Ph.D. értekezés. Dr Nagy Adrienne

Ph.D. értekezés

A Chlamydia pneumoniae okozta légúti infekció, az allergia és néhány genetikai tényezo szerepe a gyermekkori asthma bronchiale patomechanizmusában

Dr Nagy Adrienne Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu 19. sz. program Programvezeto: Dr Falus András Témavezeto: Dr Szalai Csaba

Budapest, 2003.

1

TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések………………………………………………………………………………..3 1. Bevezetés……………………………………………………………………………… .4 1.1 Problémafelvetés, célkituzés………………………………………………..….4 1.2 Betegek, módszerek…………………………………………………………....5 1.3 Vizsgálatok……………………………………………………………………. 5 1.4 Várható eredmények……………………………………………………………6 2. Irodalmi összefoglaló……………………………………………………………………6 2.1 Asthma bronchiale……………………………………………………………..6 2.2 Kemokinek az allergia és asthma bronchiale pathomechanizmusában……….13 2.3 Chlamydia pneumoniae fertozés………………………………………………22 2.4 Mannózköto lektin…………………………………………………………….28 3. Vizsgálatok……………………………………………………………………………..34 3.1 CCR5 delta 32 mutáció vizsgálata allergiás és asthmás gyermekekben……34 3.1.1 Bevezetés……………………………………………………………...34 3.1.2 Betegek és módszerek…………………………………………………34 3.1.3 Eredmények……………………………………………………………37 3.1.4 Megbeszélés……………………………………………………………40 3.2 MCP-1-2518 A/G polimorfizmus és az asthma bronchiale összefüggése…..45 3.2.1 Bevezetés………………………………………………………………45 3.2.2 Betegek és módszerek…………………………………………………45 3.2.3 Eredmények……………………………………………………………48 3.2.4 Megbeszélés……………………………………………………………55 3.3 Szérum MCP-1 vizsgálat…………………………………………………….58 3.3.1 Bevezetés………………………………………………………………58 3.3.2 Betegek és módszerek…………………………………………………58 3.3.3 Eredmények……………………………………………………………59 3.3.4 Megbeszélés……………………………………………………………62 3.4 Chlamydia pneumoniae infekció és az allergia kapcsolata asthmás gyermekekben és fiatal felnottekben………………………………………...64 3.4.1 Bevezetés………………………………………………………………64 3.4.2 Betegek és módszerek………………………………………………….65 3.4.3 Eredmények………………………………………………………… ...71 3.4.4 Megbeszélés……………………………………………………………75 3.5 A mannózköto lektin mutáció és a Chlamydia pneumoniae fertozés együttes hatása az asthmára……………………………………………………..79 3.5.1 Bevezetés………………………………………………………………79 3.5.2 Betegek és módszerek…………………………………………………80 3.5.3 Eredmények……………………………………………………………83 3.5.4 Megbeszélés……………………………………………………………90 4. Konklúzió……………………………………………………………………………….94

2

5. Összefoglalás, tézisek………………………………………………………………….97 6. Köszönetnyilvánítás……………………………………………………………………98 7. Referenciák…………………………………………………………………………….100 7.1 Az értekezésben idézett publikációk……………………………………….100 7.2 Az értekezéssel összefüggo saját közlemények…………………………….106 7.3 Az értekezéssel összefüggo eloadások, poszterek………………………….106 8. Ábrák és táblázatok címei…….………………………………………………………..108 9. Függelék………………………………………………………………………………..110 9.1 Hibalehetoségek…………………………………………………………….110 9.2 Formai megjegyzések……………………………………………...……….111 10 Summary………………………………………………………………………………112

3

RÖVIDÍTÉSEK AAB: allergiás asthma bronchiale BHR: bronchialis hyperreaktivitás bp: bázispár C. pneumoniae: Chlamydia pneumoniae CI: confidencia intervallum CPI: Chlamydia pneumoniae infekció EB: elemi test FEV1: forced expiratory volume in the first second: forszírozott kilégzési manovernél mért térfogat a kilégzés elso másodpercében (liter) GINA: Global Initiative for Asthma IL : interleukin K: kontroll LTC4: leukotrién C4 mediátor MASP: Mannose-binding lectin-associated factor MBL: Mannose-binding lectin (mannózköto lektin) MCP-1: Monocyte chemotactic protein-1 MIP-1alfa, béta: macrophage inflammatory protein 1 alfa, béta MOMP: major outer membran protein NAAB: nem allergiás asthma bronchiale PCR: Polymerase chain reaction (polimeráz láncreakció) PCR-RFLP: PCR és restrict fragment length polimorfism (magyarul: restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus) PEF: peak expiratory flow: csúcsáramlás mérés (liter/min) RANTES : regulated on activation normal T cell expressed and secreted RB: retikuláris test Th1: T helper 1 lymphocyta Th2: T helper 2 lymphocyta TNF alfa: tumornecrosis factor alfa VA: Vegyes allergia asthma nélkül

4

1.

BEVEZETÉS

1.1 PROBLÉMA FELVETÉS, CÉLKITUZÉS Az allergia és az asthma bronchiale prevalenciájának nagyfokú növekedése ma már hazai népegészségügyi, sot világméretu probléma. A szakambulanciák nagy betegforgalma sokszor az egy-egy betegre jutó ido idot csökkenti, így bizo nyos differenciáldiagnosztikai lépések elmaradnak. Ilyen elkülönítendo, az asthmára hasonlító kórképek közé tartozik, a tünetszegénysége miatt sokszor nem, vagy félre diagnosztizált Chlamydia pneumoniae fertozés (CPI) is. A CPI az esetek egy részében bronc hiális hyperreaktivitással jár, ebben hasonlít az asthmára. Kezelésük azonban eltéro. Klinikai munkám során feltunoen sok Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) okozta bronchialis hyperreaktivitással találkoztam az asthmás gyermekek között. A betegek egy része célzott antibiotikus terápiára meggyógyult, másoknál életük elso CPI-ja indította el az asthmájukat. A megfelelo antibiotikus terápia klinikailag és szerológiailag is meggyógyította a fertozést, de a gyermek attól kezdve asthmás lett. A légúti kórokozók asthma exacerbációját kiváltó hatása közismert, azonban az asthma inicializálásában betöltött szerepükrol keveset tudunk. Az asthma bronchiale multifaktoriális kórkép, amelyben genetikai és környezeti tényezok és azok kölcsönhatásai játszanak szerepet. Kutatásom célja az volt, hogy választ találjak az alábbi kérdésekre. 1.1.1 Az immunrendszer egyes tagjainak (kemokin rendszer, komplement rendszer) genetikai polimorfizmusa, mutációja milyen szerepet játszik az asthma bronchiale kialakulásában? 1.1.2 Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza az asthma kialakulásának esélyét? 1.1.3 Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza a CPI kialkulásának esélyét? 1.1.4 Gyakoribb-e a CPI az asthmás gyermekek között, mint azoknál, akik nem asthmások? 1.1.5 Fogékonyabbak-e az asthmás gyermekek a CPI-ra, mint egészséges társaik? 1.1.6 A CPI szerepelhet-e trigger faktorként az asthma bronchiale kialakulásában, az arra genetikailag hajlamos gyermekeknél? 1.1.7 Van-e kapcsolat az allergia és a CPI között? 1.1.8 Több rizikótényezo (allergia, genetikai eltérések, CPI) együttes hatása fokozza-e az asthma kialakulásának esélyét? 1.1.9 Milyen patogenetikai kapcsolat van a CPI és az asthma bronchiale között? 5

1.2

BETEGEK ÉS MÓDSZEREK

1.2.1

A betegek és kontrollok nagy része a Budai Gye rmekórház gondozottjai, kisebb részük a Heim Pál kórház és néhányan I. Gyermekklinika betegei.

1.2.2 Helyi etikai bizottságok jóváhagyták a vizsgálatokat, amelyek a betegek és szüleik felvilágosítása, önkéntes beleegyezése és aláírása után történtek. A vérvizsgálat nem jelentett külön szúrást a gyerekeknek, azt igyekeztünk egy más miatt esedékes vérvétel kibovítéseként elvégezni. 1.2.3 Módszerek 1.2.3.1 Az allergia és/vagy asthma bronchiale diagnózisát allergológus vagy pulmonológus állította fel Prick borpróba, specifikus IgE meghatározás, légzésfunkciós vizsgálatok segítségével az anamnézis és a klinikum ismeretében differenciáldiagnosztikai lépések után. 1.2.3.2 A Chlamydai pneumoniae fertozöttség kimutatását species specifikus IgA, G, M vizsgálattal, ELISA módszerel végeztük. 1.2.3.3 A genetikai vizsgálatok polimeráz láncreakcóval (PCR) és PCR-restrikciós fragme ntum hosszúság polimorfizmus (PCR-RFLP) vizsgálatokkal történtek. 1.2.4

A hibalehetoségeket mérlegeltük. (Függelék 9.1)

1.2.5

A statisztikai elemzésekhez hivatalos számítógépes programokat alkalmaztunk. Mindig 95%-os confidencia intervallummal (CI) számoltunk és p< 0,05 értéket tartottuk szignifikánsnak.

1.3

VIZSGÁLATOK

Öt keresztmetszeti vizsgálatot végeztünk. 1.3.1 CCR5? 32 mutáció vizsgálata allergiás és asthmás gyermekekben 1.3.2 MCP-1-2518 A/G polimorfizmus és az asthma bronchiale összefüggése 1.3.3 A szérum MCP-1 szint vizsgálata 1.3.4 A CPI és az allergia kapcsolatának vizsgálata 1.3.5 A mannózköto lektin mutációk és a CPI együttes hatásának vizsgálata. 2000 márciusa és 2003 márciusa között fokazatosan vontuk be a gyermekeket a viszgálatokba. Közben a több száz beteg ellátása zavartalanul folyt. A kontroll csoportból kiszurt CPI-s betegek gondozását is természetesen felvállaltuk. A homozigóta mutáns eseteket különös figyelemmel kísértük.

6

1.4

VÁRHATÓ EREDMÉNYEK

Az asthmás és kontroll gyermekek CPI prevalenciájának ismerete fontos epidemiológiai adat és meghatározó lehet a rizikó csoport erre vonatkozó szurovizsgálatának indikációjában. A kiszurt esetek kezelése csökkentheti az „álasthmások” számát, így a differenciáldiagnosztikai buktatók feltárása egyben segítséget nyújthat a szakorvosi ellátásban is. A kísérletekben vizsgált genetikai markerek ma még nem részei a rutin vizsgálatoknak, de a jövoben jó prediktorai lehetnek az asthmának. A kemokin vizsgálatok eredményeitol új terápiás célpontokat remélhetünk. Végül a multifaktoriá lis asthma bronchiale patomechanizmusában szerepet játszó környzetei és genetikai tényezok kölcsönhatásának vizsgálatával az asthma patomechanizmusának jobb megértése, ezáltal a betegek terápiás lehetoségeinek bovülése várható.

2. IRODALMI ÖSSZEFOGLALÓ A disszertáció öt különálló kísérletét az alábbi négy témakör kapcsolja össze. Ezért a kísérletek bemutatása elott közösen 4 rövid alfejezetben tárgyalom az alábbi témákat: 2.1. Asthma bronchiale 2.2. Kemokinek az allergia, asthma patomechanizmusában 2.3. Chlamydia pneumoniae fertozés 2.4. Mannózköto lektin

2.1 ASTHMA BRONCHIALE Az asthma bronchiale definíciója a róla alkotott tudásunk bovülése folytán mostanában évtizedenként megújul. A 80-as évek elott rohamokban jelentkezo nehézlégzés volt a definíció, majd az egyre pontosabb élettani ismeretek megszerzése után bronchiális simaizom görcs, nyálkahártya ödéma, megnö vekedett mennyiségu és fokozott viszkozitású nyákképzodés következményeiként jellemeztük a kórképet. A 90-es évektol, az asthma gyulladásos betegség jellegének felismerése után a meghatározás eosinophil desquamativ bronchitis.

7

A WHO 2002-es definiciója: „Az asthma a légutak krónikus gyulladásos megbetegedése; a folyamat létrehozásában számos sejt és sejtproduktum játszik szerepet. A krónikus gyulladás következménye a megnövekedett légúti érzékenység, amely ismétlodo nehézlégzéses epizódokat, légzési zavart, mellkasi szorító érzést és köhögést okoz különösen éjjel vagy kora reggel. Ezekhez a tünetekhez kapcsolódik a kiterjedt, de mértékében változó légáramlási zavar, pontosabban a légáramlás beszukülése, amely részben spontán, részben kezelés hatására szunik meg.”(1, 2) Valószínuleg ez sem az utolsó definíció.

2.1.1 Epidemiológia A gyermekkori asthma gyakorisága a nemzetközi irodalom adatai szerint valószínutlenül szélsoséges; 1,6- 36, 8%- ig terjed (kérdoíves felmérés). Magyarországi adatokról, amelyek bár kisebb szórást mutatnak, és nem fedik le az ország minden régióját, elmondható, hogy a gyermekkori asthma prevalenciája 2-5 % (orvosi vizsgálaton alapuló felmérés) (3,4).

2.1.2 Etiológia Az asthma bronchiale multifaktoriális kórkép, amelyben genetikai prediszpozíció és környezeti tényezok kölcsönhatásai manifesztálják a típusos tüneteket. Ma már több, mint 500 genetikai lókuszt hoztak összefüggésbe az asthmával és az allergiával (5,6) (1. táblázat). A környezeti tényezok között gyermekkorban kiemelt szerepe van az indoor és outdoor légúti, valamint a nutritív allergéneknek és a vírusinfekcióknak. A környezetszennyezés, dohányzás, aspirin szerepe a betegség ritkább kiváltó okai között szerepelnek ebben az életkorban. A gyermekkori asthma közel 80%-a allergiás típusú, vagyis az allergia in vivo vagy in vitro kimutatható. Körülbelül 20%-uk u.n. nem-allergiás asthma, amelyben allergia nem igazolható, gyakran fizikai terhelés vagy légúti infekció provokálja a tüneteket (7).

2.1.3 Patomechanizmus Az asthma patomechanizmusa rendkívül összetett, ezért csak vázlatszeruen foglalom össze. 2.1.3.1 hízósejt degranuláció A légúti kötoszövetben, a lamina propriában nagyszámú mastoycta található.

8

A hízósejtben levo preformált mediátorok (pl.hisztamin), proteázok, preformált citokinek, kiszabadulását számos inger idézheti elo. Ilyen az IgE-IgE bridging, amelyet antigén/allergén, autoantitest, is eloidézhet, amely típusos azonnali allergiás reakcióhoz vezet. Degranulációt okoz az antigén IgG-4-hez való kapcsolódása is a hízósejt 1. Táblázat Az allergiás/asthmás megbetegedésekkel kapcsoltságot mutató legfontosabb jelölt gének kromoszómalokalizációja és feltételezett funkciója (a teljesség igénye nélkül) Kromoszóma régió 2q

Jelölt gének

Feltételezet funkció

Fenotípus

IL-1 géncsalád

Gyulladásos válasz befolyásolása

IL-4, IL-13 GM -CSF

B sejtek átkapcsolása IgE termelésre Th2 válasz kiváltása

Asthma bronchiale (AB) Emelkedett IgE,

IL-5

Eosinophil sejtek felszabadítása a csontvelobol, eotaxin termelés fokozás

6p21.3

CD14 HLA -D

Bakteriális LPS-köto receptor Antigénbemutatás

7q31

TNF alfa CFTR

Gyulladásos válasz közvetítése Tüdoben transzmembrán kloridioncsatorna

Fc-epszilonRI-béta

Nagy affinitású IgE receptor basophil, dendritikus, és hízósejteken Légúti gyulladás szabályozása IL-4 gátlás IL-4 termelés Esszenciális citokinregulált transzkripciós faktor IL-4 és HLA -D gének transzkripcióját növeli NO vasodilatator és légúti gyulladási regulátor MHC-peptid-komplexekkel lép kölcsönhatásba IL-4 receptora Kemokin funkció (kemotaxis, aktiváció)

5q31-q33

11q13

12q14.3-q24.31

CC16 IFN-gamma SCF STAT6 NFY-béta NNOS

14q11.2-q13 16p21 17q11.2

20p13

T sejt receptor alfa és béta IL-4R RANTES, MCP-1, eotaxin ADAM33

Adhézió, jelátvitel, proteolízis

AB AB BHR Emelkedet IgE Specifikus IgE, IgG antitestek AB Allergiás bronchopulmo nális aspergillosis és cisztás fibrózis Atópia AB Anyai öröklés AB AB Atópia

össz-IgE AB Specifikus IgE antitestek Atópia, AB AB, AEDS

AB, „remodelling”

Lábjegyzet: AB: asthma bronchiale, BHR: bronchiális hyperreaktivitás, AEDS: atópiás, ekcéma betegség syndróma, LPS: lipopoliszacharid, RANTES: rergulated on activated normal T cell expressed and secreted, MCP-1: monocyte chemotactic protein-1

9

felszínén, valamint az anafilatoxinok (C3a, C5a), béta-adrenerg receptor hiány, vagy gátlás is. A kiszabaduló mediátorok hatására a tüdoben simaizom görcs, nyálkahártya ödéma jelentkezik, fokozott mennyiségu és tapadós váladék képzodik. A sejtmembránban újonnan szintetizálódó foszfolipid- arachidonsav kaszkád végtermékei - a prosztaglandinok és leukotriének - szintén ez elozo élettani folyamathoz vezetnek. 2.1.3.2 adrenerg út A béta 2 receptor ingerlése a cAMP fokozott termelodése révén a Ca pumpát aktiválja, ennek következtében az intracelluláris (IC) Ca++ csökken és bronchodilatatio jön létre. Ezért a béta 2 receptor blokkolása, hiánya bronchoconstrictiót vált ki. 2.1.3.3 cholinerg út A cholinerg/muscarin receptor ingerlése a cGMP aktivációja révén a Ca++ pumpafunkciót csökkenti következményes IC Ca++ felszaporodással, amely bronchoconstrictiót okoz. Az adrenerg és cholinerg rendszer egyensúlyi zavara is részt vesz az asthma kialakulásában. 2.1.3.4 non-adrenerg, non-cholinerg (NANC) út A NANC rendszer serkento és gátló hatásával fontos eleme a betegségnek. A serkento hatás az u.n. axon reflexnek tulajdonítható. Az axon reflex egy különleges idegroston valósul meg, amely egyszerre érzo afferens és efferens funkciójú. A myelin hüvely nélküli idegszál varicositásaiból kiszabaduló neuropeptidek lokális gyulladást okoznak. A desquamált bronchialis epithél esetén a szabaddá váló idegvégzodések könnyen ingerelhetoek, amelynek következménye a bronchus simaizom kontrakció, az ér permeabilitás fokozódás miatti helyi ödéma és a fokozott nyákszekréció. A NANC út gátló része a konstitutív nitrogén oxidáz által termelodo nitrogén monoxid (NO) révén vezet bronchodilatátióhoz. Ha a NO-t az indukálható nitrogén oxidáz révén szintetizálja a makrofág vagy az epithél sejt, akkor broncho constrictió jön létre. Ezért a NO patogenetikai hatása kétarcú. 2.1.3.5 T helper 1/T helper 2 ( Th1/Th2) egyensúly zavar A gyermekkori asthma nagy részében Th2 dominancia figyelheto meg. A Th2 típusú citokinek közül az interleukin-4 (IL-4) szerepe kiemelt a B sejtek IgE termelésre kifejtett hatása miatt.

Az IL-5 az eosinophil sejtek csontvelobol való kiáramlásában és

aktiválásában fontos tényezo. Granulumaikból kiszabaduló fehérjék toxikusak a környezo epithelsejtekre, azokat desquamálják. A szintén Th2 típusú IL-13-nak a nyákszekréció fokozásában van szerepe.

10

2.1.3.6 Az effektor immunsejtek toborzásában és aktiválásában számos u.n. kemokin molekula és receptoraik vesznek részt. Az allergiás mechanizmusban például az eotaxin, a regulated on activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) és a monocyte-chemotactic protein-1 (MCP-1) molekuláknak van kiemelt szerepe. Ezeknek a kemokineknek vagy receptorainak mutációi, polimorfizmusai hatással lehetnek az asthma fenotípusára. 2.1.3.7 A krónikus légúti gyulladás irreverzibilis struk turális és funkcionális károsodáshoz -„airways remodelling”- hez vezethet már gyermekkorban is. 2.1.3.8 Itt nem részletezett sokasága a citokineknek és növekedési faktoroknak modulálják az asthmában szereplo sejtes és humorális immunfolyamatokat.

2.1.4 Stádiumok A klinikai tünetek gyakorisága és a légzésfunkció értékek beszukülése valamint a reggeli, esti csúcsáramlás variabilitásának mértéke alapján 4 stádiumra, lépcsore osztjuk az asthmás betegeket, amely beosztás egyben a terápiás sémákat is meghatározza (1,2) (1.a ábra).

2.1.5 Differenciáldiagnosztika Az asthmához hasonló tüneteket több más kórkép is okozhat. Az idegentest, fejlodési rendellenességek, térszukíto folyamatok, infekciók, gastrooesophagealis reflux, ciliáris diszfunkció, cisztás fibrózis, immunhiány, alfa-1 antitripszin hiány, pszichés betegségek, stb. kizárása szakorvosi feladat.

2.1.6 Terápia A terápia elvei; a tartós tünetmentesség és az életminoség javításának elérése lehetoség szerint lokálisan alkalmazható készítményekkel, a stádiumnak megfelelo terápia alkalmazása. A rohamokat inhalatív rövid hatású béta 2 mimetikumokkal vagy anticholinerg szerekkel oldjuk. A gyulladást inhalatív corticosteroiddal kezeljük, amelyhez stádiumtól függoen adjuváns szereket is adhatunk (hosszú hatású béta 2 mimetikum, leukotrién antagonista, hosszú hatású theophyllin származékok). A 4. lépcsobe ritkán kerülo gyermekeknek per os steroidra is szükségük lehet (1.b ábra ).

11

1. A ábra

Súlyos perzisztáló

Intermittáló < 1-2 tünet/hét < 2 éj.tü /hó Rövid exacerbációk FEV1, PEF > 80% Variabilitás < 20%

Enyhe perzisztáló

Mérsékelt perzisztáló

> 2 tünet/hét > 2 éj.tü /hó

Napi tünetek 1-2 éj.tü / hét

Exacerbációk zavarják az aktivitást és az álmot FEV1, PEF: 80% Variabilitás: 20-30%

Napi rövid hatású béta 2 mimetikum igény FEV1, PEF: 60- 80% Variabilitás> 30%

Napi tünetek Gyakori éjszakai tünetek Gyakori exacerbációk Testi aktivitás beszukült FEV1, PEF < 60% Variabilitás > 30%

Az asthma bronchiale súlyossági lépcsoi

Lábjegyzet: éj. tü.: éjszakai tünetek FEV1: Forszírozott kilégzési volumen a kilégzés elso másodpercében (liter) PEF: Csúcsáramlás (liter/perc) Variabilitás: reggeli és esti FEV1 vagy PEF értékek ingadozása a reggeli értékek rovására (%)

Forrás: (1) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, NHLB/WHO. Workshop report: Global Initiative for Asthma. National Institute of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, Pub. No:95-3659, Bethesda, MD. 1995. (2) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, updated April, 2002. Scientific information and recommendation for asthma program. NIH Publication No. 023659

12

1. B ábra Az asthma bronchiale lépcsozetes terápiája

Súlyos perzisztáló Mérsékelt perzisztáló

Enyhe perzisztáló Intermittáló

TP: > 800 µg ICS

TP: 400-800 µg ICS

+ szükség szerint LABA/LTRA/ LATH

+ szükség szerint LABA/LTRA/ LATH

TP: 100-400 µg ICS + szükség szerint: LTRA/LATH esetleg: cromon RO: SABA

RO: SABA

RO: SABA

RO: SABA

Lábjegyzet: RO: rohamoldó, TP: tartós prevenció, ICS: inhalatív corticosteroid, SABA: rövid hatású béta 2 agonista, LABA: hosszú hatású béta 2 agonista, LTRA: leukotrién receptor antagonista, LATH: hosszú hatású theophyllin, PCS: per os corticosteroid

Forrás: (1) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, NHLB/WHO. Workshop report: Global Initiative for Asthma. National Institute of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, Pub. No:95-3659, Bethesda, MD. 1995. (2) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, updated April, 2002. Scientific information and recommendation for asthma program. NIH Publication No. 023659

13

2.2 KEMOKINEK AZ ALLERGIA ÉS ASTHMA PATOMECHANIZMUSÁBAN A szervezetünket különbözo gyulladást provokáló triggerek érik (infekció, trauma, tumor, allergén, autoantigén, stb). A károsodás leküzdésére hivatott effektor immunsejtek helyszínre áramlását adhéziós molekulák, kemotaktikus anyagok segítik. Kemotaktikus

hatásúak

az

IL-8,

PAF

(vérlemezke

aktiváló

faktor),

neutrofil

granulocytákból származó bizonyos peptidek, bakteriális termékek (formil- methioninleucin- fenilalanin),

bizonyos

enzimek

(makrofág

proteáz),

és

a

különleges

tulajdonságokkal is bíró kemokin család is. A kemokinek 8-10 kD súlyú, kb. 70-80 aminósavból álló heparinköto polipeptidek. A citokinekhez hasonlóan kis koncentrációban is „nagy hatás” elérésére képesek autokrin, parakrin módon. Rövid életidejuek, redundánsok és pleiotrópok. Nem csak kemotaxist indukálnak, hanem a fehérvérsejtek egy-egy alcsoportját specifikusan aktiválni is képesek. Szerkezetükre jellemzo, hogy a visszakunkorodó polipeptidláncon egymással szembe kerülo cisztein molekulák között diszulfidhidak stabilizálják a molekulát. Általában 2-2 cisztein között kialakult diszulfid híd jellemzi a kemokineket. Ezen érintett ciszteinek egymáshoz való távolsága alapján osztályozzák oket. A C-kemokin csak egy cisztein párt tartalmaz, a CC-kemokinekben egymás mellett vannak a hídképzo ciszteinek, a CXCkemokineknél egy, CX3C-nél 3 beékelodo aminósav választja el a közeli ciszteinhidakat. A humán kemokin csoportok között 20-50%-os homológia fedezheto fel. A csoportazonos kemokinek génjei egy kromoszómán fordulnak elo. Az allergiás folyamatokban elsosorban a 17-es kromoszómáról eredo CC-kemokinek vesznek részt. Monocyták, fibroblasztok, epithél sejtek, simaizomsejtek, endothél sejtek, glióma és melanóma sejtek termelik oket. Az eddig ismert kb. 40 kemokin közül legalább10 CC-kemokin, de a sor egyre bovül. 1. Monocyta chemotactic protein-1 (MCP-1) 2. MCP-2 3. MCP-3 4. MCP-4 5. Macrophag inflammatory protein -1 alfa (MIP-1alfa) 6. MIP-1béta 7. Regulated on activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) 8. Eotaxin-1 9. Eotaxin-2 10. I-309 14

A CC-kemokinek olyan sejtekre hatnak, amelyek CCR receptorral rendelkeznek és az allergiás mechanizmusban fontos szerepet töltenek be (2., 3 táblázat). Az endothél sejtek felszínén egyes glükóz-aminoglikánok (GAG), például az „ágas-bogas” szerkezetu hepránszulfát-proteoglikán expresszálódik, amelyek a heparin köto domménnel rendelkezo kemokineket megkötik és az állandó véráramlás ellenére egy koncentráció grádienst képesek eloidézni. A „heparánszulfát-bozótokban” felgyülemlett kemokinek a megfelelo kemokinreceptorral rendelkezo fehérvérsejt alcsoportokat magukhoz, illetve az endothélhez kötik, így az effektor immunsejtek transendotheliális migrációjának megindításában fontos szerepet töltenek be. A kemokinreceptorok 7 transzmemrán doménbol álló, úgynevezett szerpentinreceptor családba tartoznak. A receptor extracelluláris aminoterminális szakasza köti a kemokineket, míg azok másik karboxiterminális részén levo heparinköto domének tapadnak a GAG- hoz. A kemokinreceptorok jelátvitele jellemzoen G-proteinhez-kapcsolt folyamat. A jelátviteli mechanizmusban

itt

nem

részletezet

enzimatikus

kaszkád

végeredményeként

a

cytoskeleton átrendezodik, aktinja polimerizálódik és a kemotaxishoz szükséges elmozdulás létrejöhet (8). Egy kemokin receptoron többféle kemokin kötodhet és egy kemokin többfajta receptorhoz is mutat affinitást. (2-5 ábrák). Egyes vírusok, intracelluláris kórokozók a gazdasejtet teljesen új receptorok expressziójára késztetik, amelyek ismert kemokineket is képesek kötni. (Például a Cytomegalovírus egy US28 nevu receptort expresszáltat a ga zdasejttel, amely RANTES-t, MCP-1-t, MIP-1alfát jóval nagyobb affinitással köt, mint a nem fertozött sejten megjeleno klasszikus CCreceptor).

