, 2001. 124. Kimura K., Ogura Y., Biodegradable polymers for ocular drug delivery, Ophtalmologica, 215: 143-55, 2001. 125. Kleymenova E., Muga S., Fischer S., Walker CL., Application of high-performance liquid chromatography-based analysis of DNA fragments to molecular carcinogenesis, Mol Carcinog. 29: 51-8, 2000. 126. Kolibaba KS, Druker BJ., Protein tyrosine kinases and cancer, Biochim Biophys Acta, 1333: 217-48, 1997. 127. Korizis KN, Exarchou A, Michalopoulos E, Georgakopoulos CD, Kolonitsiou F, Mantagos S, Gartaganis SP, Karamanos NK., Determination of malondialdehyde by capillary electrophoresis, application to human plasma and relation of its levels with prematurity, Biomed Chromatogr., 15: 287-91, 2001. 128. Kozlowski A., Charles SA., Harris JM., Development of pegylated interferons for the treatment of chronic hepatitis C, BioDrugs, 15: 419-29, 2001. 129. Krull IS., Strong R., Sosic Z., Cho BY., Beale SC., Wang CC., Cohen S., Labeling reactions applicable to chromatography and electrophoresis of minute amounts of protein, J. Chromatogr. B biomed Sci. Appl., 699: 173-208, 1997. 130. Krull IS., Sebag A, Stevenson R, Specific applications of capillary electrochromatography to biopolymers, including proteins, nucleic acids, peptide mapping, antibodies, and so forth, J Chromatogr A., 887: 137-63, 2000.
124
131. Kwon GS, Naito M, Yokoyama M, Okano T, Sakurai Y, Kataoka K., Physical entrapment of adriamycin in AB block copolymer micelles, Pharm Res., 12: 192-5, 1995) 132. Lamb DH, Summa L, Lei QP, Duval G, Adam O., Determination of free carrier protein in protein-polysaccharide conjugate vaccines by micellar electrokinetic chromatography, J Chromatogr A., 894: 311-8, 2000 133. Lawrence DS., Niu J., Protein kinase inhibitors: the tyrosine-specific protein kinases, Pharmacol. Ther., 77: 81-114, 1998. 134. Lee G., Dallas S., Hong M., Bendayan R., Drug transporters in the central nervous system: brain barriers and brain parenchyma considerations, Pharmacol. Rev., 53: 569-97, 2001. 135. Leinweber FC., Stein J., Otto M., Capillary zone electrophoresis of proteins with poly(2hydroxyethyl methacrylate)-coated capillaries: fundamental and applications, Fresenius J Anal Chem., 370: 781-8, 2001. 136. Levitzky A., Protein tyrosine kinase inhibitors as novel therapeutic agents, Pharmacol. Ther. 82: 231-9, 1999. 137. Li F., Yu L., Determination of trimebutine maleate in rat plasma and tissues by using capillary zone electrophoresis, Biomed Chromatogr., 15: 248-51, 2001. 138. Li SFY., Capillary electrophoresis principles, practice and applications, Journal of Chromatography Library – vol. 52., Elsevier Science B. V., 1994. 139. Lindner H., Helliger W., Sarg B., Meraner C., Effect of buffer composition on the migration order and separation of histone H1 subtypes, Electrophoresis, 16: 604-10, 1995. 140. Litman T., Druley TE., Stein WD., Bates SE., From MDR to MXR: new understanding of multidrug resistance systems, their properties and clinical significance, Cell Mol. Life Sci., 58: 931-59, 2001. 141. Liu Z, Zou H, Ye M, Ni J, Zhang Y., Effects of organic modifiers on retention mechanism and selectivity in micellar electrokinetic capillary chromatography studied by linear solvation energy relationships, J Chromatogr A., 863: 69-79, 1999. 142. Lucas C., Gliddon MJ., Safarpour MM., Cardaciotto S., Ahuja ES., Foley JP., Determination of avoparcin in animal formulations by capillary electrophoresis, J Capillary Electrophor., 6: 75-83, 1999. 143. Maeda H., Miyamoto Y., Drug absorption enhancement, ed. deBoer Academic Publishers, Svájc, 221-47, 1994.
