Ph.D. Értekezés. Dr. Lohinai Zsolt

Dr. Lohinai Zsolt: A NO . biológiai jelentôsége a fogbélben és a fogágyban

Ph.D. Értekezés

A NITROGÉNMONOXID BIOLÓGIAI JELENTÔSÉGE A FOGBÉLBEN ÉS A FOGÁGYBAN

Dr. Lohinai Zsolt

Témavezetô: Prof. Dr. Sándor Péter, az orvostudományok doktora Programvezetô: Prof. Dr. Monos Emil, az orvostudományok doktora Klinikai Kísérleti Kutató és Humán Élettani Intézet Budapest, 2002

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti orvostudományok A vérkeringési rendszer normális és kóros mûködésének mechanizmusai

Bírálóbizottság: Prof. Dr. Zelles Tivadar, az orvostudományok doktora, Prof. Dr. Nagy Sándor, az orvostudományok doktora és Dr. Kékesi Violetta kandidátus Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Bari Ferenc, az orvostudományok doktora és Dr. Bartha Jenô

1


TARTALOMJEGYZÉK

1.

MAGYAR NYELVÛ ÖSSZEFOGLALÓ ………………….…. 9

2.

ANGOL NYELVÛ ÖSSZEFOGLALÓ – SUMMARY …. 11

3.

BEVEZETÉS ……………………………………………………. 13

4.

CÉLKITÛZÉSEK

4.1.

……………………………………………. 17

A NOS anatómiai lokalizálása a fogbélben, az ínyben, a nervus és artéria alveolaris inferiorban és a ganglion trigeminaleban

4.2.

17

A NO. szerepe a fogbél és a foghús vérkeringésének szabályozásában ..………………

4.2.

A NO. jelentôsége a fogágygyulladás patomechanizmusában

5.

18

……………………………. 18

IRODALMI HÁTTÉR ……………………………………………

5.1.

20

Az L-arginin/NO. rendszer ……………………..…….. 20 5.1.1. A NO. felfedezése

……………………………………. 20

5.1.2. A NO. keletkezése az emlôs szervezetben 5.1.2.1.

21

A NOS izoenzimek NO. bioszintézise és mûködésük szabályozása

……. 21

5.1.2.1.1. A konstitutív NOS (cNOS) ……. 22 5.1.2.1.1.1. A nNOS ……. 22 5.1.2.1.1.2. Az eNOS ……. 23 5.1.2.1.2. Az indukálható NOS (iNOS) …. 23 5.1.2.2.

A nem enzimatikus NO. képzôdés …. 24

2


5.1.3. A NO. hatásmechanizmusa

…………….. 25

5.1.4. A NO. mint élettani szabályozó molekula ...

3

28


5.1.5. A NO. kórélettani vonatkozásai és klinikai jelentôsége

5.2.

A NO. a száj egyes részeiben

……………………. 30

…………….……… 31

5.2.1. A NO. a szájüregben …………….……… 31 5.2.1.1.

Az enterosalivalis nitrát/nitrit/NO. körforgás

…………………….……… 34

5.2.2. A NO. a fogbélben és a foghúsban

6.

MÓDSZEREK

6.1.

….……

37

………………………………………………….… 38

A NOS anatómiai lokalizálása az ínyben, a fogbélben, a nervus és artéria alveolaris inferiorban és a ganglion trigeminaleban 6.1.1. Sebészeti beavatkozások

38

……………………. 38

6.1.2. A NADPH-diaforáz enzim-hisztokémiai ………………………………….... 39 6.1.3. A nNOS immunhisztokémia kimutatása 6.1.4. Anyagok

6.2.

………………………………….... 39

………………………………….… 39

A NO. hatása a fogbél és a foghús vérkeringésére

……………………………………………. 40

6.2.1. Sebészeti beavatkozások 6.2.2. Kísérleti protokoll

……………..….…. 40

……………………………. 40

6.2.3. Általánosan mért élettani paraméterek

41

6.2.4. A fogbél és a gingivomucosalis szövet véráramlásának mérése rádióaktivan jelzett mikrogyöngy módszerrel ………….. 41 6.2.5. Anyagok

….………………………………… 43

6.2.6. Statisztikai értékelés

……………………. 44

4


6.3.


……………………………. 44

6.3.1. Sebészeti beavatkozások és kísérleti protokoll

……………………………………. 44

6.3.2. A gingivomucosalis NOS enzimaktivitás mérése ……………………. 45 6.3.3. Az iNOS anatómiai lokalizálása a gingivomucosalis szövetben

46

6.3.4. A gingivomucosalis érfalpermeabilitás változásának meghatározása

46

6.3.5. Az alveolaris csontrezorpció meghatározása ……………………………. 47 6.3.6. Anyagok

……………………………………. 48


……………………. 48

7. EREDMÉNYEK ……………………………………….…………… 49

7.1.

A NOS anatómiai lokalizálása

……………………. 49

7.1.1. A fogbélben

……………………………………. 49

7.1.2. Az ínyben

……………………………………. 49

7.1.3. A nervus és artéria alveolaris inferiorban. 7.1.4. A ganglion trigeminaleban

7.2.

50

……………. 50

A NO. hatása a fogbél és a foghús vérkeringésére

…………………………………….……... 52

7.2.1. A NOS blokkolás és a NO. adás hatása az általános élettani paraméterekre

52

7.2.2. A NOS blokkolás és a NO. adás hatása a fog és a gingivomucosalis szövet véráramlására és érellenállására

54

7.2.3. A NOS blokkolás és a NO. adás hatása a perctérfogat fogfrakciójára

5

……………. 54


7.3.

A NO. szerepe a fogágygyulladás patomechanizmusában

……………………………. 57

7.3.1. A ligatúra hatása a gingivomucosalis szövet cNOS és iNOS enzimaktivitására …. 57 7.3.2. Az iNOS lokalizálása parodontitisben

57

7.3.3. A MEG hatása a vérnyomásra, plazma extravazációra és az alveolaris 58

8. MEGBESZÉLÉS …………………………………….……………… 65

8.1.

A konstitutív NOS a fogbélben és a gingivomucosalis szövetben

65

8.1.1. A konstitutív NOS anatómiai lokalizálása a pulpában és a parodontiumban

65

8.1.2. A fogbél és az ínyszövet neurális NOS tartalmú idegrostjainak eredete……. 67 8.1.3. A konstitutív NOS élettani funkciói a fogbélben és a gingivomucosalis 69 8.1.3.1.

A vérkeringés szabályozásában …… 69

8.1.3.1.1.

Az érkaliber beállításában ..… 69

8.1.3.1.2.

Az érpermeábilitás kialakításában ………..….. 73

8.1.3.1.3.

Egyéb funkciókban

8.1.3.2.

A szenzoros afferentációban

8.1.3.3.

A fog rögzítésében

………..….. 74 ….… 74

……………….…… 76

8.1.4. A konstitutív NOS szerepe az artéria alveolaris inferiorban ……………………. 77

8.2.

A NO. a fogágygyulladás patomechanizmusában 78 8.2.1. Az iNOS szerepe

……………………………. 78

6


8.2.2. A fogágysorvadás NO. mediált kaszkádja (az oxidatív és a nitrozatív stressz és közös pontjainak hozzájárulása a fogágy 82 8.2.3. Az iNOS szelektív blokkolása és a peroxinitrit megkötése a fogágygyulladás potenciális új terápiája lehet

9.

KÖVETKEZTETÉSEK

10.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

11.

IRODALOMJEGYZÉK

87

……………………………………………. 89

……………………………. 94

……………………………………. 96

11.1. Az értekezésben felhasznált közlemények

96

11.1.1. Az értekezés alapjául szolgáló folyóiratban megjelent saját közlemények

96

11.1.2. Az értekezésben idézett egyéb közlemények ………………….…….….. 96 11.2. A szerzô egyéb közleményei .………………….. 131 11.2.1. Folyóiratban megjelent közlemények ….. 131 11.2.2. Könyvrészletek

………………..……..….. 132

11.2.3. Folyóiratban megjelent citálható

7


AZ ÉRTEKEZÉSBEN HASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

BF

fogbél, illetve gingivomucosalis szövet véráramlása

cNOS

konstitutív nitrogénmonoxid szintáz

cGMP

ciklikus guanozinmonofoszfát

CO

perctérfogat

COX-2

indukálható ciklooxigenáz

EDRF

endothel erdetû érellazító faktor

eNOS

endothelialis nitrogénmonoxid szintáz

IL-1

interleukin-1

iNOS

indukálható nitrogénmonoxid szintáz

ip.

intraperitoneális(an)

iv.

intravénás(an)

L-NAME

NG-nitro-L-argininmetilészter

L-NMMA

N -monometil-L-arginin

LPS

lipopoliszacharid

MEG

merkaptoetilguanidin

MMP

mátrix metalloproteináz

mtsai

munkatársai

n

állatok száma

NADPH-d

nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-diaforáz

NADPH-d+

nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-diaforázzal

G

jelzett 7-NI nNOS

7-nitroindazol neurális nitrogénmonoxid szintáz

NO.

nitrogénmonoxid

NOLA

NG-nitro-L-arginin

NOS

nitrogénmonoxid szintáz

NTG

nitroglicerin

ONOO-

peroxinitrit

8


O2-.

szuperoxid

PMN

polimorfonukleáris

ppm

partikulum per millió

ppb

partikulum per billió

SE

Semmelweis Egyetem

SEM

az átlag standard hibája

SIN-1

3-morfolinoszidnonimin

SNAP

S-nitrozo-N-acetilpenicillinamin

SNP

nitroprusszidnátrium

SOD

szuperoxid dizmutáz

TNF-α

tumornekrózis-faktor-alfa

PARS

poli(ADP-ribóz) szintetáz

VIP

vazoaktív intesztinális peptid

9


MAGYAR NYELVÛ ÖSSZEFOGLALÓ

A NITROGÉNMONOXID BIOLÓGIAI JELENTÔSÉGE A FOGBÉLBEN ÉS A

Dr. Lohinai Zsolt Témavezetô: Prof. Dr. Sándor Péter Semmelweis Egyetem Doktori Iskola PhD program címe: A vérkeringési rendszer normális és kóros mûködésének mechanizmusai Budapest, 2002

A fogszuvasodás és a fogágybetegség népbetegség hazánkban. Az újabb vizsgálatok alapján megerôsítést nyert, hogy a fogászati fertôzések nem csupán lokális problémákat okoznak, hanem általános szervezeti betegségek, elsôsorban a cardiovascularis betegségek kiemelkedô rizikófaktorai is. Ezenkívül a hatvanas évek eleje óta több mint ötszörésére emelkedett a szájüregi daganatok száma is Magyarországon, ezért a szájüreg biológiájának kutatása nagy jelentôséggel bír, habár eddig még nem kapta

Az elmúlt két évtizedben intenzív kutatási érdeklôdés fordult vazoaktív anyagok, különösen az endothel erdetû érellazító faktor (EDRF) tulajdonságainak megismerése felé. Az EDRF egyik lehetséges kémiai formája a nitrogénmonoxid (NO. ) szabad gyök, L-argininbôl keletkezik a NO. szintáz (NOS) izoenzimek hatására. A NO. az egyik legkisebb szintetikus, nagyon reaktív, rövid életidejû, fontos cardiovascularis, neurológiai és immun funkciókkal bíró intercelluláris hírvivô molekulája az emlôs élôlények sejtjeinek. A NO. -nak a fogbélre, illetve a fogágyra gyakorolt hatása relatíve kevéssé tanulmányozott, de úgy tûnik, hogy ezen a területen is sokrétû, alapvetô jelentôségû hatásokkal bír. Anatómiai vizsgálatainkban macskákon és kutyákon demonstráltuk, hogy mindkét szerv endotheliuma festôdik a NADPH-diaforázzal (NADPH-d) a NOS hisztokémiai markerével, valamint, hogy a fogbélben kis számban, a foghúsban nagy számban találhatóak NADPH-d pozitív/neurális NOS immunreaktív axonok. Ezek a rostok a NADPH-d/neurális NOS reaktív nervus alveolaris inferioron keresztül jutnak el

10


parodontalis szöveteibe, ahol szerepük lehet szenzoros (pl. fájdalom) és vegetatív (pl. véráramlás szabályozás) funkciókban. Rádioaktívan jelzett mikrogyöngy technikával macskában mért kísérleti eredményeink az L-arginin/NO. útvonal jelentôségét mutatják a fogbél és a foghús vérkeringésének szabályozásában. Kimutattuk, hogy a macska fogbélben és foghúsban NO. függô bazális vazodilatátor tónus található. Adataink arra utalnak, hogy míg a pulpa erek nyugalmi tónusának kialakításához hozzájáruló NO. fôleg az endothelialis NOS-ból és nem a csekély számú perivascularis neurális NOS-ból származhat, addig a gingivomucosalis szövet nyugalmi érellenállását az endothelialis NOS mellett még a neurális NOS bazális NO. termelése is folyamatosan csökkentheti. Továbbá feltételezzük, hogy az endotheliumból, perivascularis NO. -erg idegekbôl, illetve egyéb forrásból stimuláció hatására történô endogén NO. felszabadulásnak is szerepe lehet a pulpa értónusának regulációjában, mivel a fogbél vérkeringése szenzitív az exogén NO. -ra. Patkány ligatúrával kiváltott fogágygyulladás modellben a gingivomucosalis kötôszövet gyulladásos sejtjeinek és epitheliumának indukálható NOS expresszióján keresztül fokozza a NO.

termelést.

A

szelektív

indukálható

NOS

blokkoló

és

peroxinitritkötô

merkaptoetilguanidin (MEG) kezelés ugyanakkor jótékony hatású a parodontitis tüneteire, csökkenti a következményes plazma extravazációt és Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a fokozott NO. termelôdésnek, valamint a NO. és a szuperoxid reakciójából kialakuló peroxinitrit képzôdésnek szerepe lehet a fogágygyulladás patomechanizmusában. Feltételezzük, hogy parodontitisben a NO. és a peroxinitrit védô hatású az ínybe hatoló mikrobiológiai ágensekkel szemben, azonban lokálisan, nagy koncentrációban már a gazdaszöveteket is károsíthatják. A szervezet túlzott védekezési reakciójának csökkentésén alapuló új koncepció szerint úgy véljük, hogy a MEGnek potenciálisan terápiás szerepe lehet a parodontitisben kezelésében. SUMMARY

THE BIOLOGICAL SIGNIFICANCE OF NITRIC OXIDE IN THE DENTAL PULP AND PERIODONTIUM

11


Zsolt Lohinai DMD

Supervisor: Péter Sándor MD, DMSc Professor of Physiology Semmelweis University Doctoral School PhD program: Physiological and pathological mechanisms of the cardiovascular system Budapest, 2002

Caries and periodontitis are widespread diseases in Hungary. Recent epidemiological and clinical studies have shown that the dental infections are not only local problems, but are risk factors of systemic diseases most particularly cardiovascular diseases. In addition, the increase of oral tumors has been more than five-fold since the sixties in our country. Consequently, the research of the biology of the oral cavity is very important, however, still has not received the required attention and support so far. In the past two decades there was an intensive interest in the research of various vasoactive agents of the endothelial cells aimed at the characterization of the endothelium derived relaxing factor (EDRF). One possible form of EDRF is nitric oxide (NO. ) free radical, which is produced from L-arginine by the isoenzymes of nitric oxide synthases (NOS). NO. is one of the smallest synthetic, highly reactive, short lived intercellular messenger molecules of mammalian cells with important cardiovascular, neurological and immune functions. Although the information on the effects of NO. on the dental pulp and periodontal tissues are relatively scarce in the literature, it seems, that this free radical has substantial and versatile role in these tissues as well. In our anatomical studies in cat and dog we have demonstrated that the endothelial cells of both tissues are stained with NADPH-diaphorase, which is the histochemical marker of NOS. Furthermore, we observed a few NADPHdiaphorase positive and/or neuronal NOS immunoreactive perivascular and solitary axons in the dental pulp and abundant number of similar nerve fibres in the gingiva. These fibres travel within the inferior alveolar nerve to the pulp and the gingiva of the lower teeth and may participate in their sensory (i.e. pain) as well as in autonomic (i.e. regulation of blood flow) innervation. In our functional studies we have found that the L-arginine/NO. pathway plays an important role in the regulation of pulpal and gingivomucosal blood circulation measured by radioactive labeled microspheres in cat. Based on our data we suggest, that a NO. dependent

12


basal vasodilator tone exists in the dental pulp and the gingivomucosal tissue. In the pulp the resting tone of the vessels is probably influenced by NO. derived from endothelial origin and not from the small number of NOS reactive perivascular axons, however, in the gingivomucosal tissue the basal NO. may be derived from both sources. Furthermore, based on another study we presume, that the release of endogenous NO. from various sources in response to stimulation may also be involved in the control of the dental pulp vascular tone since the dental pulp circulation is sensitive to exogenously administered NO. . In a rat model of periodontitis, the ligature increases the local NO. production through the expression of inducible NOS in the inflammatory cells of the connective tissue and in the epithelium of the gingiva. On the other hand, mercaptoethylguanidine, a selective inhibitor of inducible NOS and a peroxynitrite scavenger treatment in the same model protects against the periodontitis associated extravasation and bone destruction. Based on these data, we suggest that enhanced formation of NO. and peroxynitrite play a significant role in the pathogenesis of periodontitis. We propose, that although the locally generated NO. and peroxynitrite protect the gingiva against the invading microorganisms, the overproduction of these agents in periodontitis may lead to the host tissue damage as well. Therefore, selective inhibition of inducible NOS may be of therapeutic utility in periodontitis.

13


3. BEVEZETÉS

“Továbbra is homályosan látok, csak magasabb szinten” (Enrico Fermi)

“Minden bonyolult jelenségnek megvan a maga egyszerû, mindenki számára könnyen megérthetô, téves magyarázata” (Murphy)

A nitrogénmonoxid (NO. ) kétatomos kis molekulája az utóbbi csaknem másfél évtizedben hatalmas karriert futott be. Pályafutását egyébként megbélyegezetten, a kip környezetszennyezô komponenseként kezdte, de napjainkig eljutott odáig, hogy szervezetbeli szerepét az 1987-es elsô igazolása óta több mint 30.000 orvosi-biológiai szakcikk ecseteli világszerte. Diadalmenete során 1992-ben az év molekulája, majd 1998-ban már a NO. -dal kapcsolatos kutatásokért adják az Élettani-Orvosi Nobel díjat megosztva Robert F. Furchgottnak, Ferid Muradnak és Louis J. Ignarronak. A NO. szervezetbeli funkcióit leginkább három területen, a vérkeringésben, az idegrendszerben és az immunvédelemben tölti be. Létezése mindenekelôtt akkor váltott ki hatalmas sajtóvisszhangot, amikor forgalomba került a merevedési zavarok tüneti kezelésére szolgáló sildenafil, a "kék tabletta", ami lényegében a NO. hatását erôsíti fel. Ezt a mostani különleges figyelmet akár méltatlan dolognak is vehetnénk, hiszen kezelésében már több mint száz éve alkalmazott nitrát típusú gyógyszerek naponta sok-sok életet mentenek meg azzal, hogy belôlük NO. szabadul fel. A NO. fontos biológiai szerepet játszik a digesztiv és a respirációs rendszerekben is. .

részt vesz az értónus, a motilitás, a szekréció szabályozásban

és a gyulladásos folyamatokban (281), a légzôrendszerben a perfúzió/ventilláció

14


kapcsolásában, a ciliáris motilitás létrejöttében és az infekció kontrollban (195). E két rendszer .