A

mikroorganizmusok

ilyen

rafinált

módon

is

bekapcsolódnak

az

immunfolyamatokba. A kemokinek fo funkciója az effektor sejtek transendotheliális migrációjának elokészítése és végrehajtása részben az adhéziós molekulák kapcsolódásának elosegítése, részben a kemotaxisra bírt molekulák aktiválása révén. Így részt vesznek a pathogének elleni küzdelemben, a leukocyták aktiválásában, immunsejtek érésében, Th1/Th2 egyensúly alakításában, a gyulladásos folyamatokban, sot az angiogenezisben, sebgyógyulásban, a haemopoezisben, a metasztázis képzésben is. A krónikus allergiás gyulladásban, az allergiás asthmában a peribronchiálisan felszaporodó eosinophil sejtekért is az eosinophilekre kemoattraktáns RANTES, eotaxin, MCP-3, stb.

15

2. táblázat A CC-kemokinek és célsejtjeik CC-kemokin MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCP-4 MIP-1 alfa MIP -1 béta RANTES Eotaxin-1 Eotaxin-2 I-309

Célsejt Mo, T, Ma, Ba, O Mo, T, Ma, Eo Mo, T, Ma, Eo, D Mo, T, Eo Mo, T, B, NK, Ma, Ba, D, O Mo, T, O Mo, T, NK, Eo, Ba, D Eo, Ba, Ma, Th2 Eo Mo

Mo: monocyta, Eo: eosinophil, Ba: basophil, T: T-sejt, Th2: T helper 2, B: B-sejt, D: dendritikus sejt, Ma: mastocyta (hízósejt), NK: NK-sejt, O: ossejt Forrás: (8) Kohidai László, Dérfalvi Beáta. Egy újonnan felfedezett molekulacsalád. A kemokinek. Lege Artis Medicinae 2000; 10 (9): 666-678

16

3. Táblázat A CC-kemokin receptorok (CCR) és ligandjaik és a receptort expreszáló sejtek CCR CCR1 CCR2 CCR3 CCR4 CCR5 CCR6 CCR7 CCR8

Ligand MIP-1alfa, MIP-1beta, RANTES, MCP-1, -2, -3 MCP-1, -2, -3, -4, -5 Eotaxin-1, -2, RANTES, MIP-1alfa,béta MCP-1, MIP -1alfa, RANTES MIP-1 alfa, -béta, RANTES MIP-3 béta MIP -3béta I-309

Sejt Monocyta (Mo), eosinophil (Eo) mo Eo, Mo Basophil (Ba) Mo Mo, T-sejt (T) Dendritikus sejt (D) Aktivált T Mo

Forrás: (8) Kohidai László, Dérfalvi Beáta. Egy újonnan felfedezett molekulacsalád. A kemokinek. Lege Artis Medicinae 2000; 10 (9): 666-678

17

2. Ábra A kemokinek több kemokin receptorra kapcsolódnak és egy kemokin receptor több kemokin megkötésére is képes

MIP 1 ?

MIP 5

HCC 2 MCP 2

1? MIP

MC P1

MIP 1 ?

CCR 1

5 CCR

MCP 3 XIN A T EO

RANTES

CCR 2

CCR 10

MCP 4 CCR 3

Eo, Ba, Th 2, Mast

Lábjegyzet: MIP: macrophag inflammatory protein RANTES: regulated on activated normal T cell expressed and secreted MCP: monocyte chemotactic protein CCR: CC-kemokin köto receptor

18

3. Ábra Az eosinophil sejten megjeleno kemokin receptorok és ligadjaik

RANTES MCP 3 MCP 4 EOTAXIN

MCP 1, 2, 3, 4

2

MIG

R CC

IP - 10

CX CR 3

CCR 3

Eo CC R

4

R1 CC

RANTES MIP 1 ? MIP 5

MDC

HCC 2 MCP 2, 3

Lábjegyzet: MIP: macrophag inflammatory protein RANTES: regulated on activated normal T cell expressed and secreted MCP: monocyte chemotactic protein CCR: CC-kemokin köto receptor MDC: Alveoláris makrofág eredetu kemokin

19

4. Ábra A CCR3 receptort expresszáló sejt típusától függ az eotaxin hatása

EOTAXIN CCR 3

• kemotaxis

Eo

• toxikus fehérjék degranulációja • respiratory burst beindítása

EOTAXIN CCR 3

• kemotaxis

Ba

• histamin release • LT képzés

EOTAXIN CCR 3 • hízósejt érés

Mast

• kemotaxis • histamin degranuláció

EOTAXIN CCR 3

• migráció

Th2

• Th2 típusú citokin termelés

Lábjegyzet: Mast: hízósejt Eo: eosinophil sejt Ba: basophil sejt Th2: T helper 2 lymphocyta 20

5. Ábra Az eotaxin és MDC direkt és indirekt hatása az eosinophil sejtre

EOTAXIN CC R3

R3 CC

R4 CC

CC R4

Eo

Th 2

MDC

IL5

Lábjegyzet: CCR3 és CCR4 receptort hordoz az eosinophil (eo) és a T helper 2 (Th2) sejt is. Az eotaxin és a makrofág eredetu kemokin (MDC) direkt aktiválja az eosinophil sejtet, míg ugyanezek a kemokinek a Th2 sejt aktivációja során keletkezo IL-5 citokin hatás miatt indirekt módon aktíválják az eosinophil sejtet

21

tehetoek felelossé. Allergén provokáció után allergiás rhinitisben és atópiás dermatitisben emelkedik az epitheliumban az eotaxin és MCP koncentráció (9). Szinte mindegyik szervrendszerünket érinto krónikus vagy autoimmun gyulladásos folyamatában részt vesznek kemokinek. A jövoben a kemokin-kemokinreceptor célpontú terápiára nagy várakozással tekintünk. Részletesebben az MCP-1 és az allergia, asthma kapcsolatát elemzem, tekintettel arra, hogy ennek a kemokinnek a polimorfizmusát és szérumszintjét vizsgáltam. Az MCP-1-et olyan sejtek termelik és MCP-1 receptort (CCR2)-t olyan sejtek expresszálnak, amelyek fontos részt vevoi az allergiás gyulladásnak. MCP-1-et szintetizál például a monocyta, eosinophil sejt, hízósejt, légúti simaizomsejt. CCR2 receptorral rendelkezik és így MCP-1 kötésre alkalmas az eosinophil sejt, légúti simaizomsejt, monocyta, T lymphocyta. Az MCP-1 asthmával való összefüggését több tanulmány is alátámasztotta. Hízósejt aktíváló és leukotrién C4 (LTC4) szintézist serkento hatása révén direkt bronchiális hyperreaktivitást (BHR) okoz. Svábbogárral érzékenyített egérben az MCP-1 bronchialis hyperreaktivitást okoz (10). Az MCP-1 neutralizációja viszont a T lymphocyták és eosinophil sejtek tüdobe való infiltrációját és a BHR-t csökkenti (11). Az asthmások bronchiális epithel sejtjeinek több, mint 50%-a MCP-1–et expresszál, szemben az egészségesek bronchalis epitheljeiben levo alig 8%-kal (12). Az MCP-1 nem csupán az asthma pathogenezisében fontos sejtek toborzásában és akiválásában vesz részt, hanem a Th0 sejtek érését, az allergiás gyulladásban kulcsfontosságú Th2 irányba billenti (13). Th2 sejtek által secretált IL-4 a B sejtek IgE expresszióját növeli, az IL-5 pedig az eosinophilek csontvelobol való fokozott kilépését, érését segíti (14,15,16). A MCP-1 asthmában való kiemelt szerepe miatt az „MCP-1 -2518A/G polimorfizmus és az asthma bronchiale összefüggése” és a „Szérum MCP-1 vizsgálat” címu fejezetekben részletesen foglalkozom a témával.

22

2.3 CHLAMYDIA PNEUMONIAE FERTOZÉS A Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) Gram negatív, obligát, intracelluláris patogén. Elemi test (EB) és retikuláris test (RB) formában él különleges életciklussal. Úgynevezett energia parazita. Négy fo sejtfelszíni fehérjéjébol kettot használ a megtámadott sejten való megtapadáshoz. Az extracelluláris túléléshez adaptálódott EB-k endocitózis útján jutnak sejtbe, ahol anyagcsere- folyamatokra és szaporodásra képes RB-ké válnak. A gazdasejt energiarendszerét használva, osztódásal szaporodnak, kitöltik a teljes citoplazmát, elpusztítva vele a sejtet. Ez a fejlodési ciklus 48-72 órát vesz igénybe. Kiszabadulva az elhalt sejtbol ismét EB-k formájában fertozik a szomszédos sejteket, vagy felszívódva a keringésbe jutnak és távoli helyeken fertoznek. 6. ábra 1985-ben fedezte fel Grayston és C. TWAR-nak nevezte el a két elso izolátum TW183 és AR29 törzsek betujelzéseinek összevonásával. Csak néhány évvel késobb derült ki, hogy Chlamydiáról va n szó (17). Jelenleg 4 Chlamydia speciest ismerünk. A C. pneumoniae-t, mely elsosorban humán légúti kórképeket okoz (otitis, pharyngitis, bronchitis, pneumonia, asthma bronchiale?), valamint összefügghet az arteriosclerosissal, carditissel, hasmenéssel, hepatitissel, Guillen-Barré syndroma encephalitissel, sarcoidosissal. A C. trachomatist, amelyrol a trachomát, újszülöttek zárványtestes conjunctivitisét, újszülöttkori pneumoniát, genitalis infekciókat, kismedencei gyulladást, habituális abortuszt, noi, férfi sterilitást, reaktív arthritist okozó hatást írtak le. A C. psittaci állatról emberre terjedo, széklettel aerogén úton fertozo, többnyire fogla lkozási, légúti betegséget okozó kórokozó. Bizonyos carditisek, nephritisek, thyreoiditis, erythema, tinnitus, sarcoidosis, anaemia, DIC, faciális paresis, meningitis, encephalitis, diarrhoea etiológiájaként is szerepelt már (18). A negyedik, a C. pecorum állatok között fertoz. A C. pneumoniae csak emberrol emberre, aerogén úton terjed. Az inkubációs ideje 7-23 nap. Két-három évente, kb. fél évig tartó kisebb járványok fordulnak elo elsosorban a közösségbe járó gyermekeknél, azok közül is inkább az általános iskolás korosztálynál. Csak minden 910. C. pneumoniae infekció (CPI)-ból lesz C. pneumonia okozta pneumonia. Az összes pneumoniák között 5-10%-ot foglalnak el a C. pneumonia okozta pneumoniák. A CPI prevalenciája a magyar gyermekpopulációban magas (19).

2.3.1 A C. pneumoniae fertozés klinikuma A betegség spektruma a tünetmentestol az életet veszélyeztetoig terjedhet, de a tünetmentes, vagy enyhe tüneteket okozó, többnyire fel nem ismert forma a leggyakoribb.

23

6. ábra A Chlamydiák különleges életciklusa

EB: elemi testek RB: retikuláris testek (Forrás: www. chlamydiae.com)

24

A fertozés tünetei lehetnek: köhögés, hoemelkedés, fáradékonyság, fejfájás, fénykerülés, izom-és izületi fájdalom, nehézlégzés, sípolás, megnyúlt kilégzés. Köpet, pleurális fájdalom nem jellemzo. Sajnos nincsen olyan tünetcsoport, amely a C. pneumoniae-ra patognomikus lenne. Leginkább a jó állapotú, hosszabb ideje légúti tüneteket mutató gyermekeknél kell gondolni rá. Különbözo etiológiájú, akut légúti betegségekben a kezdeti tünetektol az orvosi vizsgálatig eltelt ido a C. pneumoniae fertozés esetén a leghosszabb (20). A klinikai diagnózis felállítását nehe zíti a szegényes tüdo hallgatózási lelet is. Amennyiben bronchiális hyperreaktivitással társul, a megnyúlt kilégzés, csökkent PEF és FEV1 értékek mérése - az asthma bronchiale-ra való hasonlósága - megtévesztheti az orvost. A tünetek néhány héttol több hó napig is tarthatnak. Csak átmeneti védettség alakul ki a betegség kiállása után, így több reinfekció is elofordulhat egy egyén élete során. A lakosság átfertozodése tehát életkorral no. Szerencsére spontán gyógyulásra hajlamos, azonban a perzisztáló infekció évekig is elhúzódhat (21).

2.3.2 A C. pneumoniae fertozés laboratóriumi diagnosztikája: 2.3.2.1

A kórokozó direkt kimutatása immunfluoreszcens (IF) mikroszkóppal,

sejtkultúrán való tenyésztéssel és/vagy DNS-ének kimutatása polimeráz láncreakcióval (PCR) nem rutin eljárások és a légutakban – ahol tünetmentesen is elofordulhat a kórokozó önmagukban nem diagnosztikusak. 2.3.2.2 Szerológiai vizsgálatok A species specifikus (spec.) immunfluoreszcencia (IF), ELISA és a genus specifikus komplementkötési reakció a legismertebbek. Az akut infekció kritériuma Grayson szerint: IF esetén: a spec. IgM> 1:16 , spec. IgG (savópár) 4x-es titeremelkedés vagy spec. IgG >1:512 Régi infekció: spec. IgG > 1:256 ELISA- nál: Az egyes tesztek határérték kontrolljai (cut-off) szabják meg, hogy milyen értéktol tekintik pozitívnak az adott ellenanyag szintjét. Általános szabály: magas spec. IgM: friss infekcióra, tartósan pozitív spec. IgA: perzisztáló fertozésre, magas spec. IgG, negatív spec. IgM és spec. IgA mellett: régi, lezajlott fertozésre utal. Reinfectió esetén a spec. IgM megjelenése már nem jellemzo.

25

A szerológiai vizsgálatok (legelterjedtebb az ELISA) jelentik a fo diagnosztikus támpontot a gyakorlat számára. Lehetoség szerint savópárt vizsgáljunk. A konkrét ellenanyagszintek finom összehasonlítása helyett a változások dinamikáját figyeljük! Tudnunk kell azonban, hogy az ellenanyagok szintjének csökkenése lassan, hónapokig, akár évekig (IgG) is eltarthat. A korrekt diagnózis természetesen csak a klinikummal együtt állítható fel.

2.3.3 C. pneumoniae fertozés radiológiai diagnosztikája Jellegzetes radiológai eltérés nincsen. Általában finom foltos, intersticiális beszurodés, peribronchiális

rajzolatfokozódás

látható.

Az

eltérés

gyakran

enyhe

és

centrális

elhelyezkedésu, ami a hallgatózási lelet szegényességét magyarázza.

2.3.4 C. pneumoniae fertozés terápiája, gondozása Gyermekkorban makrolid antibiotikummal kezeljük. Amennyiben az infekció bronchiális hyperreaktivitással jár, vagy a betegnek asthmája is van és theophyllin készítményre is szorul, akkor olyan, a citokróm P450 enzim rendszerre nem ható, makrolid antibiotikumot válasszunk, amelyik nem emeli a szérum theophyllinszintet. Az atípusos pneumonián átesett betegeket ill. a perzisztáló fertozésben szenvedoket hosszan kell gondozni. Különös figyelmet érdemelnek a bronchialis hyperreaktivitás tünetét mutató betegek, mert náluk az asthma kialakulása rizikótényezo lehet. Rendszeres légzésfunkciós vizsgálat, szükség esetén, átmenetileg tartós prevenciós asthma kezelés (inhalatív corticosteroid) is indokolt lehet, amelyet gyermekpulmonológusok, allergológusok hivatottak beállítani. A háziorvos felelossége, hogy ezek a betegek szakorvosi gondozás alá kerüljenek. Az asthmásokal foglalkozó szakorvosok figyelmét pedig – a klinkailag és légzésfunkciós vizsgálattal igazolt bronchialis hyperreaktivitás esetén - az atípusos kórokozókra való szurés jelentoségére kell felhívni, lehetoleg még az asthma diagnózisának kimondása elott. A pozitív esetek gondozására akár egy-két évig is szükség lehet (22).

2.3.5 C. pneumoniae biológiája A kórokozó (EB) cseppfertozéssel jut a légutakba, ahol az alveoláris makrofágokba, dendritikus sejtekbe és epithél sejtekbe különbözo sejtfelszíni molekulák segítségével (hepránszulfát, mannóz receptor, CD14, vagy Fc mediált úton) endocitózissal jut be (7. ábra). A gazdasejt jelátviteli faktorait és bizonyos citokin expresszióját oly módon befolyásolja, hogy ezáltal a gazdasejt MHC-I és MHC-II expressziója csökken, gyengül a 26

7. ábra A Chlamydia pneumoniae elemi testek bejutási módjai a sejtbe

Heparánszulfát

Fc- mediált

Mannóz receptor

LPS receptor (CD14)

Gazdasejt

(Forrás: D. Rockey 2002. Antalya, X. Nemzetközi Chlamydia Kongresszusi eloadás)

27

kórokozó (ily módon is történo ) antigénprezentációja a gazdasejt felszínén. Így megszökve az eroteljes immunválasz elol, sokáig perzisztálhat rejtekhelyén, a sejtben (23,24,25). Kísérletekben bizonyították, hogy a C. pneumoniae-val fertozött humán köldökzsinór véna endothél sejtekben (HUVEC) olyan kemotaktikus anyagok: Interleukin-8 és monocyta chemotactic protein-1, (IL-8, MCP-1) expressziója fokozódik, amelyek a neutrofil és monocyta sejtek transendotheliális migrációjában, he lyi gyulladás kialakításában töltenek be fontos szerepet. Mindez nem volt igaz a Chlamydia trachomatis esetében (26,27). A fokozottan expresszált MCP-1 pont azokon a CCR2+ sejteken fejti ki hatását (kemotaxis és aktiválás), amely sejtek kulcsfontosságúak (monocyta, eosinophil, T sejtek, légúti simaizomsejt) az asthma patogenezisében. Sousa ki is mutatta, hogy az asthmás betegek bronchialis epithél sejtjeinek 50%-a MCP-1-et expresszál az egészségesek bronchialis epithél sejtjeinek 8%-os MCP-1 expressziójával szemben (12). A logikusan felmerülo hipotézis, miszerint a Chlamydia pneumoniae fertozés az MCP-1 expresszió fokozásán keresztül asthmát okoz, még bizonyítást igényel. A kardiovaszkuláris tudományos kísérletek sok elgondolkodtató eredményt hoztak az asthmával foglalkozók számára is. Például a HUVEC C. pneumoniae fertozése egy olyan solubilis faktor expresszióját is fokozza, amely a közeli simaizomsejtek számát és méretét növeli (28). Ugyanez a fertozés adheziós molekulák expresszióját is növeli HUVEC-en. A vascularis sejt adhéziós molekula (VCAM-1), intracelluláris adhéziós molekula (ICAM-1), E –selectin, és endothel- leukocyta adhéziós molekula (ELAM-1) expressziója no (29). Mindkét munkacsoport az eredményeit az atherosclerosis patogenezisére vonatkoztatta. Azonban feltételezhetjük, hogy ilyen, vagy nagyon hasonló folyamatok játszódhatnak le az asthma során is. Ugyanezeket a vizsgálatokat bronchialis epithel sejteken is érdemes lenne reprodukálni. További asszociációra késztet az a megfigyelés, ho gy a humán atherómában kimutatott 60 kilodalton súlyú, Chlamydia eredetu hosokkfehérje (cHSP 60) a proinflammatórikus tumor necrosis factor-alfa (TNF-alfa) termelést fokozza (30). Ugyanez a TNF-alfa a hörgokben bronchialis hyperreaktivitást okoz (31). Ezek az irodalmi adatok is megerosítettek abban, hogy a C. pneumoniae és az asthma kapcsolatát vizsgáljam.

28

2.4 MANNÓZKÖTO LEKTIN (MBL) A kórokozó szervezetbe jutásakor a természetes, nem fajlagos immunválasz azonnal muködésbe

lép.

A

mikroorganizmusok

felszínén

levo

jellegzetes

–többnyire

szénhidrátokból vagy lipidekbol álló - molekulamintázatot, az u.n. Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP) –t a természetes immunrendszer bizonyos sejtfelszíni receptorai az u.n. Pathogen Recognition Receptors (PRR) valamint szolubilis mintázat azonosító fehérjék; Pathogen Recognition Molekules (PRM) ismerik fel. Az elsosorban makrofágokon, dendritikus sejteken megjeleno PRR: a mannóz receptor, scavenger receptor, lipopoliszacharid (LPS) receptor (CD14) és a komplement rendszer néhány receptora; CR1, CR2, CR3. A solubilis PRM–k

közé

tartozik

a

C-reaktív

protein

(CRP),

az

MBL,

a

lipopoliszacharidköto fehérje (LBP) és az amiloid protein (32). Az MBL is egy mannóz felismero solubilis fehérje, amely a kollektinek csoportjába tartozik a lung surfactant protein A, D (L-SP-A, L-SP-D)-vel és a konglutininnal együtt. Közös jellemzojük,

hogy

kollagén

és

lektin

részeket

tartalmaznak.

Lektin

részükkel

mikroorganizmusok felszínén levo szénhidrátokhoz, kollagén részükkel –a C1q-hoz való szerkezeti hasonlóságuk alapján - a C1qR-hoz tudnak kötodni. A C1q-nak nincs szénhidrátköto domenje. Az MBL a májban termelodo, szérum akut fázis fehérje. A természetes immunvédekezés szolubilis eleme. Dimer, trimer, tetramer, pentamer és hexamer szerkezetben fordul elo. A szénhidrátköto domenjeivel a mikroorganizmusok mannózban gazdag felszínéhez kötodik, így opszonizálja azokat, elosegítve, hogy a fagocitózis áldozataivá váljanak. A kollagén részével a C1qR-hoz kötodik és ezen az u.n. lektin úton keresztül aktiválja a komplement rendszert, amely végül a membran attack complex (MAC) kialakulásának eloidézésével a kórokozó líziséhez vezet. Az MBL az MBL-associated protease (MASP)-1 és MASP-2 révén a C2-t és C4-et is tudja aktiválni. A MASP-1 képes direkt hasítani a C3-t és ezáltal indukálni a MAC kialakulását (33) (8. ábra). A PRR-PAMP receptor ligand kapcsolat olyan citokinek termelodését válthatja ki (IL-1, IL-6, tumor necrosis alfa (TNF-alfa)), amelyek az akut fázis fehérjék szintézisét indukálják, köztük a CRP és MBL képzést. Az MBL és ligandjának kapcsolódását sziálsav jelenléte gátolja, amelyet bizonyos kórokozók pl. Neisseria meningitidis termelni képesek (33) (9. ábra ).

29

8. ábra Az MBL komplement aktivációja Lábjegyzet: A: Az MBL-MASP-2 komplex mikróba felszíni megtapadása a MASP-2 konformáció változását idézi elo, amely képessé teszi a C4 hasítására B:C4b kötodése C: C2 aktivációja során képzodött C2b kapcsolódik a C4b-hez, amely maga C3 konvertáz D: C3b opzonizáló Az ábra átvett illusztráció: (33) Jack DL, Klein NJ, Turner MW. Mannose-binding lectin: targeting the microbal world for complement attack and opsonophagocytosis. Immunological Reviews 2001; 108: 86-99

30

9. ábra Az MBL kötodését a sziálsav jelenléte befolyásolja Lábjegyzet: Az ábra átvett illusztráció (33) Jack DL, Klein NJ, Turner MW. Mannose-binding lectin: targeting the microbal world for complement attack and opsonophagocytosis. Immunological Reviews 2001; 108: 86-99

31

Az infekciók leküzdéséhez megfelelo koncentrációjú szérum MBL szintre van szükség, amelyért genetikai szinten elsosorban az MBL génnek az intakt 1. exonja és intakt promoter régiója felelos (34) (10. ábra). A 10. kromoszóma hosszú karján (10q 21-24) található MBL gén ( mbl2) 1. exonjában eloforduló, eddig ismert 3 féle pontmutáció; az 52-es kodonban (CGT - TGT csere miatt: arginin cystein csere), az 54-es kodonban (GGC - GAC csere miatt: glicin asparaginsav csere), vagy az 57-es kodonban (GGA - GAA csere miatt: glicin és glutaminsav csere) bármelyike MBL deficienciához vezet (35,36,37,38). (A mutáció kimutatása részletesen „A mannózköto lektin polimorfizmus és a Chlamydia pneumoniae együttes hatása az asthmára” fejezetben: 3.5.2.2 alatt található.) A mutáció következtében 5-10x kisebb koncentrációban termelodik az MBL (39). Az mbl2 gén promóter régiójában, a -221-es pozicióban eloforduló polimorfizmusnak is szignifikáns hatása van az MBL expresszióra. Míg a normál X genotípus kello mennyiségu MBL expresszióhoz vezet, addig az Y genotípus downregulál, szignifikánsan kevesebb mennyiségu MBL expressziót eredményez. Ugyanezen gén promóter régiójának -550-es poziciójában H/L variációk is magas vagy alacsony szintu MBL expresszióhoz vezetnek. A kompaund heterozigóták további variációit és lehetoségét adják az alacsony, közepes, vagy magas koncentrációjú MBL megjelenésének (40). Ugyanezen a kromoszómán az mbl1 pszeudogén (41). A csökkent MBL szintet számtalan betegséggel hozták már összefüggésbe. Az MBL deficiencia foleg fiatal gyermekkorban növeli az infekciók elofordulását (42). Az MBL deficienciát okozó mutáció szignifikánsan összefügg a cystás fibrózisban szenvedo betegek csökkent tüdofunkciójával és krónikus Pseudomonas aeruginosa fertozésükkel (39). Bizonyos autoimmun betegségek súlyossága és azok infekciókkal való szövodése is összefüggést mutat az MBL csökkent szintjével (43,44). A homoszexuálisok között az MBL gén mutációt homozigóta formában hordozóknak szignifikánsan nagyobb esélyük van a HIV fertozésre. Ez a genotípus szignifikánsan összefügg a rövidebb túlélési idovel is (45). A gyermekkori acut lymphoblastos leukémia is gyakoribb a csökkent MBL szinttel élo kisgyermekek között. Ezt a fiatal gyermekkor azon vulne rábilis idoszakában figyelték meg, amikor a specifikus immunvédelem még nem teljesen érett (46). 32

10. ábra Az MBL gén exonjai az MBL különbözo alegységeinek szintéziséért felelosek Lábjegyzet: CRD: szénhidrát felismero domen MBL: mannózköto lektin MASP: MBL-associated serine protease: manózköto lektinhez kapcsolódó szerin proteáz Az ábra átvett illusztáció (34) Turner MW. Mannose-binding lectin: the pluripotent molecule of the innate immune system. Imm Today 1996; 17: 532-540

33

Érdekes, hogy még a koronária betegség kialakulásában és progressziójában is szerepe van az MBL mutációnak. A C. pneumoniae felszínén a major outer membrane protein (MOMP) részeként mannóz molekulák találhatók, amelyek az MBL ligandjai. A C. pneumoniae azokban a felnott betegekben növeli a koronária betegség kialakulásának esélyét, illetve ront annak prognózisán, akik csökkent MBL szintet okozó MBL mutációt hordoznak (47). Az MBL a természetes immunvédekezés szolubilis eleme, amely nem egyedüli, de fontos része a kórokozók elleni védekezésnek. Genetikai tényezokön alapuló alacsony szintje a C.

pneumoniae

fertozés

krónikussá

válásának

és

következményes

betegségek

kialakulásának rizikó tényezoje. Az errol szóló fejezetben (3.5) az MBL-nek a gyermekkori asthma bronchiale kialakulásában játszott kofaktor szerepét vizsgálom.