125
AG., Harwood
144. Maeda H., The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key-role of tumor-selective macromolecular drug targeting, Advan. Enzyme Regul., 41: 189207, 2001. 145. Martinovic S., Pasa-Tolic, Masselon C, Jensen PK, Stone CL, Smith RD., Characterization of human alcohol dehydrogenase isoenzymes by capillary isoelectric focusing-mass spectrometry, Electrophoresis, 21: 2368-75, 2000. 146. Mázor L., Szerveskémiai analitikai kézikönyv, Műszaki Könyvkiadó,
Budapest,
1966. 147. Mechref Y., el Rassi Z., Fused-silica capillaries with surface-bound dextran layer crosslinked with diepoxypolyethylene glycol for capillary electrophoresis of biological substances at reduced electroosmotic flow, Electrophoresis, 16: 617-24, 1995. 148. Mellado W., Horwitz SB., Phosphorylation of the multidrug resistance associated glycoprotein, Biochemistry, 26: 6900-4, 1987. 149. Merken HM., Beecher GR., Measurement of food flavonoids by high-performance liquid chromatography: a review, J. Agric. Food Chem., 48: 577-99, 2000. 150. Meylan WM., Howard PH., Atom/fragment contribution method for estimating octanolwater partition coefficients, J. Pharm Sci., 84: 83-92, 1995. 151. Mikus P., Kaniansky D., Fanali S., Separation of multicomponent mixtures of 2,4dinitrophenyl labelled amino acids and their enantiomers by capillary zone electrophoresis, Electrophoresis, 22: 470-7, 2001. 152. Miller DN., Evaluation of gel filtration resins for the removal of PCR-inhibitory substances from soils and sediments, J Microbiol Methods. 44: 49-58, 2001. 153. Minarik M, Foret F, Karger BL., Fraction collection in micropreparative capillary zone electrophoresis and capillary isoelectric focusing, Electrophoresis, 21: 247-54, 2000. 154. Moeller MR., Steinmeyer S., Kraemer T., Determination of drugs of abuse in blood, J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl.,713: 91-109, 1998. 155. Móra M., Pató J., Effect of negative electric charges of polymers on the chymotrypsin catalyzed hydrolysis of the side chains, J. of Controlled Release, 18: 153-8, 1992. 156. Muijselaar PGHM., Claessens HA., Cramers CA., Anal. Chem. 66: 635-44, 1994. 157. Németh B.: Kémiai Táblázatok, Műszaki Könyvkiadó, Budapest, 272 old., 1979.
126
158. Neubert RH., Schwarz MA., Mrestani Y., Platezer M., Raith K., Affinity capillary electrophoresis in pharmaceutics, Pharm Res., 16: 1663-73, 1999 159. Nishi H., Capillary electrophoresis of drugs: current status in the analysis of pharmaceuticals, Electrophoresis, 20: 3237-58, 1999. 160. Nishi H., Kuwahara Y., Enantiomer separation by capillary electrophoresis utilizing noncyclic mono-, oligo- and polysaccharides as chiral selectors, J. Biochem. Biophys. Methods, 48: 89-102, 2001. 161. Nock T., Dove J., McCord B., Mao D., Temperature and pH studies of short tandem repeat systems using capillary electrophoresis at elevated pH, Electrophoresis, 22: 755-62, 2001. 162. Osthoff HD., Sujino K., Placic MM., Dovichi NJ., Effects of amine modifiers on the separation of tetramethylrhodamine-labeled mono- and oligosaccharides by capillary zone electrophoresis., J. Chromatogr A., 895: 85-90, 2000. 163. Patarca R., Protein phosphorylation and dephosphorylation in physiologic and oncologic processes, Crit Rev Oncog., 7: 343-432, 1996. 164. Pató J., Azori M., Fehérvári F., Csákvári É., Biológiailag aktív polimerek előállítása és vizsgálata I, Közvetlen észterkötésű polimer-prodrogok, Magyar Kémiai Folyóirat, 8: 37384, 1982. 165. Pató J., Azori M., Tüdős F., Polymeric prodrugs 1, Synthesis by direct coupling of drugs, Makromol. Chem., Rapid Commun., 3: 643-7, 1982. 166. Pató J., Azori M., Tüdős F., Polymeric prodrugs 2, Synthesis by coupling of drugs via spacer group, Makromol. Chem., Rapid Commun., 4: 25-8, 1983. 167. Pató J., Móra M., Naisbett B., Woodley JF., Duncan R., Uptake and transport of poly(Nvinylpyrrolidone-co-maleic acid) by the adult rat small intestine cultured in vitro: effect of chemical structure, Int. J. of Pharm., 104: 227-37, 1994. 168. Pató J., Kéri Gy., J. Chem Soc. 169. Pató J., Ulbrich K., Subr V., Baker P., Mező G., Hudecz F., Synthesis of macromolecular conjugates of urokinase inhibitor: amiloride, J. of Bioactive and Compatible Polymers, 14: 33-9, 1999. 170. Pályi I., Vincze B, Lovas S, Mezo I, Pato J, Kalnay A, Turi G, Gaal D, Mihalik R, Peter I, Teplan I, Murphy RF., Gonadotropin-releasing hormone analogue conjugates with strong selective antitumor activity, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 96: 2361-6, 1999.