-nak az élettani és kórélettani hatásait alig

A szájüreg szinte minden szempontból relatíve kevésbé tanulmányozott a szervezet többi részéhez képest, sokan még a kutatásának a jelentôségét sem ismerik el. Pedig e terület biológiájának kutatása is nagy jelentôséggel bírna, mivel a szájüregi daganatos megbetegedések soha nem látott mértékben fokozódtak az utóbbi évtizedekben (323; 80). környékén kialakuló rosszindulatú daganatos betegségben elhunytak száma a hatvanas évek eleje óta több mint ötszörösére emelkedett (323, 80). Jelenleg az összes szervrendszert érintô rosszindulatú daganatos megbetegedések közül a szájüreget érintôek mintegy 4%-ban szerepelnek halálokként (80). A hazánkban lévô kritikus helyzetet mutatja, hogy mind a férfiak, mind a nôk vonatkozásában világviszonylatban is Magyarországon a legnagyobb a szájüregi daganat miatt meghaltak aránya (323; 80). A megoldáshoz a rendszeres és szigorú sztomato-onkológiai szûrésen, korai kezelésen kívül, epidemiológiai és biológiai vizsgálatokra is szükség lenne (14; 332)! A legújabb kísérleti adatok a NO. szerepét kimutatták a szájüregi daganatokkal kapcsolatban is (42; 44; 43). A szájüregben a másik kiemelendô tényezô a fogakkal kapcsolatos gyulladásos két nagy csoportba sorolhatók: dentális és parodontalis eredetû gyulladások. A fog kemény szöveteinek a szájüregi felszínén kezdôdô és mélybe haladó irreparábilis roncsolódása a caries, különösen a fejlett ipari országokban elterjedt. A szuvasodás progrediálása a fogbél (pulpitis), a gyökércsúcs körüli fogágy (periodontitis apicalis) és további szövetek gyulladásához vezethet (1). A fogakat rögzítô szövetek gyulladása a fogágybetegség (gingivitis ill. parodontitis) elôforduló bakteriális eredetû gyulladásos betegsége (257). A fogágybetegség a fogszuvasodással szemben nem civilizációs ártalom, mivel a magas egészségügyi kultúrával rendelkezô, fejlett ipari országokban alacsonyabb a betegség elôfordulási gyakorisága és intenzitása (102). Hazánkban a fogszuvasodás és a fogágybetegség is népbetegség. Felmérések szerint a fogszuvasodás elterjedtsége majdnem 100%-os, a lakosság közel 90%-a szenved ínygyulladásban, és ezek 15-20%-ának az állapota súlyosnak tekinthetô (102; 142). Hazánk ezeknek a betegségek gyakorisága tekintetében is az élen jár az európai rangsorban. Az állam fogászati ellátásra a CIX/1999 törvény szerint 2000-ben csak 10,41 milliárd forintot azt jelenti, hogy átlagosan minden állampolgárra 1041 Forint jutott. Ez

15


átlag huszadánál is kevesebb volt. Emellett a lakosság csupán 2.5 tubus fogkrémet ill. 0,56 fogkefét használ átlagban fejenként évente, így nem is csoda, hogy egy átlagos 12 éves gyermeknek - ebben a korban mégcsak éppen áttörtek a maradó fogak - már több mint 4 foga beteg, szuvas, tömött vagy hiányzik (142). Ez a helyzet hatvanöt év feletti lakosság mintegy fele pedig már teljesen fogatlan. Annak ellenére, hogy a fogbetegségek maradandó szövethiányt okoznak, az antibiotikumoknak köszönhetôen már nem lehet e betegségek szövôdményeinek következtében meghalni. Emiatt sokan úgy gondolják, hogy ezek jelentéktelen betegségek, egy fog elvesztése “nem olyan nagy probléma”, mert van másik. Ha viszont a fogászati problémákat a beteg szemével nézzük a az egész embert befolyásolja, tudatát erre az érzésmodalitásra fókuszálja, megzavarja az éjszakai pihenését és a probléma megoldódásáig elvonja a figyelmét az élet egyéb területeirôl,

minden

életkorban

megkeserítheti

a

mindennapokat.

A

fogbetegség

következménye a foglazulás, illetve a fogvesztés emésztési, esztétikai és fonetikai problémákat is okoz. Az állatvilágban ez pusztulást jelenthet az állat számára, mivel a fogaik segítségével védik meg magukat, ragadják és ölik meg a zsákmányt, aprítják fel, illetve ôrlik meg a táplálékukat (ennek elkerülésére az egyes állatfajok a hiányzó fogaikat biológiailag pótolni tudják). Az embernél a civilizációnak (tudománynak és technikának) köszönhetôen a foghiány következményei kielégítôen rendezhetôek, azonban volumenük miatt mégis társadalmi-

epidemiológiai és klinikai vizsgálatok alapján megerôsítést nyert, hogy a fogászati fertôzések nem függetlenek a szervezet egészétôl. szemléletváltozás történik ezen a területen. A legújabb vizsgálatok alapján ismét nagyobb hangsúlyt kap, hogy a fogakkal kapcsolatos gyulladásos betegségek nem csupán lokális problémát okoznak, hanem gócként viselkedhetnek. Belôlük a vérkeringésbe kerülô baktériumok és termékeik miatt általános szervezeti betegségek, elsôsorban a szív és érrendszeri betegségek kiemelkedô rizikófaktorai is lehetnek (314; 77; 204; 205; 262; 131; 18; 109; 61; 102; 285; 189). A cardiovascularis betegségeken kívül a tudományos vizsgálatok a fogászati gócok és a diabétesz, koraszülés, alacsonyabb újszülött súly és a respiratoricus betegségek között is összefüggést mutatnak (15; 133; 214; 286; 239; 61; 102). A fogászati gócok azonban nem csupán bizonyos betegségekre hajlamosíthatnak, hanem a magas rizikócsoportba (mûbillentyû beültetés után, reumás és bakteriális endocarditisen átesett egyének, ízületi protézist viselôk, immunhiányos állapotban szenvedôk, haemodializis

16


alatt álló vesebetegek) tartozó betegek számára közvetlen életveszélyt jelenthetnek, vagy a beültetett protézisük elvesztését okozhatják a fogászati/szájsebészeti ellátásuk során létrejövô átmeneti bacteriémia következményeként. Ezt megelôzendô a Magyar Fogorvosok Egyesülete

ajánlotta a profilaxis alkalmazását a fogorvosok számára, illetve a Magyar Fogorvos szerkesztôsége szemléletformáló sorozatot indított a fogászati góckérdésrôl (64; 274; 250). Sajnos azonban kötelezô kezelési protokoll hazánkban még nem jelent meg! Mivel a cardiovascularis betegségek a vezetô halálokok hazánkban, legyôzésükhöz a rizikótényezôik okait is jobban meg kell ismerni. A fogászati/szájüregi kutatás valószínûleg a fenti adatok széleskörû ismeretének hiánya, és miatt nem kapja meg az ôt megilletô figyelmet és támogatást. A betegségek kórélettani az élettani háttér ismeretére is szükség van. A szájüregi kutatások a legkülönbözôbb biológiai anyagok élettani és kórélettani szerepét vizsgálták, de a .

hatásairól -ami az élettani hatásain kívül a fenti betegségekben is

lényeges lehet, mivel daganatkeltô és ellenes, illetve gyulladáskeltô és ellenes is lehet - alig van adat.

17


4. CÉLKITÛZÉSEK

Kísérleteinkben a NO. biológiai jelentôségét, élettani és kórtani hatásait vizsgáltuk a fogbélben és a fogágyban. Legfontosabb “fogas” kérdéseink, célkitûzéseink foglalhatók össze:

4.1. A NO. SZINTÁZ (NOS) ANATÓMIAI LOKALIZÁLÁSA A FOGBÉLBEN, AZ ÍNYBEN, A NERVUS ÉS ARTÉRIA ALVEOLARIS INFERIORBAN ÉS A GANGLION TRIGEMINALEBAN

A NO. szintáz (NOS) izoenzimek szájüregben történô anatómiai lokalizációja utalhat a NO. ezen területen betöltött szerepére, ezért

A. Vizsgálni kívántuk, hogy a fogbélben és az ínyben mely anatómiai képletek tartalmaznak NOS-t nyugalmi körülmények között. (Az indukálható NOS (iNOS) izoenzim

B. Tanulmányozni kívántuk, hogy van-e anatómiai alapja annak az elképzelésnek, hogy az alsó fogak és a fogakat rögzítô szövetek vérkeringésének regulációjában a NO. nemcsak lokálisan, hanem már a szervet ellátó artéria alveolaris inferior szintjén is részt vehet.

C. Vizsgálni kívántuk, hogy az alsó fogak és a fogakat rögzítô szövetek feltételezetten nNOS tartalmú idegrostjai származhatnak-e a nervus alveolaris inferioron keresztül a ganglion trigeminaleból, ami a szenzoros szerepüket vetné fel.

18


4.2. A NO. SZEREPE A FOGBÉL ÉS A FOGHÚS VÉRKERINGÉSÉNEK

A. Meg kívántuk határozni, hogy a NOS blokkolásnak és a NO. adásnak milyen hatása van a fogbél és a foghús nyugalmi véráramlására és érellenállására. Létezik-e a pulpát .

függô bazális vazodilatátor tónus, valamint az exogén NO. képes-e ezt az

értónust befolyásolni?

B. Vizsgálni kívántuk, hogy a NOS blokkolásnak és a NO. adásnak mi a hatása a perctérfogat fogfrakciójára. Hogyan viszonyulnak a fogban lezajló NO. függô hemodinamikai változások a szisztémás vérkeringés NO. függô redistribúciójához?

4.3.

A

NO.

JELENTÔSÉGE

A

FOGÁGYGYULLADÁS

PATOMECHANIZMUSÁBAN

A parodontitis kialakításában a dentális plakk Gram-negatív baktériumainak szerepe már tankönyvi adat (187; 22). Mivel a Gram-negatív baktériumok indukálják az iNOS izoenzimet, ezért felmerült annak a lehetôsége, hogy a NO. hozzájárul a fogágygyulladás kórfolyamatához. Feltevésünk alapján:

A. Meg kívántuk mérni az ínyszövetben a NOS konstitutív (cNOS) és indukálható (iNOS) formáinak enzimaktivitását. Hogyan befolyásolja ezeknek az enzimaktivitásoknak az értékét a bal alsó elsô ôrlôfog köré kötött fogágygyulladást kiváltó selyem ligatúra a ligatúra melletti, illetve a kontralaterális oldali ínyszövetben?

B. Meg kívántuk figyelni, hogy fogágygyulladásban, illetve kontroll körülmények között milyen anatómiai képletekben található iNOS

C. Vizsgálni kívántuk, hogy a szelektív iNOS blokkoló és peroxinitritkötô merkaptoetilguanidinnek (MEG) milyen a hatása a fogágygyulladás tüneteire, a plazma az alveolaris csontpusztulásra. Pozitív eredmények esetén felmerülhet a

19


szelektív

iNOS

gátlás

klinikai

terápiában

20

való

alkalmazásának

lehetôsége.


5. IRODALMI HÁTTÉR

5.1. AZ L-ARGININ/NO. RENDSZER

(A kötött oldalszám és az L-arginin/NO. rendszer információ robbanása miatt ebben az általáNOS pontban a többi fejezettôl eltérôen nem idézem minden egyes felfedezés szerzôjét, akiktôl ezúton is elnézést kérek, inkább fôként csak az összefoglaló publikációkra hivatkozom, amelyek a részleteket tartalmazzák.)

5.1.1. A NO. felfedezése

A NO. szabad gyök az 1980-as évek elôtt még csak egyike volt a levegôt szennyezô, a cigarettafüstben is kimutatható, karcinogén gázmolekuláknak, melyet összefüggésbe hoztak a savas esôk kialakulásával és az ózon réteg pusztulásával egyaránt. Napjainkra ennek az egyszerû és igen bomlékony gázmolekulának a megítélése alapvetôen megváltozott. A kis molekulájú, párosítatlan elektronja miatt rendkívül reakcióképes, erôsen mérgezô NO. -ot sok mindennek gondolhattuk, csak biológiai “Jolly-Jokernek” nem. Az élettani mûködések túlnyomó részét nagy méretû, összetett fehérjék és egyéb vegyületek szabályozzák, melyek .

egyszerû szerkezetéhez képest. Jelenleg a NO. -ot tekintjük

az új típusú, gázhalmazállapotú hírvivôanyagok elsô képviselôjének az élô szervezetben. Bár régóta tudjuk, hogy bizonyos baktériumok tartalmaznak NO. -t, korábban senki sem gondolta, hogy egy ilyen nagy reakcióképességû molekula fontos szerepet játszhat az emlôsök életmûködéseiben (218; 234; 139; 186). A NO. molekula biológiai hatásainak felfedezéséhez az 1980-as évek végén három kutatási terület találkozása vezetett: 1) Az endogén nitrátok és a makrofágok citotoxikus hatásának összefüggése: Már múlt század elején megfigyelték, hogy a bejutó mennyiséget meghaladó mennyiségben ürül az emberi szervezetbôl. Ezt akkor a belekben élô baktériumok termékének vélték, és nem tulajdonítottak neki jelentôséget. 1981-ben mutatták csak ki, hogy a nitrátképzôdés a beleken kívül is történik (110). Majd megfigyelték, hogy fertôzések, lázas állapotok esetén a kiválasztott nitrát vegyületek mennyisége akár a tízszeresére is emelkedhet, és ebben a

21


makrofágok nitrát termelésének nagy szerepe van (311). Bebizonyosodott továbbá, hogy a makrofágok daganatsejtölô és baktériumpusztító hatásáért

.

a

felelôs, ami a nitrát képzôdésnek a prekurzora (200; 122). 2) Az endotélium eredetû érellazító faktor (EDRF) kutatása: 1980-ban Furchgott és Zawadzki felfedezte, hogy az acetilkolin az intakt izolált artériákon dilatációt, az endothelium rétegétôl megfosztott izolált artériákon pedig kontrakciót vált ki. Az endothelium által termelt, az értágításért felelôs rejtélyes szubsztrátot EDRF-nek nevezték el (97). 1987-ben sikerült az EDRF azonos a NO. -dal (138; 255). 3) A vazodilatátor nitrátok hatásmechanizmusának tanulmányozása: A vazodilatátor az angina pectorisban kifejtett kedvezô hatásuk miatt, már több mint száz éve használják a gyakorlatban, azonban hatásmechanizmusukat sokáig homály fedte. Az 1980-as években bebizonyosodott, hogy a nitrovazodilatátorok is NO. képzôdéséhez vezetnek, és ezen keresztül aktiválják a guanilát-ciklázt az érfal simaizom sejtjeiben. (SNP) spontán, egyéb organikus nitrátok tiol csoporttal (pl. cisztein) érintkezve szabadítanak .

-ot (227; 228; 140; 88).

5.1.2. A NO. keletkezése az emlôs szervezetben

5.1.2.1. A NOS izoenzimek NO. bioszintézise és mûködésük szabályozása

A NOS enzimnek legalább három izoformája létezik a szervezetben, amelyek mindegyike igényeli a flavin-adenin-dinukleotid, flavin-mononukleotid, tetrahidrobiopterin, hem és cink kofaktorok jelenlétét. Szubsztrátjuk a NADPH, molekuláris oxigén és az L-arginin aminosav, amit azonban L-arginin tartalmú dipeptidek, mint az L-homoarginin és L-arginin-Laszparagin helyettesíthetnek, de az L-arginin D-enantiomerje már nem prekurzora a NO. szintézisnek. Az L-arginin terminális N-guanidino csoportjából a dimerizálódott NOS enzim .

keletkezik. Az L-citrullint az arginilszukcinilsav szintetáz L-

argininszukcináttá alakítja ATP és aszparaginsav felhasználásával, majd az arginilszukcinát fumársavvá és L-argininné alakul. A fumársavból a mitokondriumban a citrátkör útján aszparginsav képzôdik, miközben ammónia épül be. Ennek a módosított ureaciklusnak így két

22


szerepe van, egyrészt a NO. szintézise, másrészt sejtanyagcsere során termelôdött ammónia

A klasszikus csoportosítás szerint a NOS-nak a következô fôbb izoformái ismeretesek:

5.1.2.1.1. A konstitutív NOS (cNOS)

A cNOS állandóan jelen van a sejtekben, aktivációja fôként poszttranszlációs kontroll alatt áll, melyek közül kiemelendô az intracelluláris Ca2+ szint emelkedése. Stimulációja után rapidan és tranziensen pikomólnyi mennyiségben termel NO. -ot. Az elsôként leírt anatómiai lokalizáció alapján két típusa van:

5.1.2.1.1.1. A neuronális NOS (nNOS, vagy NOS 1)

Ez az elsôként klónozott NOS, amelynek molekula tömege 160 kDa. kromoszómán helyezkedik el. A nNOS megtalálható a szomatikus és a vegetatív idegrendszer neuronjaiban és idegrostjaiban is, ahol a neurotranszmisszióban van szerepe. Kimutatták a az idegrendszeren kívül is pl.: a tüdô és a gyomor hámsejtjeiben, a nyálmirigyek acinussejtjeiben, az endothelsejtekben és a vázizomban is.

23


5.1.2.1.1.2. Az endothelialis NOS (eNOS, vagy NOS 3)

Az endothelsejtekben a NOS 135 kDa-os izoformáját izolálták. Az eNOS génje a 7. kromoszómán található. A bazális eNOS aktivitást fokozzák az extracelluláris jelzômolekulák (acetilkolin, bradikinin, P-anyag stb.) receptoraikhoz való kötôdése, vagy az endothelsejt mechanikai deformálása, membránjára ható nyíró erô erôsôdése, amelyek a NO. szintézisén keresztül vazodilatációhoz vezetnek. Az eNOS izoforma fellelhetô még pl.: a syncytiotrophoblastokban, a vese tubuláris epithelsejtjeiben és a hippocampus neuronjaiban is.

5.1.2.1.2. Az indukálható NOS (iNOS, vagy NOS 2)

A cNOS-sal ellentétben az iNOS nyugalmi körülmények között nem található meg a sejtekben, de a bakteriális endotoxinok és/vagy a különbözô citokinek (pl.: interleukin-1 (IL1),

tumornekrózis-faktor-alfa

(TNF-α),

gamma-interferon)

hatására

elsôsorban

a

fagocitákban, a kültakaró sejtjeiben, de az általánosan elfogadott felfogás szerint valószínûleg a szervezet bármely sejtjében több órás latenciával, de novo egy 125-130 kDa molekula kromoszómán lévô kódológén átíródása után. Az iNOS megjelenése után maximálisan aktív, hosszú idôn keresztül nanomólnyi mennyiségben termel NO. -ot, aminek a mikroorganizmusok elleni védekezésben és a citotoxikus reakciókban van szerepe (352). A cNOS-zal ellentétben az iNOS aktivitás fôként transzkripciós szinten regulálódik, az intracelluláris Ca2+ szint változása nem befolyásolja.