34

3. VIZSGÁLATOK 3.1

CCR5? 32

MUTÁCIÓ

VIZSGÁLATA

ALLERGIÁS

ÉS

ASTHMÁS

GYERMEKEKBEN

3.1.1 Bevezetés, célkituzés

CCR5 kemokin receptor génjének 32 bázispárral rövidíto deléciós mutációja – CCR5?32 a CCR5 receptor elégtelen muködését, sot annak hiányát is okozhatja. Ez a receptor koreceptora a HIV-1 (human immundeficiencia vírus 1)- nek. E mutáció okozta receptor funkciókiesés összefügg a HIV elleni részleges védettséggel (48). A CCR5 a RANTES kemokinnak is egyik fontos receptora. A RANTES pedig az allergia és asthma patomechanizmusában, az effektor immunsejtek toborzásában játszik szerepet. Logikus feltételezés volt, hogy a RANTES receptorának elégtelensége esetleg véd az asthma kialakulásától. Két egymással teljesen ellentmondó közlemény jelent meg a Lancetben e mutáció és az asthma elleni védettség kapcsolatáról 1999-ben és 2000-ben. Hall és munkatársai a CCR5? 32 mutációt szignifikánsan ritkábban tudták kimutatni skót gyermek asthmásokban, mint kontrollokban, tehát véleményük szerint ez az allélvariáció véd az asthmától (49). Ezzel szemben Mitchell és munkatársai nem találtak szignifikáns összefüggést ezen mutáció és az asthma, atópia között dél-angliai, és kelet-ausztrál populációt vizsgálva (50). Kísérletünk célja az volt, hogy magyar gyermekeknél és a fentieknél nagyobb esetszámmal vizsgáljuk a CCR5?32 mutáció esetleges összefüggését az asthma bronchiale fenotípusával.

3.1.2 Betegek és módszerek

3.1.2.1 Beteganyag A vizsgálatba 566 magyar gyermek került, 118 asthmás (3-18év, átlag: 10,1 év (SD 3,5) ), 145 nem-asthmás, de allergiás (1-18 év, átlag: 5,4 év (SD 3,8)), és 303 illesztett korú allergia és atópia mentes kontroll. Az asthmás gyermekek a Budai Gyermekkórház és Rendelointézet Allergológiai szakrendelésének gondozottjai. Diagnózisukat allergológus állította fel az alábbi 35

kritériumok

szerint:

1)

kezelésre

szoruló,

visszatéro

nehézlégzés,

exspiratórikus

nehezítettséggel, 2) kislégúti obstructio kimutatása légzésfunkciós vizsgálattal, 3) kislégúti obstructio reverzibilitása bronchodilatatio hatására a FEV1> 15 %, és a PEF> 15%-os javulásával. Az asthma stádiumait a Global Initiative for asthma (GINA) eloírásai szerint határoztuk meg (1,2). Gondozottjaink között azonban nagy számban voltak szezonális asthma bronchiale-ben szenvedok, emiatt az elso és második lépcso közé egy „másfeledik” lépcsot is iktattunk, hiszen ezek a betegek az év egyik felében az elso, másik felében a második lépcsobe tartoztak. (4. Táblázat). A nem-asthmás, de allergiás gyermekek a Heim Pál Gyermekkórház Allergológiai szakrendelésének szénanáthás, táplálék allergiás, urticariás, AEDS-s (atópia, ekcéma dermatitis syndrómás) gondozottjai. Diagnózisukat allergológus szakorvos állította fel az alábbi kritériumok szerint: 1) allergia klinikai tünetei, 2) atópia jelenléte (magas IgE és/vagy pozitív borpróba). A kontroll gyermekeket a Heim Pál Gyermekkórházban megforduló gyermekekbol random választottuk, akiknek 1) nem volt sem aktuálisan, sem az ana mnézisükben allergiás tünetük, 2) össz IgE szintjük, az életkori átlagot figyelembe véve, normál tartományban volt.

3.1.2.2 Laboratóriumi vizsgálatok A fehérvérsejt szám és eosinophil sejtszám meghatározás a Coulter MAXM Analizátorral történt. Az IgE vizsgálatok Pharmacia CAP System- mel és a Budai Gyermekkórházban ELISA Syrings Diagnostic kittel, az össz IgE EIAgen Total IgE BIOCHEM IMUNOSYSTEMS kittel történtek. A Prick borpróbákat Soluprick teszttel végeztük. Pozitívnak a 3mm, vagy annál nagyobb urtica- göbcsét minosítettük, amelynek hasonlónak, vagy nagyobbnak kellett lennie, mint a pozitív kontrollnak, reakciómentes negatív kontroll mellett.

3.1.2.3 Genotipizálás A CCR5? 32 mutációját PCR-rel határoztuk meg. A fehérvérsejtekbol történt teljes DNS izoláláshoz Miller módszerét használtuk (51). A CCR5 PCR-hez használt primer pár: F: 5’ – CTT CAT TAC ACC TGC AGC TCT CA3’; R: 5’ – CAC AGC CCT GTG CCT CTT CTT CTC – 3’, amelyek a 32 bp deléció két oldalán helyezkedtek el. A vérminták nagy részét Guthrie- féle szuropapírra szárított vérbol nyertük, amelybol

36

4. Táblázat Asthmás betegek súlyossági lépcsok szerint Asthma súlyossági lépcsok

Esetszám n: 118 (100%)

Tünetek

Éjszakai tünetek

Enyhe intermittáló Szezonális enyhe perzisztáló Enyhe perzisztáló

24 (20,3) 16 (13,6) 55 (46,6)

<1-2/hét

<1-2/hó

#

#

1-2/hét, de <1/nap

1-2/hó

Mérsékelt perzisztáló Súlyos perzisztáló

23 (19,5) 0

>1-2/hét

1-2/hó

folyamatos

gyakori

Lábjegyzet: # : szezon alatt enyhe perzisztáló, szezonon kívül enyhe intermittáló FEV1: forszírozott kilégzési térfogat a kilégzés elso másodpercében (liter) PEF: Eroltetett kilégzésnél mért csúcsáramlás (liter/perc)

37

FEV1 és PEF a kívánt érték %-ában, és a reggeli esti variabilitás % >80% variabilitás< 20% # 60-80% variabilitás: 2030% 60-80% variabilitás> 30% <60% variabilitás> 30%

1,5- 2 mm-es mintát vágtunk le, ezeket a PCR- reakciós keverékbe helyeztük, amely a fenti primereken kívül négyféle dNTP (dezoxi- nukleotid-trifoszfát) keverékét, Promega puffer A-t és magnesium chloridot tartalmazott 45 µl összmennyiségben. Három ciklust Taq polimeráz nélkül végeztünk: 99,9 Celsius fokon 2 percig, 55 Celsius fokon 2 percig. Centrifugálás után 1,5 Unit keverék Promega Taq polimeraz 5 µl elegyben került minden egyes reakcióba. Egy perces , 95 Celsius fokon történt denaturálást követoen 35 cikluson át végeztük a PCR-t. (95 Celsius fokon 30 másodperc; 65 Celsius fokon 1 perc; 72 Celsius fokon 30 másodperc). A terméket 4%-os agarose gélen szeparáltuk, ethidium bromiddal festettük. Vad típus esetén 182 bázispár (bp) hosszú, mutáns allél esetén 32 bp-vel rövidebb, 150 bp hosszúságú szakasz futott tovább a gélben (11. ábra). Néhány random esetben direkt szekvenálással erosítettük meg a kapott genotípus eredményeinket.

3.1.2.4 Statisztikai módszerek CCR5? 32 allélfrekvenciát allélfrekvencia alábbi számolási képletével határoztuk meg:

heterozigóták száma + 2x homozigóták száma 2x a betegek száma

Hardy-Weinberg equilibriumot Chi- négyzet goodness-of- fit teszttel vizsgáltuk. CCR5? 32 mutáció különbözo fenotípusokban való eloszlását chi négyzet próbával vizsgáltuk. ANOVA variancia analizist alkalmaztunk a polimorfizmus hatásának becslésére. Bonferroni féle többszörös összehasonlítással határoztuk meg a CCR5 ? 32 mutáció és az asthma súlyossági fokai közötti szignifikanciát. (Ezek értékelhetosége az alcsoportok tagjainak kis létszáma miatt kérdéses.) A „power calculation” StatMate software-rel készült (GraphPad Software Inc., San Diego, California).

3.1.3 Eredmények

1. Nem találtunk szignifikáns különbséget a vizsgált genotípus allélfrekvenciáiban a 3 csoport között. Hall és munkatársainak eredményeivel ellentétben még néhány homozigótát is találtunk az asthmások között (5. Táblázat). A CCR5? 32 mutáció asthmára kifejtett hatását több szempontból is vizsgáltuk.

38

11. ábra CCR5 delta 32 mutáció vizsgálata PCR-rel. Vad típus esetén 182 bp hosszúságú DNS, míg CCR5 delta 32 mutáció esetén 32 bázispárral rövidebb, 150 bp hosszúságú DNS szakasz fut a gélben tovább. 1, 4, 7, 8-as csík: vad/vad homozigóta, 3, 5, 6-os csík: vad/ delta 32 heterozigóta, a 2-es csík: homzigóta mutáns delta 32/ delta 32.

182 150

1 2

3

4

5

6

7

8

39

5. Táblázat A CCR5 delta 32 mutáció genotípusai és allélfrekvenciái a gyermekek 3 csoportjában Csoportok Asthmások Allergiások, de nem asthmások Kontrollok: nem allergiások, nem asthmások

vad/vad n (%) 95 (80,5)

vad/delta 32 n (%) 19 (16,1)

delta32/delta32 n (%) 4 (3,4)

116 (80,0) 240 (79,2)

26 (17,9)

3 (2,1)

58 (19,1)

2 (1,7)

40

Összes n (%) 118 (100) 145 (100) 303 (100)

Allélfrekvencia % 11,4 11,0 11,2

A 118 asthmásból 87 (73,7%) volt allergiás, 31 (26,3%) nem-allergiás, mely arány a nemzetközi megoszláshoz hasonlónak mutatkozott (7).

2. Nem találtunk szignifikáns különbséget a CCR5 ? 32 mutáció elofordulásában e két (atópiás és nem-atópiás) alcsoport között. Allélfrekvencia 10,3% és 14,5% volt.

3. A fehérvérsejtszám, az abszolút eosinophil sejtszám, az össz IgE szint sem mutatott összefüggést ezzel a mutációval.

4. A relatív eosinophil sejtszám szignifikánsan alacsonyabb volt a heterozigótákban, mint a vad allélokat hordozókban (3,9% (SD:1,6) vs 5% (SD:1,9), p:0,02). Bár a relatív eosinophil sejtszám a homozigótákban volt a legmagasabb (6% (SD: 2,8)), azonban valószínuleg azok kis esetszáma miatt a különbség nem bizonyult szignifikánsnak.

5. Az IgE érték is kissé, de nem szignifikánsan magasabb volt a homozigótákban, mint a heterozigótákban ill. a vad allélokat hordozókban. Az értékelhetoséget itt is a kis homozigóta szám (4 db) korlátozta (6. Táblázat).

6. Nem találtunk szignifikáns különbséget az asthma stádiumok és a vizsgált allélfrekvenciák között, tehát ez a mutáció nem befolyásolta az asthma súlyosságát sem (7. Táblázat).

3.1.4 Megbeszélés

Az asthma bronchiale, mint eosinophil desquamatív bronchitis patomechanizmusában kiemelt szerepe van az eosinophil sejteknek. Az allergiás asthmában a Th2 citokin mintázat korrelál az eosinophil infiltrációval és a betegség súlyosságával (52,15). Az utóbbi években derült fény olyan kemokin hatásokra (a gyulladás helyszínére irányuló szelektív sejt kemoattraktáns hatás, IgE regulációban való részvétel, Th2 típusú citokin válasz, fehérvérsejtek gyulladásos mediátorok termelésére való aktiválása), amelyek beindíthatják vagy perpétuálhatják az asthmát (14). 41

6.Táblázat Az asthmás betegek fehérvérsejt számai, abszolút és relatív eosinofil sejt számai és össz IgE szintjei a CCR5 genotípus szerint csoportosítva Klinikai és biológiai jellemzok Genotípus Szám n (%) Életkor (3-18 év) (SD) Fiú/lány Allergia (összes asthmás %-ában) IgE (kU/l) (9-1001 kU/l)) (SD) Fehérvérsejt szám (106 /ml) (SD) Eosinophil (%) (SD) Eosinophil sejtszám (106 /ml) (SD) *

Összes asthmás beteg

CCR5 genotípus

vad/vad

vad/? 32

? 32/? 32

118 (100) 10,1 (3,5 )

95 (80,5) 9,8 (3,1)

19 (16,1) 8,7 (4,5)

4 (3,4) 13,3 (1,8)

68/50 87 (73,7)

53/38 71 (81,6)

11/12 14 (16,1)

4/0 2 (2,3)

271

276

243

285

(246) 6,96

(257) 6,87

(186) 7,1

(249) 7,1

(1,9) 4,9 (2,0) 0,338

(1.38) 5* (1,9) 0,350

(2,6) 3,9* (1,6) 0,280

(0,6) 6 (2,8) 0,430

(0,27)

(0,32)

(0,25)

(0,22)

p: 0,02 vad/vad vs. vad/? 32

42

7. Táblázat CCR5 genotípusok az asthma bronchiale stádiumai szerint Asthma bronchiale stádiumai

Genotípus Szám n (%) 1. lépcso Enyhe intermittáló 1,5. lépcso Szezonális enyhe perzisztáló 2. lépcso Enyhe perzisztáló 3. lépcso Mérsékelt perzisztáló

Összes asthmás beteg n (%)

CCR5 genotípus

vad/vad

vad/? 32

? 32/? 32

118 (100)

95 (80,5)

19 (16,1)

4 (3,4)

24 (20,3)

21 (17,8)

3 (2,5)

0

16 (13,6)

13 (11,0)

3 (2,5)

0

55 (46,6)

41 (34,7)

10 (8,5)

4 (3,4)

23 (19,5)

20 (16,9)

3 (2,5)

0

43

Az eosinophileknek a tüdobe való toborzásában különbözo kemokinek (eotaxin, RANTES, stb.) vesznek részt. Az eosinophil sejtszám szignifikáns csökkenése a vizsgált heterozigótákban (vad/? 32) a homozigóta vad típúsúakhoz (vad/vad) képest, jelezheti, hogy a RANTES a funkcióját a CCR5 mutáció következtében elégtelenné vált CCR5 receptoron nem tudja kifejteni. Így az ismert – a RANTES által is generált - eosinophil sejtek toborzása is gyengébb. A kis homozigóta szám (4db) korlátozta az IgE értékek genotípus szerinti összehasonlításának értékelését. A CCR5 nem kizárólagos receptora a RANTES- nek, a RANTES a CCR1-en és CCR3-on is tud kötodni. A RANTES ugyan részt vesz az eosinophil sejtek kemotaxisában, mégis az eosinophil sejtek toborzását elsosorban a CCR3 receptor közvetíti, amelyen nem csak RANTES, hanem például az eotaxin is kötodik (53). Az egyes sejtek aktiváltságától is függ, hogy milyen kemokin receptorokat expresszálnak. Az aktivált macrophag CCR1-t és CCR3-t expresszál, az aktivált T sejt csak CCR5-öt (54). A kemokinek és kemokin receptorok közötti affinitás különbség ellenére, a nagy kemokin redundancia és pleiotrópia miatt valószínuleg egy-egy receptor sérülés (pl. CCR5) esetén, vagy helyi kemokin koncentráció változás hatására a nagy szerkezeti homológiával bíró kemokinek egymás helyettesítésére is képesek. Ezt alá is támasztják megfigyelések; CCR5 -/- egerek is jól fejlodnek. Jelenleg nem ismert egyetlen humán betegség sem, amelyet összefüggésbe hoztak CCR5 hiánnyal (55). A CCR5? 32 allél az afrikai és ázsiai populációval ellentétben a kaukázusi népességben viszonylag gyakran megtalálható (56,57). A receptorok és ligandjain bekövetkezo finom eltérések a harmonikus egyensúlyt kibillenthetik, amely még egy bizonyos határig önkorrekcióra képes. Ennek a határnak a megkeresése, amelyen túl már betegség manifesztálódhat, jelent általában kihívást a kutatóknak.

Az általunk vizsgált 566 gyermek eredményei szerint nincs szignifikáns különbség a CCR5? 32 mutáció elofordulásában az asthmás, az allergiás és a kontroll gyermekek között. Tehát a magyar gyermekek e populáció ját tekintve a CCR5?32 mutáció nem véd az asthma kialakulásától. Eredményeink nem a Hall és munkatársai, hanem Mitchell és munkacsoportja által talált eredményeket erosítik meg. A különbözo országok eltéro adatai a környezeti tényezok befolyását is valószínusítik (58).

44

A RANTES-CCR5-eosinofil tengely fontos, de nem kizárólagos az asthma illetve allergia patomechanizmusában. A CCR5? 32 mutáció tekintetében az asthmás, az allergiás és kontroll csoportok között vizsgált szignifikáns különbség hiánya a RANTES és receptorának jelentoségét ugyan nem csökkenti, de az asthma, és az allergia patomechanizmusában csak adjuváns funkcióját mutatja.

Megjegyzés: Az asthma 4 lépcsos stádium beosztását itt a szezonális asthma fogalmával 5 lépcsosre bovítettük. A szezonális asthma bronchiale új lépcsojének beiktatását a saját betegeim között már régóta így használom és más asthmásokat gondozók számára is hasznosnak tartom. Hiszen míg súlyos asthma bronchialés beteg e felmérésben egy sem akadt, addig ebben a „másfeledik” lépcsoben volt az asthmások 13,6%-a. Bár az asthmások ilyen csoportosítása miatt az egyes lépcsok statisztikai értékelhetosége csökken, mégis a klinikum számára van létjogosultsága egy olyan csoport létrehozásának, melyben a betegek az év egyik felében enyhe intermittáló, az év másik felében enyhe perzisztáló, következésképpen más terápiát igénylo stádiumban vannak.

45

3.2 MCP-1 -2518A/G POLIMORFIZMUS ÉS AZ ASTHMA BRONCHIALE ÖSSZEFÜGGÉSE

3.2.1 Bevezetés, célkituzés

A CC-kemokinek családjába tartozó Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), új nomenklatúta szerint a CCL2, egy olyan kemokin, amelyet igen különbözo típusú sejtek képesek termelni (monocyta, eosinophil, mastocyta, endothel, mesothel, fibroblast, légúti és vaszkuláris simaizomsejt). Receptora, a CCR2 érdekes módon, pontosan azoknak a sejteknek a felszínén expresszálódik, amelyek fontos szerepet töltenek be az asthma pathogenezisében (eosinophil, monocyta, T lymphocyta és légúti simaizom sejt). Az MCP-1 a CCR2-t expresszáló sejtekre kemotaktikus és aktiváló hatású. Az asthma és az MCP-1 összefüggését több irodalmi adat is alátámasztja. Hízósejt aktiváló és leukotrién C4 (LTC4) szintézist serkento hatása révén direkt bronchiális hyperreaktivitást (BHR) okoz (10). Az MCP-1 neutralizációja viszont a T lymphocyták és eosinophil sejtek tüdobe való infiltrációját és a BHR-t csökkenti (11). A többi CC- kemokinhez hasonlóan az MCP-1 génje is a 17-es kromoszómán található. Az MCP-1 gén disztális regulációs régiójában a -2518 pozícióban normál esetben adenin (A) található (a szám a nukleotid pozíciónak a fo transzkripciós start ponttól való relatív távolságát jelzi). Az adenin (A) bázisnak guaninra (G) való cseréje hatással van az MCP-1 expressziójára. A A/G heterozigóta forma esetén több MCP-1 szintetizálódik, G/G homozigóta forma esetén még több (59). Az MCP-1 allergiás gyulladásban játszott szerepe és az MCP-1-2518A/G polimorfizmus MCP-1 expressziójára gyakorolt hatása alapján vizsgálni kívántuk asthmás és allergiás betegek genotípusát erre az egy nukleotidot érinto polimorfizmusra (single nucleotid polimorphism (SNP)). Két kérdésre kerestünk választ: 1. Összefügg-e ez a polimorfizmus az asthmával vagy az allergiával? 2. Van-e befolyása ennek az allélnak az asthma súlyosságára?

3.2.2 Betegek és módszerek

3.2.2.1 Beteganyag

46

A vizsgálatban 511 gyermek vett részt; 3-18 éves korú 160 asthmás, átlagéletkora (á:) 10,1 év (SD:3,5), 151 allergiás, de nem asthmás 1-18 évesek, á: 5,6 év (SD:3,8), és 303 illesztett korú kontroll. A betegek kiválasztási elvei és a diagnózisuk felállításához használt módszerek megegyeznek a CCR5 fejezetben (3.1.2.1) leírtakkal.

3.2.2.2 Genotipizálás PCR-RFLP módszerrel genotipizáltunk. A DNS extrakció Miller- féle kisózással történt fehérvérsejtbol (51). Az amplifikáláshoz használt primerek: MCP417S: 5’-TCT CTC ACG CCA GC ACT GAC C-3’ és MCP650AS: 5’-GAG TGT TCA CAT AGC CTT CTG-3’segítségével egy 234 bp hosszúságú terméket kaptunk. 94 Celsius fokon történt egy perces denaturálást követoen 35 cikluson keresztül (95 Celsius fokon 30 másodpercig, 58 Celsius fokon egy percig, 72 Celsius fokon 30 másodpercig) történt a PCR. A polimorfizmus kimutatásához PvuII restrikciós enzimet használtunk, amely a terméket a -2518 helyen G allél esetén egy 159 és egy 75 bp hosszú fragmentre hasította. A hasított fragmenteket és nem hasított termékeket 3%-os agaróz gélen szeparáltuk, ethidium bromiddal festettük (60) (12. ábra).

3.2.2.3 Laboratóriumi vizsgálatok A fehérvérsejszám és eosinophil sejszám meghatározás Coulter MAXM Analizátorral történt. Az IgE vizsgálatok a Hemi Pál kórházban Pharmacia CAP System- mel és a Budai Gyermekkórházban EIA Total IgE BIOCHEM IMUNOSYSTEMS kittel történtek.

3.2.2.4 In vivo vizsgálat A Prick borpróbákat Soluprick teszttel végeztük. Pozitívnak a 3mm, vagy annál nagyobb urtica- göbcsét minosítettük, amelynek hasonlónak, vagy nagyobbnak kellett lennie, mint a pozitív kontrollnak, reakciómentes negatív kontroll mellett.

3.2.2.5 Statisztikai módszerek Az allélfrekvenciát allélszámolás képletével számoltuk ki, mint a CCR5 fejezetben. Az adatokat a MedCalc és az Arlequin programmal elemeztük. Az allél eloszlást HardyWeinberg equilibriumot teszttel vizsgáltuk. 95%-os confidencia intervallumal számoltunk. ANOVA tesztet használtunk a polimorfizmusnak a különbözo mennyiségi paraméterekre gyakorolt hatásának elemzésére. A p értéket 0,05 alatt tartottuk szignifikánsnak. 47

12. ábra MCP-1-2518 A/G polimorfizmus kimutatása PCR-RFLP-vel

PVU 2 resztrikciós enzim Hasít, ha G van Nem hasít, ha A van

2: G/G homzigóta mutáns 3: A/G heterozigóta 4: A/A vadtípus

48

3.2.3 Eredmények

1. A polimorfizmusok allélfrekvenciáit az 8. táblázat mutatja a 3 vizsgált csoportban. Szignifikánsan több G allél fordult elo az asthmásokban, mint az allergiás, de nem asthmás csoportban. p < 0,001; OR:2,0 (95% CI:1,4-2,9). Ugyanígy szignifikánsan több G allél fordult elo az asthmásokban a kontrollokhoz képest is. P < 0,001; OR: OR:2,0 (95% CI:1,4-2,6). Az asthmásoknak több, mint a fele hordozott G allélt, az allergiásoknak, de nem asthmásoknak és a kontrolloknak csak kb. harmada. Az asthmások között több volt a homozigóta mutáns.

2. Annak kiderítésésre, hogy a G allél hetero-vagy homozigóta jelenléte szemponjából vane különbség az asthmára való hajlamban, eloször a heterozigóta asthmásokat (46,3%) hasonlítottuk a heterozigóta kontrollokhoz (29,7%), itt szignifikánsan több G allél volt az asthmásokban: p: <0,001 , OR: 2,4 (95% CI: 1,6-3,6). Majd a homozigóta asthmásokat (11,2%) hasonlítottuk a homozigóta kontrollokhoz (6,3%). Itt is szignifikánsan több volt a G/G genotípus az asthmásokban, mint a kontrollokban: p < 0,001, OR: 2,7 (95% CI: 1,45,5). A két összehasonlítás hasonló OR értéke azt mutatja, hogy nincs lényeges különbség az asthmára való relatív hajlamban a hetero-és homozigóták között. Vagyis az MCP-1-2518 G polimorfizmus domináns jellegu hatással bír az asthma kialakulására (8. táblázat). Minden eredmény Hardy-Weinberg equilibriumban volt, kivéve az allergiás, de nem asthmás csoport MCP-1 genotípus eloszlását, akikben a chi- négyzet: 7,15; p < 0,01. Ennek értelmezésében tekintettel kell lennünk a homozigóták G/G magas arányára, amely magyarázhatja a Hardy-Weinberg equilibriumtól való eltérést. Bár a kontrollokban és az allergiás, de nem asthmásokban G allélfrekvenciáinak Fisher’s exact teszttel történt összehasonlítása során nem kaptunk szignifikáns különbséget. (p: 0,6; OR:1,3 (0,6-2,7)). Nagyobb populáció vizsgálatára lenne szükség annak megítélésére, hogy milyen szerepe lehet ennek a polimorfizmusnak az allergiában.

3. Az adott polimorfizmus asthmában játszott szerepének tisztázására bizonyos klinikai és laboratóriumi jellemzoket vetettünk össze genotípusok szerint (9. Táblázat).