127
171. Peng SX., Hyphenated HPLC-NMR and its applications in drug discovery, Biomed Chromatogr., 14: 430-41, 2000. 172. Phillips TM., Analysis of single-cell cultures by immunoaffinity capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection, Luminescence, 16: 145-52, 2001. 173. Poulsen HE., Weimann A., Loft S., Methods to detect DNA damage by free radicals: relation to exercise, Proc Nutr Soc., 58: 1007-14, 1999. 174. Prado MS., Steppe M., Tavares MF., Kedor-Hackman ER., Santo P., Method validation for diclofenac sodium in pharmaceuticals by capillary electrophoresis, J. Capillary Electrophor., 6: 125-9, 1999. 175. Rabel SR., Stobaugh JF., Applications of capillary electrophoresis in pharmaceutical analysis, Pharm Res., 10: 171-86, 1993 176. Raggi MA, Pucci V, Bugamelli F, Volterra V., Comparison of three analytical methods for quality control of clozapine tablets, J AOAC Int., 84: 361-7, 2001. 177. Raviv Y., Pollard HB., Bruggemann EP., Pastan I., Gottesman MM., Photosensitized labeling of a functional multidrug transporter in living drug-resistant tumor cells, J Biol Chem., 265: 3975-80, 1990. 178. Righetti PG., Gelfi C., Capillary electrophoresis of DNA for molecular diagnostics: an update, J Capillary Electrophor., 6: 119-24, 1999. 179. Righetti PR., Gelfi C., Verzola B., Castelletti L., The state of the art of dynamic coatings, Electrophoresis, 22: 603-11, 2001. 180. Rios, H., Gargallo, L., Radic, D., Properties of polyelectrolytes: maleic acid-vinylpirrolidone copolymers: potentiometric behaviour in dilute solution, Eur. Polym., J., 21: 1045-9, 1985. 181. Rios,H., Gargallo,L., Radic,D., Properties of polyelectrolytes: maleic acid-vinylpirrolidone copolymers: viscosimetric behaviour in dilute solution, Journal of Polymer Sci., 24: 2421-31, 1986. 182. Ronai Z., Barta C., Sasvary-Szekely M., Guttman A., DNA analysis on electrophoretic microchips: effect of the operational variables, Electrophoresis, 22: 294-9, 2001. 183. Rothenberg M., Ling V., Multidrug resistance: molecular biology and clinical relevance, J. Natl. Cancer Inst., 81: 907-10, 1989. 184. Routier FH, Hounsell EF, Rudd PM, Takahashi N, Bond A, Hay FC, Alavi A, Axford JS, Jefferis R., Quantitation of the oligosaccharides of human serum IgG from patients with
128
rheumatoid arthritis: a critical evaluation of different methods, J Immunol Methods., 213: 113-30, 1998. 185. Ruetz S., Gros P., Phosphatidylcholine translocase: a physiological role for the mdr2 gene, Cell, 77: 1071-81, 1994. 186. Sadecka J., Cakrt M., Hercegova A., Polonsky J., Skacani I., Determination of ibuprofen and naproxen in tablets, J Pharm Biomed Anal., 25: 881-91, 2001. 187. Sarkadi B., Muller M, Homolya L, Hollo Z, Seprodi J, Germann UA, Gottesman MM, Price EM, Boucher RC., Interaction of bioactive hydrophobic peptides with the human multidrug transporter, FASEB J. 8: 766-70, 1994. 188. Sarkadi B., Müller M., Search for specific inhibitors of multidrug resistance in cancer, Semin. Cancer. Biol., 8: 171-82, 1997. 189. Scala S., Akhmed N, Rao US, Paull K, Lan LB, Dickstein B, Lee JS, Elgemeie GH, Stein WD, Bates SE., P-glycoprotein substrates and antagonists cluster into two distinct groups, Mol Pharmacol., 51: 1024-33, 1997. 