Bár a fenti csoportosítás ma már nem teljesen állja meg a helyét (a cNOS is indukálódhat bizonyos esetekben, az iNOS konstitutívan is jelen lehet egyes sejtféleségekben, az iNOS által termelt nagymennyiségû NO. -nak nemcsak szövetkárosodást okozó következményei lehetnek pl. terhességben, stb.), de a nemzetközi irodalomban mégis ez a hagyományos felosztás jelenleg az irányadó. A NOS mindhárom izoformáját sikerült klónozni, aminosav sorrendjük kb. 50%-os azonosságot mutat. Egyéb, az emlôs szervezetben elôforduló enzimek közül a citokróm P-450 reduktázzal fedezhetô fel jelentôs szekvencia homológia, amely a gyógyszermetabolizmusban is fontos szerepet játszó citokróm P-450-nek juttat elektronokat. Egy sejtben több izoenzim is

24


expresszálódhat élettani körülmények között is, amit a patológiás állapotok még tovább kombinálhatnak. Alacsony celluláris L-arginin szint mellett a NOS képes szuperoxid szintézisre is. A végtermékgátlás mindegyik izoformánál megfigyelhetô, a NO. negatív feedback hatást fejt ki a saját szintézisére. A NO. biológiai szerepének megismerésében nagy segítséget .

donor vegyületek (pl.: 3-morfolinoszidnonimin (SIN-1), nitroprusszidnátrium

(SNP), S-nitrozo-N-acetilpenicillinamin (SNAP)), illetve az L-arginin szintetikus analógjai (pl.: G

G

G

N -nitro-L-arginin (NOLA), N -nitro-L-arginin-metil-észter (L-NAME), N -monometil-Larginin (L-NMMA)), amelyek képesek a NOS kompetitív gátlására (256; 113; 220; 225; 272; 179). Jellemzô, hogy a gátlás sztereospecifikus, a D-enantiomernek nincs hatása a NOSra és a gátlás L-argininnel kivédhetô. Ezek a széles körben alkalmazott NOS blokkolók azonban nem szelektíven gátolják a különbözô NOS izoenzimeket. Szelektív NOS blokkolók (pl.: nNOS szelektív blokkoló a 7-nitroindazol (7-NI), iNOS szelektív blokkoló az aminoguanidin (AG)) kísérleti alkalmazása a NOS izoenzimek funkcióinak jobb megismerését segítették elô (221). Mellékhatásoktól mentes, nem toxikus, könnyen NOS izoenzim blokkolók jelenleg is intenzív fejlesztés alatt állnak. ( 39; 219; 218; 234; 302; 235; 240; 352; 20; 304; 316; 60; 353; 139; 174; 186; 271).

5.1.2.2. A nem enzimatikus NO. képzôdés

A NO. keletkezhet nem enzimatikusan az acidótikus hatásra létrejövô kémiai nitrit redukcióból (8; 24; 82; 364; 207; 360). A szervezetben ennek a NO. képzôdésnek élettani jelentôsége az alacsony pH-jú gyomorban, a parodontalis plakkban élô savtermelô baktériumok környezetében (lásd 5.2.1.) vagy ischemiás, gyulladásos kórfolyamatokban is lehet (148; 8; 24; 82; 364; 207; 360). A NO. képzôdhet még nem enzimatikusan gyulladásos szövetekben a hidrogénperoxid és az L-arginin reakciójából is (231).

5.1.3. A NO. hatásmechanizmusa

25


A NO. egy új típusú, a régebben ismert szabályozó anyagoktól alapvetô tulajdonságaiban

különbözô

szignálmolekula.

Bioszintézise

után

rendkívül

gyorsan

szétdiffundál, mivel mind vízben, mind lipidekben jól oldódik. Életideje 6-10 másodperc gyök könnyen lép reakcióba más molekulákkal. A szintetizálódott NO. kilép a sejtbôl, és a hatását a környezô sejtekre fejti ki, a vérbe kerülve oxihemoglobin jelenlétében rendkívül gyorsan nitráttá eliminálódik. A nagy reakciókészsége behatárolja a NO. parakrin hatásainak idôtartamát, és biztosítja, hogy a hatás lokalizált maradjon. A NO. nak nincsen a hagyományos értelemben vett receptora, a NO. (1) fémekkel, (2) szabad gyökökkel és (3) oxigénnel lép reakcióba (139; 186). A különbözô nagyságrendû

NO.

koncentrációknál eltérô kölcsönhatások fordulhatnak elô, illetve ezek keveredhetnek is

1/a) A NO. legismertebb és legáltalánosabb célpontjai a guanilát-cikláz és egyéb A NO. stabil kovalens kötésbe lép a hem vassal, eközben a vas kiemelkedik a porfirin gyûrûbôl, megváltozik az enzim konformációja, ami a guanilát-cikláz aktiválódásához vezet. A guanilát-cikláz enzim katalizálja a guanozintrifoszfát konverzióját ciklikus guanozinmonofoszfáttá (cGMP), ami a sejttôl függôen több folyamatot is elindíthat. Ilyen pl.: a cGMP-függô proteinkináz specifikus intracelluláris fehérjék foszforilálása, ami módosítja a sejtfunkciókat, közvetíti a simaizom ellazulást, a szignáltranszdukciót az idegrendszerben; a cGMP-foszfodiészteráz a cAMP degradáción keresztül a NO. -cGMP és a cAMP hírközlô útvonalak egymásra hatását befolyásolja; a cGMP-függô aspecifikus kation csatornáknak pedig egy jellegzetes képviselôje található a fotoreceptorokban.

.

hem protein target a ciklooxigenáz. A NO. koncentrációjától függôen serkenti vagy gátolja a ciklooxigenázt, ugyanakkor a ciklooxigenáz termékei is befolyásolják a NOS aktivitását módosítva ezzel pl. a gyulladásos választ. Szintén a NO. hem vas interakción keresztül gátlódik a citokróm P-450, a citokróm oxidáz, a kataláz és a NOS enzim is. A citokróm P450 gátlás megváltoztatja különbözô endogén és exogén anyagok metabolizmusát, farmakokinetikáját. A mitokondriális elektron transzport lánc terminális enzimének a citokróm oxidáz inhibiciójának a sejtlégzés szabályozásában van élettani szerepe, a kataláz blokkolás O2 mediált citotoxicitást, baktericid aktivitást, a NOS enzim végtermékgátlása

2

.

termelést (5.1.2.1.), de az iNOS mediált endotheliális diszfunkcióban

26


1/b) A NO. rapidan lép redoxreakcióba a fém oxigén komplexekkel, ennek legprominensebb példája az oxihemoglobin NO. oxidálása, ami methemoglobint és nitrátot A vörösvértestek ezzel a NO. katabolizmusában domináns reakcióval az erek felé irányuló jelentôs diffúziós grádienst, erôteljes NO. drenázst hoznak létre. 1/c) Ezenkívül számos olyan enzim létezik, amely nem hem prosztetikus csoport formájában tartalmaz vas atomot, leggyakrabban vasszulfid alakban, amelyekkel a NO. reakcióba lép és az enzim aktivitásának csökkenését okozza. Ilyen pl. a mitokondriális és a citoplazmatikus akonitáz inhibiciója, aminek következményeként gátlódik a sejt energia a csökkent ferritin szintézise miatt kialakuló vas anyagcserezavar a sejt életmûködését, növekedését, oxidatív folyamatainak katalizálását károsítja. Ezek a .

direkt citotoxikus hatásaihoz.

2) Mivel a NO. szabadgyök, ezért könnyen lép reakcióba más szabadgyökökkel is. A ribonukleotid reduktáz tirozil gyökének és a NO. interakciójának eredményeként a DNS szintézis zavart szenved, aminek a NO. mediált mikroorganizmusok és tumorsejtek elleni citotoxikus mechanizmusban van szerepe. A lipid peroxidációban a NO. megköti a lipid lipidhidroperoxi gyököt és így leállítja a lipidszabadgyökök önmaguk újraképzôdését felerôsítô láncreakcióját. Ez a fô mechanizmusa a NO. oxidatív stressz ellenes védôhatásának. A szuperoxid és elsôsorban az iNOS által nagymennyiségben szintetizált NO. kombinációjából keletkezô nagyon reaktív peroxinitritnek az oxidációs és nitrációs (NO2+) reakciókban van kiemelkedô szerepe. Alacsony L-arginin, vagy magas lipoprotein koncentráció esetén a NOS szintén képes szuperoxid termelésre, ezért a NOS-t bizonyos feltételek teljesülése esetén peroxinitrit szintáznak is nevezhetjük. A peroxinitrit féléletideje kb. 1 szekundum, de ez elegendô, hogy szignifikáns interakciókba lépjen a biomolekulákkal. Vizes oldatban protonálódik, így képes nitráttá izomerizálódni. A peroxinitrit a hatásait csak részben önmaga, inkább a peroxinitrit és a széndioxid interakciójából kialakuló nitrozoperoxikarbonát, NO2. és CO3- . szabadgyökökön keresztül fejti ki. A peroxinitrit oxidációs reakciói közül a lipidperoxidáció következtében kialakuló membrán károsodás, a mitokondriális légzési komplexek oxidálása miatt létrejövô sejtlégzés zavar, a glutation oxidációja következtében csökkent enzim regenerációs képesség, a DNS oxidációja, törése és mutagenézis indukálása a ma ismert fôbb mechanizmusok. Másik fontos következménye a peroxinitrit képzôdésének a tirozin fenol gyûrûjének nitrálása, ami a 3-nitrotirozin kialakulásához vezet. A 3-nitrotirozin detektálását sokáig a peroxinitrit in vivo biomarkerének

27


tartották, de az újabb adatok azt mutatják, hogy a 3-nitrotirozin a peroxinitrittôl függetlenül is keletkezhet a NO. oxidált intermedierjei, azaz a reaktív nitrogén szpecieszek reakciói által. A szuperoxid dizmutáz (SOD) nitrációja gátolja az enzim aktivitását, ami a szuperoxid eliminálásának csökkenése miatt a peroxinitrit képzôdést segíti elô. A citoszkeleton nitrálódása a sejt architektúrájának dezorganizációját okozza. A prosztaciklin szintáz nitrációja gátolja a .

és az arachidonsav metabolizmus kölcsönhatásának

további lehetôsége. Nitrációja a protein tirozin-kináznak gátolja a saját foszforilációját, ezzel az intracelluláris jelközvetítô kaszkád mûködését. 3) Vizes oldatokban a NO. molekuláris oxigénnel lép reakcióba és nitritté alakul nitrogéndioxid és dinitrogéntrioxid intermediereken keresztül. Mivel mind a NO. és az oxigén is lipofil karakterû, a reakciójuk nagyon jelentôsen felgyorsul a hidrofób biológiai membrán kompartmentekben. Nagymennyiségû NO. termelôdés esetén a dinitrogéntrioxid szignifikáns +

) okoz, ami N-nitrózaminok és S-nitrozothiolok képzôdéséhez vezet. A N-

nitrózaminokat teszik felelôssé egyéb tényezôk mellett a krónikus gyulladásos talajon kialakuló rákkeltésért. Az S-nitrozothiolok NO. donor molekulák, szerepük lehet a NO. raktározásában és szállításában. Ezenkívül az S-nitrozációt a legújabb adatok alapján széles körben elterjedt, a foszforilációhoz hasonló regulációs mechanizmusnak tartják. Intracelluláris metabolikus útvonalak, transzkripciós faktorok, receptorok és ioncsatornák szabályozásában is részt vesz. (irodalmi áttekintés: 218; 234; 238; 7; 73; 21; 30; 20; 316; 60; 153; 307; 260; 139; 186; 193)

5.1.4. A NO. mint élettani szabályozó molekula

Az L-arginin/NO. /cGMP reakcióláncolatot leginkább az erekben tanulmányozták, ahol a mechanizmus lényege a következô: a véráramlás hatására keletkezô nyíró erô és a perfuzátumba kerülô számos lokális mediátor (pl.: acetilkolin, bradikinin) aktiválja az eNOS enzimet az endothel sejtekben. A frissen szintetizálódott NO. a kis méretének és lipofil tulajdonságának köszönhetôen átdiffundál a szomszédos simaizomsejtbe, aktíválja a guanilát cikláz enzimet a hem kofaktorához kötôdve. A következményes cGMP szint növekedés protein foszforiláción keresztül a citoszól kálcium koncentrációjának csökkenéséhez, simaizom relaxációjához és így vazodilatációhoz vezet (218; 234; 352). Az endotheliumból

28


felszabaduló NO. a perfúzió beállításán kívül befolyásolja az érfal permeábilitását, gátolja az érfal simaizom proliferációját, valamint a vérlemezkék aggregációját és adhézióját és a leukociták kitapadását is, ezért trombózis és gyulladásellenes hatású is. Az arteriolákban állandóan érvényesül a NO. tónusos értágító hatása. Az állandó, tónusos jellegû NO. felszabadulás mellett egyes változó intenzitású fiziológiai tényezôk is .

-ot, mely viszont fázisos jellegû. Az egyik tényezô mechanikai: a

véráramlás sebeségének fokozódása az endothelsejtekre ható nyíróerôk növekedése következtében növeli az endothelsejten belüli kálcium szintet, ezzel a NOS aktivitását. Ezzel a hatással a prekapilláris rezisztenciaerekben bekövetkezô értágulat visszahat a megelôzô artériaszakaszra is, minthogy a véráramlás sebessége az arteriolatágulat eredményeként ott is megváltozik (retrográd vasodilatatio). Ilyen módon az endothelsejtek a keringésben áramlási érzékelôként (szenzorként) is mûködnek, és a vazodilatátor anyag kibocsátásával az érkalibert

.

szerepet játszik az idegrendszer morfogenézisében,

antero- és retrográd nem konvencionális transzmitterként mûködik. A NO. -ot azért tartjuk atípusos neurotranszmitternek, mert nem raktározódik vezikulákban, nem kvantumokban szabadul fel az idegingerület hatására és nincsen a szokványos értelemben vett receptora sem. A NO. -erg idegek a központi idegrendszerben a szinaptikus plaszticitás befolyásolásán keresztül a tanulás, a memória és a viselkedés, a gasztrointesztinális és az urogenitális traktusban a szfinkterek tónusának, a perisztaltikának, a szekréciónak a szabályozásában, a cardiovascularis rendszerben a lokális értónus kialakításában, a respiratórikus rendszerben a légutak simaizomtónusának a beállításában és a belsôelválasztású mirigyek szekréciójának szabályozásában is részt vesznek. Újabb felfogás szerint, élettani-kórélettani szerepét tekintve a NO. ambivalens karakterû, “Jánus arcú” molekula az emlôs szervezetben, mert míg a cNOS által termelt kis .

jelátvivô és citoprotektív, addig az iNOS által nagy mennyiségben szintetizált

NO. viszont már citotoxikus hatású is lehet. Gyulladásban az endotoxinok és a citokinek triggerelik az iNOS expresszióját. A nagy mennyiségben termelôdô NO. szerepet játszik a nem specifikus immunitásban, toxikus a baktériumokra, vírusokra, gombákra, protozoonokra és a tumorsejtekre is (218; 234). A NO. önmagában valószínûleg kevésbé mérgezô mint ahogy korábban gondolták, a NO. által mediált toxikus hatásokért részben a NO. és a szuperoxid kombinációjából keletkezô peroxinitrit és ebbôl tovább képzôdô ma még

29


kutatások tárgyát képezô, nagy oxidációs képességû vegyületek (reaktív nitrogén szpecieszek mint pl. a nitrogéndioxid gyök) a felelôsek. (irodalmi áttekintés: 40; 219; 218; 234; 302; 78; 238; 7; 73; 21; 30; 281; 195; 20; 316; 320; 60; 153; 260; 139; 174; 186; 193)

30


5.1.5. NO. kórélettani vonatkozásai és klinikai jelentôsége

Általánosságban

megállapíthatjuk,

hogy

a

NO.

fiziológiai

koncentrációban

citoprotektív hatással bíró hírvivô molekula, de a túltermelôdése már toxikus lehet a gazdaszövetekre. Ezért a pathomechanizmustól függôen bizonyos betegségekben, ahol az eNOS ill. nNOS csökkent aktivitású, a NO. koncentrációját a célszövetekben fokozni kell az élettani szintre. Ezzel szemben más esetekben, ahol az iNOS ill. nNOS aktivitás túlfokozott, a NO. koncentrációjának csökkentésére van szükség. Az L-arginin/NO. útvonal klinikai farmakológiai módosítása újfajta megközelítést, jelentôs elôrelépéseket hozhat a különbözô

A gyógyászatban már régóta rutinszerûen alkalmazzák a korábban említett NO. donor nitrovazodilatátorokat

(lásd

5.1.1.)

iszkémiás

terápiájában. Újabban hatásosnak bizonyult

szívbetegségek, .

hipertenzív

krízisek

inhalációban alkalmazva

pulmonalis hipertóniában, respiratoricus distress szindrómában és bronchopulmonalis displasiaban is. Endotheliális diszfunkcióban, atheroszklerózisban a csökkent NO. termelôdés vazospazmushoz, trombózishoz, iszkémiához, érfal simaizom proliferációhoz vezet. Per os vagy infúzióban adott L-arginin ezekben a kórképekben javítja a károsodott endothelium függô vazorelaxációt, gátolja a trombózisképzôdést. A corpus cavernosum NO. szintjét növelô anyag adása az erekciós eredetû impotencia kezelésében lehet bíztató. Vizsgálatok igazolták, hogy a gyerekek pylorus stenózisának kialakulásáért feltehetôen a lokális nNOS

Sok adat gyûlt össze a NO. és a következményes reaktív nitrogén szpécieszek gyulladásban játszott szerepérôl. Az endotoxinok és a citokinek triggerelik az iNOS expresszióját, ami nagymennyiségû NO. keletkezéséhez vezet. Az ennek következtében kialakuló kifejezett vazodilatáció bakteriális szepszisben drámai vérnyomás csökkenést és keringésösszeomlást eredményez, amely a NOS gátlásával megfordítható. Krónikus gyulladásokban pl.: izületi gyulladás, vagy autoimmun betegségekben a túltermelôdô NO. szövetkárosodásokhoz vezet, míg véreztetéses sokkban a vaszkuláris dekompenzációban játszik szerepet. A NOS gátlók azonban nemcsak a túlzott NO. szintézisért felelôs iNOS-t, hanem a fiziológiailag szükséges cNOS-t is blokkolják, ami túlzott vazokonstrikcióhoz, a mikrocirkuláció zavarához és a vitális szervek károsodásához vezethet, ezért a szelektív iNOS gátlók használata a célravezetô megoldás. Az agyi iszkémiában létrejövô neurotoxicitást

31


részben az excesszíven felszabaduló excitatórikus glutamát NMDA receptorok túlingerlésének következtében az nNOS-ból felszabaduló nagymennyiségû NO. mediálja, ezért a NOS blokkolók alkalmazása, különösen a szelektív nNOS gátlószerek ígéretes eredményt mutatnak. Hasonló mechanizmusnak lehet pathogenetikai szerepe a neurodegeneratív folyamatokban is, mint pl.: az Alzheimer, vagy a Huntington kór. A perivaszkuláris idegek túlzott nNOS aktivitása is lehet bizonyos fejfájások oka, amit a NOS blokkolók jótékony hatásai igazolnak. NO. koncentráció csökkentô hatású lehet még a NOS izoenzim gén expressziójának szelektív blokkolása, a NOS kofaktorainak redukciója, vagy a NO. gyökfogók és a peroxinitrit dekompozícióját elôsegítô szerek alkalmazása is. az L-arginin/NO. szubsztitúció új terápiás lehetôségeket kínálhat számos egyéb betegség kezelésében is, azonban a gyógyászatban történô alkalmazásuk még további kutatásokat, ismereteket kíván (irodalmi áttekintés: 219; 78; 238; 7; 73; 21; 30; 264; 316; 60; 226; 153; 260; 139; 193; 347).