49

8. Táblázat MCP-1-2518A/G genotípusok és allélfrekvenciák az asthmás, az allergiás, de nem-asthmás és a kontroll gyermekeknél Polimorfizmus

Betegcsoportok

MCP-12518A/G

Asthma Allergia de nem asthma Kontroll

A/A n (%) 68 (42,5) 100 (66,2) 194 (64)

A/G n (%) 74 (46,3) 39 (25,8) 90 (29,7)

G/G n (%) 18 (11,2) 12 (8,0) 19 (6,3)

Összes n (%) 160 (100) 151 (100) 303 (100)

G Allélfrekvencia 34,4%** 20,9%** 21,1%**

** p < 0,001; OR:2,0 (95% CI:1,4-2,9) asthmás és nem-asthmás, de allergiás gyermekek összehasonlítása esetén. P < 0,001; OR: 2,0 (95% CI:1,4-2,6) asthmás és kontroll gyermekek összehasonlítása esetén. Allergiás, de nem-asthmás gyermekeknél: HardyWeinberg Equilibriumtól való eltérés: chi- négyzet: 7,15; p< 0,01.

50

9. Táblázat Az asthmás betegek fehérvérsejt számai, abszolút és relatív eosinophil sejt számai és össz IgE szintjei a MCP-1-2518 genotípus szerint csoportosítva Klinikai és biológiai jellemzok Genotípus Szám n (%) Életkor (3-18 év) (SD) Fiú/lány Allergia (összes asthmás %-ában) IgE (kU/l) (9-1001 kU/l)) (SD) Fehérvérsejt szám (106 /ml) (SD) Eosinophil (%) (SD) Eosinophil sejtszám (106 /ml) (SD)

Összes asthmás beteg

MCP-1-2518 genotípus

160 (100) 10,1 (3,5 )

A/A 68 (42,5) 9,8 (3,1)

A/G 74 (46,3) 8,7 (4,5)

G/G 18 (11,2) 13,3 (1,8)

90/70 125 (78,1)

34/34 52 (76,5)

46/28 58 (78,4)

10/8 15 (83,3)

266

243

278

301

(231) 6,9

(227) 6,7

(256) 7,1

(228) 7,2

(1,5) 5,4 (3,1) 0,35

(1.5) 3,9* (2,2) 0,27**

(1,7) 5,9* (3,7) 0,36**

(1,0) 9,3* (4,8) 0,64**

(0,24)

(0,20)

(0,27)

(0,26)

* p < 0,001 A/A vs A/G; P: <0,001 A/A vs G/G; P:0,001 AG vs G/G **p: 0,03 A/A vs A/G; P: P<0,001 A/A vs G/G; P <0,001 A/G vs G/G

51

A 160 asthmás betegbol 125 (78,1%) volt allergiás asthmás, 35 (21,9%) nem-allergiás asthmás. Az MCP-1-2518 G polimorfizmus allélfrekvencia és genotípus eloszlás tekintetében nem volt szignifikáns különbség az asthmások e két alcsoportja között. Az allergiás asthmások G prevalenciája 35,2%, míg a nem-allergiás asthmásoké 31,4% volt. A G allél szignifikánsan magasabb frekvenciáját tapasztaltuk az allergiás asthmások között összevetve a csak allergiás, de nem asthmás betegek G allélfrekvenciáival. (p< 0,001; OR:2,1 (1,4-3,0)). Azonban a G allélfrekvenciája magasabb volt a nem-allergiás asthmásokban, mint a kontrollokban (31,4% vs. 21,1%). Ez a különbség, valószínuleg a nem-allergiás asthmások kis esetszáma miatt, nem bizonyult szignifikánsnak; p: 0,07; OR: 1,7 (95% CI: 1,0-2,9). Ezek az eredmények az MCP-1-2518 G genotípus és az asthma között jeleznek összefüggést, de nem utalnak kapcsolatra e genotípus és az allergia fenotípusa között.

4. Annak megítélésére, hogy miképpen hat az MCP-1-2518 G az asthmára, az egyik legfontosabb effektor sejtnek, az eosinophil sejteknek a vérben mérheto abszolút és relatív mennyiségét vizsgáltuk. Az abszolút és a relatív eosinophil sejtszámokban szignifikáns különbségeket találtunk a különbözo genotípusú csoportok között (9. Táblázat). A legmagasabb sejtszámot a G/G homozigóta mutánsokban mértük, a legalacsonyabbat a normál A/A típusban. Az A/G heterozigótákban a két érték közötti értéket találtunk, amely a G allélnak nem a korábban leírt domináns, hanem csak additív hatását jelzi az eosinophil sejtek vérben való megjelenésére. A allergiások (de nem asthmások) különbözo genotípusaiban mért eosinophil sejtszám összehasonlítása során hasonló tendenciát tapasztaltunk, de nem találtunk szignifikáns összefüggéseket. A relatív eosinophil sejt arány (%) A/A esetén: 4,9+ 4,1 %, A/G esetén: 5,3+ 4,0%, G/G esetén: 5,7+ 3,7% voltak. A p értékek p: 0,6 A/A vs A/G és P: 0,5 A/A vs G/G. Az abszolút eosinophil sejtszámok: A/A esetén: 0,41+ 0,34 106 /ml, A/G esetén: 0,52+ 0,48 106 /ml, G/G esetén: 0,55+ 0,35 106 /ml voltak. A p értékek p: 0,1 A/A vs A/G és p: 0,2 A/A vs G/G.

5. Arra a kérdésre, hogy az MCP-1-2518 G genotípus befolyásolja-e az asthma súlyosságát,

52

a CCR5 fejezetben leírt módon és indoklással az asthmásokat 5 csoportra osztottuk és súlyossági fokok szerint vizsgáltuk a fenti genotípus elofordulását hetero-és homozigóta formákban. A 160 asthmás betegbol 32-nek (20%) volt enyhe intermittáló (1-es), 22-nek (13,75%) szezonális enyhe perzisztáló (1,5-ös), 74-nek (46,25%) enyhe perzisztáló (2-es) és 32-nek (20%) mérsékelt perzisztáló (3-as) súlyossági fokú asthmája és senki nem szerepelt a súlyos perzisztáló (4-es) csoportban. Genotípus és súlyossági fok szerinti eloszlásukat az 13. ábra mutatja.

A G allél elofordulása a súlyosság mértékével párhuzamosan növekedett: 18,8%, 29,5%, 33,1%, 56,3% az 1-es, 1,5-ös, 2-es és 3-as csoportban. A különbségek az 1-es és 2-es (p < 0,05); az 1-es és 3-as (p < 0,0001); 1,5-ös és 3-as (p: 0,01); és a 2-es és 3-as (p: 0,002) súlyossági csoportok között voltak szignifikánsak. Az MCP-1-2518 G polimorfizmus asthma súlyosságára vonatkozó hatásának becslésére összevetettük az 1-es és 3-as fokozatú asthmásokat, azok genotípusai szerint. A G/G homozigóták (10/18) 55,6%-ban voltak mérsékelt perzisztáló (3-as) asthmások, de csak (1/18) 5,6%-uknak volt enyhe intermittáló (1-es) asthmája. A különbség szignifikáns; p: 0,003. A normál A/A homozigóták között jóval több (21/68) 30,9% volt az enyhe intermittáló (1es), mint a súlyosabb, 3-as, mérsékelt perzisztáló fokozat (6/68) 8,8%. A különbség szignifikáns; p:0,002. Az A/G heterozigóták esetében nem volt szignifikáns különbség az 1es (10/74; 13,5%) és a 3-as (16/74; 21,6%) súlyossági fokok között. Ezek az eredmények arra a utalnak, hogy az asthma súlyossága összefügg és az MCP-1 G/G homozigótasággal, viszont a G allél hiánya „jótékony” hatású az asthma tüneteire (13. ábra).

6. Végül az eosinophil sejtszámokat hasonlítottuk össze az asthma súlyossága szerint. ( 14/A ábra) Az eosinophil sejtszám az asthma súlyosságával párhuzamosan emelkedik. (14/A. Ábra ). Szignifikáns különbséget mértünk az 1-es intermittáló és a 3-as mérsékelt perzisztáló között (p: 0,003). Annak eldöntésésre, hogy az eosinophil sejtszám az asthma súlyosságával függ-e össze vagy az asthmások genotípusával, az eosinophil sejtszámokat és genotípusokat is összehasonlítottuk a súlyossági lépcsokön belül ( 14/B Ábra).

53

% patients

13. Ábra A különbözo súlyossági fokú asthmás betegek genotípus szerinti megoszlása

60 40 20 0

A/A

Intermittáló

A/G Genotípus

Szezoná lis

G/G

Enyhe p

Mérsékelt perzisztáló

(p: perzisztáló, % patients: betegek százaléka)

Szignifikáns különbségek: A/A genotípus esetén az intermittáló és a mérsékelt perzisztáló stádium között p:0,002 G/G genotíus esetén az intermittáló és a mérsékelt perzisztáló stádium között p: 0,003

54

14. A, B Ábra

0,8

6

10 /ml

Blood eosinophil

A. Eosinophil sejtszám különbözo súlyosságú asthma esetén

0,6 0,4 0,2 0

Asthma súlyosság

Blood eosinophil 106/ml

Szignifikáns különbség az intremittáló és a mérsékelt perzisztáló stádium között p: 0,003

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

AA

AG Genotype

GG

B. Eosinophil sejtszám különbözo genotípus és asthma stadium esetén

Intermittáló

Szezonális

Enyhe perz.

Mérsékelt perzisztáló

(p: perzisztáló, blood eosinophil: vér eosinophil sejtszám, genotype: genotípus) Lábjegyzet 14. B-hez Szignifikáns különbségeket mértünk (p< 0,05 ): A/A genotípus esetén a szezonális enyhe perzisztáló és a mérsékelt perzisztáló stádium között G/G genotípus esetén a szezonális enyhe perzisztáló és a mérsékelt perzisztáló stádium között

55

Minden súlyossági csoportban az átlagos eosinophil sejtszám alacsonyabb vo lt A/A, mint G/G genotípus esetén. Az átlagos eosinophil sejtszám a súlyossággal is emelkedett a genotípus csoportokon belül. Bár a sok alcsoport miatt kis esetszámok kerültek összehasonlításra, mégis elfogadhatónak tartjuk a mért szignifikáns (p< 0,05) eosinophil sejtszám-beli különbségeket az A/A vs G/G és A/G vs G/G genotípust hordozó szezonális, enyhe perzisztáló és mérsékelt perzisztáló asthmás gyermekek között. A különbség a súlyossági fokok között nem volt szignifikáns genotípus csoportokon belül.

Eredményeink szerint az MCP-1-2518 G allél mind a vér eosinophil szintjére, mind az asthma súlyosságára hatással van.

3.2.4 Megbeszélés

A több, mint 500 eddig publikált atópia –és asthma lokusz is bizonyítja, hogy az asthma pathogenezisében a genetikai tényezoknek fontos szerepük van (5). Eredményeink egy újabb genetikai kapcsolatot igazoltak az asthma bronchiale és egy kemokin polimorfizmus között. Az MCP-1-2518 G polimorfizmust hordozó gyermekek hajlamosabbak az asthmára, mint azok, akik nem hordozzák azt. A G allél jelenléte korrelál az asthma súlyosságával és az asthmás gyermekek vérének eosinophil sejtszámával. Az MCP ezen regulációs régiójának A/G, G/G polimorfizmusa fokozott MCP-1 szintézishez vezet. Az MCP-1 upregulációját asthmában több publikáció demonstrálta. Az asthmások bronchiális epithel sejtjeinek több, mint 50%-a MCP-1–et expresszál, szemben az egészségesek bronchalis epitheljeiben levo alig 8%-kal (12). Az MCP-1 nem csupán az asthma pathogenezisében fontos sejtek toborzásában és aktiválásában vesz részt, hanem a Th0 sejtek érését, az allergiás gyulladásban kulcsfontosságú Th2 irányba billenti (13). Th2 sejtek által secretált IL-4 a B sejtek IgE expresszióját növeli, az IL-5 pedig az eosinophilek csontvelobol való fokozott kilépését, érését segíti (14,15,16). Állatkísérletek is bizonyítják az MCP-1-nek az allergia patomechanizmusában játszott szerepét. Ép és allergiás egerekben légúti hyperreaktivitást és direkt hízósejt degranulációt

56

okoz az MCP-1 (10). Holgate és munkacsoprtja igazolta, hogy asthmában allergén terhelésre is upregulálódik az MCP-1 (61). Az MCP-1 gén transzkripció kettos kontroll alatt áll. A disztális regulációs régió a transzkripciós startponttól 1,8-2,7 kb szakaszra van upstream pozícióban. Ez a szakasz a két nukleáris faktor-kappaB köto motívumával alapveto fontosságú az MCP-1 expresszióért felelos citokin indukcióban (62). A -2518 A/G polimorfizmus ennek a régiónak a transzkripciós aktivitására hat és korrelál az egyéni MCP-1 szekrécióval (59). Eredményeink, miszerint a fokozott MCP-1 termelésért felelos G allélt hordozó egyéneknek fokozott hajlama van az asthma kialakulására és a G allél jelenléte korrelál az asthma súlyosságával, alátámasztják azt az állatkísérletes megfigyelést, amelyben egereknél alkalmazott MCP-1, dózisdependensen és szignifikánsan növeli a légúti hyperreaktivitást. Ebben a folyamatban az MCP-1-nek két olyan mediátorra (a basophil sejtek hisztamin release-re és a leukotrién C4 mediált mechanizmusára), kifejtett hatását feltételezik, amelyek az asthma exacerbációjában is fontos szerepet töltenek be (10,63). Egérkísérletben az MCP-1 gátlása csökkenti a mononukleáris sejtinfiltrációt a tüdobe és a légúti hyperreaktivitást (64). Eredményeink szerint az MCP-1 -2518 G polimorfizmusa az atópiával nem, de az asthmával

összefügg.

Ezt

nagy

genetikai

vizsgálatok

eredményei

alátámasztják,

amelyekben kapcsolatot mutattak ki a kemokin cluster (17p11.1- q11.2) és az asthma között, de ugyanez a régió nem mutatott összefüggést az atópiával (65,66,67). Hogyan befolyásolja az MCP-1 -2518 G polimorfizmus miatt fokozottan expresszálódott MCP-1 az eosinophil szintet? Egyrészt az eosinophil sejtek felszínén van CCR2 receptor (68). Így az MCP-1 az eosinophil sejtek kemotaxisát és aktiválását segíti. Másrészt a differenciálatlan T sejtek Th2 sejtté való érésében aktív szerepet játszó MCP-1, indirekt módon növeli a Th2 sejtre jellegzetes IL-4 citokin expresszióját, amely az eotaxin upregulációja révén az eosinophilekre kemoattraktáns (69, 63,70). Ugyanakkor a Th2 sejt eredetu IL-5 azon kívül, hogy az eosinophil sejtek csontvelobol való kiáramlását és érését serkenti, közvetlenül aktiválja az eotaxint (71). Az MCP-1 eosinophil sejtekre kifejtett direkt és indirekt kemoattraktáns hatásával magyarázható az általunk tapasztalt szignifikáns eosinophil sejtszám emelkedés a G/G genotípusú asthmásoknál.

57

A nem-allergiás asthmásoknál tapasztalt hasonló, de nem szignifikáns eosinophil sejtszám emelkedés az MCP-1-2518 G allél kevésbé kifejezett hatására utal nem-allergiás típusú asthma esetén. Valószínuleg az MCP-1-en kívül más tényezok is hatással vannak a vér eosinophil sejtszámára.

Összefoglalva, az MCP-1 -2518 G hajlamosít asthmára. A G/G homozigóta mutáns forma esetén magasabb a vérben az eosinophil sejtszám és súlyosabb az asthma. Az MCP-1 -22518A/G polimorfizmus jó prediktora lehet az asthmának. Az MCP-1-CCR2 tengely jó terápiás célpont lehet az asthma terápiájában (72). E polimorfizmus és a szérum MCP-1 szintjének vizsgálata javasolt.

58

3.3 SZÉRUM MCP-1 VIZSGÁLAT

3.3.1 Bevezetés, célkituzés Az MCP-1 kemokin Chlamydia pneumoniae fertozésben és asthmában betöltött szerepérol az elozo fejezeteken részletesen tárgyaltam (2.3.5, 3.2.4) Vizsgálni kívánt uk a szérum MCP-1 szintet egy olyan SNP esetén (MCP-1-2518A/G), amely Rovin leírása szerint növeli az MCP-1 expressziót (59). Összefüggéseket kerestünk a szérum MCP-1 szintek és a különbözo betegségek között is (asthma bronchiale, allergia asthma nélkül, Chlamydia pneumoniae fertozés).

3.3.2 Betegek és módszerek 3.3.2.1 Betegek Az elozo fejezetben szereplo 3-23 éves korú 323 fiatalból 108-nál volt lehetoségünk szérum MCP-1 szint meghatározására. A betegeket random választottuk ki. Közülük 64 asthma bronchialés (3,35-19,52 éves, átl: 11,19 év SD: 3,74), 19 vegyes allergiás, de nem asthmás (5,3-17,78 éves, átl.: 12,49 év SD: 4,04), 25 kontroll (4,13-22,54 éves , átl.: 11,22 év, SD: 5,56) gyermek, fiatal volt. A 64 asthmás gyermekbol 52-nek volt allergiás asthmája és 12- nek nem-allergiás asthmája. A betegek gondozási helyei és diagnózisuk módszerei megegyeznek az elozo fejezetben leírtakkal. 3.3.2.2 Genotipizálás Az MCP-1-2518A/G genotípizálás leírása az elozo fejezetben található.

3.3.2.3 Laboratóriumi módszerek 3.3.2.3.1 Chlamydia pneumoniae fertozés kimutatása Chlamydia pneumoniae-species specifikus IgA, G, M antitest meghatározást ELISA módszerrel végeztük. A pozitivitást a cut-off index > 1,1 alapján számítottuk. Az értékelés a specifikus antitestek pozitivitásának kombinációja alapján történt. C. pneumoniae species-specifikus IgM, IgA és IgG kimutatása a szérumból Sero CP-IgM, IgA és IgG protein ELISA kittel történt (Savyon Diagnostic Ltd), ahol antigénként tisztított C. pneumoniae elemi testet használtunk. A Cut-off value (COV) és Cut-off index (COI) kalkulációja a gyári leírás szerint: COV= NCx2

59

(NC= a negatív kontrollok átlagos absorbanciája 450 nm-en) A különbözo kitek közötti különbségek kiküszöbölésére cut-off indexet (COI) kalkuláltunk az alábbi formula segítségével, a gyári leírásnak megfeleloen. COI= A szérum minta absorbanciája 450nm-en / COV. Az eredményeket pedig a COI értékei semiquantitative tükrözték az alábbi módon. COI: < 1,0: Negatív (nincs kimutatható specifikus antitest) COI: 1-1,1: Határérték (alacsony specifikus antitest szint) COI: > 1,1: Pozitív (releváns specifikus antitest szint) A határértéket mutató méréseket megismételtük. Az eredmények interpretációja az alábbiak szerint történt. IgM, IgG és IgA negatívak: nem utal fertozésre. IgM pozitív, IgG negatív és IgA negatív vagy pozitív: zajló, friss, primer fertozésre utal. IgM negatív, IgG pozitív és IgA negatív: régi, lezajlott fertozésre utal. IgM negatív, IgG erosen pozitív és IgA negatív: zajló reinfekció jele. IgM negatív, IgG negatív vagy pozitív és IgA pozitív: zajló perzisztáló, krónikus fertozésre utal. Reinfekció esetén specifikus IgM ritkán mérheto, az IgA és IgG megjelenése gyors (73), és az IgG igen magas lehet. Savópár esetén 4x-es IgG titeremelkedés diagnosztikus.

3.3.2.3.2 A szérum MCP-1 szint meghatározás ELISA módszerrel történt (Quantakine Human MCP-1 Imunoassay R& D Systems) a gyári leírás szerint. A standard, a kontrollok és a szubsztrát optikai denzitási (OD) értékeibol felvett kalibrációs görbe segítségével számítottuk ki az MCP-1 szinteket, amely pg/ml egységben adott eredményt.

3.3.2.4 Statisztikai módszerek Nem-paraméteres Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis teszteket használtuk.

3.3.3 Eredmények

1. Az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus szérum MCP-1 szintre gyakorolt hatását az 10. táblázat mutatja. Látható, hogy az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus típusok nem függenek össze szignifikánsan a szérum MCP-1 szinttel.

2. A szérum MCP-1 szintek betegségenkénti összehasonlításai a 11. táblázatban láthatóak.

60

10. Táblázat Az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus hatása a szérum MCP-1 szintjére (n:) MCP-1 -2518A/G A/A (47) vs. A/G (41) A/A (47) vs. G/G (14) A/G (41) vs. G/G (14)

Szérum MCP-1 összehasonlítások p: 0,059 0,240 0,847

Lábjegyzet: A/A: vad típus, A/G: heterozigóta, G/G: homozigóta mutáns, vs.:versus

61

11. Táblázat A szérum MCP-1 szintek (rank szám átlagok) különbözoképpen csoportosított betegeknél

Betegség csoportok (n) 1. öh: 2. öh: 3. öh: 4. öh: 5.öh: 6. öh: 7. öh: AB-ban 8. öh: VA-ban 9. öh: K-ban 10. öh: AB vs. Nem-AB (K+ VA) 11. öh: VA vs. nem-VA =K 12. öh: K vs. nem-K (AB+VA) 13. öh: AB-ban

AB (64) VA (19) AB (64) K (25) VA (19) K (25) AAB (52) NAAB (12) AB (64) K+ VA (44) a/p CPI+ (51) a/p CPI- (47) a/p CPI+ (31) a/p CPI- (32) a/p CPI+ (9) a/p CPI- (2) a/p CPI+ (11) a/p CPI- (13) AB és a/p CPI+ (31) Nem-AB és a/p CPI+ (20) VA és a/p CPI+ (9) Nem-VA és a/p CPI+ (11) K és a/p CPI+ (11) Nem-K és a/p CPI+ (40) AAB és a/p CPI+ (n) NAAB és a/p CPI+ (n)

Szérum MCP-1 (átlag rank szám) 36,30 61,18 37,80 63,44 23,58 21,68 30,90 39,42 41,60 73,26 49,46 49,54 31,39 32,59 5,89 6,5 12,64 12,38 19,71

p:

< 0,001 < 0,001 0,627 0,153 < 0,001 0,989 0,794 0,909 0,955 < 0,001

35,75 11,11 0,710 10,00 35,18 0,021 23,48 15,54 0,422 20,33

Lábjegyzet: AB: asthma bronchiale, VA: vegyes allergia asthma nélkül, K: kontroll, AAB: allergiás asthma bronchiale, NAAB: nem-allergiás asthma bronchiale a/p CPI +: akut vagy perzisztáló (krónikus) Chlamydia pneumoniae infekció van a/p CPI -: akut vagy perzisztáló (krónikus) Chlamydia pneumoniae infekció nincs öh: összehasonlítás p < 0,05= szignifikáns különbség

62

Az asthmá sokban szignifikánsan alacsonyabb volt az MCP-1 szint, mint a kontrollokban vagy a vegyes allergiás, de nem asthmásokban (p < 0,001) (11. táblázat 1., 2., 5. összehasonlítás).

3. C. pneumoniae fertozésrol tudjuk, hogy lokálisan fokozott MCP-1 expressziót okoz (27). Vizsgáltuk, hogy szisztémásan is emelkedik-e az MCP-1 szint. (11. Táblázat) Megállapíthatjuk, hogy az akut vagy krónikus CPI nem befolyásolja a szérum MCP-1 szintet (11. táblázat 6. összehasonlítás).

3.3.4 Megbeszélés

Három olyan tényezot vizsgáltunk, amelyek az irodalmi adatok szerint növelik az MCP-1 expressziót. Ezek 1. MCP-1-2518 A/G polimorfizmus 2. Az asthma bronchiale 3. C. pneumoniae.

1. Az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus típusok nem függenek össze szignifikánsan a szérum MCP-1 szinttel. Ez ellentétes Rovin megfigyelésével.

2. Az irodalmi adatok alapján az asthmás betegekben magasabb szérum MCP-1 szintet vártunk (12). Az MCP-1 -2518 G allél, amelyet az elozo fejezetben szignifikánsan gyakrabban találtunk az asthmások között és összefüggött az asthma súlyosságával is, fokozott MCP-1 expresszióval jár. Ennek alapján is az asthmások között (foleg a G allélt hordozók között) magasabb szérum MCP-1 szintre számítottunk. A kapott eredmény a várttal ellentétes, az asthmások között szignifikánsan alacsonyabbak a szérum MCP-1 szintek. Az asthmások szérumában mért alacsonyabb MCP-1 szint nem zárja ki, hogy lokálisan, a tüdoben több MCP-1 van jelen, mint nem asthmásoknál. Tekintettel arra, hogy az MCP-1 molekulák kemoattraktáns hatásukat akkor fejtik ki, ha éppen lekötött állapotban vannak. Az endothel sejtek heparán-szulfát molekuláin megtapadva feldúsulnak és magukhoz kötik a CCR2+ sejteket, így segítik a célsejtek transendotheliális migrációját és aktiválását. Asthmában aktív szerepet töltenek be az MCP-1 molekulák. Sejt toborzó munkájukat kötött állapotukban végzik, ezért lehetséges, hogy a szolubilis formájuk csak kisebb koncentrációban mérheto. 63

Bár a kemokinek lokálisan képzodnek, a keringésben is mérhetoek kisebb mennyiségben. A lokális gyulladás helyszínén nemcsak több kemokin képzodik, de feltehetoen a keringésbol is kitapadnak a lokálisan nagyszámban megjeleno heparán-szulfát molekulákon. Így csökkentve a szérum kemokin szintet. A tüdobol a lokális MCP-1 kimutatására bronchoalveoláris lavage vagy biopszia jöhetnének szóba, azonban etikai okok miatt asthmás gyermekekben csak tudományos indikációval ilyen vizsgálatot nem végzünk. A másik ok, amely magyarázhatja az alacsony MCP-1 szintet a vérben, talán az is lehet, hogy az asthmások nagy része inhalatív corticosteroid kezelésben részesül. Bár ezek a korszeru készítmények nem vagy csak kismértékben jutnak be a szisztémás keringésbe, hatásuk elegendo lehet az MCP-1 expresszió gátlására.

3. C. pneumoniae fertozésrol is tudjuk, hogy lokálisan fokozott MCP-1 expressziót okoz. Eredményeink szerint, szisztémásan nem emelkedik az MCP-1 szint akut vagy krónikus CPI hatására. Ez itt is részben lokális hatással magyarázható. Másrészt az MCP-1 expresszió a gyulladás kialakulásának elso fázisában jelenik meg (15. napon mért csúcs) és betegeink vérvétele nem ilyen szempont szerint történt (11).

Összefoglalva: az MCP-1 szint nem volt összefüggésben az MCP-1-2518 A/G polimorfizmussal, sem az akut vagy krónikus CPI-val, de szignifikánsan alacsonyabb volt az asthmás betegekben. Jelen vizsgálattal csupán 108 betegnél volt lehetoségünk a szérum MCP-1 szint meghatározására, és a betegségenkénti csoportosítás is csökkentette a típusonkénti beteglétszámot, ezért a jövoben nagyobb populáción érdemes megismételni méréseinket.