190. Schlessinger J., Ullrich A., Growth factor signaling by receptor tyrosine kinase, Neuron, 9: 383-91, 1992. 191. Schmalzing D., Piggee CA., Foret F., Carrilho E., Karger BL., Characterization and performance of a neutral hydrophilic coating for the capillary electrophoretic separation of biopolymers, J Chromatogr A., 652: 149-59, 1993. 192. Schmidt L, Duh FM, Chen F, Kishida T, Glenn G, Choyke P, Scherer SW, Zhuang Z, Lubensky I, Dean M, Allikmets R, Chidambaram A, Bergerheim UR, Feltis JT, Casadevall C, Zamarron A, Bernues M, Richard S, Lips CJ, Walther MM, Tsui LC, Geil L, Orcutt ML, Stackhouse T, Zbar B, Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat Genet. 16: 68-73, 1997. 193. Sharom FJ., Lu P., Liu R., Yu X., Linear and cyclic peptides as substrates and modulators of glycoprotein: peptide binding and effects on drug transport and accumulation, Biochem J., 333: 621-30, 1998. 194. Sharom FJ., YuX., Lu P., Liu R., Chu YW., Szabó K., Müller M., Hose CD., Monks A., Váradi A., Seprődi J., Sarkadi B., Interaction of P-glycoprotein multidrug transporter (MDR1) with high affinity peptide chemosensitizers in isolated membranes, reconstituted systems and in intact cells, Biochem. Pharmacol., 58: 571-86, 1999.
129
195. Shen Y., Berger SJ, Anderson GA, Smith RD.,
High-efficiency capillary isoelectric
focusing of peptides, Anal Chem., 72: 2154-9, 2000. 196. Shimura K., Wang Z, Matsumoto H, Kasai K., Synthetic oligopeptides as isoelectric point markers
for
capillary isoelectric
focusing with
ultraviolet absorption
detection,
Electrophoresis, 21: 603-10, 2000. 197. Shively JE., The chemistry of protein sequence analysis, EXS, 88: 99-117, 2000. 198. Shtil AA., Signal transduction pathways and transcriptional mechanisms as targets for prevention of emergence of multidrug resistance in human cancer cells, Curr. Drug Targets, 2: 57-77, 2001. 199. Smith JT., el Rassi Z., Capillary zone electrophoresis of biological substances with fused silica capillaries having zero or constant electroosmotic flow, Electrophoresis, 14: 396-406, 1993 200. Snyder LR., Kirkland JJ., Bevezetés az intenzív folyadékkromatográfiába, Műszaki Könyvkiadó, Budapest, 1979 201. Stein WD., The movement of molecules across cell membranes, Academic Press, New York, 1967. 202. Stein WD., Kinetics of the multidrug transporter (P-glycoprotein) and its reversal, Physiol Rev. 77: 545-90, 1997. 203. Sugano M., Hidaka H, Yamauchi K, Nakabayashi T, Higuchi Y, Fujita K, Okumura N, Ushiyama Y, Tozuka M, Katsuyama T., Analysis of hemoglobin and globin chain variants by a commonly used capillary isoelectric focusing method, Electrophoresis, 21: 3016-9, 2000. 204. Suntomsuk L., Separation of cold medicine ingredients by capillary electrophoresis, Electrophoresis, 22: 139-43, 2001. 205. Taga A., Suzuki S., Honda S., Capillary electrophoretic analysis of carbohydrates derivatized
by
in-capillary
condensation
with
1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,
J
Chromatogr A., 911: 259-67, 2001. 206. Takagi T., Tsujii K, Shirahama K., Binding isotherms of sodium dodecyl sulfate to protein polypeptides with special reference to SDS-polyacylamide gel electrophoresis., J. Biochem , 77: 939-47, 1975.