5.2. A NO. A SZÁJ EGYES RÉSZEIBEN

5.2.1. A NO. a szájüregben

A NO. a következô módokon kerülhet a szájüregbe: (1) a ki-belégzett levegôvel, (2) a szájüreget körülvevô szövetek, nyálmirigyek NOS izoenzimjeibôl, (3) képzôdhet a szájüregben a baktériumok nitrit reduktáz enzimén keresztül, vagy (4) keletkezhet nem enzimatikus nitrit redukcióból is (45; 33; 82; 266; 195; 360; 280). Hogy a szájüregi levegôben és nyálban milyen tényezôk befolyásolhatják a NO. megoszlását e két kompartment között, valamint a NO. és a nitrit, illetve a nitrit és a NO. konverzióról a nyálban, jelenleg még alig van adat. A civilizáció kialakulásával az emberiség lokálisan nagy mennyiségû NO. -ot jutatott be a szájüregbe a dohányfüsttel (400-1000 ppm, 236), a szennyezett levegôvel (266), vagy a nyelv alól felszívódó antihipertenzív nitrovazodilatátor szerekkel. A szájüregi NO. képzôdés mellett szól, hogy a szájon át kilégzett levegô NO. koncentrációja (5-15ppb) magasabb, mint a tracheostomian keresztül kilégzett levegô NO. koncentrációja, de kisebb mint az orron át kilégzett

levegô

NO.

koncentrációja

az

32

orrmelléküregek

nyálkahártyája

által


nagymennyiségben termelt NO. miatt (195). A kilégzett levegô NO. tartalmát a különbözô légzôszervi gyulladások fokozzák, ezért a kilégzett levegô NO. koncentrációjának a mérése gyors, noninvaziv diagnosztikus és terápiás monitorozása lehet a légzôszervi betegségeknek (195; 79). A nyálmirigyek is szekretálnak NO. -ot a szájüregbe, amely idegi szabályozás alatt áll (33). A szájüreget körülvevô szövetek NOS izoenzimjeiben (elsôsorban az iNOS-ban, lásd 8.2.1.) szintetizálódott NO. is bediffundálódhat a szájüregbe, illetve a sulcus gingivae-n keresztül a szájüregbe kerülô fehérvérsejtek iNOS enzime is hozzájárulhat a nyál NO. tartalmához (160; 233; 76; 280). A nyál nitrátot és nitritet a szájüregben élô baktériumok anyagcseréjükhöz és az egymás elleni küzdelemben is felhasználhatják (49; 50; 300; 4). Baktériumok, fôként a nyelvháton élôk a nitrát reduktáz enzim által a nyál nitrátból képzett nitritettel védekeznek többek között a többi mikroorganizmus ellen (327; 330; 82; 195; 81). Ezért az lehet annak a klinikai tapasztalatnak a magyarázata, hogy a széles spektrumú antibiotikum kezelés után orális candidiasis alakulhat ki, hogy az antibiotikum elpusztítja a Candida Albicans ellenes küzdelemben részben a fenti mechanizmust is felhasználó baktériumokat (81; 82). A nyál nitrit .

képzôdhet az alacsony pH-jú cirkumdentális területeken nem

enzimatikusan is (lásd 5.1.2.2.) (148; 82; 360), úgy mint a gyomorban (24; 207). Lépcsôzetesen emelkedô koncentrációjú nitrites szájöblítéssel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a nitrit redukció kapacitása a szájüregben nem limitált, a reakció limitáló tényezôje inkább a nitrit koncentrációja lehet (360). A bakteriális enzimatikus nitrát és a nem enzimatikus nitrit redukció eredményezheti a NO. és a nitrit koncentrációjának paralell növekedését orális nitrát bevitel után (82; 360). Ezt igazolja, hogy nitrát bevitel után klórhexidinnel, vagy bikarbonátos szájvízzel való szájöblítés után a kilégzett NO. koncentrációja azonnal lecsökkent, valószínûleg az antiszeptikus hatás, illetve a pH fokozása miatt (360). Ezek a szájöblítôk nemcsak nitrát bevitel után, hanem normális körülmények között is csökkentik a kilégzett NO. koncentrációját, igaz, hogy kisebb mértékben, ami a nyál .

tartalmának a kilégzett NO. -hoz való nyugalmi hozzájárulására utal (360).

A plakk anaerob denitrifikáló baktériumainak nitrit reduktáz enzime is termelhet NO. ot. Ezek a baktériumok nitritet használnak fel a légzésükhöz, ahol a NO. egy intermedier (106; 45), viszont ezek a baktériumok a NO. -ot toxicitása miatt alacsony koncentráción tartják. A szájüregnek a légutaktól való izolálása után NO. mentes levegô beinjektálását 30 másodperccel követôen a szájüregi levegô NO. koncentrációja 44,3±4,9 ppb-ot ér el (50).

33


Figyelemre méltó, hogy ez az érték szignifikánsan alacsonyabb a dohányzókban (további részletek a 8.2.2. pontban) (50). Mivel a nyál NO. és nitrit tartalma baktérium, gomba és vírus ellenes hatású is lehet, a NO. fô funkciója feltételezhetôen a gazdaszervezet szempontjából a szájüregben a lokális szövetek, a tápcsatorna és a légutak védelme a behatoló mikroorganizmusok ellen (lásd még 5.2.1.1.). Ezt az elképzelést támasztja alá az a megfigyelés is, hogy a szájhigiéne elhagyása miatt létrejövô plakk depozíció szignifikánsan fokozza a .

és a nyál nitrit koncentrációját (50). A NO. elleni védekezésül az aerob

baktériumok NO. dioxigenáz enzimet használnak, ami egy indukálható flavohemoglobin és a NO. -ból O2 dependensen nitrátot szintetizál (lásd 8.2.2.) (101; 100). Elképzelhetô az is, hogy a szájüregben keletkezô NO. a légutak egyéb területén képzôdô NO. -dal együtt mint “aerokrin mediátor” a bronchus átmérô és tüdô keringés beállításához is hozzájárulhat (195). Hogy a szájüregi NO. mennyire abszorbeálódik a szájüreget bélelô szövetekben és milyen lokális hatásai lehetnek (vérkeringés, epithelialis permeabilitás szabályozás (lásd 8.1.3., 8.2.1.)) még nem lett vizsgálva, jövôbeli kutatási

További figyelemre méltó érdekesség, hogy egyes vérszívó ízeltlábúak nyálából .

kötô/szállító hemoproteint, nitroforint kimutatni, ami a megcsípett szervezetbe

inokulálva segíti a vérszívást, mivel értágító és véralvadás csökkentô hatású (273; 339; 357).

5.2.1.1. Az enterosalivalis nitrát/nitrit/NO. körforgás

A szájüreg fontos bemenete és része az enterosalivalis nitrát/nitrit/NO. körforgásnak (1. ábra) (82; 195). Bizonyos zöldségfélék (pl.: spenót, saláta) és a feldolgozott húsok (pl. kolbász) a fô forrásai a szájon át bekerülô nitrátnak/nitritnek. A nitrát nitritté redukálódik enzimatikusan a nyelv dorzális részén élô baktériumokban (lásd 5.2.1.), majd a lenyelt nitrit NO. -dá redukálódik kémiailag a gyomor savas közegében nem enzimatikus módon (lásd 5.1.2.2.) (24; 82; 195; 207). Az így képzôdô NO. -nak fontos szerepe van az aspecifikus immunitásban, védi a szervezetet a lenyelt kórokozók ellen. A megmaradt és a NO. -ból visszaoxidálódott nitrát felszívódik a bélcsatornából, a vérkeringésben ehhez adódik hozzá a szervezetben bioszintetizálódótt NO. oxidációjának stabil végtermékeként képzôdô nitrát, a vérkeringésbôl a nitrát a vesékben kiválasztódik, vagy a nyálmirigyekben szekretálódik a

34


szájüregbe és a körforgás újra indul (110; 111; 356; 62; 82; 195). A pozitív korrelációban van a plazma nitrát tartalmával, átlagosan 9-szerese a plazmaszintnek (111; 108; 62). A táplálék, ivóvíz és/vagy a nyál magas nitrit/nitrát szintje a korábbi ismereteink alapján káros, mert betegségek etiológiai tényezôje lehet. gyógyszerekbôl karcinogén nitrózaminokat (lásd 5.2.1.) képezhet a bélcsatornában (bár az epidemiológiai vizsgálatok nem mutattak ki egyértelmû összefüggést a nitrátbevitel és a gyomorrák között), vagy a hemoglobin két vegyértékû vasát három vegyértékû vassá transzformálva methemoglobinaemiát hozhat létre (151; 269; 71; 84; 125; 270; 330; 92; 168; 340). Ez a hagyományos szemlélet az utóbbi években megváltozni látszik, mert a nitrát bevitel következtében a tápcsatornában keletkezô nitrit, majd NO. protektív hatású is lehet az itt élô és a folyamatosan bekerülô mikroorganizmusokkal szemben és elképzelhetô, hogy a gyomor vérkeringésének, izomtónusának és nyákszekréciójának szabályozásában is részt vehet (lásd 5.2.1.) (82; 195; 340). Eddig nem is sejtettük, hogy a nyálba szekretálódó nagy mennyiségû, .

körforgásban keringô jodidionnak mi lehet a szerepe. Mivel a jodidion

jelentôsen fokozza a savas környezetben a nitrit NO. -dá alakulását, ezért így hozzájárulhat a szájüreg és a gyomor védekezôrendszeréhez (83; 82). A nyálban, gyomornedvben és a táplálékban is jelen lévô aszkorbinsav viszont függetlenül a pH-tól és a pH csökkentésén keresztül is fokozza a nitrit redukcióját NO. -dá, ezért a fogágygyulladás prevenciójában a szájüregben a baktérium ellenes hatása és az ínyszövetben a gyulladásban keletkezô szabad gyökök ellenes antioxidáns hatása (lásd 8.2.2.) is szinergizálhatja egymást, melyek jelentôségét a többszáz éve ismert, elsôsorban hajósokon megfigyelt skorbut jellegzetes parodontalis panaszai is igazolnak, illetve a korábban említett gyomor funkciók regulációját is elôsegítheti (184; 16; 24; 82; 194; 360).

--------------------------------------------------------------------------------------------------------1. ábra. Az enterosalivalis nitrát/nitrit/NO. körforgás. A szájüreg fontos bemenete és része az enterosalivalis nitrát/nitrit/NO. körforgásnak. Bizonyos zöldségfélék (pl.: spenót,

35


saláta) és a feldolgozott húsok (pl. kolbász) a fô forrásai a szájon át bekerülô nitrátnak/nitritnek. A nitrát nitritté redukálódik enzimatikusan a nyelv dorzális részén élô baktériumokban, majd a lenyelt nitrit NO. -dá redukálódik kémiailag a gyomor savas közegében nem enzimatikus módon. Az így képzôdô NO. -nak fontos szerepe van az aspecifikus immunitásban, védi a szervezetet a lenyelt kórokozók ellen. A megmaradt és a NO. -ból visszaoxidálódott nitrát a bélcsatornából felszívódik a vérkeringésbe, amihez hozzáadódik a szervezetben bioszintetizálódótt NO. oxidációjának stabil végtermékeként képzôdô nitrát is. A vérkeringésbôl a nitrát vagy a vesékben kiválasztódik, vagy a nyálmirigyekben szekretálódik a szájüregbe és a körforgás újra indul. További részleteket lásd

36


5.2.2. A NO. a fogbélben és a foghúsban

Már a NO. felfedezése elôtt ismertté váltak olyan megfigyelések a fogbélben és a foghúsban, melyek mai ismereteink szerint a NO. szerepére utalhatnak mint pl. az, hogy a pulpa cGMP tartalma pulpitisben fokozódik (lásd 8.1.3.2.) (306; 35). Ugyancsak emelkedik a cGMP a fog mechanikai stimulációja után a parodontalis fibroblastokban és a fogmeder osteoblastjaiban (lásd 8.1.3.3.) (67; 68; 69). Fogszabályozáskor a fogakat gyorsabban el lehet mozdítani mechanikai erô és piezoelektromos áram együttes alkalmazásával, amiben szintén cGMP által mediált mechanizmusnak van szerepe, mert a cGMP festôdés intenzitásást az elektromos áram tovább fokozza az egyedüli mechanikai stimuláció által kiváltott növekedéshez képest a fenti sejtekben (66; 70). A nitroprusszidnátriumot (SNP) és a nitroglicerint (NTG) erôteljes vazodilatátor hatása miatt anélkül, hogy tudták volna, hogy ezt a NO. leadásán keresztül hozza létre szintén használták a fogbél hemodinamikájának tanulmányozására (lásd 8.1.3.1.1.) (165; 166; 242). A iv. SNP-dal kiváltott vérnyomás csökkenés nem változtatta meg a fogbél vascularis rezisztenciájának és vér viszkozitásának hányadosaként kifejezett fogbél “vascularis hindrance”-át az ugyanilyen mértékû vérnyomás esést okozó aorta okklúzióval és véreztetéssel szemben, ami a SNP (NO. ) jelentôs lokális vazodilatációs hatására utal (165; 166). A NTG pedig lokálisan, kavitáson keresztül a fogbélbe jutatva fokozta a véráramlást (242). Mivel a célkitûzésekben megfogalmazott, a NO. szerepét a fogbélben és a foghúsban vizsgáló kísérleteinket ezen a területen az elsôk között publikáltuk, ezért az elôttünk megjelent kis számú, részben csak absztraktjában angol nyelvû (orosz, kínai) szakcikkeket a publikációink megjelenése óta napvilágot látott nagy mennyiségû irodalmi adat diszkuttálásával

37


6. MÓDSZEREK

A célkitûzéseink megvalósítására a következô 3 kísérletsorozatot végeztük el:

6.1. A NOS ANATÓMIAI LOKALIZÁLÁSA AZ ÍNYBEN, A FOGBÉLBEN, A NERVUS ÉS ARTÉRIA ALVEOLARIS INFERIORBAN ÉS A GANGLION TRIGEMINALEBAN

6.1.1. Sebészeti beavatkozások

Kísérleteink egy részét 6 db 2-2.5 kg testsúlyú macskán végeztük. A kísérletet az állatok 24 órán keresztül éheztek, de vizet szabadon fogyaszthattak. A macskákat 50 mg/kg nátrium-pentobarbitál intraperitoneális injekcióját követôen, terminális anesztézia állapotában a jobb pitvar átvágása után transzkardiálisan kanülön keresztül perfundáltuk. A perfúzióhoz elsô lépésként 250ml 0.9 %-os fiziológiás sóoldatot, majd 1000ml 0.1 M nátriumfoszfát pufferrel (pH 7,4) készített 4 %-os paraformaldehid oldatot használtunk. Az alsó és felsô szemfogak melletti bukkális ínyt, az alsó és felsô szemfogak kihúzása és feltörése után a pulpaszövetet, a canalis mandibulae képleteit (a nervus és artéria alveolaris inferiort), valamint a ganglion trigeminalét eltávolítottuk és 4 %os paraformaldehid oldatban utófixáltuk. A szövetblokkokat 20 % szaharóz 0.1 M nátriumfoszfát puffer (pH 7,4) oldatában 4 °C-on egy estén keresztül elôkezeltük, majd fagyasztó mikrotómmal 30-60 µm-es hossz és kereszt sorozatmetszeteket készítettünk. A fagyasztott metszetek párhuzamos sorozatain nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-diaforáz (NADPH-d, egy lehetséges NOS marker (129; 72)) enzimhisztokémiai és nNOS immunhisztokémiai reakciókat végeztünk Dawson és mtsai. (72) szerint. NOS lokalizációs kísérleteink másik részét 6 db 15-36 kg-os (más élettani kísérlethez használt) kutyából post mortem eltávolított felsô szemfog melletti bukkális ínyen és felsô szemfog fogbélen végeztük. A szöveteket 0.1 M nátriumfoszfát pufferrel (pH 7,4) készített 4 %-os paraformaldehid oldatban 1 hétig 4 °C-on immerziós fixálással tartósítottuk. A további procedúra azonos a fent leírtakkal.

38


6.1.2. A NADPH-diaforáz enzimhisztokémiai kimutatása

A metszeteket 0.1 M nátriumfoszfát pufferben többször átöblítettük, majd a NADPHd hisztokémiai reakció végzéséhez olyan oldatban inkubáltuk, amelynek minden millilitere 1 mg nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot (NADPH), 0,1 mg nitroblue tetrazoliumot és 0.1% Triton X-100-at tartalmazott. Az inkubációt 37 °C-os vízfürdôben végeztük. A reakció menetét mikroszkóp alatt követve, az elôhívást 3-4 pufferes öblítéssel akkor állítottuk le, amikor sötétkék axonok/szövetelemek jelentek meg a metszetben. A metszeteket ekkor tárgylemezre szárítottuk és DePeX segítségével fedôlemezzel lezártuk. A kontroll metszetekben ahol a NADPH hiányzott az oldatból, nem találtunk jelölt struktúrákat.

6.1.3. A nNOS immunhisztokémiai kimutatása

A párhuzamos metszeteket alapos pufferes öblítés után 1%-os H2O2-ben, majd 10%os normál kecskeszérumban elôkezeltük, hogy a nem-specifikus immunjelölés mértékét A metszeteket ezután nyúlban termelt anti-nNOS primer antiszérum 1:1000 oldatában 24-48 óra hosszat 4 °C-on inkubáltuk. Pufferes öblítések után a metszeteket biotinhez kötött kecske antinyúl szekunder antiszérummal (hígítás mértéke: 1:100) 3 óra Harmadik lépésként avidin-biotin-peroxidáz komplexet tartalmazó oldattal (1:100) reagáltattuk a metszeteket 3 óra hosszat szobahôn. Az immunkomplexet 3,3,-diaminobenzidin (DAB) segítségével tettük láthatóvá. A metszeteket ezt követôen tárgylemezre szárítottuk és DePeX felhasználásával lefedtük. A kontroll metszetek inkubáló oldataiból kihagytuk a primer vagy a szekunder antitesteket.