64

3.4 CHLAMYDIA PNEUMO NIAE FERTOZÉS ÉS AZ ALLERGIA KAPCSOLATA ASTHMÁS GYERMEKEKBEN ÉS FIATAL FELNOTTEKBEN

3.4.1 Bevezetés, célkituzés A Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) különleges életciklusú obligát intracelluláris patogén. Az elmúlt években tanulmányok százai jelentek meg e kórokozó és különbözo szervek, szervrendszerek krónikus betegségei közötti kapcsolatokról. Kardiovaszkuláris, központi idegrendszeri, izületi és légzorendszeri gyulladásos kórképekkel mutattak már ki összefüggéseket, köztük az asthma bronchialéval is. Klinikailag a legtöbb légúti Chlamydia pneumoniae infekció (CPI) enyhe, akár tünetmentes lefolyású, éppen ezért diagnózisa nehézkes, sokszor el is marad. A fel nem ismert, kezeletlen akut CPI perzisztáló, krónikus fertozéssé válhat. Az általános tünetek (fáradékonyság, subfebrilitás, fejfájás, izomfájdalom, fénykerülés) sok más betegségre is jellemzoek

lehetnek.

Légúti

tünetek

az

enyhe

köhécseléstol,

a

bronchialis

hyperreaktivitással igazolt asthmatikus tüneteken át, a ritkán eloforduló súlyos pleuropneumonia és légzési elégtelenség képéig terjedhetnek. De a leggyakoribb az enyhe vagy tünetmentes fertozés. C. pneumoniá-val életünk során legtöbbünk egyszer vagy akár többször is fertozodik. A kórokozó seroprevalenciája már kis gyermekeknél sem alacsony (19), életkorral no, idosebbeknél 60% fölötti. A fiúk gyakraban fertozodnek meg, mint a lányok (74). A CPI elofordulása országról, országra is változó. Magyarországon Marton és munkatársai írták le eloször a magas; 46,5%-os C. pneumoniae IgG pozitivitást 5-15 éves budapesti gyermekeknél. Az érintett gyermekek nagy számát az óvodák, iskolák és a tömegközlekedés zsúfoltságával magyarázták. Ez az arány, már akkor, 1991-ben is magasabb volt, mint a dán vagy belga populációban (75). Az asthma bronchiale szövettanilag krónikus eosinophil bronchitis, élettanilag a kis légutak reverzibilis obstrukciójával, bronchialis hyperreaktivitással, a hörgo simaizmok görcsével és hypertrófiájával, megnövekedett mennyiségu és fokozott viszkozitású nyákképzodéssel jellemezheto, klinikailag pedig rohamokban jelentkezo nehézlégzés, megnyúlt kilégzéssel. A légúti CPI élettanilag és klinikailag sokszor hasonlíthat az asthmára. Éppen ezért az asthma differenciál diagnosztikájához hozzátartozik a CPI kizárása is. Az asthmásoknál is a fiúk szenvednek gyakrabban ebben a kórképben (76). Késobb ez az arány kiegyenlítodik. A gyermekkori asthma kb 80%-a allergiás eredetu, a maradék kb

65

20%-ot kitevo, u.n. nem-allergiás asthmát infekciók, fizikai terhelés vagy ismeretlen okok váltják ki. Hahn és munkatársai írták le eloször gyermekekben az asthmatikus tünetek és a CPI közötti összefüggést (77). Számos tanulmány igyekezett megerosíteni ezt a kapcsolatot (78-82), mások cáfolták (83-87). A C. pneumoniae asthmatikus rohamot provokáló hatását bizonyító közlemények is napvilágot láttak 9,5-45% között változó seroprevalenciával (88-92).

Vizsgálatom kiinduló pontja az a megfigyelés volt, hogy az asthma ambulancián számos változó lefolyású CPI-s beteg is megfordult. A korábban nem asthmás betegeknek sokszor csak bronchialis hyperreaktivitás volt a tünetük. Egy részük az igazolt CPI makrolid antibiotikus terápiájára meggyógyult, fél éves követés után sem mutatott bronchialis hyperreaktivitást. Más részük asthmássá vált a klinikailag és serológiailag is gyógyultnak minosített CPI után. Ha egy korábban asthmás beteg kapott CPI-t, az vagy asthmás rohamokat provokált nála, vagy hosszabb idore súlyosabb stádiumú asthma besorolást és terápiát igényelt. Tekintve, hogy az asthma gyerekkorban foleg allergiás eredetu, az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. Van-e különbség a CPI prevalenciájában asthmás és nem asthmás gyermekek és fiatal felnottek között? 2. Van-e különbség a CPI prevalenciájában allergiások és nem allergiások között? 3. Van-e jelentosége az allergén típusának ebben a mechanizmusban?

3.4.2 Betegek és módszerek 3.4.2.1 Betegek A vizsgálatba 323 (3,01- 22,54 éves, átlag életkor: 11,04 év, SD: 4,35 év) gyermeket és fiatal felnott diákot vontunk be. Közülük 139 volt asthma bronchiale-s (3,03- 21,81 év, á.: 10,62 év, SD: 4,24), 61 vegyes allergiás, de nem asthmás (5,05- 17,78 év, á.:11,56 év, SD: 3,73) és 123 pedig nem asthmás, nem allergiás kontrol (3,01- 22,54 év, á.:11,28 év, SD: 4,74). Az asthmások és az allergiások is a Budai Gyermekkórház gondozottjai. Az asthmás csoportban 110 betegnek volt allergiás asthmája, míg 29- nek nem-allergiás típusú asthmája (12. Táblázat). A kontrollokat a Budai Gyermekkórházban egyéb enyhe betegséggel megforduló olyan gyermekek közül választottam ki random módon, akik nem voltak allergiások, nem voltak

66

12.Táblázat A vizsgálatban szereplok (n: 323) összetétele betegség és allergia szempontjából Betegség

Asthma bronchiale

csoportok

n: 139

ALLERGIÁS Indoor Outdoor Táplálék/gyógyszer NEM-ALLERGIÁS

allergiás n: 110 (79%) 110 78 86 39 0

nem-allergiás n: 29 (21%) 0 0 0 0 29

67

Vegyes allergia asthma nélkül n: 61

Kontrol

61 16 33 18 0

0 0 0 0 123

n: 123

asthmások, nem zajlott náluk infekció és semmilyen gyógyszert nem szedtek. (pl. enyhe scoliosis, lúdtalp, testsúly probléma, vegetatio adenoides). A vegyes allergiás, de nem asthmás csoportban (VA) szénanáthások, táplálék allergiások, gyógyszer allergiások szerepeltek. A betegeket a magyar oktatási rendszer szerinti életkori csoportokra osztottuk. Óvodás korúak (3-5,9 év) 49-en voltak, alsó tagozatosok (6-9,9 év) 88-an, felso tagozatosok (1013,9 év) 100-an, középiskolások (14-17,9 év) 72-en és 14-en voltak a felsooktatásban tanuló 18-23 éves diákok. A Jahn Béla Országos Epidemiológiai Központ adatai szerint, a vizsgálati periódus alatt, 2000. márciusától 2003. márciusáig, nem volt Magyarországon C. pneumoniae járvány. (OEK évkönyv 2000, 2001, 2002.). A betegeket összehasonlítási csoportokba soroltuk. (13. Táblázat) Az allergia CPI-re gyakorolt szerepének vizsgálata céljából a betegeket különbözo módon csoportosítottuk (16 összehasonlítás). Az allergén típus hatásának vizsgálata céljából indoor, outdoor, táplálék/gyógyszer allergia pozitív betegeket különítettünk el. A 7-10. összehasonlításokban az inhalatív (indoor és/vagy outdoor) allergén pozitív és negatív betegek kerültek összehasonlításra akut vagy krónikus CPI-juk szerint. A 11-14. összehasonlításban is az inhalatív allergén pozitív és negatív betegek kerültek csoportokba a krónikus CPI-re jellemzo specifikus IgA pozitivitásuk összehasonlítása céljából. A CPI fertozött betegek makrolid antibiotikus kezelésben részesültek, gondozásuk folyik.

4.2.2.2 Az allergia és az asthma bronchiale diagnosztikája Az asthmás és allergiás gyermekek diagnóziának felállításának elvei és módszerei megegyeznek

az

elozo

fejezetben

leírtakkal. Az

allergiás

betegek

mono-vagy

poliallergiások voltak, betegségeik allergiás rhinitis, táplálék allergia, gyógyszer allergia. Az allergia kimutatására Prick bortesztet, specifikus IgE szint mérést a vérbol és/vagy kettos vak placebo kontrolált ételterhelést (néhány esetben nyílt ételterhelést) végeztünk. A gyógyszerallergia diagnózisa más intézetben történt. Indoor allergének a háziporatkák (Dermatophagoides pteronissimus, Dermatophagoides farinae) és az állati epithélek (indoor élo háziállatokból) voltak, outdoor allergének közé soroltuk a polleneket, az Alternaria és Cladosporium kültéri gombákat. Specifikus IgE méréseket ELISA technikával végeztük (Syrings Diagnostics).

68

13. Táblázat Összehasonlítások az alcsoportok között

Sorszám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Lábjegyzet:

AAB+ NAAB AAB+ NAAB AAB+ VA AAB+ VA AAB VA ia AAA+ ia VA ia AAB+ ia VA ia AAB ia VA ia AAB+ ia VA ia AAB+ ia VA ia AAB ia VA

Összehasonlítások vs. K vs. K+ VA vs. K+ NAAB vs. NAAB vs. NAAB vs. K vs. K+ NAAB vs. nem-ia AAB+ NAAB vs. nem-ia AAB+ NAAB vs. nem-ia VA+ K vs. K+ NAAB vs. nem-ia AAB+ NAAB vs. nem-ia AAB+ NAAB vs. nem-ia VA

AAB: allergiás asthma bronchiale, NAAB: nem-allergiás asthma bronchiale, K: kontrol, VA: vegyes allergia asthma nélkül, ia: inhalatív (indoor és/vagy outdoor) allergen pozitív, nem-ia: inhalatív allergen negatív, v.s.: versus

69

4.2.2.3 Chlamydia pneumoniae fertozés kimutatása A C. pneumoniae-specifikus antitestek kimutatása ELISA módszerrel megegyezik a 3.3.2.3.1 fejezetben leírtakkal. Az eredmények interpretálása a specifikus antitestek pozitivitásainak kombinációin alapult (14. Táblázat). Reinfekció esetén specifikus IgM ritkán mérheto, az IgA és IgG megjelenése gyors (73) és az IgG igen magas lehet. Savópár esetén 4x-es IgG titeremelkedés diagnosztikus. Azokat a betegeket, akik akut CPI következtében reagáltak bronchiális hyperreaktivitással, majd makrolid antibiotikus terápia hatására meggyógyultak, kizártuk a vizsgálatból. Így nem keverdhettek az asthmások közé.A 323 vizsgálatban levo fiatal kiindulási CPI státusza ismeretlen volt. Több, mint 300 beteg, több, mint 900 specifikus antitest leleteibol egy-egy elveszett, így az adott csoportosításokba bevonható betegek száma változott, amelyet a 4-6. táblázatban jelzek. A hiányzó adatok minimális száma azonban lehetové tette a korrekt statisztikai elemzést.

(Itt kell megjegyeznem, hogy átmeneti (fél éves) reagens hiány miatt 40 beteg specifikus IgA és IgG meghatározása az eredmény terápiás konzekvenciája miatt, a hosszú eredményvárás kiküszöbölésére, itt nem részletezett Ridascreen ELISA kittel történt. Késobb, a reagens megérkezése után 15 betegnél lehetoségünk volt a lefagyasztott, eredeti vérmintából a fenti Savyon kittel ellenorizni a Ridascreen leletek validitását.)

3.4.2.4 Statisztikai módszer A statisztikai elemzést SPSS 11.0 számítógépes programal Chi- négyzet próbával, Fisher’s exact teszttel végeztük. Az adatokat korra és nemre logisztikus regresszióval adjusztáltuk, tekintettel arra, hogy mind az asthma, mind a CPI fiúkban gyakoribb és a CPI gyakorisága életkorral no. A p értéket 0,05 alatt tartottuk szignifikánsnak.

70

14. Táblázat Az ELISA lelet összegzo értékelése a Chlamydia pneumoniae-specifikus IgM, IgA és IgG pozitivitások és negativitások kombinációin alapul

Chlamydia pneumoniae antitestek IgM IgG IgA Negatív Negatív Negatív Pozitív Negatív Negatív vagy pozitív vagy pozitív Negatív Pozitív Negatív (*vagy erosen pozitív) Negatív Pozitív Pozitív vagy negatív

Értékelés Nincs kimutatható CPI Zajló, akut CPI (primer) Régi lezajlott CPI (*vagy zajló reinfekció ) Zajló, krónikus = perzisztáló CPI

Lábjegyzet: CPI: Chlamydia pneumoniae infekció

71

3.4.3 Eredmények

1. Van-e különbség a CPI prevalenciájában asthmás és nem asthmás gyermekek és fiatal felnottek között? Az asthmás betegek 48,1%-a, a kontroll csoport 45,1%-a szenvedett akut vagy krónikus CPI-ben. A különbség nem szignifikáns (p: 0,71). Ha az asthmásokat a nem-asthmásokkal (kontroll + VA) hasonlítottuk össze, az asthmások 48,1%-os CPI fertozöttsége sem különbözött a nem-asthmások 48,8%-os fertozöttségétol szignifikánsan (p: 0,91) (15. Táblázat 1-2. összehasonlítás).

2. Van-e különbség a CPI prevalenciájában allergiások és nem allergiások között? Feltételezésünk az volt, hogy a nem-allergiás asthmában találunk majd több CPI-t, mint az allergiás asthmában. Eredményeink ennek az ellenkezojét mutatták. Az akut vagy krónikus CPI prevalenciája szignifikánsan magasabb volt allergiás asthmában a korra és nemre történt adjusztálást követoen is p: 0,026 és p: 0,032 (15. Táblázat 3-4. összehasonlítás). Azonban a VA, de nem asthmás betegek és kontrollok között mért CPI elofordulásában nem volt szignifikáns különbség (15. Táblázat 6. összehasonlítás).

3. Van-e jelentosége az allergén típusának ebben a mechanizmusban? Inhalatív (indoor és/vagy outdoor) allergénekre pozitivitást mutató betegek többször szenvedtek akut vagy krónikus CPI-ben. A különbség szignifikánssá vált, ha asthmás is volt az inhalatív allergénre allergiás beteg (16 Táblázat 7-9 összehasonlítás). Azonban az inhalatív allergén pozitív VA, de nem asthmás betegek nem kaptak gyakrabban CPI-t, mint a kontrollok és a másra, de nem inhalatív allergénre érzékeny társaik (10. összehasonlítás). Mivel a C. pneumoniae-specifikus IgA jó prediktora a perzisztáló, krónikus fertozésnek, az ihalatív allergénekre pozitív és negatív betegek C. pneumoniae-specifikus IgA pozitivitását is összevetettük a 17. táblázatban. A 11-14. összehasonlításban a 7-10. összevetéshez hasonló tendenciát tapasztaltunk, csak erosebb szignifikanciával. Erosen szignifikánsan több C. pneumoniae-specifikus IgA pozitív eset volt az inhalatív allergénekre allergiás asthmások között, mint azoknál, akik nem voltak ezekre az allergénekre allergiások (11-13. öszehasonlítás). A foleg szénanáthásokból álló VA csoportban nem különbözött a C. pneumoniae-specifikus IgA pozitív esetek aránya attól

72

15. Táblázat 1-6. összehasonlítás. Az akut vagy krónikus Chlamydia pneumoniae fertozések elofordulásának különbségei (p és Odds ratio) különbözo képpen csoportosított betegek között

Összehasonlítási csoportok (n)

Akut vagy krónikus CPI n (%)

Adjusztálás nélkül

p 1. összehasonlítás (257) Asthma (135): AAB+ NAAB Kontrol (122) 2. összehasonlítás (307) Asthma (135): AAB+ NAAB Nem-asthma: K+ VA (172) 3. összehasonlítás (307) Allergiás: AAB+ VA (158) Nem-allergiás: K+ NAAB (149) 4. összehasonlítás (185) Allergiás: AAB+ VA (158) Nem-allergiás: NAAB (27) 5. összehasonlítás (135) Allergiás: AAB (108) Nem-allergiás: NAAB (27) 6. összehasonlítás (172) Allergiás: VA (50) Nem-allergiás: Kontrol (122)

OR(95% CI)

Korra és nemre adjusztálva

p

OR(95%CI)

65 (48.1) 0.707 55 (45.1) 65 (48.1) 0.909 84 (48.8)

87 (55.1) 0.022

1.72 (1.09-2.70)

0.026

1.70 (1.07-2.70)

0.006

3.50 (1.40-8.75)

0.032

2.89 (1.06-7.60)

0.011

3.31 (1.29-8.49)

0.055

2.74 (0.98-7.66)

0.134

1.68 (0.87-3.27)

0.128

1.69 (0.86-3.32)

62 (41.6)

87 (55.1) 7 (25.9) 58 (53.7) 7 (25.9)

29 (58.0) 55 (45.1)

Lábjegyzet: AAB: allergiás asthma bronchiale, NAAB: nem-allergiás asthma bronchiale, VA: vegyes allergia asthma nélkül, K: kontroll, CPI: Chlamydia pneumoniae infekció.

73

16. Táblázat 7-10. összehasonlítás. Az akut vagy krónikus Chlamydia pneumoniae fertozések elofordulásának különbségei (p és Odds ratio) különbözo képpen csoportosított inhalatív (indoor és/vagy outdoor) allergén pozitív és negatív betegek között

Összehasonlítási csoportok (n)

Akut vagy krónikus CPI n (%)

Adjusztálás nélkül

p 7. összehasonlítás (307) Inhalatív allergiás: AAB+ VA (136) Nem-allergiás: K+ NAAB (171) 8. összehasonlítás (185) Inhalatív allergiás: AAB+ VA (136) Nem-inhalatív allergiás: AAB+ NAAB (49) 9. összehasonlítás (135) Inhalatív allergiás: AAB (103) Nem-inhalatív allergia asthmában: nem-inhalatív allergiás ABA+ NABA (32) 10. összehasonlítás (172 ) Inhalatív allergiás: VA (33) Nem-allergiás: Kontrol+ nem-inhalatív allergiás VA (139)

OR(95% CI)

Korra és nemre adjusztálva

p

OR(95%CI)

78 (57.4) 0.008

1.894 (1.20-2.99)

0.013

1.825 (1.137-2.93)

0.004

2.77 (1.39-5.51)

0.024

2.37 (1.12-5.01)

0.004

3.72 (1.53-9.05)

0.028

3.13 (1.13-8.67)

71 (41.5)

78 (57.4) 16 (32.7)

57 (55.3) 8 (25.0)

21 (63.6) 0.081

0.079

63 (45.3)

Lábjegyzet: AAB: allergiás asthma bronchiale, NAAB: nem-allergiás asthma bronchiale, VA: vegyes allergia asthma nélkül, K: kontroll, CPI: Chlamydia pneumoniae infekció.

74

17. Táblázat 11-14. összehasonlítás. A Chlamydia pneumoniae-specificus IgA pozitív, krónikus Chlamydia pneumoniae fertozések elofordulásának különbségei (p és Odds ratio) különbözoképpen csoportosított inhalatív (indoor és/vagy outdoor) allergén pozitív és negatív betegek között

Összehasonlítási csoportok (n)

n (%) of Cp.IgA+

Adjusztálás nélkül

p 11. összehasonlítás (306) Inhalatív allergiás: AAB+ VA (134) Nem-allergiás: K+ NAAB (172) 12. összehasonlítás (183) Inhalatív allergiás: AAB+ VA (134) Nem-inhalatív allergiás: AAB+ NAAB+VA (49) 13. összehasonlítás (133) Inhalatív allergiás: AAB (101) Nem-inhalatív allergiás: Nem-inhalatív AAB(3)+ NAAB (29) (=32) 14. összehasonlítás (50) Inhalatív allergiás: VA (33) Nem-inhalatív allergiás: VA (17)

OR(95% CI)

Korra és nemre adjusztálva

p

OR(95%CI)

55 (41.0) 0.010

1.91 (1.18-3.09)

0.041

1.68 (1.02-2.78)

<0.001

6.13 (2.28-16.44)

0.011

3.85 (1.37-10.82)

<0.001

10.25 (2.32-45.27)

0.033

5.48 (1.14-26.21)

46 (26.7)

55 (41.0) 5 (10.2)

41 (40.6) 2 (6.3)

14 (42.4) 0.12

0.16

3 (17.6)

Lábjegyzet: AAB: allergiás asthma bronchiale, NAAB: nem-allergiás asthma bronchiale, VA: vegyes allergia asthma nélkül, K: kontroll, Cp.IgA+: Chlamydia pneumoniae-specifikus IgA pozitív (krónikus fertozés valószínu)

75

függoen, hogy inhalatív allergénre volt-e érzékeny a beteg vagy másra (14. összehasonlítás). Az indoor és outdoor allergénre érzékenyeket külön-külön elemezve nem találtunk ilyen különbségeket (nincs ábra). A CPI elofordulásában nem az asthmások és a nem-asthmások között volt szignifikáns különbség, mint azt számos korábbi közleményben igazolták, hanem az inhalatív allergén pozitív és negatív asthmások között.

A 3-5,9, a 6-9,9, a 10-13,9, a 14-17,9 és a 18-23 éves korcsoportokban az asthmás betegek 9,5%, 48,6%, 59,6%, 57,7% és 50%-a szenvedett akut vagy krónikus CPI-ban, a kontrolloknak 21%, 40,6%, 51,5, 53,6%, és 60%-a, míg a VA-ok 25%, 68,8%, 47,1%, 69,2% és 58%-a. A fertozöttség elofordulása többnyire nott az életkor elorehaladtával, azonban a korcsoportos bontásban szereplo betegek kis számai nem tettek lehetové releváns statisztikai értékelést.

3.4.4 Megbeszélés

Amióta Grayston és munkatársai (17) több, mint 10 éve azonosították a C. pneumoniae–t, közlemények ezrei jelentek meg ezzel a patogénnel kapcsolatban. Ebben a vizsgálatban mért 40% fölötti C. pneumoniae fertozöttség, hasonlóan magas, mint azt Marton és munkatársai 1991-ben regisztrálták (75). Háromszázhuszonhárom esetünk eredményei szerint a C. pneumoniae nem válogat, egyformán fertozi az asthmás betegeket és a nem asthmásokat vagy a kontrolokat. Kontroll eseteink azonban sosem mutattak infekciós jelet vagy bronchiális hyperreaktivitást CPI estén sem. Ha egy asthmás gyermek kap CPI-t, az asthmás rohamot provokálhat vagy az asthma stádiuma súlyosabb besorolást igényel.

Infekció vagy a fizikai terhelés provokálja a nem-allergiás asthmát. Ezért feltételeztük, hogy mint infekció, a CPI a ne m-allergiás asthmások között lesz gyakoribb. Az allergiás asthmások között mért szignifikánsan magasabb akut vagy krónikus CPI az allergia, különösen az inhalatív allergénekre való allergia domináns szerepére hívja fel a figyelmet. A legerosebb szignifikáns különbség az inhalatív allergén pozitív és negatív asthmás betegek krónikus CPI-re jellemzo; C. pneumoniae-specifikus IgA pozitivitásában

76

mutatkozott. Ez felveti az inhalatív allergének szerepét a perzisztáló gyulladás mechanizmusában. Tekintettel arra, hogy azokban az összehasonlításokban, ahol a VA-kat vetettük össze kontrollal vagy inhalatív allergén pozitív és negatív VA-k kerültek a CPI szerint összehasonlításra, nem mértünk szignifikáns különbségeket. Úgy tunik, hogy a csak allergiás, de nem asthmás betegeknél még nem olyan jelentos faktor a CPI, azonban allergiás ashtmás betegekben már meghatározó tényezo lehet. A kérdés nyitva marad, vajon van-e szerepe a CPI-nak az allergiás menetelésben, az „allergic march”-ban? Valószínuleg megfelelo genetikai tényezok, inhalatív allergének és a krónikus, perzisztáló CPI együtt vezetnek az asthma bronchiale manifesztálódásához (93). Az allergia és a Chlamydia pneumoniae közötti feltételezett kapcsolat két kérdést vet fel: 1. A CPI provokálja-e az allergia manifeszálódását? vagy 2. Az allergiás betegek hajlamosabbak CPI-re?

Számos publikáció és hipotézis pozitív választ ad az elso kérdésre. A C. pneumoniae-nek, mint intracelluláris patogénnek az antigén prezentációja az MHC-I-en is történik. A Chlamydiák képesek a konstitutív vagy a gamma interferonindukálta MHC-I expressziót gátolni azáltal, hogy tönkre teszik az esszenciális downstream transzkripciós faktort, az RFX5-öt (23), valamint gátolni képesek a gamma interferonnal indukálható MHC-II expressziót is a fertozött sejtben azáltal, hogy tönkre teszik az upstream stimulációs faktort, az USF-1-et (24). A gyengült antigénprezentáció miatt a Chlamydiák meg tudnak szökni a CD8+ Tc és a CD4+Th1 immunválasz elol. Ez az egyik módja annak, hogy a Chlamydiák képesek a fertozött sejtben hosszan perzisztálni. Antibiotikus terápia nélkül a perzisztáló, krónikus CPI provokálhatja vagy facilitálhatja a proinflammatórikus citokin és kemokin szekréciót, valószínuleg csak az arra genetikailag hajlamos egyénekben. Ahogyan a Chlamydia trachomatis fertozés sok esetben a conjunctiva és a méhkürt fibrózisához vezet, hasonló mechanizmus révén, lehetséges, hogy a C. pneumoniae a légutakban beindítja a légutak „remodelling”-jét. A köhögés, a nyákképzodés, az atópia és a CPI között már jeleztek összefüggést (94). Kardiovaszkuláris vizsgálatokban igazolták, hogy a C. pneumoniae fokozza a monocyta chemotactikus protein-1 (MCP-1) expresszióját és szecrécióját in situ (26). CCR2+ (MCP-1 receptor pozitív) sejtek a monocyták, az eosinophilek, T lymphocyták, légúti simaizom sejtek, stb. MCP-1 hatására aktiválódnak és a gyulladás helyszínére 77

kemotaktálnak. Pontosan azok a sejtek hordoznak MCP-1 receptort, amelyeknek kiemelt szerepük van az asthma patogenezisében. Az MCP-1 génjének regulációs régiójában leírt, egy nukleotidot érinto polimorfizmusa (SNP), a -2518A/G polimorfizmus, összefügg az asthma hajlammal és annak súlyosságával (72). Tenyészetben a humán légúti simaizom sejt MCP-1-et képes expresszálni és kiválasztani, mindezt upreguláltan, ha asthmás légutakból származik a simaizomsejt. Ezért is lehetséges, hogy az MCP-1-nek szerepe van az asthma kórlefolyásában (95). Az MCP-1-nek a CPI-ben és az asthmában betöltött szerepe felveti annak lehetoségét, hogy maga az MCP-1 lehet egy összeköto kapocs, láncszem a CPI és az asthmás gyulladás között. A CPI magas prevalenciáját mértük már fiatal gyermekekben is. Nem-allergiás szülok gyermekének kb. 10-15%-os esélye van arra, hogy allergiás legyen. Ha az egyik szülo allergiás, ez az esély kb. 50%-ra is emelkedhet, ha mindkét szülo allergiás, a gyermek több mint 70%-os eséllyel lesz allergiás (96). Az anyai allergia hatása erosebb, amelyet genetikai imprintinggel magyaráznak. Feltételezheto, hogy a családok hosszabb idot töltenek együtt, különösen az anyák és gyermekek, amely lehetoséget teremt ping-pong CPI-re. Tehát ne mcsak a szülok atópiás státusza és a gyermek genetikai hajlama magyarázhatja az allergia magas prevalenciáját az atópiás családokban, hanem a családokban cirkuláló tünetmentes, mégis fertozo CPI-nek is jelentosége lehet. Az anyai CPI könnyen fertozheti a gyermeket és esetleg manifesztálja az allergiát az arra hajlamos egyénben. Az inhalatív allergének is és a C. pneumoniae is a légutakon át lépnek be a szervezetbe. Vajon van-e ennek jelentosége a krónikus légúti gyulladásban? Strukturális homológiák ismertek már a humán és a Chlamydia eredetu 60 kilodalton hosokk fehérjék között is (97). Feltételezheto, hogy a C. pneumoniae fontos homológ peptidjei (keresztreaktív epitópjai) humorális immunválaszt generálnak és a keresztreagáló antitestek molekuláris mimikri révén autoimmun reakciót indíthatnak el. Talán az indoor és outdoor allergéneknek és a C. pneumoniaenak is vannak keresztreaktív epitópjaik? Az egyik leggyakrabban vizsgált epitóp a profilin, amely a nyírfa pollen allergénje és humán sejtek alkotórésze is egyben. Homológia vizsgálatokra lenne szükség e kérdések tisztázására, esetünkben az inhalatív alergének és C. pneumoniae epitópokat kellene tanulmányozni. Chlamydia pneumoniae-specifikus IgE vizsgálatok végzését is tervezzük a jövoben.