130
207. Takakura Y., Hashida M., Macromolecular drug carrier systems in cancer chemotherapy: macromolecular prodrugs, Crit. Rev. Oncol.Hematol., 18: 207-31, 1995. 208. Terabe S., Otsuka K., Ichikawa K., Tsuchiya A., Ando T., Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries, Anal. Chem., 56: 111-3, 1984. 209. Terabe S., Otsuka K., Ando T., Electrokinetic chromatography with micellar solution and open-tubular capillary, Anal. Chem., 57: 834-41, 1985 210. Tewary HK., Iversen PL., Qualitative and quantitative measurements of oligonucleotides in gene therapy: Part I. In vitro models., J Pharm Biomed Anal., 15: 857-73, 1997. 211. Torchilin VP., Structure and design of polymeric surfactant-based drug delivery systems, J. Control Release, 73: 137-72, 2001. 212. Torchilin VP., Levchenko TS, Whiteman KR, Yaroslavov AA, Tsatsakis AM, Rizos AK, Michailova EV, Shtilman MI., Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidones: synthesis, properties and liposome surface modification, Biomaterials, 22: 3035-44, 2001. 213. Trone MD, Leonard MS, Khaledi MG., Congeneric behavior in estimations of octanolwater partition coefficients by micellar electrokinetic chromatography, Anal Chem. 72: 1228-35, 2000. 214. Ueda K., Pastan I., Gottesman MM., Isolation and sequence of the promoter region of the human multidrug-resistance (P-glycoprotein) gene, J. Biol. Chem., 262: 17432-6, 1987. 215. Van Heyningen, Genetics. One gene--four syndromes, Nature, 367: 319-20, 1994. 216. Van Tellingen O., The importance of drug-transporting P-glycoproteins in toxicology, Toxicol. Lett., 120: 31-41, 2001. 217. Vela J., Yanes EG., Stalcup AM., Quantitative determination of clenbuterol, salbutamol and tulobuterol enantiomers by capillary electrophoresis, Fresenius J Anal Chem., 369: 212-9, 2001. 218. Vickers ER., Goebel C., Mather LE, Mackay L, Wells RJ., High-performance liquid chromatographic determination of bradykinin in saliva: a critical review and a new method, J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 755: 101-10, 2001. 219. Vindevogel J., Sandra P., Introduction to micellar electrokinetic chromatography, Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, Németország, 1992.
131
220. Vizioli NM., Carducci CN., Pena C., Guzman NA., Monitoring the purity of a synthetic peptide by capillary electrophoresis: utilization of an on-line preconcentration method for improved separation and detection sensitivity, J Capillary Electrophor., 6: 109-18, 1999. 221. Von Brocke A., Nicholson G., Bayer E., Recent advances in capillary electrophoresis / electrospray-mass spectometry, Electrophoresis, 22: 1251-66, 2001. 222. Wahl JH, Goodlett DR, Udseth HR, Smith RD., Use of small-diameter capillaries for increasing peptide and protein detection sensitivity in capillary electrophoresis-mass spectrometry, Electrophoresis, 14: 448-57, 1993. 223. Walhagen K, Unger KK, Hearn MT., Capillary electrochromatography analysis of hormonal cyclic and linear peptides, Anal Chem., 73: 4924-36, 2001. 224. Wallingford RA., Ewing AG., Capillary electrophoresis, Adv. Chromatogr., 29: 1-76, 1989 225. Ward TJ., Farris AB., Chiral separations using the macrocyclic antibiotics: a review, J. Chromatogr. A, 906: 73-89, 2001. 226. Weisburg JH., Roepe PD., Dzekunov S., Scheinberg DA., Intracellular pH and multidrug resistance regulate complement-mediated cytotoxicity of nucleated human cells, J Biol Chem., 274: 10877-88, 1999. 227. Wen J., Arakawa T., Philo JS., Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions, Anal. Biochem., 240: 155-66, 1996. 228. Wiese M., Pajeva IK., Structure-activity relationships of multidrug resistance reversers, Curr. Med. Chem. , 8: 685-713, 2001. 229. Winzor DJ., From gel filtration to biosensor technology: the development of chromatography for the characterization of protein interactions, J Mol Recognit., 13: 279-98, 2000. 230. Wolf SM., Vouros P.,