6.1.4. Anyagok

A

nátrium

pentobarbitált

(Nembutál)

a

Phylaxia-Sanofi-tól

(Budapest),

kecskeszérumot, a kecske antinyúl szekunder antiszérumot, az avidin-biotin komplexet tartalmazó oldatot (ABC Vectakit Elite) a Vector Laboratories-tôl (Peterborough, UK), az anti-nNOS primer antiszérumot a Transduction Laboratories-tôl (Affiniti Research, UK) vásároltuk. Minden egyéb anyagot a Sigma KFT-tôl (Budapest) szereztünk be.

39


6.2.

A NO. HATÁSA A FOGBÉL ÉS A FOGHÚS VÉRKERINGÉSÉRE

6.2.1. Sebészeti beavatkozások

Kísérleteinket 19 db ip. 50 mg/kg kloralóz és 300 mg/kg uretán kombinációjával altatott, 2.7-4 kg súlyú hím macskán végeztük. A mûtétet megelôzôen keresztül éheztek, de vizet szabadon fogyaszthattak. A kísérlethez mindkét femoralis artériát balt referencia vérminta vételhez), a bal brachialis artériát (referencia vérminta vételhez), a bal femoralis vénát (anyag beadáshoz) és a tracheát (O 2-vel dúsított szobalevegôvel történô) mesterséges lélegeztetéshez (Harvard Apparatus Co., South Natick, MA, USA) megkanüláltuk. A lélegeztetés térfogatát és frekvenciáját, valamint az artériás pH-t (iv. nátrium bikarbonát injekcióval) úgy állítottuk be, hogy az artériás pO2, pCO2 és pH fiziológiás tartományban maradjon. Intercostalis mellkasfal megnyitás után a bal pitvar fülcséjén keresztül a bal pitvarba polietilén kanült vezettünk (izotóp beadáshoz), amit a fülcséhez dohányzacskó öltéssel rögzítettünk. Az állatok heparint kaptak iv. 200 U/kg dózisban, hogy elkerüljük a kanülök bealvadását. Az állatok a hasukon feküdtek a kísérlet alatt.

6.2.2. Kísérleti protokoll

A mûtétet minden esetben 30 perces nyugalmi periódus követte. Az állatokat két csoportba osztottuk. Mindkét csoportban kontroll körülmények között meghatároztuk a fog véráramlását, érellenállását, a középvérnyomást, a szívfrekvenciát, a szívperctérfogatot, a vérgázokat és a vér pH-ját. Az elsô csoportban az állatok (n=9) iv. 30 mg/kg kompetitív NOS inhibitor NG-nitro-L-arginin (NOLA) (113; 220; 179) infúziót, a második csoportban az állatok (n=10) iv. 1 mg/kg NO. donor 3morfolinoszidnonimint (SIN-1) (88; 89; 342; 346; 27; 341) kaptak 5 perc alatt. 15 perccel az anyagbeadás után ismét meghatároztuk a fenti paramétereket. A kísérleti protokollt jóváhagyta a Pennsylvaniai Egyetem Institutional Animal Care and Use Committee-je.

6.2.3. Általánosan mért élettani paraméterek

40


Az artériás középnyomást a jobb a. femoralis katéteren át (Statham p23/d elektromanométer, Spectamed, Hato Rely, Puerto Rico) és a kilégzett levegô CO2 tartalmát (End-tid IL 200 CO2 monitor, Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, USA) Grass poligráfon (Model 7D, Quincy, MA, USA) folyamatosan regisztráltuk. A rectalis o

C-on tartottuk hômérsékletszabályozó (Model 73A, Yellow Springs

Instrument Co., OH, USA) által irányított infravörös lámpa ki-bekapcsolása révén. Az artériás bal femoralis artériából anaerob módon vett vérmintákból Radiometer vérgázanalizátorral (ABL-30, Koppenhága, Dánia) mértük.

6.2.4. A fogbél és a gingivomucosalis szövet véráramlásának mérése rádióaktivan

A fogbél és a gingivomucosalis szövet véráramlásának mérésére rádióaktív izotóppal jelzett 15 µm átmérôjû mikrogyöngyöket használtunk Buckberg és mtsai. (46), Malik és mtsai. szerint, mivel a 8-9 µm átmérôjû mikrogyöngyök a pulpális söntökön nem akadnak fent (210; 166). Ez a módszer általánosan elfogadott a fog és a gingivomucosalis szövet véráramlásának mérésére (261; 185; 210; 165; 105; 149). A kísérletekben 5 különbözô izotóp (95Nb, 57Co, 85Sr, 113Sn, 46Sc; DuPont, Boston, MA. USA) közül random módon kiválasztott két különbözô izotóppal jelzett mikrogyöngyöket (kb. 3,5*106) fecskedezünk az anyagbeadás elôtt ill. 15 perccel utána a bal pitvarba 10 másodperc alatt, majd ezt 30 másodpercen keresztül 2 ml fiziológiás sóoldattal mostuk be. Ezalatt két referencia vérmintát szívtunk le Hardvard pumpával (Dover, Mass, USA) a bal a. femoralisból és a. brachialisból 1 ml/perces sebességgel. A vérmintavétel 20 másodperccel a mikrogyöngy beadás elôtt kezdôdött és folyamatosan a beadás után 2 percig tartott. A kísérlet az állatokat Nembutállal túlaltattuk. A gingivomucosalis szövetet bukkális oldala mellôl lefejtettük és kivágtuk. Ezután a többi foghoz képest a nagyobb fogbél (ami biztosítja a megfelelô számú mikrogyöngy tartalmat (46)), valamint képest az egyszerûbb sebészeti beavatkozás miatt a felsô szemfogakat kihúztuk. A parodontalis szöveteket a fogakról alaposan eltávolítottuk, majd a fogakat fiziológiás sóoldatban lemostuk, itatós parírral letöröltük. Az eltávolított szövetek súlyát lemértük. A szövet és a vérmintákat 7ml-es boroszilikát szcintillációs csövekbe helyeztük (Kimble, Toledo,

41


OH, USA) és Pacard többcsatornás autogamma szcintillációs spektrométeren (5000 Series, Downers Grove, IL, USA) megmértük részleges átfedést mutat, az alábbi leolvasási határokat alkalmaztuk: 57Co, 80-150; 113Sn, 340430; 85Sr, 460-560; 95Nb, 700-800; és

46

Sc 810-1400 keV, és az átfedésbôl adódó hibát

megfelelô számítógépes program segítségével korrigáltuk. Az áramlás számításánál a mért két referencia vérminta aktivitásértékének számtani közepét vettük figyelembe. A szövetek véráramlását a következô képlet alapján határoztuk meg:

BF=100*AS*WR/AB*TW

ahol: BF

=

a fog, illetve a gingivomucosalis szövet véráramlása (ml/perc/100g)

AS

=

a szövetminta rádióaktivitása (beütésszám)

WR

=

a pumpa visszaszívási sebessége (ml/perc)

AB

=

a referencia vérminta rádióaktivitása (beütésszám)

TW

=

a szövetminta súlya (g)

A

fog,

illetve

a

gingivomucosalis

szövet

vascularis

rezisztenciáját

(Hgmm/ml/perc/100g) a vérnyomás (Hgmm) és a megfelelô szövet véráramlásának

A perctérfogatot a következô képlet segítségével fejeztük ki (197): CO=NAI*WR/AB

ahol: CO

= a perctérfogat (ml/perc)

NAI

= a nettó beadott aktivitás (a beadás elôtti teljes aktivitásból levonva a szerelékekben

(fecskendô, zár, kanül) visszamaradt aktivitást) (beütésszám) WR

= a pumpa visszaszívási sebessége (ml/perc)

AB

= a referencia vérminta rádióaktivitása (beütésszám)

A perctérfogat fogfrakcióját BF/100/CO/grammban kifejezett testsúly képlettel

42


A fenti paraméterek százalékos változásait a 100-szor a beadás utáni paraméter/kontroll paraméter formula segítségével határoztuk meg. Az itt ismertetett módszerrel mért fog véráramlás abszolút értéke nem azonos a fogbél véráramlásának abszolút értékével, mert a fogszövet mintánk (TW) a fogbélen kívül a fog kemény szöveteit is tartalmazta. Ugyanakkor, mivel a fog kemény szöveteinek nincs külön vérkeringése, a fog vérkeringésének százalékos változásai megegyeznek a fogbél vérkeringésének százalékos változásaival az abszolút értékük különbözôsége ellenére is. Ezért a fog vérkeringésének relatív változásait a fogbél vérkeringésének relatív változásaiként

A gingivomucosalis szövet eltávolításánál törekedtünk arra, hogy minél kevesebb mucosa kerüljön a mintába, így a késôbbiekben ezt a szövetet inkább ínynek vagy foghúsnak nevezem.

6.2.5. Anyagok

Kloralózt, uretánt és a NOLA-t a Sigma Chemical Co.-tól (St Louis, MO. USA), a SIN-1-et a Cassella-tól, (Frankfurt, Németország) vásároltuk. Az anyagokból az oldatokat beadás elôtt mindig frissen készítettük el, a NOLA-t felhasználás elôtt szonikáltuk.

Az eredmények értékelésére egyfaktoros variancia analízist (ANOVA) használtunk statisztikai programcsomag segítségével Apple Machintos személyi számítógépen. A p<0,05 értékeket tekintettük szignifikánsnak. Konvencionálisan *-gal jelöltük a táblázatokban és az ábrákon a különbséget ha p<0,05, **-gal ha p<0,01 és ***-gal ha p<0,001. A szövegben és az ábrákon megadott értékek számtani középértékek, ± az átlag standard hibája (SEM), a zárójelben az n az esetszámot jelenti.

6.3.

A

NO.

JELENTÔSÉGE

PATOMECHANIZMUSÁBAN

43

A

FOGÁGYGYULLADÁS


6.3.1. Sebészeti beavatkozások és kísérleti protokoll

Kísérleteinket 30 db hím Wistar 280-400 g testsúlyú patkányon végeztük. A az állatokat ip. 35 mg/kg nátrium-pentobarbitállal elaltattuk, és a bal alsó elsô ôrlôfog köré sterilizált, fekete, 2/0-ás selyemfonalat helyeztünk, melyet a fog mesiális oldalán csomóztunk meg (275; 157; 208; 289; 278; 358; 115). bukkálisan, linguálisan és distálisan subgingivális, mesiálisan pedig supragingivális elhelyezkedésû volt. Az állatok ébredés után konvenciális laboratóriumi táplálékot és csapvizet ad libitum fogyaszthattak. A ligatúra felhelyezése után az állatokat három csoportra osztottuk. vehikulumot (fiziológiás sóoldatot) kaptak (naponta 4-szer, 8 napig). Ebbôl a csoportból 7 állatot gingivomucosalis NOS aktivitás méréshez, 3 állatot iNOS immunhisztokémiára, 6 állatot pedig gingivomucosalis érpermeábilitás és alveolaris csontpusztulás mérésre használtunk fel. A második csoport (n=7) 4-szer naponta 8 napig ip. 30 mg/kg szelektív iNOS blokkoló (304; 305) és peroxinitritkötô (319) merkaptoetilguanidin (MEG) kezelést kapott és a gingivomucosalis érpermeábilitás és az alveolaris csontpusztulás mérésére lett felhasználva. A harmadik csoport (n=7) a ligatúra felhelyezését leszámítva ugyanazon a procedúrán esett át mint abszolút kontroll csoport). Ezeket az állatokat a gingivomucosalis NOS aktivitás méréshez

A ligatúra felhelyezését követô 8. napon az állatokat újból elaltattuk ip. 35 mg/kg nátrium-pentobarbitállal, a mandibulát a ramusnál kivágtuk, megtisztítottuk és a metszôk között szaggitális síkban kettévágtuk. Mindkét mandibulafélen propria) az alsó elsô és a második moláris fogak vestibuláris és linguális oldaláról leválasztottuk, s a szomszédos alveolaris nyálkahártyával együtt kb. 3 mm-es csíkban kivágtuk a második ôrlô bukkális oldalának közepétôl kezdve, az elsô ôrlô körül, a második ôrlô linguális oldalának közepéig. A kimetszett gingivomucosalis szövetet a protokollnak megfelelôen vagy NOS enzimaktivitás mérésre, vagy iNOS anatómiai lokalizálásra, vagy érfalpermeábilitás mérésre használtuk. A NOS aktivitás méréséhez a gingivomucosalis szövetet a kimetszés után azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és a mérésig -80 °C-on az alveolaris csontpusztulás meghatározásához használtuk fel. A minden kísérletben ugyanaz a személy végezte.

44


6.3.2. A gingivomucosalis NOS enzimaktivitás mérése

A NOS aktivitását Szabó és mtsai. (322) által módosított Bredt és Snyder (41) módszerével határoztuk meg. A gingivomucosalis szövet homogenizátumban a kalcium függô L-arginin L-citrullinná alakulása a cNOS indikátora, a kálcium független L-arginin L-citrullinná az iNOS indikátora. A -80 °C-on tárolt gingivomucosalis szövetmintákat jégen homogenizáljuk egy 50 mM Tris/HCl-t, 0,1 mM EDTA-t, 12 mM merkaptoetanolt és 1 mM fenilmetilszulfonil fluoridot tartalmazó homogenizációs pufferban (pH 7,4) Tissue Tearor 985-370 homogenizálóval (Biospec Products, Racine, WI, USA). A cNOS aktivitás méréshez 30 µl homogenizátumot 20 percig inkubáltunk 22 °C-on 10 µmol/L [3H]-Largininnel (5 kBq/csô), 1 mM NADPH-val, 30 nM kalmodulinnal, 5 µM terahidrobiopterinnel és 2 mM kalcium kloriddal. Az iNOS aktivitás méréshez 30 µl homogenizátumot 20 percig inkubáltunk 22 °C-on 10 µmol/L [3H]-L-argininnel (5 kBq/csô), 1 mM NADPH-val, 30 nM kalmodulinnal, 5 µM terahidrobiopterinnel és 2 mM EGTA-val. A reakciót jéghideg 2 mM EGTA-t és 2 mM EDTA-t tartalmazó HEPES pufferrel (0,5 ml, pH 5,5) való hígítással állítottuk le. A reakció termékeket DOWEX (50W) oszlopra öntöttük és a kimosott [3H]-Lcitrullin aktivitást Wallac szcintillációs számlálón (Wallac, Gaithersburg, MD, USA) megmértük. Ezzel párhuzamosan a NOS-független citrullin képzôdés meghatározásához a minták NOS aktivitását legátoltunk 1 mM nem specifikus NOS blokkoló NOLA inkubációjával, ezt a citrullin képzôdésbôl levonva kaptuk a teljes NOS aktivitást. A NOS aktivitást mg proteinre vonatkoztattuk, a proteint Bradford módszerével mértük. A minták kis az elsô csoportból és a harmadik csoportból 7-7 állat gingivomucosalis szövetmintáit összevontuk és a méréseket csoportonként négyszer megismételtük.

6.3.3. Az iNOS anatómiai lokalizálása a gingivomucosalis szövetben

A sebészeti és a technikai leírást lásd az 6.1.1. és 6.1.3. pontoknál. A perfúzátumhoz a jobb fixálódás érdekében itt 0.1% glutaraldehidet és telített pikrin savat (pH 7,3) is adtunk. A primer 1:1000-es hígítású poliklonális nyúl anti-iNOS antiszérum, a szekunder pedig 1:500as hígítású biotinhez kötött kecske-antinyúl antiszérum volt.

45


6.3.4. A gingivomucosalis érfalpermeabilitás változásának meghatározása

A gingivomucosalis erek permeabilitásának változását Evans-kék extravazációval meg Gamse és mtsai-nak (98) módszere szerint. A szérum albuminhoz kötôdô festék az interstitium felé irányuló fehérjekiáramlás, azaz az érfalpermeabilitás fokozódás kimutatásásra a gingivomucosalis szövetben (115). Ebben az állatcsoportban a ligatúra felhelyezése utáni 8. napon altatás után (lásd 6.3.1.) megkanüláltuk a tracheát a zavartalan légzés biztosítására, a véna femorálist anyagbeadáshoz és az artéria femorálist vérnyomásméréshez (lásd 6.2.3.). perces stabilizációs periódus követte. Az állatok konstans testhômérsékletét (végbélben 38 °C) idôszakos infralámpás melegítéssel biztosítottuk. Az állatok a kísérlet folyamán a hátukon feküdtek. Az érfalpermeábilitás meghatározásához 2.5%-os Evans-kék (Reanal, fiziológiás sóoldatba oldva) oldatból a femorális vénába 50 mg/kg-ot adagoltunk állatonként. percben a gingivomucosalis szövet érrendszerében maradt festéket a jobb pitvar fülcséjének átvágása után az aorta abdominálisba a beadás utáni 5. percben behelyezett katéteren keresztül retrográd irányban befecskendezett 40 ml fiziológiás sóoldattal kimostuk. A gingivomucosalis szövetmintát kimetszettük (lásd 6.3.1.), nedves súlyát lemértük. Az extravazálódott Evans-kék tartalmát szobahômérsékleten, sötétben, 48 óráig tartó formamidos (1 ml) áztatással kivontuk, 620 nm-en spektrofotométerrel (Spectromon) kalibrációs görbe segítségével meghatároztuk (34) és µg/g gingivomucosalis szövet egységben fejeztük ki.

6.3.5. Az alveolaris csontrezorpció meghatározása

Ugyanabból a kísérletbôl ahol az érfalpermeábilitást mértük az elsô alsó ôrlôfogak alveolaris csontrezorpcióját is megmértük Crawford és mtsai. (63) módosításával. Az elsô alsó ôrlôfogak alveolaris csontrezorpcióját a meziális és a mediolinguális gyökerek linguális felszínének tengelye mentén, a zománc-cement határ és az alveolaris csontperem távolságának lemérésével határoztuk meg. A távolságot preparációs mikroszkópon (Wild M32) keresztül videókamerával monitorra (Phillips) vetítjük, ahonnan egy intézetünk mûhelyében készített analizátor segítségével a távolság digitálisan leolvasható. minden mérés elôtt bekalibráltuk. A kép nagyítása a képernyônél 69 szeres, az alkalmazott optikai és elektronikus nagyítás mellett jobb mint 10 µm.

46


A ligatúra által kiváltott csontsorvadást a ligatúrás és a kontralaterális kontrol oldal

47


6.3.6. Anyagok

A nátrium pentobarbitált (Nembutál) a Phylaxia-Sanofi-tól (Budapest), a 2/0-ás selyemfonalat a Medicortól (Budapest) vásároltuk. A MEG-et Southan és mtsai. (305) alapján készítettük el. A nyúl anti-iNOS antiszérum Dr. M. Currie (Monsanto Co., St. Louis, MO, USA) ajándéka volt, a 6.3.3. többi anyagának a beszerzési helyét lásd a 6.1.4-nél. Minden egyéb terméket a Sigma Chemical Co.-tól (St Louis, MO. USA ill. Budapest)


Az eredmények statisztikai analízisére a Student-féle kétmintás t-tesztet használtuk. A p<0,05 értékeket tekintettük szignifikánsnak. Konvencionálisan *-gal jelöltük különbséget ha p<0,05, **-gal ha p<0,01. A szövegben és átlagértékek ± SEM, zárójelben n az esetszám.