78

Arra a kérdésre, hogy az allergiás betegek hajlamosabbak-e a CPI-re, egy egyszeru magyarázat lehet a jól ismert, allergiában jellemzo Th2 dominancia, amely relatív Th1 gyengeséggel járva megnehezíti a gazdasejt CPI elleni védelmét. Valószínuleg a válasz nem ilyen egysze ru, hiszen akkor halmozottan több más infekciót is megkapnának az allergiások. A gyakorlat pedig nem ezt mutatja. Eredményeink szignifikáns összefüggést mutattak az allergia és CPI között. A feltételezett ok-okozati összefüggés iránya még bizonytalan, annak feltárására követéses tanulmányok, epitóp analízisek és további genetikai vizsgálatok szükségesek.

Az asthma bronchiale differenciáldiagnosztikájában kello súlyt kell helyezni az asthmát utánzó bronchiális hyperreaktivitással is járó CPI kizárására. A kezeletlen CPI krónikussá válhat és olyan kemokin és citokin képzési kaszkádot indíthat be, amely irreverzibilis következményekkel járhat a légutakban (remodelling). Ha a CPI okozta bronchiális hyperreaktivitást asthmának véljük és inhalatív szteroiddal kezeljük, az infekció súlyosbodhat. Tehát a gyermekkori asthma diagnózisának felállítása elott zárjuk ki a CPI-t és ha kell makrolid antibiotikummal kezeljük, hogy megelozzük a krónikus gyulladás kialakulását (98).

79

3.5 MANNÓZKÖTO LEKTIN MUTÁCIÓ ÉS A CHLAMYDIA PNEUMONIAE FERTOZÉS EGYÜTTES HATÁSA AZ ASTHMÁRA

3.5.1 Bevezetés, célkituzés A mannózköto lektin (=mannose binding lectin) (MBL) egy olyan szolubilis szérum fehérje, amely a veleszületett természetes immunvédekezés része, annak egyik szolubilis eleme. Az MBL ligandumai a különbözo mikroorganizmusok felszínén levo szacharidok. Az MBP a szénhidrátköto doménjével a mikroorganizmusok cukorban gazdag felszínéhez kötodik, így opszonizálja ezeket az antigéneket. A C1-hez való szerkezeti hasonlósága alapján a C1qR-hez kötodik, aktiválja a klasszikus komplement útba kapcsolódó u.n. lektin úton át a komplement rendszert és fokozza a fagocitózist. A kórokozó szervezetbe jutásakor azonnal muködésbe lép (32,99). Több publikáció foglalkozik az MBL infekciókban betöltött szerepével. Az MBL képes gátolni a HeLA sejtek Chlamydia fertozodését, amely felveti e molekulának a CPI elleni védekezésben játszott szerepét (100). Az MBL deficiencia és a szérum alacsony MBL szintje összefügg az MBL polipeptid szerkezeti varánsaival (37,38). Az MBL gén 1. exonjában, az 54-es kodonban (allél B) és az 57-es kodonban (allél C) eloforduló SNP-k az MBL kollagén tripla hélixében a Gly-Xaa-Yaa repeat-et megszakítják, mert az esszenciális glicin helyett aszparaginsav vagy glutaminsav keletkezik. Az 52-es kodonban (allél D) megjeleno SNP az arginin ciszteinre való cseréjét okozza. Mindhárom apró strukturális fehérje variáció az MBL alegységek alap trimer szerkezetté való összekapcsolódását gátolja és csökkenti a jól muködo MBL mennyiségét. Ezek az MBL variáns allélok összefüggenek a légúti fertozések fokozott rizikójával, különösen kora gyermekkorban (42,39). Ezen megfigyelések alapján vizsgáltuk az MBL allél variánsait az CPI-ben szenvedo asthmás gyermekekben.

80

3.5.2 Betegek és módszerek 3.5.2.1 Betegek A vizsgálatban 313 budapesti 3-18 éves korú gyermek vett részt. Százharminckilenc asthmás gyermek (79 fiú, 60 leány, 3-18 év átl.: 10,5 év, SD:4,1) és 174 nem-asthmás kontroll (95 fiú, 79 leány; 3-18 év átl.: 11,5 év, SD3,9). Az

asthmás

gyermekek

a

Budai

Gyermekkórház

allergológiai

szakrendelésének

gondozottjai. Diagnózisuk felállításának módszerei és elvei megegyeznek 3.1.2.1 fejezetben leírtakkal. A kontrollok is a Budai Gyermekórházban megforduló, infekció mentes, enyhe, gyógyszeres kezelésre nem szoruló, nem-asthmás betegek voltak (enyhe scoliosis, testsúly probléma, stb.). A lokális szerekre szoruló szénanátha itt nem volt kizáró ok. A betegek jellemzoit az 18. táblázat mutatja.

3.5.2.2 Genotipizálás A DNS-t Miller- féle kisózással nyertük fehérvérsejtekbol (51). Az MBL polimorfizmust PCR-RFLP módszerrel mutattuk ki Ten és munkatársai leírása alapján (101). Az MBL gén 1. exonjának a 119 bp hosszúságú, az 52, 54 és 57-es kodont tartalmazó szakaszát amplifikáltuk PCR-rel. Primer pár: 5’- CAT CAA CGG CTT CCC AGG CAA AGA CGC G-3’ és 5’- CAG GCAGTT TCC TCT GGA AGG-3’. A PCR-t 70 µg reakciós elegyben Biometra TRIOThermoblock-ban végeztük. A PCR reakció 95 Celsius fokon 4 percig; 35 cikluson keresztül 95 Celsius fokon 30 másodpercig, 63 Celsius fokon 1 percig és 72 Celsius fokon 30 másodpercig, majd végül 72 Celsius fokon 5 percig tartott. A PCR terméket Ban I, Mbo II és Mlu I (New England Biolabs) restrikciós enzimekkel emésztettük. A szeparálás 4%-os agaróz gélen történt, a festék ethidium bromid volt. Ha az 52-es kodonban mutáció volt (D allél), a Mlu I enzim a 119 bp hosszúságú szakaszt 95+ 24 bp szakaszra hasította, normál vad típus (A/A allél) esetén nem jött létre a hasítás (119 bp). Ha az 54-es kodonban volt a mutáció (B allél), akkor a Ban I restrikciós enzim nem tudott hasítani (119bp), itt csak vad típus esetén hasított 84+ 35 bp szakaszokra. Az 57es kodon mutációja (C allél) esetén a Mbo II enzim 79+ 40 bp fragmentekre hasít, míg vad típus esetén nem történik meg a hasítás (119 bp). (19. táblázat) Az A allél a vad típus jele, míg a 3 mutáns közül bármelyik jelenlétét 0 allélnak nevezzük.

81

18. Táblázat Az asthmás betegek jellemzoi Klinikai és biológiai jellemzok

Asthma bronchiale-s betegek 139 10,1 + 4,1 79/60 79,1 55,1

Szám Életkor (3-18 év) Fiú/leány Allergia (%) C. pneumoniae pozitív (%) Asthma súlyosság Intermittáló (%) Szezonális enyhe perzisztáló (%) Enyhe perzisztáló (%) Mérsékelt perzisztáló (%) Súlyos perzisztáló (%)

25,9 12,9 46,1 15,1 0,0

Lábjegyet: Az asthma súlyossági lépcsok GINA ajánlása (1) NHBLI/WHO Workshop Report 1995. Global strategy for ashma management and prevention. National Institute of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute, Bethesda MD. Publication No. 95-3659. és Nagy A. gyermekkorra ajánlott módosítása szerint. (72) Szalai C, Kozma GT, Nagy A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polimorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol 2001; 108: 375-381

82

19. Táblázat Az MBL mutációk kimutatásához használt restrikciós enzimek hatására kialakuló fragmentumok hossza Mutáns allél neve

Mutáns kodon

Restrikciós enzim neve

D allél B allél C allél

52. 54. 57.

Mlu I Ban I Mbo II

Lábjegyzet: bp: bázispár

83

A/A (vad) allélok esetén a fragmentumok hossza (bp) 119 84 + 35 119

Mutáció estén a fragmentumok hossza (bp) 95 + 24 119 79 + 40

3.5.2.3 Chlamydia pneumoniae fertozés kimutatása A CPI kimutatása megegyezik a 3.3.2.3.1 fejezetben leírtakkal.

3.5.2.4 Statisztikai módszerek Az allélfrekvenciát a 3.1.2.4 fejezetben leírt képlettel számoltuk ki. Az adatokat a MedCalc 5.0, az SPSS 11.0 és az Arlequin 1.1 programokkal vizsgáltuk. A Hardy- Weinberg equilibriumot chi- négyzet goodness-of fit teszttel határoztuk meg. A csoportok közötti allél eloszlást Chi- négyzet próbával határoztuk meg. A konfidencia interva llum 95% volt. P értéket 0,05 alatt tartottuk szignifikánsnak. Néhány esetben logisztikus regressziót alkalmaztunk. A CPI életkorral való szeroprevalenciájának növekedése és az asthmások között és CPI-ben is jellemzo enyhe fiú túlsúly miatt korra és nemre adjusztáltuk az adatokat.

3.5.3 Eredmények

1. A 20. táblázat a C. pneumoniae-specifikus IgA, IgG és IgM pozitív gyermekek számát és százalékát mutatja a két csoportban. Nem volt szignifikáns különbség egyik C. pneumoniae-specifikus antitest pozitivitásban sem az asthmás és a kontroll csoport között. 2. Az IgA+ IgG pozitív esetek, amelyek a krónikus CPI-re jellemzoek, sem különböztek szignifikánsan a két csoport között (p: 0,9). 3. Az MBL genotípusokat és azok elofordulását az asthmásokban és a kontrollokban a 21. táblázat tartalmazza. Egyik alléltípus gyakorisága sem különbözött szignifikánsan a vizsgált 2 csoportban. 4. A C pneumoniae pozitívak és C. pneumoniae negatívak között sem volt szignifikáns különbség egyik allélvariáció esetén sem. A 0 allél frekvenciája C. pneumoniae-specifikus IgG pozitívak között: 29,6%, IgG negatívak között: 23,8% (p:0,1); IgA pozitívaknál: 28,3%, IgA negatívaknál: 25,0% (p: 0,50); IgM pozitívak között: 28,7%, IgM negatívak között: 26,0% (p: 0,60). Az allél eloszlás Hardy-Weinberg Equilibriumban volt. 5. Az MBL variáns alléljainak asthmára való hajlamban feltételezett szerepének vizsgálatára CPI esetén, a gyermekeket MBL allél szerint és CPI státuszuk sze rint csoportosítottuk és így hasonlítottuk össze a beteg és kontroll csoportot (22.A,B táblázat).

84

20. Táblázat Chlamydia pneumoniae-specifikus antitest pozitivitások száma és százaléka asthmás és kontroll gyermekekben

IgA

Esetek (n) Chlamydia pneumoniae pozitív n (%)

Asthma bronchiale IgG IgM

137

135

138

IgA + IgG 134

43 (31,4)

59 (43,7)

28 (20,3)

27 (20,1)

IgA

Kontroll IgG IgM

174

173

174

173

56 (32,2)

82 (47,4)

43 (24,7)

37 (21,3)

IgA+ IgG

IgA

p* IgG IgM

1,0

0,6

Lábjegyzet: A 139 asthmás betegbol néhánynak, a 174 kontroll gyermekbol egynek hiányzott 1-1 specifikus antitest lelete, ezért változóak az esetszámok. * asthmás vs. kontroll esetek: p értéket chi-négyzet próbával számoltuk.

85

0,4

IgA + Ig G

0,9

21. Táblázat MBL allélvariánsok elofordulása és allélfrekvenciái asthmásokban és kontrollokban MBL genotípus* A/A A/B A/C A/D B/B B/C B/D C/C C/D D/D Összesen B allél frekvencia C allél frekvencia D allél frekvencia 0 allél frekvencia

asthmás 70 37 5 19 2 2 3 1 0 0 139 16,5% 3,2% 7,9% 27,7%

kontroll 91 39 8 18 2 2 5 0 0 0 165 15,2% 3,0% 7,0% 25,2%

*A a normal MBL allél; B: 54-es kodon variáns; C: 57-es kodon variáns; D: 52-es kodon variáns. 0 a variáns allél általános jelölése (B+C+D) A variáns allél (0) frekvenciájában nem volt szignifikáns különbség a két csoport között: P: 0.7; OR (95%CI): 1.14 (95%CI 0.79-1.64) (? 2 teszt)

86

22. A Táblázat Logisztikus regressziós analízis a különbözo C. pneumoniae-specifikus antitestek és az asthma közötti kapcsolatra MBL genotípusok szerint C.pneumoniae státusz

Homozigóták a normál (A/A) MBL allélre IgG Pozitív IgG Negatív Heterozigóták és homozigóták a variáns (A/0 és 0/0 ) MBL allélekre IgG Pozitív IgG Negatív Homozigóták a normál (A/A) MBL allélre IgA Pozitív IgA Negatív Heterozigóták és homozigóták a variáns (A/0 és 0/0 ) MBL allélekre IgA Pozitív IgA Negatív Homozigóták a normál (A/A) MBL allélre IgM Pozitív IgM Negatív Heterozigóták és homozigóták a variáns (A/0 és 0/0 ) MBL allélekre IgM Pozitív IgM Negatív

Asthmás n (%)

Kontrol n (%)

Odds Ratio (95% CI)

18 (27,7) 44 (49,4) 47 (72,3) 45 (50,6)

0,39 (0,20-0,78)

44 (63,7) 29 (40,3) 25 (36,2) 43 (59,7)

2,61 (1,32-5,15)

P

Adjusztálva* Odds Ratio (95% CI)

P*

0,007

0,33 (0,16-0,68)

0,003

0,008

2,21 (1,10-4,41)

0,02

13 (20,0) 52 (80,0)

33 (35,5) 60 (64,5)

0,45 (0,22-0,95)

0,05

0,46 (0,21-1,08)

0,06

27 (39,1) 42 (60,9)

17 (25,4) 50 (74,6)

1,90 (0,91-3,93)

0,1

2,04 (0,95-4,18)

0,06

10 (15,2) 56 (84,8)

24 (26,7) 66 (73,3)

0,49 (0,22-1,11)

0,1

0,51 (0,22-1,18)

0,16

18 (26,1) 51 (73,9)

16 (22,2) 56 (77,8)

1,23 (0,57-2,68)

0,7

1,12 (0,56-2,75)

0,58

Lábjegyzet: *Adjusztálva korra és nemre

87

22. B Táblázat Logisztikus regressziós analízis a különbözo C. pneumoniae-specifikus antitestek és az asthma közötti kapcsolatra MBL genotípusok szerint C.pneumoniae státusz

Homozigóták a normál (A/A) MBL allélre IgA+IgG Pozitív IgA+IgG Negatív Heterozigóták és homozigóták a variáns (A/0 és 0/0 ) MBL allélekre IgA+IgG Pozitív IgA+IgG Negatív

Asthmás n (%)

Kontrol n (%)

Odds Ratio (95% CI)

9 (13,8) 26 (29,2) 56 (86,2) 63 (70,8)

0,39 (0,17-0,90)

17 (24,6) 9 (12,7) 52 (75,4) 62 (87,3)

2,25 (0,93-5,47)

Lábjegyzet: *Adjusztálva korra és nemre

88

P

Adjusztálva* Odds Ratio (95% CI)

P*

0,04

0,45 (0,22-1,05)

0,06

0,1

2,18 (0,96-5,34)

0,07

Azon asthmások között, akik hetero- és homozigóta formában hordozták valamelyik MBL variáns allélt (A/0, 0/0), szignifikánsan több betegnek volt C. pneumoniae-specifikus IgG pozitivitása, mint a kontrolloknak ugyanilyen allél- hordozás esetén (asthmában 63,7% vs. kontrollban 40,3%, p:0,008 OR (95% CI) :2,61 (1,32-5,15). Az eredmény a korra és nemre történt adjusztálás után is szignifikáns maradt (p: 0,02, OR (95% CI): 2,21 (1,10-4,41). Tehát a C. pneumoniae-specifikus IgG csak akkor függ össze az asthmával, ha az asthmás beteg valamelyik MBL allél variánst (0 allél) hordozza.

A normál vad típust (A/A) hordozó asthmások szignifikánsan kevesebbszer voltak Chlamydia pneumoniae-specifikus IgG-re pozitívak, mint a kontrollok, korra és nemre történt adjusztálást követoen is (27,7% vs 49,4% p:0,003; OR (95% CI): 0,33 (0,16-0,68)). Ez az eredmény a normál A/A allél asthma kialakulása elleni védo szerepét jelzi a C. pneumoniae-specifikus IgG-re pozitív gyermekekben. Tehát a normál allélt hordozó asthmások védettebbek, a kóros allélt hordozó asthmások védtelenebbek a CPI ellen. IgA és IgM-re vizsgálva nem találtunk szignifikáns különbséget ugyanilyen összehasonlítás esetén. Bár specifikus IgA pozitivitásra vonatkozó összehasonlítás esetén a szignifikánshoz közeli különbséget mértünk. P: 0,05, adjusztálás után p: 0,06. Az IgA+ IgG pozitivitás kombinációja esetén sem kaptunk szignifikáns eltérést az A/A genotípust hordozó asthmások és kontrollok között. 6. Az MBL genotípus asthma hajlamban való szerepének további vizsgálata céljából az egyes C. pneumoniae-specifikus antitest pozitivitások esetén hasonlítottuk össze asthmásokban és kontrollokban különbözo allél variációkat. (23. Táblázat) Minden feltüntetett (IgA pozitív, IgG pozitív és IgA+ IgG pozitív) esetben az asthmások között több volt a variáns allélt hordozók száma, mint a normál A/A allélt hordozók száma. Szignifikánsan több volt mind az IgA pozitív, IgG pozitív és IgA+ IgG pozitív esetekben az asthmások között a variáns allélt hordozók száma, mint a kontrollokban. A legmagasabb Odds ratio-t abban az összehasonlításban mértük, ahol a krónikus CPI-re jellemzo C. pneumoniae-specifikus IgA+ IgG pozitivitás esetén vetettük össze az asthmások és a kontrollok közötti mutáns allél elofordulását (OR (95% CI): 5,38 (1,75-14,36); p: 0,01). A friss fertozésre jellemzo C. pneumoniae-specifikus IgM pozitivitás esetén nem volt ilyen különbség.

89

23. Táblázat Logisztikus regressziós analízis a különbözo MBL genotípusok elofordulása és az asthma közötti kapcsolatra C. pneumoniae-specifikus antitest pozitivitások szerint

C Beteg vagy pneumoniae kontroll státusz

IgA pozitív

IgG pozitív

IgM pozitív

IgG+IgA pozitív

Asthmások (%) Kontrollok (%) Asthmások (%) Kontrollok (%) Asthmások (%) Kontrollok (%) Asthmások (%) Kontrollok (%)

MBL genotípus

A/0+0/0

A/A

27 (20,1) 17 (10,6) 44 (32,8) 29 (18,0) 18 (13,3) 16 (9,9) 17 (12,7) 9 (5,6)

13 (9,7) 33 (20,6) 18 (13,4) 44 (27,3) 10 (7,4) 24 (14,8) 9 (6,7) 26 (16,3)

Adjusztálás nélkül

Adjusztálva korra és nemre OR P (95% CI)

OR (95% CI)

P

4,03 (1,71-9,75)

0,003

3,95 0,005 (1,52-8,78)

3,71 (1,80-7,63)

0,001

3,55 0,005 (1,62-6,93)

2,70 (0,99-7,33)

0,09

2,41 (0,91-6,88)

0,1

5,38 (1,7514,36)

0,01

5,46 0,005 (1,80-16,52)

Esetek száma: n és százaléka: (%).

90

Eredményeink szerint az MBL allél variánst hordozó gyermekek krónikus CPI-ja esetén (C. pneumoniae-specifikus IgA és/vagy IgG pozitívak) hajlamosabbak az asthma bronchiale kialakulására, mint azok a CPI-s gyermekek, akik normál A/A MBL genotípussal rendelkeznek. A közlemények többsége a krónikus CPI asthma exacerbációját okozó hatását igazolták (77,102,86). Eredményeink pedig a krónikus CPI-nek az asthma kialakulásában játszott kofaktor szerepét bizonyították. A 139 asthmás beteg közül 36-nak (25,9%) volt intermittáló, 18-nak (12,9%) volt szezonális enyhe perzisztáló, 64-nek (46,1%) enyhe perzisztáló és 21-nek (15,1%) mérsékelt perzisztáló asthmája, súlyos perzisztáló asthmás nem volt közöttük (1,2) (18. Táblázat).

7. A krónikus CPI asthma súlyosságára gyakorolt hatásának vizsgálata céljából a C. pneumoniae-specifikus IgA+IgG pozitivitást hasonlítottuk össze az intermittáló és a mérsékelt perzisztáló asthmás csoportban. Az 54 intermittáló asthmás közül 12 (22,2%) volt IgA+IgG pozitív, míg a 21 mérsékelt perzisztáló asthmásból 5 (23,8%). A különbség nem szignifikáns (p: 0,9). Akkor sem kaptunk szignifikáns különbséget, ha az MBL allélvarációt is bevontuk az összehasonlításba. A C. pneumoniae-specifikus IgA+IgG pozitivitást és valamelyik MBL variánst egyszerre hordozó intermittáló asthmások 6/54; 11,1% és mérsékelt perzisztáló asthmások 2/21; 9,5% paraméterei között sem volt szignifikáns különbség ( p: 0,8). Tehát a krónikus CPI-nak nincs hatása az asztma súlyossági fokának alakulására akkor sem, ha azt az MBL polimorfizmus hordozással is kiegészítettük.

3.5.4 Megbeszélés

Az eredményeink igazolták a kapcsolatot a CPI és az asthma bronchiale között.

Direkt kapcsolatot mi sem tudtunk kimutatni a CPI és az asthma között, hiszen az asthmások is és a kontrollok is hasonló arányban szenvedtek el CPI-t. A különbség akkor vált

szignifikánssá,

amikor

az

MBL

allélvariánsok

szerepét

is

bevontuk

az

összehasonlításba.

Az MBL variáns allélt hordozó és egyben krónikus CPI-re utaló szerológiai lelettel bíró gyermekek hajlamosak az asthma manifesztálódására. E két rizikó tényezo együttes 91

jelenléte csak hajlamosít az asthmára, nem vezet obligát módon az asthma kialakulásához, mert voltak kisebb számban a kontrollok között is MBL mutációt hordozó és ugyanakkor krónikus CPI-ben szenvedo gyermekek is, akik nem voltak asthmások. (Egyelore?) Nem kizárt, hogy egy harmadik rizikó tényezo szimultán jelenléte már obligáttá teheti az asthma kialakulását. Az eddig ismert, közel 500 allergiára, asthmára hajlamosító gén esetében ez nagyon valószínu. Más genetikai és környezeti tényezok kölcsönhatása is ugyanerre az eredményre vezethet.

Természetesen az MBL deficiencia és az asthma közötti kapcsolat iránya ellenkezo is lehet. Azok az asthmás gyermekek, akik MBL polimorfizmust hordoznak, hajlamosabbak krónikus CPI-re, amely rontja az asthma tüneteit. Tekintettel arra, hogy a krónikus CPI nem hat az asthma súlyosságára, akkor sem, ha az MBL 0 allél hordozással kigészítve vizsgáltuk, e szerint, ez utóbbi hypotézis nem teljesen állja meg a helyét. Prospektív tanulmányra lenne szükség ennek a genotípus-környezeti tényezo kölcsönhatásnak az asthmára gyakorolt hatásának vizsgálatára.

Az MBL deficienciának szerepe van a CPI-ben, hiszen a C. pneumoniae hordoz a felszínén MBL megkötésére alkalmas cukor molekulát. In vitro kimutatták, hogy az MBL a célsejt egy rokon Chlamydia, a Chlamydia trachomatis felvételét gátolni képes (101). Az MBL- nek a CPI elleni direkt védo hatását mi nem tapasztaltuk, hiszen az asthmásokat és kontrollokat közel egyenlo arányban fertozte a C. pneumoniae. Azonban a krónikus CPIsok között a normál A/A allél szignifikáns védo hatást mutatott az asthma kialakulása ellen, feltehetoleg a kello mennyiségu és ép funkciójú MBL-nak köszönhetoen. Érdekes, hogy az MBL nincs jelen a normál, infekciómentes tüdoben (42, 103). Noha a normál tüdoben nincs MBL, amely magyarázza a CPI elleni védettség hiányát, állatkísérletben influenza vírussal való fertozés után 3 nappal már megjelenik a tüdoben (103). Sot cystás fibrózisban is van a tüdoben MBL, ahol több légúti kórokozó perzisztálása jellemzo. Az A/A normál MBL genotípusú egyénnek 10x több MBL-je van, mint a variáns allélt hordozóknak. A homozigóta mutánsok esetén nincs kimutatható MBL (39). Pontosan nem ismerjük azt a mechanizmust, amely infekció hatására a májban termelodo MBL-t a tüdobe irányítja. Valószínuleg nem is direkt véd az infekciótól, hanem a fertozés súlyosságát modulálja. 92

Ép MBL genotípus és a tüdoben megjeleno, kello mennyiségu MBL hatásosan vesz részt a C. pneumoniae opszonizációjában és killingjében. Szerepe van a CPI lezajlásának ütemére. Gyenge MBL funkció következtében perzisztálhat a CPI. Tehát nem direkt véd, hanem modulálja fertozés lezajlását, súlyosságát. Ezt valószínusítik azok a kísérletek is, melyek az MBL citokin válaszra gyakorolt hatását igazolják (104). Továbbá az MBL deficiencia szerepét igazolták in vivo különbözo krónikus gyulladásos kórképben is, például systemás lupus erythematosusban, rheumatoid arthritisben, és atherosclerosisban

(105,106,47).