Incorporation of sample stacking techniques into the capillary
electrophoresis CF-FAB mass spectrometric analysis of DNA adducts, Anal Chem., 67: 891900, 1995. 231. Wright AK, Thompson MR, Miller RL., A study of protein-sodium dodecyl sulfate complexes by transient electric birefringence, Biochemistry, 14: 3224-8, 1975. 232. Wu YS., Lee HK., Li SF, Rapid estimation of octanol-water partition coefficients of pesticides by micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis, 19: 1719-27, 1998
132
233. Wu YS., Lee HK., Li SF., High-performance chiral separation of fourteen triazole fungicides by sulfated beta-cyclodextrin-mediated capillary electrophoresis, J Chromatogr A., 912: 171-9, 2001 234. Zabzdyr JL., Lillard SJ., UV- and visible-excited fluorescence of nucleic acids separated by capillary electrophoresis, J. Chromatogr. A, 911: 269-76, 2001. 235. Zamora JM, Pearce HL, Beck WT., Physical-chemical properties shared by compounds that modulate multidrug resistance in human leukemic cells, Mol. Pharmacol., 33: 454-62, 1988. 236. Zhang M, El Rassi Z., Capillary electrochromatography with novel stationary phases. I. Preparation and characterization of octadecylsulfonated silica, Electrophoresis, 19: 2068-72, 1998. 237. Zhao J, Yang G, Duan H, Li J., Determination of synthesized alpha-vitamin E by micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis, 22: 151-4, 2001 238. Zhao S., Liu YM., Quantification of D/L-aspartic acids in Aplysia californica central nervous system by beta-cyclodextrin modified micellar electrokinetic chromatography, Biomed Chromatogr. 15: 274-9, 2001 239. Zhao S., Prasad C., Robertson HJ., Liu YM., Determination of enterostatin in human cerebrospinal fluid by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection, Fresenius J. Anal. Chem., 369: 220-4, 2001. 240. Zidkova J., Chmelik J., Determination of saccharides in fruit juices by capillary electrophoresis
and
matrix-assisted
laser
desorption/ionization
time-of-flight
mass
spectometry, J. Mass. Spectrom., 36: 417-21, 2001. 241. Yao XW., Wu D., Regnier FE., Manipulation of electroosmotic flow in capillary electrophoresis, J. Chromatogr. , 636:21-9, 1993. 242. Yarden Y., Ullrich A., Growth factor receptor tyrosine kinases, Annu. Rev. Biochem., 57: 443-78, 1988.
133
IX. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés témájával összefüggő közlemények: I. Győrffy E., Pató J., Horváth A., Érchegyi J., Teplán I., Kéri Gy., Idei M. Behaviour of macromolecular drug carrier poly(N-vinyl pyrrolidone-co-maleic acid) and its bioconjugates at different pH values investigated by gel permeation chromatography J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 21: 2341-53, 1998. II. Győrffy E., Pató J., Horváth A., Érchegyi J., Teplán I., Kéri Gy., Idei M. Analysis of polyanionic carrier poly(N-vinyl pyrrolidone-co-maleic acid) and its bioconjugates by capillary electrophoresis Electrophoresis, 19: 295-9, 1998. III. Idei M., Seprődi J., Győrffy E., Hollósy F., Vadász Zs., Mészáros Gy., Teplán I., Kéri Gy. Micellar electrokinetic chromatography of highly hydrophobic peptides Analytica Chimica Acta 372: 273-9, 1998. IV. Idei M., Győrffy E., Kiss É., Őrfi L., Seprődi J., Tamás B., Hollósy F., Mészáros Gy., Kéri Gy. A novel normalized retention factor in micellar electrokinetic chromatography Electrophoresis 20: 1561-7, 1999. Az értekezés témájától eltérő közlemény: Braun L., Puskás F., Csala M., Győrffy E., Garzó T., Mandl J., Bánhegyi G. Gluconeogenesis from ascorbic acid: ascorbate recycling in isolated murine hepatocytes FEBS Letters, 390: 183-6, 1996.
134