48


7. EREDMÉNYEK

7.1. A NOS ANATÓMIAI LOKALIZÁLÁSA

7.1.1. A fogbélben

Kutya és macska szemfog pulpa kötôszövetében csak nagyon kevés NADPHdiaforázzal jelzett (NADPH-d+) inkább perivascularis mint a mátrixban szabadon futó idegrost volt látható. A pulpaszövet hosszmetszetében követhetô az enyhén varicosus rostok érmenti lefutása, jelentôs elágazódás vagy terminális hálózat kialakulása nem volt megfigyelhetô (2/b,c. ábra).

Nem

találtunk

NADPH-d+

axonokat

vagy

terminálisokat

a

stratum

periodontoblasticumban. Macskában és kutyában hasonló eloszlást mutatott a nNOS immunhisztokémiával jelzett idegrostok mintázata is (2/a,d. ábra). Mindkét fajban az erek endothel sejtjei NADPH-d reaktívok voltak.

, mind kutyában NADPH-d hisztokémiával diffúz, erôs reakció volt megfigyelhetô az egész epitheliumban (

). Az endothel sejtek citoplazmájában szintén

diffúz, de világosabb volt a festôdés. Alkalmanként egyes metszetekben NADPH-d+ makrofágok és hízósejtek is megjelentek a kötôszövetben. Viszont erôsen jelölôdô, gazdag hálózatú, arborizálódó idegrostokat találtunk a szubepiteliális kötôszövetben (lamina propria), az erek köré csoportosulva követte azok lefutását, más része a mucosalis epithelium közelében lokalizálódott (

). A nNOS immunhisztokémia alkalmazásával

azonos jelölési mintázatot találtunk az idegképletekben mindkét kísérleti speciesben.

49


7.1.3. A nervus és artéria alveolaris inferiorban

Számos NADPH-d+, illetve nNOS immunpozitív axont találtunk macskában a nervus alveolaris inferior idegrostjai között, valamint jelölt enyhén varicosus idegrostokat az artéria 2/f,g. ábra). Az artéria alveolaris inferior endotheliuma jellegzetes csomós jelölést mutatott NADPH-d reakció után.

7.1.4. A ganglion trigeminaleban

Tekintélyes számú idegrost és fôként kis méretû ganglionsejt mutatott NADPH-d+ és nNOS immunreaktivitást a macska trigeminális ganglionban (

).

A kontroll metszeteken ahol az inkubáló oldatból kihagytuk a primer vagy a szekunder antitestet, nem jelent meg nNOS immunreakció az egyik vizsgált képletben sem.

------------------------------------------------------------------------------------2. ábra. NNOS és NADPH-diaforáz reaktív idegrostok kutya és macska fogbélben és (a) NNOS immunreaktív idegrostok (nyílhegyek) a fogbél gyökér részében A macska fogbél gyökér részének paralell metszetében futó NADPH-diaforáz pozitív idegrostok (nyílhegyek). (c) NADPH-diaforáz reaktív idegrostok (nyílhegyek) a fogbél koronai részében macskában. (d) NNOS pozitív axonok a fogbél koronai részében kutyában. (e) NADPH-diaforáz reaktív idegkötegek (nyílhegyek) és diffúz, erôs NADPH-diaforáz az epitheliumban macska ínyben (a nyílak az epithelium-kötôszövet határára mutatnak). (f) NADPH-diaforáz reaktív axonok (nyílhegyek) a nervus alveolaris inferiorban macskában. (g) NNOS immunpozitív idegrostok (nyílhegyek) közvetlen közelében kutyában. (h) NADPH-diaforáz reaktív kis méretû neuronok és axonjaik a macska trigeminális ganglionban. A fekete vonal mindegyik képen 50 µm-nek felel meg.

50


51


7.2. A NO. HATÁSA A FOGBÉL ÉS A FOGHÚS VÉRKERINGÉSÉRE

7.2.1. A NOS blokkolás és a NO. adás hatása az általános élettani paraméterekre

A kontroll és a 15 perccel a 30 mg/kg kompetitív NOS blokkoló NOLA (n=9), illetve az 1 mg/kg NO. donor SIN-1 (n=10) beadása után mért élettani paraméterek az 1-es, illetve a 2-es táblázatban találhatóak. A kiindulási élettani paraméterek nem különböztek a két csoportban. A NOLA-val kezelt csoportban az artériás középnyomás szignifikánsan növekedett, a perctérfogat és az artériás pO2 szignifikánsan csökkent, míg a szívfrekvencia, az artériás pCO2 és a pH nem változott (1. táblázat ). A SIN-1-gyel kezelt csoportban az artériás középnyomás és az artériás pO2 szignifikánsan csökkent, a többi mért élettani értékben a változás nem volt szignifikáns (2. táblázat).

52


1. táblázat

élettani paraméterek artériás középnyomás (Hgmm) szívfrekvencia (szám/perc) perctérfogat (ml/perc) artériás vér pH artériás vér pCO2 (Hgmm) artériás vér pO2 (Hgmm)

Az élettani paraméterek a NOLA beadása elôtt és 15 perccel a NOLA beadása után kontroll

NOLA után

szignifikancia

118.1±4.8 233.2±11.9 511.4±57.9 7.39±0.01 37.5±0.3 160.5±11.8

148.7±6.4 204.1±16.2 283.1±46.0 7.35±0.01 38.3±1.0 112.7±15.1

** n.s. *** n.s. n.s. *

A NOS inhibitor NOLA-t 30 mg/kg dózisban, 5 perc alatt iv. adtuk be macskába. Az adatok számtani középértékek ± az átlag standard hibája, n=9, n.s. nem szignifikáns, * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001.

Az élettani paraméterek a SIN-1 beadása elôtt és 15 perccel a SIN-1 beadása után

artériás középnyomás (Hgmm) szívfrekvencia (szám/perc) perctérfogat (ml/perc) artériás vér pH artériás vér pCO2 (Hgmm) artériás vér pO2 (Hgmm)

kontroll

SIN-1 után

szignifikancia

125.1±5.6 223.2±7.7 547.6±49.2 7.36±0.01 39.1±1.1 124.4±4.3

71.9±7.3 208.6±10.0 775.7±129.6 7.34±0.01 39.1±1.0 77.0±5.2

*** n.s. n.s. n.s. n.s. ***

A NO. donor SIN-1-et 1 mg/kg dózisban, 5 perc alatt iv. adtuk be macskába. Az adatok számtani középértékek ± az átlag standard hibája, n=10, n.s. nem szignifikáns, ***p<0.001.

53


7.2.2. A NOS blokkolás és a NO. adás hatása a fog és a gingivomucosalis szövet véráramlására és érellenállására

A fog (a pulpa és a keményszövetek összsúlyára normalizált) véráramlása 11.3±2.5 ml/perc/100g (n=9) volt a NOLA csoportban, 17.6±4.5 ml/perc/100g (n=7) a SIN-1 csoportban kontroll helyzetben. A kiindulási véráramlási értékek nem különböztek a két csoportban. A véráramlás NOLA beadás után 15 perccel a kontroll 53±13%-ára esett (p<0,01), míg SIN-1 után 15 perccel csak enyhén (82±12%-ra) csökkent (

).

A fogbél kontroll érellenállása a NOLA (20.9±6.8 Hgmm/ml/perc/100g, n=9) és a SIN-1 csoportban (10.1±2.0 Hgmm/ml/perc/100g, n=7) statisztikailag nem különbözött egymástól. Az érellenállás a kontroll 367±69%-ára (p<0,01) nôtt NOLA kezelés után, míg SIN-1 hatására 73±10%-ára csökkent (p<0,05) (

).

A gingivomucosalis szövet véráramlására nyugalmi körülmények között 21.4±2.5 ml/perc/100g (n=9) volt, ami a NOLA beadás után 15 perccel a kontroll 62±14%-ára esett (p<0,05), érellenállása 9.5±1.6 Hgmm/ml/perc/100g (n=9), ami a kontroll 299±80%-ára

.

adás hatása a perctérfogat fogfrakciójára

Sem a NOLA (n=9), sem a SIN-1 (n=7) csoportban nem változott szignifikánsan a perctérfogat szemfogra jutó frakciója a beadásuk után 15 perccel, 109±27% a NOLA csoportban és 111±27% a SIN-1 csoportban az anyagbeadás elôtti értékhez képest.

54


100

80

**

60

40

20

0

1

NOLA

SIN-1

3. ábra. 30 mg/kg NOS inhibitor NOLA (n=9) és 1 mg/kg NO. donor SIN-1 (n=7) hatása a macska szemfog rádióaktívan jelzett mikrogyöngy módszerrel mért Az adatok a kontroll százalékában kifejezett értékek átlaga ± standard hibája. 100% a vízszintes vonal, ** p<0,01 a kontrollhoz képest.

55


**

A fogbél érellenállása

(a kontroll százalékában)

400

300

200

*

100

0

1

SIN-1

NOLA

4. ábra. 30 mg/kg NOS inhibitor NOLA (n=9) és 1 mg/kg NO. donor SIN-1 (n=7) hatása a macska szemfog érellenállására. Az adatok a kontroll százalékában kifejezett értékek átlaga ± az átlag standard hibája. 100% a vízszintes vonal, ** p<0,01 és * p<0,05 a

56


7.3. A NO. SZEREPE A FOGÁGYGYULLADÁS PATOMECHANIZMUSÁBAN

A bal alsó elsô ôrlôfog köré kötött ligatúra felhelyezését követô 8. általános élettani paraméterek (testsúly lásd 6.3.1.; artériás középnyomás lásd 7.3.3.) nem különböztek a ligatúrát nem kapott kontroll állatokéhoz képest. Lokálisan viszont a ligatúra körül erôteljes gyulladásos klinikai tünetek voltak megfigyelhetôek, a mért mutatókat az alábbiakban ismertetem:

7.3.1. A ligatúra hatása a gingivomucosalis szövet cNOS és iNOS enzimaktivitására

Ligatúrát nem, de vehiculumot kapott kontroll állatok (n=7) gingivomucosalis szövetében jelentôs mennyiségû cNOS aktivitást (a két oldal átlaga: 299±56 fmol/mg protein/perc) és kis mennyiségû iNOS aktivitást (a két oldal átlaga: 60±7 fmol/mg ). A ligatúra több mint négyszeres iNOS aktivitás fokozódást okozott a gingivomucosalis szövetben a kontralaterális (kontroll) oldalhoz képest (245±52 versus 58±8 fmol/mg protein/perc, n=7, p<0,01), de a cNOS aktivitást sem az ipsilaterális, sem a kontralaterális ).

7.3.2. Az iNOS lokalizálása parodontitisben

A kontroll gingivomucosalis szövetben néhány kötôszöveti sejtet kivéve nincs iNOS ). Nyolc nappal a ligatúra felhelyezése után a szövetminta ligatúrás oldalán jelentôs számban megnövekedett az iNOS immunpozitív gyulladásos sejtek (makrofág, PMN leukocita, plazma sejt, limfocita) száma a tunica propriaban (

). Az

epithelium bazális és a legfelsô rétege erôsen festôdött, különben a hám enyhén volt reaktív (6/d. ábra). A hám felszíne keratinizálódott ( mutattak enyhe immunpozitivitást (

). Egyes erek és fibroblastok is

). Említésre méltó, hogy a ligatúrás és a kontroll

oldalon is egyaránt látható volt a kötôszövetben néhány iNOS reaktív idegköteg (

57

).


7.3.3. A MEG hatása a vérnyomásra, plazma extravazációra és az alveolaris csontpusztulásra

Az Evans kék extravazáció mérése elôtt az artériás vérnyomást a 4-szer naponta 8 napig ip. vehikulummal, vagy 30 mg/kg iNOS blokkoló és peroxinitritkötô MEG-gel kezelt állatoknál is megmértük. A MEG kezelés nem okozott változást (vehikulum kezelés: 108±12 mmHg, n=6 versus MEG kezelés: 104±9 mmHg, n=7). Az Evans kék beadás után, a száj többi részének kontrasztjaként, a fognyakak körül övszerûen futó, a környezeténél sötétebb kék elszínezôdés jelent ligatúrás fogak mellett is. A ligatúra ezen túl is szignifikánsan fokozta extravazációt a gingivomucosalis szövetben a kontralaterális oldalhoz képest (79,3±12,8 µg/g versus 34,5±6,1 µg/g, n=6, p<0,05) (

). A MEG kezelés csökkentette a ligatúra által

kiváltott Evans kék extravazáció fokozódást, de nem befolyásolta a kontralaterális oldal Evans kék tartalmát (52,4±6,9 µg/g versus 45,2±8,1 µg/g, n=7) (

). A ligatúrás és a

kontralaterális oldal különbsége, azaz a ligatúra által kiváltott Evans kék tartalom növekedés a vehikulummal kezelt csoportban 44,7±12,2 µg/g, a MEG-gel kezelt csoportban pedig csak

ltott fogmedri nyúlvány csontpusztulása a vehikulummal kezelt csoportban (n=6) a ligatúrás és a kontralaterális alsó elsô ôrlô zománc-cement határ és alveolaris csontperem távolságának különbségeként mérve, a meziális gyökérnél 0,24±0,05 mm (8. ábra) és a mediolinguális gyökérnél 0,26±0,04 mm (

) volt. A MEG

szignifikánsan csökkentette a ligatúra okozta csontsorvadást. A MEG-gel kezelt csoportban (n=7) az alveolaris csontpusztulás a meziális gyökérnél 0,08±0,02 mm-re (p<0,01) ( és a mediolinguális gyökérnél 0,09±0,03 mm-re (p<0,01) (

58

)


400 300 200 100 0 áloperált

300 200 100 0 áloperált

400 300 200 100 0 áloperált

400

nincs ligatúra iNOS (fmol/mg/perc)

iNOS (fmol/mg/perc)

baloldal cNOS (fmol/mg/perc)

cNOS (fmol/mg/perc)

jobboldal

400

ligatúra

**

300 200 100

nincs ligatúra

0 áloperált

ligatúra

5. ábra. A ligatúra felhelyezése (n=7) és az áloperáció (ligatúrát nem kapott, n=7) hatása a bal és a jobb oldali elsô alsó ôrlôfogak körüli gingivomucosalis szövet cNOS és iNOS aktivitására patkányban. Az adatok a számtani középértékei ± hibái az összevont gingivomucosalis szövetmintáknak és csoportonként négyszer megismételt p<0,01 ligatúrás és az áloperált baloldal között. A NOS aktivitás mértékegységében a mg a szövet protein tartalmára vonatkozik.

59


6. ábra. INOS immunreaktív struktúrák a patkány gingivomucosalis szövetében. (a) Ínyrészlet kontroll állatból. A nyíl a mérsékelten festôdô kötôszöveti sejtekre mutat. (b) A nyíl immunreaktív sejteket mutat a kötôszövetben (makrofág, plazmasejt, limfocita). (c) Ligatúrás állat tunica propriaja közepesen immunreaktív érrel (nyíl). A pontozott nyíl egy immunpozitív idegre mutat. (d) közepesen immunreaktív epitéliumra (E) mutat. A pontozott nyílak a bazális és a legfelsô erôsen immunreaktív epitélium rétegekre irányulnak.

60


61


*

100

jobb bal (ligatúra)

Evans kék tartalom (µg/g)

80

60

40

20

0

1

2

kontroll

MEG

7. ábra. A ligatúra hatása a gingivomucosalis szövet Evans-kék tartalmára a kontroll (n=6) és a MEG-gel kezelt (n=7) patkányokban. * p<0,05 a kontroll állatok bal és a jobb oldal között. Az adatok a számtani középértékek ± az átlag standard hibája.

62


2.0

++

1.8

jobb bal (ligatúra)

*

*

1.6

1.2

csontperem távolsága (mm)

A zománc-cement határ és az alveolaris

1.4

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 1

2

MEG

kontroll

8. ábra. A ligatúra hatása az elsô alsó ôrlôfogak meziális gyökerének csontrezorpciójára a kontroll (n=6) és a MEG-gel kezelt (n=7) patkányokban. * p<0,05 a bal és a jobb oldal, ++ p<0,01 a kontroll bal és a MEG-gel kezelt állatok bal oldala között. Az adatok a számtani középértékek ±

63


2.0

jobb 1.8

+ **

1.4

csontperem távolsága (mm)

A zománc-cement határ és az alveolaris

1.6

bal (ligatúra)

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

1

2

kontroll

MEG

9. ábra. A ligatúra hatása az elsô alsó ôrlôfogak mediolinguális gyökerének csontrezorpciójára a kontroll (n=6) és a MEG-gel kezelt (n=7) patkányokban. **p<0,01 a bal és a jobb oldal, + p<0,05 a kontroll bal és a MEG-gel kezelt állatok bal oldala között. Az adatok a számtani középértékek ±

64


8. MEGBESZÉLÉS

A fenti eredményeink és a legújabb vizsgálatok alapján megállapíthatjuk, hogy a fogbélben és a foghúsban is mindhárom NOS izoenzim megtaláható (II; III; IV; 182; 90; 162; 232; di Nardo és mtsai. közlés alatt álló kooperáció). A NOS tekintetében a fô különbség e két szerv között, hogy míg a fogbélben alig figyelhetô meg nNOS tartalmú idegrost, addig a foghúsban nNOS tartalmú idegrostok gazdag hálózata van jelen (II). Valamint, hogy míg a pulpában egészséges körülmények között nem található klinikailag gyulladásmentes állapotban is kimutatható (III; IV; 182; di Nardo és mtsai. közlés alatt álló kooperáció). A fogbélben vagy a foghúsban viszont a NOS izoenzimek expressziójának/aktivitásának a változása lehet a magyarázata a NO. paradox szerepének e szervek élet és kórtanában. Az eddigi irodalmi és saját adatok alapján általánosságban megállapíthatjuk, hogy a többi szervhez hasonlóan a pulpában és a parodontiumban fiziológiás körülmények között jelen lévô konstitutív NOS által kis koncentrációban szintetizált NO. protektív hatású, ugyanakkor a patológiai folyamatokban upregulálódó indukálható NOS által .

viszont már káros lehet a saját szövetekre (I; III; IV; 230).