Coronaria

artériás

betegségben

(CAD)

a

CPI

progresszióját az MBL deficiencia modulálja (47). A mi eredményeinkhez hasonlóan csak azoknak a betegeknek volt szignifikánsan nagyobb rizikójuk a CAD kialakulására, akik C. pneumoniae-specifikus IgG pozitívak voltak és legalább egy MBL mutáns allélt is hordoztak. Az asthma bronchiale is egy krónikus gyulladásos kórkép, feltételezhetjük, hogy az MBL deficienciának direkt vagy indirekt módon szerepe van a krónikus asthmás gyulladás kialakulásában vagy fenntartásában. Kísérletünk során nem találtunk az akut CPI-s (IgM pozitív) betegek estén összefüggést az asthma és az MBL deficienciát okozó MBL allél variánsok között. Azonban a krónikus vagy korábban lezajlott CPI-t többször hozták már összefüggésbe az asthmával vagy a wheezing- gel (77, 102, 86, 107). A klinikai gyakorlatban is fontos, hogy a beteg ne jusson el a krónikus CPI fázisába. Törekednünk kell arra, hogy még az akut CPI idoszakában keze ljük makrolid antibiotikummal a beteget, hogy a krónikus infekció kialakulását megelozhessük, amely már - kóros MBL allél esetén - asthma kialakulásához vezethet. A gyakorlatban MBL allél variáns vizsgálatok ma még nem elérhetoek a napi rutin számára, bízunk benne, hogy a jövoben néhány, az asthma bronchiale kialakulására hajlamosító gén vizsgálatára lesz lehetoség a betegek jobb gondozása érdekében. Eredményeink megerosítik a CPI és az asthma bronchiale között sokak által vizsgált kapcsolat fennállását. A szerológiai vizsgálatokkal a nemzetközi szakirodalomban kimutatott ellentmondó szignifikáns és nem szignifikáns összefüggések oka lehet, hogy nem kombinálták genetikai rizikótényezokkel a szerológiai pozitivitást. Eredményeink szerint a C. pneumoniae-specifikus IgG pozitív gyermekek, akik legalább egy kóros MBL allélt is hordoznak, hajlamosabbak asthmára mint a C. pneumoniaespecifikus IgG negatívak. Valamint a krónikus CPI-ben ( IgA+ IgG pozitívak) szenvedok

93

mutáns MBL variánssal hajlamosabbak az asthmára, mint a krónikus CPI-ben szenvedok normál MBL genotípus esetén. Eredményeinkben tetten érheto a multifaktoriális eredetu asthma bronchiale kialakulásában szerepet játszó genetikai és környezeti tényezok együttes hatása. Eredményeink összecsengenek néhány korábbi közlemény tapasztalataival, amelyekben a veleszületett immunitásban fontos gének és variációjuk szerepét hangsúlyozzák (108,109). Ezeknek a génvariánsoknak önálló hatásai gyengék vagy nem is elegendoek ahhoz, hogy konkrét betegséget okozzanak, de fenotípusbeli különbségeket kiválthatnak, ha gén-gén vagy gén-környezeti tényezo kölcsönhatásokban vesznék részt. Eredményeink szerint a CPI gyógyulása eltéro a normál vad MBL alléleket hordozók és a variáns allélt hordozók között. Ez a megfigyelés egy újabb példája az u.n. nem-lineáris génkörnyezet kölcsönhatásnak. Elsoként közöltük, hogy két rizikótényezo; az MBL polimorfizmus és a krónikus légúti CPI együttes jelenléte hajlamosít asthmára gyermekekben (93, 110). A biológiai paraméterek kis száma további megfigyeléseket és prospektív tanulmányokat tesz szükségessé. Vizsgálatunk

klinikai

konzekvenciája,

hogy

az

asthma

bronchiale

differenciál-

diagnosztikájában kiemelt szerepet kell, hogy kapjon a CPI kimutatása és annak korai, lehetoleg az akut szakban megkezdett célzott antibiotikus terápiája a krónikus CPI megelozése és az asthma manifesztációjának gátlása céljából különösen a genetikai rizikó csoportba tartozók között.

Megjegyzés: A közelmúlt SARS (severe acute respiratory syndrome) járványa (2003.) is aktuálissá teszi vizsgálati eredményeinket. Kínai kutatók 7 SARS-ban elhunyt beteg tüdejébol mutatták ki a C. pneumoniae egyideju jelenlétét. Bár a coronavírus volt a fo kórokozó, a C. pneumoniaeval való társfertozés szerepet játszhatott a betegség drámai lefolyásában (111). Eredményeink alapján e mechanizmusban akár MBL deficiencia is szerepet játszhatott. A coronavírussal fertozöttek genotípizálása MBL mutációra tisztázhatja a C. pneumoniae társfertozés szerepét e fatális betegségben. Súlyos lefolyású, többszörös fertozés esetén, ahol az egyik kórokozó a C. pneumoniae, az immunológiai kivizsgálási protokollba célszeru lenne az MBL deficienciát okozó MBL polimorfizmus vizsgálatot is felvenni.

94

4. KONKLÚZIÓ A bevezetoben feltett kérdésekre az alábbi válaszokat kaptunk. 4.1 Az immunrendszer egyes tagjainak (kemokin rendszer, komplement rendszer) genetikai polimorfizmusa, mutációja milyen szerepet játszik az asthma bronchiale kialakulásában? A CCR5? 32 mutáció nincs hatással az asthma kialakulására. A RANTES valószínuleg más receptoron fejti ki ebben az esetben a hatását. Az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus asthmára hajlamosító tényezo, a G allélek száma összefügg az asthma súlyosságával és az eosinophil sejtszámmal. A komplement rendszer egyik szolubilis elemének, az MBL-nek az 1. exonjának mutációja hatással van a CPI elhúzódó gyógyulására, annak perzisztálására. A krónikus CPI során lokálisan felszaporodó citokinek és kemokinek (pl. MCP-1) szerepet játszhatnak az asthma kialakulásában. (Lokális mérésre nem volt lehetoségünk). 4.2

Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza az asthma kialakulásának esélyét?

Igen. Az általunk vizsgált ak közül a MCP-1-2518A/G, valamint az MBL mutáció+ egyideju CPI. 4.3

Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza a CPI kialkulásának esélyét?

Ilyen eltérést nem tudtunk bizonyítani. 4.4

Gyakoribb-e a CPI az asthmás gyermekek között, mint azoknál, akik nem

asthmások? Nem. Mindkét csoportban 40% fölötti a CPI, köztük nincs szignifikáns különbség. 4.5

Fogékonyabbak -e az asthmás gyermekek a CPI-ra, mint egészséges társaik?

Nem. 4.6

A CPI szerepelhet-e trigger faktorként az asthma bronchiale kialakulásában, az

arra genetikailag hajlamos gyermekeknél? Igen. Az MBL 1. exon mutáció t hordozó gyermekek CPI fertozése esetén gyakrabban alakul ki asthma, mint azoknál, akik ugyanezt a mutációt hordozzák, de CPI mentesek. 4.7

Van-e kapcsolat az allergia és a CPI között?

Az inhalatív allergénekre allergiás asthmások között mért szignifikánsan gyakoribb krónikus CPI igazolta a kapcsolatot asthma esetén, de szénanátha esetén nem.

95

4.8

Több rizikótényezo (allergia, genetikai eltérések, CPI) együttes hatása fokozza-e az

asthma kialakulásának esélyét? Igen. Ld.4.6. 4.9

Milyen patogenetikai kapcsolat van a CPI és az asthma bronchiale között?

A légúti fertozések asthma exacerbációját okozó hatásán kívül az asthma manifesztálódásában is szerepet játszat a krónikus CPI. A CPI leküzdésének ütemét az MBL gén épsége is befolyásolja. Az allergia és a CPI összefüggés irányának kutatása további vizsgálatokat igényel.

Az asthma bronc hiale bonyolult patomechanizmusában néhány új aspektust tártunk fel. Felhívtuk a figyelmet a kemokin rendszer szerepére és jelentos hatására a gyulladás kialakításában. Genetikai vizsgálatokkal támasztottuk alá a kemokin rendszer két tagjának mutáció, vagy polimorfizmus okozta expresszió-változásának hatását az asthma bronchiale fenotípusára. Kimutattuk, hogy már gyermekkorban is gyakori a Chlamydia pneumoniae okozta légúti fertozés, amelynek szerepe lehet az asthma bronchiale kialakulásában. A CPI és az inhalatív allergénekre pozitív asthma bronchiale-ben szenvedok között bizonyított szignifikáns összefüggés, valamint a CPI és MBL mutáció közös hatásának igazolása az asthma bronchiale kialakítására további új kutatási irányt jelöl ki az infekciók és allergé nek, az infekciók, a komplement rendszer és a genetika kölcsönhatásának feltárására. Eredményeinkkel felhívjuk az asthma bronchiale- val foglalkozó szakorvosok figyelmét az infektológiai és genetikai szurovizsgálat jelentoségére és lehetoségére (15. A, B ábra). A genetikai szurovizsgálattal (MCP-1-2518A/G, MBL mutációk) a rizikócsoport kiemelheto, fokozott figyelemmel kísérheto. Az infektológiai szurovizsgálattal a kiszurt fertozést (CPI) már akut szakban kezelve megelozhetjük a krónikus fertozés kialakulását, amelynek szerepe lehet az asthma bronchilae kialakulásában.

96

15. A ábra Genetikai és környzetei tényezok az asthma bronchiale kialakításában

1. K + CPI ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? K 2. K + CPI ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? BHR? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? K ? Genetika ? ? ? 3. K + CPI ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? BHR? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ABR ? Infekció (CPI)

+

? Genetika (MBL)

+

? Allergének (Inhalatív)

Lábjegyzet: K: egészséges kontroll BHR: bronchialis hyperreaktivitás ABR: Asthma bronchiale A CPI 3 féle kimenetele: 1. Egészséges kontroll CPI esetén vagy tünetmentesen átvészeli a betegséget, vagy 2. Bronchialis hyperreaktivitás tünete jelentkezik, de antibiotikummal gyógyítható, vagy 3. Bronchilais hyperreaktivitás állandósul, asthma bronchiale alakul ki adekvát antibiotikus kezelés ellenére A 3.4 fejezetben a CPI és az inhalatív allergiára pozitív asthma kölcsönhatását A 3.5 fejezetben a CPI és MBL mutáció együttes hatását bizonyítottuk az asthma bronchiale kialakításában

97

15. B ábra Genetikai és környzetei tényezok az asthma bronchiale kialakításában és terápiás lehetoségek gyermekkorban 1. K + CPI ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? K 2. K + CPI ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? BHR? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? K ? Genetika ? ? ?

? MAB ? ?

?? MAB ?? ??

+

IHCS + AE, IT ? ?

3. K + CPI ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? BHR? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ABR ? Infekció (CPI)

+

? Genetika (MBL)

Lábjegyzet: K: egészséges kontroll BHR: bronchialis hyperreaktivitás ABR: Asthma bronchiale MAB: Makrolid antibiotikum IHCS: Inhalatív corticosteroid AE: allergén elimináció és irritánsok eliminációja IT: specifikus immunterápia

98

+

? Allergének (Inhalatív)

5. ÖSSZEFOGLALÁS, TÉZISEK

Munkám célja, hogy hozzájáruljak a gyermekkori asthma bronchiale korszeru diagnosztikájához, differenciáldiagnosztikájához, célzott kezeléséhez és gondozásához. Ezt a Chlamydia pneumoniae fertozés pathogenetikai és differenciál diagnosztikai problémájának bemutatásával, az asthmás betegek genetikai vizsgálatával, klinikai kutatómunka segítségével kívántam elérni. Az új rizikótényezok feltárásával a prevenciós lehetoségek bovülhetnek, a diagnosztika és terápia pontosabbá válik. Eredményeinket az alábbiakban foglalom össze: 1. Megállapítottuk, hogy a CCR5 ? 32 mutáció nem véd az asthma kialakulása ellen. 2. Az MCP-1-2518A/G polimorfizmus hajlamosít asthmára. 3. Az MCP-1 az asthmás gyulladás kialakításában fontos szerepet tölt be. 4. Eredményeink alátámasztják azt a feltételezést, hogy a gyermekkori asthma bronchiale és a krónikus Chlamydia pneumoniae fertozés között van összefüggés. A) Szignifikáns összefüggést találtunk az inhalatív allergénekre pozitív allergiás asthma és a krónikus Chlamydia pneumoniae fertozés között. B) Kimutattuk, hogy az MBL mutáció és a krónikus Chlamydia pneumoniae fertozés együttes elofordulása elosegíti az asthma bronchiale kialakulását. Így az MBL mutációnak prediktív értéke lehet. Eredményeinkben tetten érheto a multifaktoriális asthma bronchiale kialakulásában szerepet játszó genetikai és környezetei tényezok kölcsönhatása. A klinikai gyakorlat számára is hasznosítható eredményeink és következtetéseink alapján az asthmás és/vagy allergiás gyermekek genetikai és infektológiai szurovizsgálatától hosszú távon a betegek életminoségének javulását reméljük.

99

6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönetemet szeretném kifejezni a felsorolt és fel nem sorolt minden munkatársamnak, családomnak, barátaimnak, akik ennek a munkának a megszületését segítették:

Dr Falus András Professzor Úrnak, programvezetomnek a kutatási munka támogatásáért, a közleményeim és a disszertáció megírásához nyújtott értékes tanácsaiért, Dr Szalai Csaba témavezetomnek a genotípizálásban, a kutatási munka minden fázisában, a publikációk írásában, és az értekezés összeállításásban nyújtott segítségéért, Kis Zoltán

Ph.D. hallgató társamnak a statisztikai feldolgozásban nyújtott türelmes

segítségéért, Kozma Gergely

Ph.D. hallgató társamnak az MCP-1 ELISA vizsgálatoknál, a PCR

vizsgálatoknál nyújtott segítségéért, Keszei Márton egyetemi hallgatónak néhány PCR vizsgálatban való részvételéért, Dr Szabó Teréz foorvosnonek, hogy a Heim Pál kórház, általa irányított laboratóriumi osztályán a kutatáshoz szükséges berendezések egy részét rendelkezésre bocsátotta, Dr Budai Irénnek a Chlamydia pneumoniae mikrobiológiájának megértésében nyújtott segítségért és az erre vonatkozó publikációban nyújtott hasznos tanácsaiért, Dr Herpay Máriának, Petrovai Fruzsinának és dr Szojka Gizellának a Chlamydia pneumoniae ELISA vizsgálatainak elvégzéséért és az értékelésben nyújtott segítségükért, Dr Kohidai Lászlónak a kemotaxis témakör feldolgozásában nyújtott segítségéért, Dr Kalmár Ágnes és dr Madarasi Anna kolleganoimnek az értekezés gondos javításában nyújtott segítségükért, Dr Schuler Ágnesnek a sok szempontú tanácsaiért, A Budai Gyermekkórház korábbi és jelenlegi Vezetoségének, Péter Ferenc Professzor Úrnak és Blatniczky László Foigazgató Foorvos Urnak, hogy szakmai ambícióimat mindig is támogatták, a Ph.D. kutatásokhoz tartozó bizonyos laboratóriumi vizsgálatok lehetoségét biztosították, Dr Újvári Anna által vezetett laboratórium és dr Szécsényi-Nagy István által vezetett radiológiai osztályok munkatársainak a számtalan vizsgálat elvégzésében, értékelésében nyújtott hasznos segítségükért, dr Lellei István által vezetett gégészeti osztály munkatársainak a rendszeres, szoros együttmuködésért,

100

Kollegáimnak, akik a mintagyujtésben, és a betegek ellátásában nyújtott helyettesítésben voltak segítségemre, Dombi Mariannak, asszisztensnomnek a fáradhatatlan, kitartó, lelkiismeretes munkájáért, Fonovérünknek Pész Andrásnénak és Holkáné Nemes Katalin, Fábián Magdolna, Skalka Erzsébet,

Hatvani

Izabella,

Tuzné

Beránszky

Hajnalka,

Briczky

Krisztina

asszisztenseinknek és a többi munkatársaimnak a vérvételek során és vérminták gyujtésében nyújtott segítségükért, Pálmainé Fábián Klárának az elkallódott leletek felkutatásában nyújtott segítségéért, Kobolákné Zábó Bea asszisztensnek a Prick borpróbák kivitelezéséért, Demeter Judit és Varga Zita könyvtárosoknak az irodalomgyujtésben nyújtott segítségükért. Végül nem utolsó sorban családomnak, barátaimnak. A Ph.D. tandíj fedezésében, bizonyos költséges reagensek vásárlásában, a témámhoz kapcsolódó magyar és külföldi kongresszusi részvételem költségeinek fedezésében köszönöm a MAKIT és az alábbi cégek támogatását: AstraZeneca, Schering-Plough, UCB, Frank Diagnosztika, Richter, MSD, Biogal-TEVA, AWD, gsk.

101

7. REFERENCIÁK 7.1 Az értekezésben idézett publikációk 1. Global Strategy for Asthma Management and Prevention, NHLB/WHO. Workshop report: Global Initiative for Asthma. National Institute of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, Pub. No:95-3659, Bethesda, MD. 1995, 2002. 2. Global Strategy for Asthma Management and Prevention, updated April, 2002. Scientific information and recommendation for asthma program. NIH Publication No. 02-3659 3. Endre László. Az asthma bronchiale epidemiológiája. Cserháti Endre, Gyurkovits Kálmán, Nagy Béla (szerk.). Gyermekkori légzoszervi megbetegedések. Medicina 2003. p: 240-41 4. Tulassay Tivadar (szerk.): Gyermekgyógyászati útmutató. Diagnosztikus és terápiás ajánlások gyermekgyógyászati kórképekhez és tünetekhez. Mediton 2003. 5. Szalai Csaba, Kozma Gergely Tibor, Nagy Adrienne, Bojszkó Ágnes, Falus András Az allergiás megbetegedések genomikai megközelítése; lehetoségek és távlatok Orv Hetil 2002; 143 évf. 8. sz.: 381-390 6. Cookson W. A new gene for asthma: would you ADAM and EVE it? Trends Genet 2003; 19 (4): 169-172 7. Johansson SGO, O’B Hourihane J, Bousquet J, Bruijnzeel-Koomen C, Dreborg S, Haahtela T, Kowalski ML, Mygind N, Ring J, van Cauwenberge M, Wüthrich B. A revised nomenclature for allergy. An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy 2001; 56: 813-824 8. Kohidai László, Dérfalvi Beáta. Egy újonnan felfedezett molekulacsalád. A kemokinek. Lege Artis Medicinae 2000; 10(9): 666-678 9. Luster AD. Chemokines – Chemotactic cytokines that mediate inflammation. New Engl J Med 1998; 338: 436-45 10. Campbell EM, Charo IF, Kunkel SL, Strieter RM, Boring L, Gosling J, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 mediates cockroach allergen-induced bronchial hyperreactivity in normal but not CCR2 -/- mice: The role of mast cells. J Immunol 1999; 163: 2160-67 11. Gonzalo JA, Lloyd CM, Wen D, Albar JP, Wells TN, Proudfooot A, et al. The coordinated action of CC chemokines in the lung orchestrates allergic inflammation and airway hyperresponsiveness. J Exp Med 1998; 188: 157-67 12. Sousa AR, Lane SJ, Nakhosteen JA,Yoshimura T, Lee TH, Poston RN. Increased expressio n of monocyte chemotactic protein-1 in bronchial tissue from asthmatic subjects. Am J Respir Cell Mol Biol 1994; 10: 142-7 13. Karpus WJ, Kennedy KJ. MIP-1alpha and MCP-1 differentially regulate acute and relapsing autoimmune encephalomyelitis as well as Th1/Th2 lymphocyte differentiation. J Leukoc Biol 1997; 62: 681-687 14. Gangur V, Oppenheim JJ. Are chemokines essential or secondary participants in allergic responses? Ann Allerg Asthma Imm 2000; 84: 569-81 15. Homey B, Zlotnik A. Chemokines in allergy. Curr Opin Immunol 1999; 11: 626-34 16. Baggiolini M, Dahinden CA. CC chemokines in allergic inflammation. Immunol Today 1994; 15: 127-33 17. Grayston JT, Cambell LA, Kuo CC et al. A new respiratory tract pathogen Chlamydia pneumoniae strain (TWAR). J Infect Dis 1990; 161: 618-25 18. Leichtner Tamás: Rejtélyes Chlamydiasis; Praxis, 1996. 5. évf. 2. szám. 34-41 19. Budai I, Nagy A, Boriszova D, Rozgonyi F. The prevalence of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae antibodies in Hungarian children with symptoms of atypical pneumonia. The Pediatric Infection Disease Journal 2003 (közlés alatt)

102

20. Gero Anna, Marton Anna: Chlamydia pneumoniae fertozés gyermekekben; Kórház 1997. IV. évf. 9. szám 18-20 21. Szalka András, Mészner Zsófia: Infektológia Springer Kiadó Kft. 2000. 138-144 22. Nagy Adrienne, Budai Irén, Madarasi Anna. Gyermekkori elhúzódó köhögés és az atípusos kórokozók. Praxis 2002. 11 évf. 3. sz. 43-49 23. Zhong G, Liu L, Fan T, Fan P, Ji H. Degradation of transcription factor RFX5 during the inhibition of both constitutive and interferon gamma-inducible major histocompability complex class I expression in Chlamydia- infected cells. J Exp Med 2000; 191: 1525-34 24. Zhong G, Fan T, Liu L. Chlamydia inhibits interferon gamma- inducible major histocompatibility complex class II expression by degradation of upstream stimulatory factor 1. J Exp Med 1999; 189: 1931-8 25. Caspal-Bauguil S, Puissant B, Nazzal D, Lefevre JC, Thomsen M, Salvayre R, Benoist H. Chlamydia pneumoniae induces interleukin-10 production that down-regulates major histocompability complex class I expression. J Infect Dis 2000; 182 (5): 1394-1401 26. Molestina RE, Miller RD, Ramirez JA, Summersgill JT. Infection of human endothelial cells with Chlamydia pneumoniae stimulates transendothelial migration of neutrophils and monocytes. Infect Immun 1999;67 (3): 1323-30 27. Molestina RE, Miller RD, Lentsch AB, Ramirez JA, Summersgill JT. Requirement for NF-kappaB in transcriptional activation of monocyte chemotactic protein 1 by Chlamydia pneumoniae in human endothelial cells. Infect Immun 2000; 68: 4282-8 28. Coombes BK, Mahony JB. Chlamydia pneumoniae infection of human endothelial cells induces proliferation of smooth muscle cells via an endothelial cell-derivated factor(s). Infect Imun 1999; 67 (6): 2909-15 29. Kaukoranta-Tolvanen SS, Ronni T, Leinonen M, Saikku P, Laitinen K. Expression of adhesion molecules on endothelial cells stimulated by Chlamydia pneumoniae. Microb Pathog 1996; 21 (5): 407-11 30. Kol A, Sukhova GK, Lichtman AH, Libby P. Chlamydial heat shock protein 60 localizes in human atheroma and regulates macrophage tumor necrosis-alfa and matrix metalloproteinase expression. Circulation 1998; 98 (4): 300-7 31. Halász Adrien, Cserháti Endre. A tumornecrosis faktor (TNF) rendszer szerepe az asthma bronchiale pathomechanizmusában. Orv Hetil 2002; 143: 553-7 32. Gergely János, Erdei Anna. Immunbiológia. Medicina 1998. p: 53-57 33. Jack DL, Klein NJ, Turner MW. Mannose-binding le ctin: targeting the microbal world for complement attack and opsonophagocytosis. Immunological Reviews 2001; 108: 86-99 34. Turner MW. Mannose-binding lectin: the pluripotent molecule of the innate immune system. Immunol Today 1996; 17: 532-540 35. Sastry K et al. The human mannose-binding protein gene. Exon structure reveals its evolutionary relationship to a human pulmonary surfactant gene and localization to chromosome 10. J Exp Med 1989; 170: 1175-89 36. Taylor ME, Brickell PM, Craig RK, Summerfield JA. Structure and evolutionary origin of the gene encoding a human serum mannose-binding protein. Biochem 1989; 262: 763-71 37. Sumiya M et al. Molecular basis of opsonic defect in immunodeficient children. Lancet 1991; 337: 1569-70 38. Madsen HO, Garred P, Kurzhals JAL, Lamm LU, Ryder LP, Thiel S, et al. A new frequent allele is the missing link in the srtuctural polymorphism of the human mannosebinding protein. Immunogenetics 1994; 40: 37-44 39. Garred P, Pressler T, Madsen HO, Frederiksen B, Svejgaard A, Hoiby N, Schwarz M, Koch C. Association of mannose-binding lectin gene heterogeneity with severity of lung disease and survival in cystic fibrosis. J Clin Invest 1999;104: 431-7

103

40. Madsen HO, Garred P, Thiel S, Kurtzhals JA, Lamm LU, Ryder LP, Svejgaard A. Interplay between promoter and structural variants control basal serum level of mannanbinding protein. J Immunol 1995; 155: 3013-3020 41. Guo N, Mogues T, Weremowicz S, Morton CC, Sastry KN. The human ortholog of rhesus mannose-binding protein-A gene is an expressed pseudogene that localizes to chromosome 10. Mamm Genome 1998; 9: 246-9 42. Koch A, Melbye M, Sorensen P et al. Acute respiratory tract infection and mannosebinding lectin insufficiency during early childhood. JAMA 2001; 285: 1316-21 43. Garred P, Voss A, Madsen HO, Junker P. Association of mannose-binding lectin gene variation with disease severity and infections in a population-based cohort of systemic lupus erythematosus patients. Genes Immun 2001; 8: 442-50 44. Gradual NA, Homan C, Madsen HO, Svejgaard A, Jurik AG, Gradual HK, Garred P. Mannan binding lectin in rheumatoid arthritis. A longitudinal study. J Rheumatol 1998; 25 (4): 629-35 45. Garred P, Madsen HO, Balslev U, Hofmann B, Pedersen C, Gerstoft J, Sbvejgaard A. Susceptibility to HIV infection and progression of AIDS in relation to variant alleles of mannose-binding lectin. Lancet 1997; 349 (9047): 236-40 46. Schmiegelow K, Gared P, Lausen B, Andreassen B, Petersen BL, Madsen HO. Increased frequency of mannose-binding lectin insufficiency among children with acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100: 3757-60 47. Rugonfalvi-Kiss SZ, Endrész V, Madsen HO, Burián K, Duba J, Prohászka Z, Karádi I, Romics L, Gönczöl É, Füst G, Garred P. Association of Chlamydia pneumoniae with coronary artery disease and its progression is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. Circulation 2002; 106: 1071-76 48. Dean M, Carrington M, Wincler C et al. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of CKR5 structural gene. Science 1996; 273: 185662 49. Hall IP, Wheatley A, Christie G, Mc Dougall C, Hubbard R, Helm PJ. Association of CCR5 delta-32 with reduced risk of asthma. Lancet 1999; 354: 1264-65 50. Mitchell TJ, Walley AJ, Pease JE. Delta 32 mutation of CCR5 gene and association with asthma or atopy. Lancet 2000; 356: 1491-2 51. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988: 16: 1215 52. Del Prete G. Human Th1 and Th2 lymphocytes: their role in the pathophysiology of atopy. Allergy 1992; 47: 450-55 53. Nickel R, Beck LA, Stellato C, Schleimer RP. Chemokines and allergic disease.J Allergy Clin Immunol 1999; 104: 723-42 54. Zhou Y, Kurihara T, Riseck R-P, et al. Impaired macrophag function and enhanced T cell-dependent immune response in mice lacking CCR5, the mouse homologue of the major HIV-1 coreceptor. J Immunol 1998; 160: 4018-25 55. Szalai C, Császár A, Czinner A et al. Chemokine receptor CCR2 and CCR5 polymorphisms in children with insulin dependent diabetes mellitus. Pediatr Res 1999; 46: 82-84 56. Martison JJ, Chapman NH, Rees DC, Liu YT, Clegg JB. Global distribution of the CCR5 gene 32-basepair deletion. Nat Gen 1997; 16: 100-103 57. Szalai C, Czinner A, Császár A, Szabó T, Falus A. Frequency of the HIV-1 resistance CCR5 delation allele in Hungarian newborns. Eur J Pediatr 1998; 157: 782 58. A Nagy, GT Kozma, Á Bojszkó, D Krikovszky, A Falus, C Szalai. No association between asthma or allergy and the CCR5 delta 32 mutation. Arch Dis Child 2002; 86: 426427