8.1 A KONSTITUTÍV NOS A FOGBÉLBEN ÉS A GINGIVOMUCOSALIS

8.1.1. A konstitutív NOS anatómiai lokalizálása a pulpában és a parodontiumban

A fogbélben a NOS hisztokémiai markere a NADPH-d (72; 129) az erek endotheliumában és csak néhány, fôként perivascularis elhelyezkedésû idegrostban adott a NADPH-d nem különíti el a NOS izoformáit, valamint a NOS csak egy része a NADPH-d reaktivitásnak (336), a NOS verifikációjához immunhisztokémiai vizsgálatokat kell végezni. Az eNOS immunhisztokémiai vizsgálat nNOS immunhisztokémiai vizsgálatunk pedig az idegrostokban mutatott a NADPH-d pozitivitással azonos festôdési mintázatot, a konstitutív NOS izoformák jelenlétét megerôsítve a fogbélben (II). Az általunk kutya és macska fogbélben megfigyelt néhány NADPH-d+ és nNOS immunreaktív idegrostok jelenlétét azonban nem erôsítették

65


(160; 182). A különbség egyrészt módszertani eltérésekkel (pl. mi nem dekalcifikáltuk a szöveteket), másrészt fajok közötti eltérésekkel is magyarázható, ahogy a vazoaktív sem található meg patkány fogbélben, ellentétben a többi emlôs

es megfigyelés, hogy az eNOS az endotheliumon kívül megtalálható a NADPHd+ humán odontoblastokban is (160; 90). Ezeket a sejteket mi nem vizsgáltuk, mivel a mi mintáink nem tartalmazták a fog keményszöveteit. Az eNOS fibroblastokban is kimutatható és az endotheliummal együtt okozzák a subodontoblasticus NADPH-d pozitivitást (160; 90). A periodontiumban futó erek endotheliumában a NADPH-d pozitív festôdés eNOS immunhisztokémiai verifikációja még nem történt meg. Mivel a szervezet egyéb szöveteiben az endotheliumuk eNOS-t tartalmaz, ezért valószínû, hogy a gingivomucosalis erek endotheliumának NADPH-d reaktivitását az eNOS okozza (160). A nagyszámú szubepitheliális NADPH-diaforázzal festôdô idegrostfonatokkal viszont azonos mintázatú nNOS immunreaktív idegrostfonatokat találtunk a foghúsban (II). A patkány metszôfog bukkális oldalán nem, de a nyelv felôli oldalán parodontalisan ugyancsak NADPHd+/nNOS immunpozitív idegrostok mutathatóak ki, melyek szabad idegvégzôdésben vagy NADPH-d+/iNOS immunreaktív Schwann sejtek melletti Ruffini-testben végzôdnek (137). A Schwann sejtek egyébként a Ruffini-végtesteken kívül idegrostok mentén nem NADPH-d+/iNOS immunreaktívak (137). A fogrögzítô ligamentum alveolaris csont junkcióban a csont felszínén szintén nagy számban találhatóak NADPH-d reaktív sejtek (160). A junkció területérôl izolált parodontalis ligamentum fibroblastjai nNOS immunpozitívek. Immunhisztokémiával és western blottal az eNOS-t nem lehetett kimutatni, de mivel az eNOS mRNS-e nyugalomban is detektálható, feltehetôen nagyon alacsony lehet bazálisan az eNOS fehérje tartalmuk (162; 232). Mechanikai stimuláció azonban minden izolált parodontalis ligamentum fibroblastban erôs eNOS immunreakciót váltott ki (162). Az alveolaris csontban talált kerekded NADPH-diaforázzal intenzíven festôdô sejtek immunhisztokémiai verifikációja sem történt még meg, de a gingiva hám NADPH-diaforázzal jelölôdô rétegei feltételezhetôen iNOS (160; 329; 12; III; 282).

66


8.1.2. A fogbél és az ínyszövet neurális NOS tartalmú idegrostjainak eredete

A szájképletek elsôdleges afferens szenzoros neuronjaiban, a ganglion trigeminaleban és a nucleus tractus mesencephalici nervi trigeminiben nagyszámban találhatók NADPHd/nNOS reaktív idegsejtek és rostfonatok (2; 224; 5; II; 183). Érdekes, hogy a ganglion trigeminaleban a festôdött idegsejtek kisebbek mint a többi ganglionsejt és sok közülük kolokalizál a P-anyaggal és a kalcitonin-gén-relációs peptiddel, melyek a nociceptív elsôdleges afferens neuronok karakterisztikus markerei (2; II). A nucleus tractus mesencephalici nervi trigeminiben viszont a jelölôdött sejtek többsége közepes nagyságú a többi neuronhoz képest (183). A szájképletek nNOS tartalmú szenzoros idegrostjai a NADPH-d/nNOS reaktív nervus alveolaris inferioron keresztül juthatnak el az alsó, a nervus infraorbitalison keresztül a felsô fogak pulpájába és parodontalis szöveteibe. .

szerepét az idegi regenerációban mutató vizsgálatok is, melyek szerint a nervus

alveolaris inferior átmetszése után az ipszilaterális ganglion trigeminaleban a NADPH-d+ neuronok száma megemelkedett, és ezt az emelkedést NOS gátló L-NAME-mel csökkenteni lehetett, illetve hogy a nervus infraorbitalis átvágása után az ipszilaterális nucleus tractus mesencephalici nervi trigeminiben a NADPH-d+ idegsejtek denzitása fokozódott (355; 74). Esetleg az V. agyidegen keresztüli inputon kívül a VII. agyideg ganglion geniculijának mindkét cNOS izoformát tartalmazó neuronjai is közremûködhetnek az íny szenzoros

A szájképletek szimpatikus ganglionjában, a ganglion cervicale superiusban a preganglionális plexus rostjai nNOS pozitívok, viszont a ganglion sejtek közül csak nagyon kevés nNOS reaktív (224; 53; 217; 5; 116). Így az elméleti lehetôség ellenére valószínûleg csekély lehet a posztganglionális szimpatikus NO. -erg idegrostok funkcionális szerepe az ínyben és a fogbélben amennyiben egyáltalán beidegzik ezeket a területeket. Az íny és a fogbél paraszimpatikus beidegzése vitatott, de jelenlétére több adat is utal (291; 143; 177; 178; 249; 284). A pulpában (338; 51) és az ínyben (196) is megtalálható VIP tartalmú rostok, a fogbelet és a foghúst paraszimpatikus posztganglionáris idegrostokkal feltételezetten ellátó ganglion pterygopalatinumban és ganglion oticumban a NO. és a VIP kolokalizációja (53; 5), valamint az hogy a ganglion pterygopalatinumból erednek az agy és a retina ereinek paraszimpatikus NO. -erg idegrostjai (331) felveti annak a lehetôségét, hogy a

67


fogbél és a foghús be van idegezve nNOS reaktív posztganglionáris paraszimpatikus idegrostokkal is. A vegetatív nNOS tartalmú idegrostok a fentiekben említett nNOS tartalmú szenzoros idegrostok mellett a NADPH-d/nNOS reaktív nervus alveolaris inferiorban is futhatnak a célterületre, mivel a nervus alveolaris inferior vegetatív rostokat is tartalmaz (333; 203; 223; 178). A nervus alveolaris inferior viszont az egyedüli forrása az alsófogak parodontalis a NADPH-d/nNOS reaktív idegrostjainak, mivel a nervus alveolaris inferior transzszekciója eltünteti látszólag az összes jelölôdô rostot a periférián (137). A NO. -nak nemcsak a szájképleteket beidegzô elsôdleges neuronok egy részében, hanem az ezekkel szinapszisban lévô központi idegrendszeri neuronokban is szerepe lehet, mivel fogbél afferens inzultusai transzszinaptikusan retrográd módon regulálják a NADPH-d aktivitást az agytörzs megfelelô magvaiban (326). Ezt mutatja, hogy a patkány moláris fogbél expozícióval kiváltott pulpitis után a retrográd transzganglionális transportmarkerrel jelölôdött mindkét oldali spinalis trigeminalis magvakban és a nucleus tractus solatarii sejtjeiben is a NADPH-d+ neuronok száma, míg a nervus trigeminus átmetszése lecsökkentette a NADPH-d+ neuronok mennyiségét ezekben az agyidegmagvakban (326). Összefoglalva az eddigi kísérletek alapján a pulpában talált csekély számú és a periodontiumban kimutatott nagy mennyiségû nNOS tartalmú idegrostok lehetnek tehát szenzoros, szimpatikus és paraszimpatikus rostok is, így szerepük lehet mind a szenzoros (pl. fájdalom) mind a vegetatív (pl. véráramlás szabályozás) funkciók regulálásában is (lásd 8.1.3.1., 8.1.3.2., 8.1.4.).

8.1.3. A konstitutív NOS élettani funkciói a fogbélben és a gingivomucosalis

8.1.3.1. A vérkeringés szabályozásában

8.1.3.1.1. Az érkaliber beállításában

A pulpában még nincs kimérve, de a gingivomucosalis szövethomogenizátumban detektálható mennyiségben találtunk konstitutív NOS aktivitást bazális körülmények között

68


(III). Az endothelialis és perivascularis anatómiai lokalizációja a cNOS-nak a fogbélben és az ínyben (lásd 8.1.1.) a NO. lokális vazoregulációs hatására utal (II). Kísérleti adataink szintén az L-arginin/NO. útvonal jelentôs szerepét demonstrálták a fogbél és az íny vérkeringések

A NOS szisztémás farmakológiai blokkolása a szignifikáns artériás vérnyomás fokozás ellenére lecsökkentette a fogbél véráramlását, mivel megnövelte a pulpa ereinek ellenállását (I). .

szintézis gátlása miatt kialakuló lokális

vazokonstrikció a fogbélben képes legyôzni a szisztémás vérnyomás emelkedés miatt létrejövô passzív véráramlás fokozódást. Ezzel szemben a korábban vizsgált szisztémásan beadott vazokonstriktorok nem ilyen hatékonyak a fogbélben pl. a noradrenalin dózis függôen emeli a vérnyomást és ezzel arányosan fokozza a fogbél véráramlását is (283). A perctérfogat fogfrakciója a szisztémás NOS blokkolás után 109±27% a beadás elôtti állapothoz képest (I). Ebbôl arra következtethetünk, hogy a NOS blokkolás a perctérfogat fogfrakcióját nem meg, mivel a perctérfogat és a fogbél véráramlása is arányosan csökkent le. Adataink alapján megállapíthatjuk, hogy a fogbél ereiben a szervezet más részeihez hasonlóan nyugalomban NO. függô bazális vazodilatátor tónus található (99; 348; 135; 171; I). A pulpa erek nyugalmi tónusát fenntartó NO. fôleg az eNOS tartalmú endotheliumból és nem a csekély számú nNOS-t tartalmazó perivascularis idegekbôl származhat (II; 90). Eredményünk összhangban van egy másik NOS blokkoló L-NAME beadása után patkány metszôfogban és vadászmenyét szemfogban más módszerekkel (lézer-Doppler áramlásmérôvel,

86

Rb

megoszlási technikával) mért nyugalmi véráramlás csökkenéssel (158; 86; 26) és megfigyelt jelenségnek a korábbi elméleti spekulációjával is (242). A mai álláspont alapján nyugalomban a fogbélben az endothelbôl bazálisan felszabaduló NO. , a szenzoros idegrostokból P-anyag és kalcitonin-gén-relációs peptid kibocsátás és a metabolikus faktorok együtt biztosítják az érfal simaizom tónusának reciprok kontrollját a csekély bazális szimpatikus vazokonstriktor aktivitással és az endothelin felszabadulással szemben hozzájárulva az optimális keringési viszonyok kialakításához (333; 248; 51, 1991; 103; 158; 249; 146; 26; 25). Ez az antagonizmus a NO. -dal kapcsolatban nem az idegrostok, hanem feltehetôen a simaizmok .

-nak nincs nyugalmi gátló hatása a szimpatikus rostok noradrenalin

felszabadulására a fogbélben ellentétben egyes más szervekkel, sôt cervicalis sympathectomia után is csökkenti a NOS blokkolás a fogbél bazális véráramlását (112; 158; 290; 259).

69


Az iv. NOS blokkoló NOLA beadása után a vérnyomás emelkedés ellenére a gingivomucosalis szövetben is csökken a véráramlás, tehát fokozódik utal, hogy az érellenállás nyugalmi értékét a bazális NO. szekréció folyamatosan csökkenti ezen az érterületen is (IV). Következtetésünk egybevág a patkány orális mucosaban NOS blokkolás után mért véráramlás csökkenéssel (158; 86). A gingivomucosalis szövetben a szelektív nNOS blokkoló 7-NI szignifikánsan redukálta a véráramlást, növelte a vérnyomás változtatása nélkül, ami arra enged következtetni, hogy a gingivomucosalis szövet .

dependens vazodilatátor tónusának kialakításában az endothel eredetû NO.

mellett az idegi eredetû NO. is részt vesz (IV). Ezt a konklúziót az íny anatómiai metszetein talált gazdag perivascularis hálózat is alátámasztja (lásd 7.1.2.) (II). A bazálisan termelôdô NO. az érfal simaizom tónusának reciprok kontrollját biztosítja a nyugalmi szimpatikus vazokonstriktor aktivitással szemben az ínyszövetben is (144). Az artériás vérnyomás esése véreztetés vagy szisztémásan alkalm hatására a pulpa véráramlását is lecsökkenti, mert a fogbélben csak nagyon limitált az autoregulációs kapacitás (165; 166; 283). Ezzel szemben az iv. NO. donor SIN-1 kezelés redukálta az artériás vérnyomást, de a fogbél véráramlását szignifikánsan nem befolyásolta, mivel lecsökkentette a pulpa érellenállását (I). Adataink azt mutatják, hogy a szisztémás SIN-1 kezelés által kiváltott lokális értágulat képes meghaladni a vérnyomás esés miatt létrejövô lokális szimpatikus vazokonstrikciót a korábban vizsgált iv NO. donor SNP hatásához hasonlóan (lásd 5.2.2.) (165; 166), azonban a fogbél véráramlása a vazodilatáció ellenére sem változott szignifikánsan, mert az artériás töltônyomás is leesett (I). A merev dentintokkal körülzárt helyzetbôl adódó alacsony fogbél compliance következményeként a pulpa ; 163). A tranziens véráramlás fokozódást elnyújtott paradox véráramlás csökkenés követ a zárt térben történô vazodilatáció hatására kialakuló szöveti nyomásfokozódás véna kompressziója miatt (163). A mi kísérleteinkben azonban NO. hatására létrejövô jelentôs artériás vérnyomás esés következtében az intrapulpális nyomás valószínûleg nem fokozódott, nem komprimálta a pulpa ereit és így nem csökkentette .

lokális vazodilatációs hatását. A perctérfogat fogfrakciója a szisztémás NO.

donor kezelés után 111±27% a beadás elôtti állapothoz képest, ami azt mutatja, hogy a NO. donor kezelés nem befolyásolja a perctérfogat fogfrakcióját, mivel sem a perctérfogat, sem a fogbél véráramlása sem változott szignifikánsan (128; 126; I). Adataink alapján feltételezzük, az endotheliumból, de az odontoblastokból, a perivascularis

70


NO. -erg idegekbôl, valamint bizonyos esetekben egyéb forrásból (pl. gyulladásos infiltrátum .

felszabadulásnak is szerepe lehet a pulpa értónusának

regulációjában, mivel a fogbél vérkeringése szenzitív az exogén NO. -ra (I; II; 90; di Nardo és mtsai. közlés alatt álló kooperáció). A feltételezésünket késôbb igazolta, hogy a carbachol indukálta vazodilatációban a stimulált endogén NO. értágító szerepét kimutatták patkány fogbélben (249), valamint hogy a NO. donor SNP iontoforézissel a patkány pulpába vagy a NTG kavitáson keresztül kutya fogbélbe lokálisan juttatva hosszantartó jelentôs vazodilatációt hozott létre (242; 170). Ugyanakkor a várakozással ellentétben a nervus alveolaris inferior elektromos ingerlésével, illetve a P-anyag infúziójával kiváltott vazodilatációt patkány pulpában az iv. NOS blokkoló L-NAME kezelés tovább fokozta, történô kontroll értékre való csökkentése után is (158). A NO. hatásmechanizmusát a fogbél neurogén gyulladásában azonban még tisztázni kell, mivel: 1/ az utóbbi megfigyelés nem volt L-arginin elôkezeléssel megfordítható, tehát felmerül, hogy az L-NAME-nek ez a hatása nem az L-arginin/NO. rendszeren keresztül történt. Az L-NAME-nek a NOS blokkoláson kívül atropinszerû szerepét is leírták (47). A humán fogbél elektromos stimulációját követô noradrenalin felszabadulást vizsgáló kísérletben is az L-NAME hatása disszociált a másik NOS blokkoló NOLA és az ezzel ellentétes NO. donor SNAP hatásától (259). 2/ Egy másik vizsgálat szerint az elektromos stimulációnál felszabaduló P-anyag és kalcitonin-gén-relációs

peptid

által

kiváltott

véráramlás

fokozódást

vadászmenyét

szemfogbélben az L-NAME nem befolyásolta, azaz a NO. nem mediátor ebben a reakcióban (26). 3/ Más érterületek neurogén gyulladásában Kerezoudis és mtsai. (158) ellentétesek a NOS blokkolás hatásai (96; 351). Elképzelhetô az is, hogy az alacsony complience miatt a pulpában a túlzott NO. szintézis a keringés összeomlásához vezethet, ezért eltérhetnek a lokális szabályozó mechanizmusok a szervezet többi részétôl. 4/ Valamint a különbözô dózisú L-NAME (vagy egy másik NOS blokkoló) hatását, illetve a NO. mellett egyéb faktorok szerepét (pl. endothelialis hiperpolarizációs faktor) is meg kellene vizsgálni a pontos mechanizmus kiderítéséhez. az ínyben nemcsak az erekbôl, hanem bármilyen egyéb forrásból pl.: iNOS, nem-enzimatikus NO. képzôdés, légutakban termelt NO. , cigaretta füst, .

szublingvális vazodilatátorok stb. (

71

is befolyásolhatja az


értónuson keresztül a lokális véráramlást. A lokális iNOS jelentôségét a 8.2.1. fejezetben tárgyalom. Az hogy a szájüreg felôl a NO. gáz megfelelô koncentrációban éri-e el a parodontalis szöveteket a biológiai válasz kiváltásához jelenleg még nem felderített (lásd 5.2.1.). A gazdag perivascularis feltehetôen paraszimpatikus NO. -erg vazomotoros idegrostfonatok (lásd 8.1.2.) reguláló szerepérôl még szintén nincs funkcionális adat. Az eddigi az ínyben a lokális kapszaicin hatására kialakuló vascularis konduktancia növekedés véráramlás fokozásában szerepe van a NO. -nak, mivel az L-NAME a vérnyomás emelése ellenére lecsökkentette a kapszaicin véráramlás növelô hatását patkány ínyszövetben (87). Irodalmi adatok alapján a kapszaicin hatására a szenzoros afferens C rostokból felszabaduló vazoaktív anyagok (pl.: P-anyag, kalcitonin-gén-relációs peptid) az eNOS aktiválásán keresztül okozhatnak NO. szintézist és ennek következtében értágulatot (132; 87; 247; 351). Ezzel szemben az elôzô bekezdésben már elemzett, további vizsgálatokat felvetô kísérletben a P-anyag által kiváltott vazodilatációt az L-NAME nem csökkentette, hanem tovább fokozta patkány fogbélhez hasonlóan a mucosaban is (158).