104

59. Rovin BH, Lu L, Saxena R. A novel polymorphism in the MCP-1 gene regulatory region that influences MCP-1 expression. Biochem Bioph Res Co 1999; 259: 344-8 60. Szalai C, Duba J, Prohászka Z, Kalina Á, Szabó T, Nagy B, Horváth L, Császár A. Involvement of polymorphisms in the chemokine system in the susceptibility for coronary artery disease (CAD). Coincidence of elevated Lp(a) and MCP-1 -2518 G/G genotype in CAD patients. Atherosclerosis 2001; 158: 233-239 61. Holgate ST, Bodey KS, Janezic A, Frew AJ, Kaplan AP, Teran LM. Release of RANTES, MIP-1 alfa and MCP-1 into asthmatic airways following endobronchial allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 156: 1377-83 62. Udea A, Okuda K, Ohno S, Shirai A, Igarashi T, Matsunaga K et al. NF-kappa B and Sp1 regulate transcription of the human monocyte chemoattractant protein-1 gene. J Immunol 1994; 153: 2052-63 63. Bochner BS. Systemic activation of basophils and eosinophils: Markers and consequences. J Allergy Clin Immunol 2000; 106: S292-302 64. Lukacs NW, Strieter RM, Warmington K, Lincoln P, Censue SW, Kunkel SL. Differential recruitment of leukocyte population and alteration of airway hyperreactivity by C-C family chemokines in allergic airway inflammation. J Immunol 1997; 158: 4398-4404 65. A genome-wide search for asthma susceptibility loci in ethnically diverse populations: the Collaborative Study on the Genetics of Asthma (CGSA). Nat Genet 1997; 15: 389-92 66. Barnes KC. Evidence for common genetic elements in allergic disease. J Allergy Clin Immunol 2000; 106: S192-200 67. Kozma GT, Falus A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Nagy A, Szalai C. Lack of association between atopic eczema/dermatitis syndrome and polimorphisms in the promoter region of RANTES and regulatory region of MCP-1. Allergy 2002; 57: 160-163 68. Dunzendorfer S, Kaneiden NC, Kaser A, Woell E, Frade JM, Mellado M, MartinezAlonso C, Wiedermann CJ. Functional expression of chemokine receptor 2 by normal human eosinophils. J Allergy Clin Immunol 2001; 108: 581-7 69. Lukacs NW, Oliveira SHP, Hogaboam CM. Chemokines and asthma: redundancy of function or a coordinated effort? J Clin Invest 1999; 104: 995-999 70. Gutierrez-Ramos JC, Lloyd C, Gonzalo JA. Eotaxin: from an eosinophilic chemokine to a major regulator of allergic reactions. Immunology Today 1999; 20: 500-504 71. Gleich GJ. Mechanism of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 651-63 72. Szalai C, Kozma GT, Nagy A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polimorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol 2001; 108: 375-381 73. Saikku P, Leinonen M, Tenkanen L, Linnanmaki E, Ekman MR, Mannin V et al. Chronic Chlamydia pneumoniae infections as a risk factor for coronary heart disease in Helsinki Heart Study. Ann Intern Med 1992; 116: 273-8 www. chlamydiae . com (Ward, M. E.) www.ginaasthma.com 74. Lund-Olsen I, Lundback A, Gnarpe J, Gnarpe H. Prevalence of specific antibodies to Chlamydia pneumoniae in children with acute respiratory infections. Acta Paediatr 1994; 83: 1143-5 75. Marton A, Károlyi A, Szalka A, Fóris K. Chlamydia pneumoniae: egy újabb légúti kórokozó. Lege Artis Medicinae 1991; 16: 1120-5 76. Milner, AD: Childhood asthma. 2nd ed. London: Springer-Verlag, 1992, p.13

105

77. Hahn DL, Dodge RW, Golubjatnikov, R. Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma. JAMA 1991; 266: 225-30 78. Bjornsson E, Kjelm E, Janson C, Fridell E, Boman G. Serology of Chlamydia in relation of asthma and bronchial hyperresponsiveness. Scand J Infect Dis 1996; 28: 63-9 79. Hahn DL, Peeling RW, Dillon E, McDonald R, Saikku P. Serologic markers for Chlamydia pneumoniae in asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 2000; 84: 227-33 80. Von Hertzen L, Toyryla M, Gimishanov A, Bloigu A, Leinonen M, Saikku P et al. Asthma, atopy and Chlamydia pneumoniae antibodies in adults. Clin Exp Allergy 1999; 29: 522-8 81. Von Hertzen L, Vasankari T, Liippo K, Wahlstrom E, Poulakkainen M. Chlamydia pneumoniae and severity of asthma. Scand J Infect Dis 2002; 34: 22-7 82. Gencay M, Rudiger JJ, Tamm M, Soler M, Perruchoud, AP, Roth M. Increased frequency of Chlamydia pneumoniae antibodies in patients with asthma. Am J Resp Crit Care Med 2001; 163: 1097-100 83. Mills, GD, Lindeman JA, Fawcett JP, Herbison GP, Sears MR. Chlamydia pneumoniae serological status is not associated with asthma in children or young adults. Int J Epidemiol 2000; 29: 280-4 84. Larsen FO, Norn S, Mordhorst CH, Skov PS, Milman N, Clementsen P. Chlamydia pneumoniae and possible relationship to asthma. Serum immunoglobulins and histamine release in patients and controls. APMIS 1998; 106: 928-34 85. Hahn DL, Anttila T, Saikku P. Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptomatic asthma. Epidemiol Infect 1996; 117: 513-7 86. Cook PJ., Davies P, Tunnicliffe W, Ayres JG, Honeybourne D, Wise R. Chlamydia pneumoniae and asthma. Thorax 1998; 53: 254-9 87. Routes JM, Nelson HS, Noda JA, Simon FT. Lack of correlation between Chlamydia pneumoniae antibody titers and adult-onset asthma. J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 391-2 88. Allegra L, Blasi F, Centanni S, Cosentini R, Denti F, Raccanelli R. et al. Acute exacerbations of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection. Eur Resp J 1994; 7: 2165-8 89. Cunningham AF, Johnston SL., Joulius SA, Lampe FC, Ward, ME. Chronic Chlamydia pneumoniae infection and asthma exacerbation in children. Eur Resp J 1998; 11: 345-9 90. Freymuth F, Vabret A, Brouard J, Toutain F, Verdon L, Petitjean J. et al. Detection of viral, Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae infections in exacerbations of asthma in children. J Clin Virol 1999; 13: 131-9 91. Miyashita N, Kubota Y, Nakajima M, Niki, Y, Kawane H, Matsushima T. Chlamydia pneumoniae and exacerbation of asthma in adults. Ann Allergy Asthma Immunol 1998; 80: 405-9 92. Emre U, Roblin PM, Gelling M, Dumornay W, Rao M, Hammerschlag MR. et al. The association of Chlamydia pneumoniae infection and reactive airway disease in children. Arch Pediatr Adolesc Med 1994; 148: 727-32 93. Nagy A, Kozma GT, Keszei M, Treszl A, Falus A, Szalai Cs. The development of asthma in children infected with Chlamydia pneumoniae is dependent on the modifying effect of mannose binding lectin. J Allergy Clin Immunol (accepted for publication: 15.07.2003) (megjelenik: 2003. októberében) 94. Ferrari M., Poli A., Olivieri M., Verlato G., Tardivo S., Nicolis M et al. Respiratory symptoms, asthma, atopy, Chlamydia pneumoniae IgG antibodies in a general population sample of young adults. Infection 2002; 30: 203-7

106

95. Pype JL, Dupont LJ, Menten P, Van Coillie E, Opdenakker G, Van Damme J, et al. Expression of monocyte chemotactic protein (MCP)-1, MCP-2, MCP-3 by human airway smooth- muscle cells: modulation by corticosteroid and T-helper 2 cytokines. Am J Resp Cell Mol Biol 1999; 21: 528-36 96. Halász Adrien. Az asthma bronchiale természetes lefolyása; citokinek a bronchiális hyperreaktivitás pathomechanizmusában. Ph.D. értekezés tézisek p:13 97. Huittinen T, Hahn D, Anttila T, Wahlström E, Saikku P, Leinonen M. Host immune response to Chlamydia pneumoniae heat shock protein 60 is associated with asthma. Eur Respir J 2001; 17: 1078-82 98. Nagy A, Kis Z, Budai I, Falus A, Szalai Cs. Associacion of Allergy and Chlamydia pneumoniae Infection in Asthma in Children and Young Adults. (Acta Paediatrica közlés alatt) 99. Turner MW, Hamvas RMJ. Mannose binding lectin: structure, function, genetics and diseases associations. Rev Immunogenetics 2002; 2: 305-22 100. Swanson AF, Ezekowitz RA, Lee A, Kuo CC. Human mannose binding protein inhibits infection of HeLa cells by Chlamydia trachomatis. Infect Immun 1998; 66: 160712 101. Ten RM, Carmona EM, Babovic-Vuksanovic D, Katzmann JA. Mannose-binding lectin deficiency associated with neutrophil chemotactic unresponsiveness to C5a. J Allergy Clin Immunol 1999; 104: 419-24 102. Kraft M. The role of bacterial infections in asthma. Clin Chest Med 2000; 21: 301-313 103. Reading PC, Morey LS, Crouch EC, Anders EM. Collectin- mediated antiviral host defense of the lung: evidence from influenza virus in mice. J Virol 1997; 71: 8204-12 104. Soell M, Lett E, Holveck F, Scholler M, Wachsmann D, Klein JP. Activation of human monocytes by streptococcal rhamnose glucose polymers is mediated by CD14 antigen and mannan binding protein inhibits TNF-alfa release. J Immunol 1995; 154: 851-60 105. Garred P, Madsen HO, Halberg P, Petersen J, Kronborg G, Svejgaard A et al. Mannose-binding lectin polymorphism and susceptibility to infection in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1999; 42: 2145-52 106. Gradual NA, Madsen HO, Tarp U, Svejgaard A, Jurik G, Gradual HK et al. The association of variant mannose-binding lectin genotypes with radiogr aphic outcome in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2000; 43: 515-21 107. Falck G, Gnarpe J, Hansson L-O, Svardsudd K, Gnarpe H. Comparison of individuals with and without specific IgA antibodies to Chlamydia pneumoniae. Chest 2002; 122: 1587-93 108. Lazarus R, Vercelli D, Palmer LJ, Klimecki WJ, Silverman EK, Richter B et al. Single nucleotide polymorphisms in innate immunity genes: abundant variation and potential role in complex human disease. Immunol Rev 2002; 190: 1-9 109. Koppelman GH, Reimerink NE, Stine OC, Howard TD, Whittaker PA, Meyers DA et al. Association of a promoter polymorphism of the CD14 gene and atopy. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 965-9 110. Nagy Adrienne, Kozma T Gergely, Keszei Márton, Treszl András, Falus András, Szalai Csaba. A mannózköto lektin polimorfizmus és a Chlamydia pneumoniae fertozés együttes hatása az asthmára. Allergológia és Klinikai Immunológia (közlés alatt) 111. Normile D. Battling SARS on the frontlines. Science 2003; 300: 714-15 112. Fábián Pál, Magasi Péter (foszerk.) Orvosi Helyesírási Szótár. Akedémiai Kiadó, Budapest 1992.

107

7.2 Az értekezés alapjául szolgáló publikációk: Angol nyelvu közlemények:

Szalai C, Kozma GT, Nagy A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polimorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol 2001; 108: 375-381 Kozma GT, Falus A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Nagy A, Szalai C. Lack of association between atopic eczema/dermatitis syndrome and polimorphisms in the promoter region of RANTES and regulatory region of MCP-1. Allergy 2002; 57: 160-163 A Nagy, GT Kozma, Á Bojszkó, D Krikovszky, A Falus, C Szalai. No association between asthma or allergy and the CCR5 delta 32 mutation. Arch Dis Child 2002; 86: 426-427 Nagy A, Kozma GT, Keszei M, Treszl A, Falus A, Szalai Cs. The development of asthma in children infected with Chlamydia pneumoniae is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. J Allergol Clin Immunol 2003; 112: 729-34 Nagy A, Kis Z, Budai I, Falus A, Szalai Cs. Associacion of Allergy and Chlamydia pneumoniae Infection in Asthma in Children and Young Adults. (közlés alatt) Budai I, Nagy A, Boriszova D, Rozgonyi F. The prevalence of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae antibodies in Hungarian children with symptoms of atypical pneumonia. The Pediatric Infection Disease Journal (közlés alatt)

Magyar nyelvu közlemények: Szalai Csaba, Kozma Gergely Tibor, Nagy Adrienne, Bojszkó Ágnes, Falus András Az allergiás megbetegedések genomikai megközelítése; lehetoségek és távlatok Orv Hetil 2002; 143 évf. 8. sz.: 381-390 Markusovszky díj 2003. Nagy Adrienne, Budai Irén, Madarasi Anna. Gyermekkori elhúzódó köhögés és az atípusos kórokozók. Praxis 2002. 11 évf. 3. sz. 43-49 Nagy Adrienne, Kozma T Gergely, Keszei Márton, Treszl András , Falus András, Szalai Csaba. A mannózköto lektin mutáció és a Chlamydia pneumoniae fertozés együtes hatása a gyermekkori asthmára. Allergológia és Klinikai Immunológia (közlésre elfogadva).

7.3 Az értekezés témájában megtartott eloadások, poszterek Nagy Adrienne.Chemokinek szerepe az allergiás és gyulladásos reakciókban. Eloadás. MAKIT XXIX. Kongresszus 2001. május 24-26. Balatonfüred Szalai Csaba, Kozma Gergely, Nagy Adrienne, Bojszkó Ágnes, Krikovszky Dóra, Szabó Teréz, Falus András. Polimorfizmus az MCP-1-gén szabályozó régiójában befolyásolja az

108

asthmára való hajlamot és az asthma súlyosságát. Eloadás. MIT XXXI. Kongresszus 2001. okt. 17-19. Eger Nagy Adrienne, Szalai Csaba, Kozma Gergely, Bojszkó Ágnes, Krikovszky Dóra, Szabó Teréz, Falus András. MCP-1 polimorfizmus és az asthma bonchiale. Eloadás. MAKIT XXX. Kongresszus 2001. június 13. Sopron Budai I, Nagy A, Boriszova D, Rozgonyi F. Prevalence of Chlamydia pneumoniae species specific antibodies in Hungarian children with symptoms of atypical pneumonia detected by ELISA. Poster. Tenth International Symosium on Human Chlamydial Infections. 2002. juni 16-21. Antalya, Törökország Nagy Adrienne. Chlamydia pneumoniae és az asthma kapcsolata. Eloadás. MAKIT Fiatal Allergológusok és Klinikai Immunológusok Negyedik Fóruma. 2002. szept. 26. Budapest Ambrus Katalin, Kalmár Ágnes, Nagy Adrienne, Madarasi Anna. A Chlamydia pneumoniae szerepe a gyermekkori légúti betegségekben. Eloadás. Magyar Gyermekorvosok Társasága és a Magyar Tüdogyógyász Társaság Gyermektüdogyógyász Szekciójának tudományos ülése. 2002. nov. 7-10. Dobogóko Nagy Adrienne, Kis Zoltán, Budai Irén, Falus András, Szalai Csaba. A Chlamydia pneumoniae fertozés és az allergia kapcsolata gyermekkori asthmában. Eloadás. MIT Vándorgyulés 2003. okt. 15-17. Gyor

109

8. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK CÍMEI (15 ábra és 23 táblázat az elofordulás sorrendjében) Az ábrák és a táblázatok az elso hivatkozát követo oldalon (old.) találhatóak. 1. táblázat Az allergiás/asthmás megbetegedésekkel kapcsoltságot mutató legfontosabb jelölt gének kromoszómalokalizációja és feltételezett funkciója (a teljesség igénye nélkül) (8. old.) 1. A ábra Az asthma bronchiale súlyossági lépcsoi (11. old.) 1. B ábra Az asthma bronchiale lépcsozetes terápiája (12. old.) 2. táblázat A CC-kemokinek és célsejtjeik (15. old.) 3. táblázat A CC-kemokin receptorok (CCR) és ligandjaik és a receptort expreszáló sejtek (16.old.) 2. ábra A kemokinek több kemokin receptorra kapcsolódnak és egy kemokin receptor több kemokin megkötésére is képes (17. old.) 3. ábra Az eosinophil sejten megjeleno kemokin receptorok és ligadjaik (18. old.) 4. ábra A CCR3 receptort expresszáló sejt típusától függ az eotaxin hatása (19. old.) 5. ábra Az eotaxin és MDC direkt és indirekt hatása az eosinophil sejtre (20. old.) 6. ábra A Chlamydiák különleges életciklusa (23. old.) 7. ábra A Chlamydia pneumoniae elemi testek bejutási módjai a sejtbe (26. old.) 8. ábra Az MBL komplement aktivációja (29. old.) 9. ábra Az MBL kötodését a sziálsav jelenléte befolyásolja (30. old.) 10. ábra Az MBL gén exonjai az MBL különbözo alegységeinek szintéziséért felelosek (32. old.) 4. táblázat Asthmás betegek súlyossági lépcsok szerint (36. old.) 11. ábra CCR5? 32 mutáció vizsgálata PCR-rel (38. old.) 5. táblázat A CCR5? 32 mutáció genotípusai és allélfrekvenciái a gyermekek 3 csoportjában (39. old.) 6. táblázat Az asthmás betegek fehérvérsejt számai, abszolút és relatív eosinofil sejtszámai és össz IgE szintjei a CCR5 genotípus szerint csoportosítva (41. old.) 7. táblázat CCR5 genotípusok az asthma bronchiale stádiumai szerint (42. old.) 12. ábra MCP-1-2518 A/G polimorfizmus kimutatása PCR-RFLP-vel (47. old.) 8. táblázat MCP-1-2518A/G genotípusok és allélfrekvenciák az asthmás, az allergiás, de nem-asthmás és a kontroll gyermekeknél (49. old.) 9. táblázat Az asthmás betegek fehérvérsejtszámai, abszolút és relatív eosinophil sejt számai és össz IgE szintjei a MCP-1-2518 genotípus szerint csoportosítva (50. old.) 13. ábra A különbözo súlyossági fokú asthmás betegek genotípus szerinti megoszlása (53. old.) 14. A ábra Eosinophil sejtszám különbözo súlyosságú asthmában (54. old.) 14. B. ábra Eosinophil sejtszám különbözo genotípus és asthma stádium esetén (54. old.) 10. táblázat Az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus hatása a szérum MCP-1 szintjére (n:) (60. old.) 11. táblázat A szérum MCP-1 szintek (rank szám átlagok) különbözoképpen csoportosított betegeknél (61. old.) 12.táblázat A vizsgálatban szereplok (n: 323) összetétele betegség és allergia szempontjából (66. old.) 13. táblázat Összehasonlítások az alcsoportok között (68. old.) 14. táblázat Az ELISA lelet összegzo értékelése a Chlamydia pneumoniae-specifikus IgM, IgA és IgG pozitivitások és negativitások kombinációin alapul (70. old.)

110

15. táblázat 1-6. összehasonlítás. Az akut vagy krónikus Chlamydia pneumoniae fertozések elofordulásának különbségei (p és Odds ratio) különbözo képpen csoportosított betegek között (72. old.) 16. táblázat 7-10. összehasonlítás. Az akut vagy krónikus Chlamydia pneumoniae fertozések elofordulásának különbségei (p és Odds ratio) különbözo képpen csoportosított inhalatív (indoor és/vagy outdoor) allergén pozitív és negatív betegek között (73. old.) 17. táblázat 11-14. összehasonlítás. A Chlamydia pneumoniae-specificus IgA pozitív, krónikus Chlamydia pneumoniae fertozések elofordulásának különbségei (p és Odds ratio) különbözo képpen csoportosított inhalatív (indoor és/vagy outdoor) allergén pozitív és negatív betegek között (74. old.) 18. táblázat Az asthmás betegek jellemzoi (81.) 19. táblázat Az MBL mutációk kimutatásához használt restrikciós enzimek hatására kialakuló fragmentumok hossza (82. old.) 20. táblázat Chlamydia pneumoniae-specifikus antitest pozitivitások száma és százaléka asthmás és kontroll gyermekekben (84. old.) 21. táblázat MBL allélvariánsok elofordulása és allélfrekvenviái asthmásokban és kontrollokban (85. old.) 22. A táblázat Logisztikus regressziós analízis a különbözo C. pneumoniae-specifikus antitestek és az asthma közötti kapcsolatra MBL genotípusok szerint (86. old.) 22. B táblázat Logisztikus regressziós analízis a különbözo C. pneumoniae-specifikus antitestek és az asthma közötti kapcsolatra MBL genotípusok szerint (87. old.) 23. táblázat Logisztikus regressziós analízis a különbözo MBL genotípusok elofordulása és az asthma közötti kapcsolatra C. pneumoniae-specifikus antitest pozitivitások szerint (89. old.) 15. A ábra Genetikai és környzetei tényezok az asthma bronchiale kialakításában (96. old.) 15. B ábra Genetikai és környzetei tényezok az asthma bronchiale kialakításában és terápiás lehetoségek gyermekkorban (97. old.)

111

9. FÜGGELÉK 9.1 HIBALEHETOSÉGEK 9.1.1 A Chlamydia pneumoniae a vizsgált MOMP antigénjén kívül más immunogén antigénekkel is rendelkezik. (c HSP 60, LPS, IncA, B stb.) Ennek tudatában értékelem eredményeimet. 9.1.2 A bronchialis hyperreaktivitást is okozni tudó Chlamydia pneumoniae megtévesztésig hasonlít az asthmára. Ezért az asthma gyanúval ambulanciánkra került, igazoltan Chlamydia pneumoniae fertozött gyermekek asthma diagnózisát csak fél éves várakozási ido után mondtam ki, amennyiben az alkalmazott makrolid antibiotikus terápia, terápiák ellenére a BHR perpétuálódott és az alkalmazott inhalatív steroid és adjuváns szerek jótékony hatásúak voltak klinikailag és spirometriásan egyaránt, valamint ezek nem voltak elhagyhatóak. 9.1.3 Ha a Chlamydia pneumoniae fertozés tartotta fenn a BHR-t, vagyis a makrolid terápiára és szükség esetén az ihalativ szeroidokra és inhalatív bronchodilatátorok használatára csak átmenetileg volt szükség és azok elhagyása után sem tért vissza a BHR, azok az esetek nem kerültek a vizsgált asthmás csoportba. Ugyanis ez fals magas Chlamydia fertozöttséget mutatott volna az asthmás csoportban. 9.1.4 A betegek beválasztása és vizsgálata 3 évig tartott. Átmeneti reagens hiány miatt néhány hónapig a Chlamydia pneumoniae specifikus IgA és IgG meghatározás Ridascreen ELISA módszerrel történt 40 esetben. Szerencsésen itt is a MOMP volt a vizsgált antigén. Késobbiekben 15 esetben párhuzamosan Ridascreen és Savyon ELISA-val is kontrolláltuk ezen eredeti lefagyasztott vérmintákat, amelyek ereményei korreláltak. 9.1.5 Serológiai vizsgálatokat általában savópár eredményei alapján ajánlott értékelni. Szurovizsgálatról lévén szó, egyszeri vérminta- vétellel történtek a me ghatározások. Az eredmények átlagosan, sajnos csak 6 hét alatt születtek meg. A második vérvételt, amelyet az elso eredményének megérkezése elott kellett volna levenni, a gyermekek ill. szüleik negálták. Ismételt vérvételre csak a kétes esetben és a kezele ndo fertozöttek kúra utáni kontrolljaként került sor. A gyermekeket nem terheltük tudományos célú vérvétellel, minden esetben egy más miatt aktuális vérvételhez kapcsoltan vettünk le több vért (felvilágosítás és írásos beleegyezés után). 9.1.6 A nemzetközi irodalomban számos Chlamydia pneumoniae specifikus ellenanyag kimutatási módszert (pl. mikroimmunofluoreszcencia, ELISA) és direkt kimutatásokat, (tenyésztést, PCR-t) alkalmaztak a fertozés igazolására. Vizsgálatom során szándékosan olyan ELISA módszert választottam, amely országosan elérheto, reprodukálható. 9.1.7 A vérminták intézmények közötti szállítása -20 és -70 Celsius fokos jégszekrények között ennél magasabb hofokon történt. Mikrobiológiai vélemény alapján ez nem rongálhatta a vérmintákat. 9.1.8 A több, mint 300 gyermek, több, mint 6000 adata nem minden gyermeknél volt minden paraméterre komplett. Azonban egy-egy eseti paraméter hiánya nem okozott statisztikai feldolgozási, illetve értékelési problémát. 9.1.9 A C. pneumoniae elleni védekezésben nemcsak az általam vizsgált humorális immunrendszer és a komplement rendszer vesz részt. Eredményeimet ennek tudatában értékelem.

112

9.2 Formai megjegyzések 9.2.1 Az irodalmi összefoglalót terjedelme miatt a bevezeto után külön fejezetben tárgyalom . 9.2.2 A módszerek részletes leírásai mindig az adott vizsgálat bemutatásáná l találhatóak (3.1-3.5). 9.2.3 A házivédés opponensének javaslatára az ábrák és táblázatok az elso hivatkozást követo oldalon találhatóak a jobb olvashatóság érdekében. 9.2.4 Az Orvosi Helyesírási Szótár Akadémiai Kiadó, Budapest 1992 ajánlásait igyekeztem betartani. Az asthma bronchiale kórképet több helyen röviden asthma néven említem, amelynek helyesírására az „asthma ” és „asztma ” a szótár szerint egyaránt elfogadott. A többi, köznyelvben honossá vált fogalmaknál törekedtem a magyaros írásmódra. 9.2.5 Egyes táblázatok mérete és 10-es betumérete tovább nem volt csökkentheto az olvashatóság miatt. Ezért a jobb oldali margót 2,5 cm-re kellett csökkentenem, amely a bekötést nem zavarja. A többi margó a formai javaslat szerint 3 cm-es.

113

10. SUMMARY The aim of our research was to contribute to the modern diagnostics, differential diagnostics, targeted treatment and care of childhood bronchial asthma. In order to achieve our objectives, we presented the pathogenetic and differential diagnostic difficulties of Chlamydia pneumoniae infection, conducted genetic studies of asthmatic patients, and performed clinical research activities. The identification of new risk factors can enhance the possibilities for prevention, and improve both diagnostic and therapeutic methods. Our results can be summarised as follows: 1.

We have established that the CCR5?32 mutation does not confer protection against the development of asthma.

2.

MCP-1-2518 A/G polymorphism increases the susceptibility to the development of bronchial asthma.

3.

MCP-1 plays an important role in the development of asthmatic inflammation.

4.

Our results support the assumption, that there is an association between childhood bronchial asthma and chronic Chlamydia pneumoniae infection. a. We have found a significant association between bronchial asthma with an underlying allergy to inhaled allergens and chronic Chlamydia pneumoniae infection b. We have shown that the simultaneous occurrence of MBL mutation and chronic Chlamydia pneumoniae infection promotes the development of bronchial asthma, so MBL can have a predictive value

Our results show the interaction of genetic and environmental factors involved in the development of bronchial asthma, a multifactorial disease. According to our conclusions of practical clinical importance, the genetic and infectological screening of asthmatic and/or allergic children may have long term effects in improving the quality of life of our patients.

114