8.1.3.1.2. Az érpermeábilitás kialakításában

A gingivomucosalis szövetben lévô bazális NO. produkció hozzájárul az érfal nyugalmi permeábilitásának a fenntartásához is, mivel az L-NAME lecsökkenti a patkány gingivomucosalis szövet Evans kék extravazációját bazális körülmények között (23). Ligatúrával kiváltott baktériális ínygyulladásban a nyugalmi NO. függô érpermeábilitáshoz még hozzáadódik a NO. túltermelôdése miatt kialakuló permeábilitás fokozódás is (lásd 8.2.1.) (III), ugyanakkor az íny kapszaicinnel, vagy az íny és a fogbél nervus alveolaris inferior elektromos ingerlésével kiváltott neurogén gyulladásában az érpermeábilitás fokozódásban a NO. -nak nincs szerepe patkányban más szövetekkel ellentétben (136; 23; 159; 245). Az említett ellentmondások és a lehetséges helyi specifikus regulációs mechanizmusok miatt a NO. biológiai jelentôségét a pulpa és a gingivomucosalis szövet neurogén gyulladásában a késôbbiekben saját kísérletekkel tisztázni szeretnénk.

72


8.1.3.1.3. Egyéb funkciókban

Az endothelbôl, illetve a perivascularis idegrostokból bazálisan felszabaduló NO. gátolja a neutrofil granulociták és a vérlemezkék adhézióját is az endotheliumhoz, így a szöveti perfúzió fokozás mellett gyulladás ellenes hatású és a microvascularis thrombosis képzôdését is gátolja (209; 267; 176). Bár ezeknek a jelenségeknek a tudományos feltárása még nem meg a szájüreg szöveteiben, azonban a szervezet más részeinek vizsgálata alapján .

-nak a pulpában és a parodontiumban is van ilyen hatása.

8.1.3.2. A szenzoros afferentációban

a fog körül futó nNOS tartalmú soliter idegrostok lehetnek szenzoros afferensek (lásd 8.1.2.), illetve modulálhatják a szenzoros szignál transzdukciót. A nNOS tartalmú axonokban szintetizált NO. többek között mediálhatja a fogbél és a fogágy nociceptív ingereit, mivel a nNOS reaktív idegrostok szabad idegvégzôdésekben is terminálódnak és a ganglion trigeminaleban a NADPH-d/nNOS reaktív idegsejtekben megtalálhatóak a nociceptív elsôdleges afferens neuronok karakterisztikus markerei a P-anyag és a kalcitoningén-relációs peptid is (2; II; 137; 183). Ennek a mechanizmusnak valószínûleg inkább a parodontiumban és nem a pulpában lehet jelentôsége a nNOS pozitív idegrostok lokalizációjának számarányai alapján. Mivel a fogbélben a fibroblastok és között elektromikoroszkóposan kapcsolat mutatható ki, ezért különösen figyelemre méltó, hogy a NO. részt vehet a cathepsin B által aktivált analgetikus hatású enkefalinok, opioid peptidek termelésében is a pulpa fibroblastjaiban (48; 361). a NO. szerepet játszik a pulpitises fájdalom és a fogbélben mérhetô cGMP szint fokozódás között kimutatható korrelációban is (306; 35). Az odontoblastokban és azok dentinben futó nyúlványaiban nyugalomban is megtalálható eNOS-nak és iNOS-nak szerepe lehet a dentintubulusokban kifelé áramló intersticiális folyadék termelése mellett a dentin fájdalom érzékenységének beállításában is (206; 90; di Nardo és mtsai. közlés alatt álló kooperáció). A fog fájdalom érzékelésére több ; 359). Hipotézisem szerint a NO. egyesítheti az odontoblastot receptornak tekintô elképzelést a leginkább elfogadott hidrodinamikus fájdalomérzékelô

73


mechanizmussal (48; 359). A legkülönbözôbb hatásokra (hô, ozmotikus nyomásában eltérô folyadékkal való érintkezés, mechanikai hatás, stb.) a dentintubulusokban áramló folyadék által keltett nyíróerôt az odontoblast a szervezet egyéb mechanoszenzoros sejtjeihez hasonlóan .

-dá transzformálhatja (lásd 5.1.4., 8.1.3.3.). Ennek a

fájdalom érzékelésén kívül a szenzoros input és a lokális véráramlás szabályozás összekapcsolásában is szerepe lehet a pulpa-dentin komplexumban. Ezzel szemben a nociceptiv input modulációjához, a szenzitizálódott nociceptorok downregulációjához vezethet a dentin hiperszenzitivitásnál alkalmazott kálium hatóanyagú fogkrémek hatásmechanizmusában szerepet játszó depolarizáció okozta NO. felszabadulás az odontoblastokból (206). Ehhez a kálium által kiváltott NO. deliberációhoz még hozzájárulhat a káliumnitrát tartalmú fognyaki érzékenységet csökkentô szereknél a nitrátból képzôdô NO. is (lásd 5.2.). A NO. fájdalomérzékelésben betöltött szerepének a tisztázásához ezen a területen jelenleg még nem áll rendelkezésre elegendô adat, további vizsgálatok szükségesek. az eredmények értelmezését, hogy a periférián termelôdô NO. kis mennyiségben fájdalomkeltô, nagy mennyiségben analgéziás hatású is lehet (127; 155; 252; 303). A fent az odontoblast eNOS aktivációján alapuló fogfájdalomérzô hipotézisem kidolgozása jövôbeli kutatási célkitûzéseim közé tartozik. A

NO.

a

nocicepción

kívül

mediálhatja

a

proprioceptív

parodontalis

mechanoreceptorokból származó információkat is a nNOS pozitív idegrostok iNOS immunreaktív Schwann sejtekkel körülvett mechanoszenzitív Ruffini-test terminációja és a nNOS tartalmú neuronok nucleus tractus mesencephalici nervi trigeminiben való topográfiai lokalizációja alapján (137; 183; 74). A mechanoreceptorokon keresztül a NO. -nak szerepe lehet a rágás, nyelés, beszéd közben és a fogáttörésnél a fog érintés, nyomás, mozgás

8.1.3.3. A fog rögzítésében

Az izolált parodontalis ligamentum fibroblastjai is termelnek bazálisan fluktuálva NO. ot, amit NOS inhibitor L-NMMA-vel fel lehet függeszteni (162; 232; 343). A mechanikai stimuláció fokozza az eNOS (más kutatók szerint nNOS) NO. termelését ezekben a sejtekben is az endothel és az osteoblastokhoz hasonlóan (lásd még 5.1.4., 8.1.3.2.). (276;

74


265; 162; 232; 343). A mechanoszenzoros parodontalis ligamentum fibroblastoknak az ingert a fogelmozdulás mátrix-fibroblast, fibroblast-fibroblast erôátvitele és az alveolus fala és a gyökér által határolt zárt tér hidraulikus rendszerében a fogelmozdulás intersticiális folyadék áramoltatása által létrejövô nyíróerô jelentheti. A hatékony mechanikai stimuláció és az orthodonciai klinikai gyakorlatban használt nyomásértékek azonos tartományba esnek, ezért a NO. közremûködhet a fogszabályozásnál létrehozott feltehetôleg cGMP-n keresztül mediált fogelmozdításban is (lásd 5.2.2.) (232). Feltehetôen más mechanizmus váltja ki parodontalis ligamentum fibroblastokban az eNOS expresszióját mint az iNOS-ét, mert az iNOS mechanikai stimulációra nem upregulálódik (156; 162). az interleukin 1ß és a prosztaglandin E2 termelôdése is fokozódik az izolált parodontalis ligamentum fibroblastokban mechanikai terhelés után, ezért elképzelhetô, hogy túlterhelés esetén a túlzott citokin termelés már az iNOS útvonalat is beindítja, illetve parodontitis okozta csontpusztulás következtében létrejövô fokozott fogmozgathatóság esetén mindkét útvonal (299; 354). Bár a csontszövet konstitutiv NOS izoenzimeinek vizsgálata nem szerepel a Ph.D. értekezés témakörei között (az iNOS szerepét lásd 8.2.1.-ban), azért meg kell említeni, hogy a NO. -nak különbözô, még részleteiben nem teljesen felderített parakrin és autokrin mediátor funkciói vannak a csontszövet élettanában is (38; 134; 268; 118). A konstitutív és az indukálható NOS jelenléte, az ellentmondásos farmakológiai kísérleti eredmények, valamint az, hogy kis illetve nagy koncentrációban a NO. lokálisan ellentétes hatású is lehet a csontszövet metabolizmusára a NO. komplex regulációját sugallja az osteoclastokban és az osteoblastokban (38; 134; 312; 268; 118). A NO. -nak szerepe van mind a nyugalmi csont homeosztázisban, az anabolikus hatású folyamatok pl.: mechanikai feszültség, nemi hormonok, csonttörés gyógyulásának mediálásában, mind a proinflammatorikus citokinek katabolikus csontrezorpciójának mediálásában is (38; 134; 312; 268; 118; 199;). Az alveolaris csontban a NO. élettani szerepérôl még csak annyit tudunk, hogy a nyugalmi vérkeringése a többi vizsgált szövethez hasonlóan NO. dependens (IV). Az alveolaris csont parodontalis felszínén lokalizálódó NADPH-d reaktív sejtek NO. termelését (hasonlóan az elôzôekben említett parodontalis ligamentum fibroblastokhoz) a rágónyomás húzássá transzformálásán keresztül a fogrögzítô szalagok mechanikai stimulációja és a fogelmozdulás intersticiális folyadék mozgatása által fellépô nyíróerô is befolyásolhatja, hozzájárulva ezzel a parodontalis rés nagyságának a kialakításához is (160; 130; 268). Az alveolaris csont

75


fogrögzítô szalagok felôli felszínén lévô NADPH-d pozitív sejtek ezenkívül az alveolaris csontvelô kriptákban található NADPH-d pozitív sejtekkel egyetemben a nyugalmi csont remodellingben és a funkciónális adaptációban is részt vehetnek (160; 54; 268).

8.1.4. A konstitutív NOS szerepe az artéria alveolaris inferiorban

Az apicalis foramenen ill. a foraminakon keresztül a fogbélûrbe belépô erek átmérôjüket tekintve arteriolák, így már a mikrocirkulációs rendszerhez tartoznak (166). Mivel a teljes arteriovenozus nyomáskülönbségnek csupán kb. az 1/5-e esik a fogbélre, ezért a fogakat ellátó extrapulpalis ereknek kb. négyszer ekkora ellenállásuk van, aminek a szabályozása nagy jelentôséggel bírhat az ellátott szövetek vérkeringése szempontjából (335; 120; 166). Az artéria alveolaris inferior nNOS tartalmú (feltehetôen paraszimpatikus, lásd 8.1.2.) perivascularis idegrostjai és NADPH-d reaktív endotheliuma azt sugallja, hogy az artéria alveolaris inferior nemcsak egy passzív “vérvezeték” a csontban, hanem potenciális helye a pulpa és a periodontium vérkeringés szerven kívüli szabályozásának és ebben a .

-nak is szerepe lehet (II). Ezt az elképzelést támasztja alá, hogy a NO. a

szervezet más területein is az artériák bazális tónusának regulációjában jelentôsebb szerepet játszhat, mint az arteriolákban (85). Az ellátó erek szabályzásán kívül felmerült, hogy a fogakat körülvevô szövetek értágulata - amiben a NO. -nak szintén részt vehet - is “ellophatja” a pulpa perfúzióját (334). A pulpa és a periodontium vérkeringésének szerven kívüli az irodalomban.

8.2 A NO. A FOGÁGYGYULLADÁS PATOMECHANIZMUSÁBAN

8.2.1. Az iNOS szerepe

A parodontitis kialakításában a dentális plakk Gram-negatív baktériumainak szerepe jól dokumentált és a végeredmény az alveolaris kötô- és csontszövet pusztulása már régóta ismert. Azt azonban, hogy e két pont között milyen molekuláris mechanizmusok zajlanak még nem tudjuk pontosan (301; 309; 188; 187).

76


Kísérleti adataink azt mutatják, hogy a ligatúra által kiváltott fogágygyulladás fokozza a gingivomucosalis epithelium és kötôszövet gyulladásos sejtjeinek iNOS expresszióján .

termelést és a szelektív iNOS blokkoló (305) és peroxinitritkötô (319) MEG

kezelés jótékony hatású a parodontitis tüneteire, csökkenti a következményes plazma extravazációt és az alveolaris csontdestrukciót (III; IV). Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a fokozott NO. és a NO. valamint a szuperoxid reakciójából kialakuló peroxinitrit termelôdésnek szerepe lehet a fogágygyulladás patomechanizmusában (III; IV). Fogbélgyulladásban, a fog periapikális gyulladásában ill. gyulladásaiban (ileitis, ulcerativ colitis) szintén megfigyelhetô a fokozott NO. és peroxinitrit produkció (36; 213; 215; 216; 281; 195; 150; 325; 324; 313; 182; di Nardo és mtsai. közlés alatt álló kooperáció). A lokálisan nagy mennyiségben keletkezô NO. és peroxinitrit hozzájárul a nemspecifikus immunitáshoz, toxikus a behatoló mikrobiológiai kórokozokra (198; 122; 24; 75; 352; 49; 50; 300; 4). Saját és irodalmi adatok alapján ezért feltételezzük, .

és a peroxinitrit véd az ínybe hatoló mikrobiológiai

ágensekkel szemben (lásd 5.2.1., 293; 49; 50; 300; 4), azonban lokálisan nagy koncentrációban különbözô mechanizmusokkal viszont már károsíthatja is a gazdaszöveteket (329; 216; 65; III; IV; 13; 241; 230). Elképzelésünket a NO. patomechanikai szerepérôl fogágygyulladásban az újabban megjelent közlemények is alátámasztják: 1) A legjelentôsebb periodontopatogén baktériumok mint pl.: a Porphyromonas az Actinobacillus actinomycetemcomitans upregulálják a NO. szintézist a makrofágokban (32; 93; 294; 295; 288; 154). 2) A humán szájból izolált PMN leukociták spontán NO. -ot generálnak, valamint a lokalizált agresszív parodontitisben szenvedô betegek vénás vérébôl izolált PMN sejtekben a az egészséges egyének vénás vérébôl izolált PMN sejtekben (233; 76; 298). 3) A gyulladt humán gingivában is fokozott az L-arginin (NOS prekurzor), L-citrullin (NOS melléktermék) tartalom és az iNOS expresszió az egészséges ínyszövethez képest (58; 201; 202; 156; 180). 4) Patkány fogágygyulladás modellben a nitrotirozin képzôdés fokozódik a gingivomucosalis szövetben (191).

77


5) A szájhigiéne elhagyása révén kialakuló plakk depozíció fokozza a szájüregi NO. és a nyál nitrit koncentrációját, melyeket a plakk elimináló fogmosás normalizál (50). 6) Professzionális szájhigiénés kezelés után alkalmazott L-arginint (NOS szubsztrátját) tartalmazó parodontalis bevonat, valamint a nyál nitrit és NO. tartalma káros a szájüregi baktériumokra (293; 49; 50; 300; 4). 7) A NO. donor SNAP, SIN-1 cytotoxikus a humán gingivális epitheliális sejtekkel, fibroblastokkal és a periodontális ligamentum sejtjeivel szemben (13; 241; 95). a krónikus hiperpláziás ínygyulladás kialakulásában is szerepe van a NO. -nak humán izolált sejtes és patkány kísérletes modellben (94; 95). 9) Sejtpusztulással járó erozív és ulceratív szájnyálkahártya betegségekben (lichen, afta) is fokozódik a nyál nitrit koncentrációja (241). Ezekkel az eredményekkel ellentétesen az irodalomban csak egy publikáció jelent meg. Itt feltételezték, hogy a fogágygyulladásban a neutrofil granulocitáknak a NO. inaktiválásában lehet szerepe, mivel izolált fibroblast bioassayben a parodontitises betegekbôl származó neutrofil granulociták sokkal jobban gátolják a NO. indukálta cGMP akkumulációt, mint az egészséges egyénekbôl származók (3). Ez a jelenség viszont magyarázható úgy is, hogy az aktivált neutrofil granulociták szuperoxidot termelnek, ami a NO. -ot peroxinitritté alakítja, a peroxinitrit viszont már nem triggereli a cGMP akkumulációt. Parodontitisben a fokozott NO. termelôdésnek elônyös és hátrányos hatásai is lehetnek (III; IV). Elônyös az antimikrobális aktivitás (lásd 5.2.1.), immunmoduláció, microvascularis thrombosis gátlás (lásd 8.1.3.1.3.), fokozott szöveti perfúzió (lásd 8.1.3.1.1.), valamint az, hogy a NO. felszabadulásnak a szabaddá vált fognyakon fájdalomcsillapító, érzékenység csökkentô hatása lehet (lásd 8.1.3.2.). Másfelôl hátrányos a gazdaszövettel szemben is fennálló toxicitása miatt. A gingivomucosalis szövet fokozott NO. tartalma hozzájárulhat a parodontitis klinikai tüneteihez (III; IV). Az íny vörös és duzzadt, amit részben a NO. értágító és érpermeábilitás fokozó hatása is magyarázhat (218; 234). Az érintésre bekövetkezô ínyvérzést egyebek mellett a NO. trombocita aggregáció és adhézió gátlása is okozhatja (209; 267). A fokozott alveolaris csontrezorpcióhoz a NO. osteoclast stimulációja, illetve a NO. és a peroxinitrit osteoblast differenciálódást csökkentô hatása is hozzájárulhat (lásd késôbb) (134; 65; 59; 124).

78


A ligatúra több mint négyszeres iNOS aktivitás fokozódást okozott a gingivomucosalis szövetben a kontralaterális (kontroll) oldalhoz képest, de méréseink szerint a cNOS aktivitást sem az ipsilaterális, sem a kontralaterális oldalon (III). Felmerült, hogy a ligatúra a diszkomfort érzést okozó hatása révén esetleg a táplálkozás megváltozása miatt a kontralaterális oldal iNOS aktivitását is módosíthatja, azonban a kontralaterális oldal iNOS aktivitása és a ligatúrát nem kapott állatok iNOS aktivitása között a gingivomucosalis

A fogágygyulladásban expresszálódott iNOS jelentôségének a meghatároz összehasonlítottuk a ligatúra felhelyezése után 8 nappal (lásd 7.3.1.) és az ip. E. coli LPS beadás után 6 órával a gingivomucosalis szövetben kialakuló iNOS aktivitást (III). A szisztémás LPS sok szövetben indukál iNOS-t, ebben a modellben a 6. expresszió csúcsa (322). Eredményeink azt mutatják, hogy az iNOS expresszió ligatúra hatására sokkal jelentôsebb volt, mint a szisztémás LPS kezelés után (III). A ligatúra körüli érpermeábilitás fokozódása a szervezet védelmi rendszerének mûködésbe lépését jelzi, ennek következtében a sulcusfolyadék mennyisége megnô, ami mechanikusan kimossa és összetevôivel megtámadja a behatoló baktériumokat. Ebben a NO. nak is szerepe lehet, mert a MEG nagyon hatékonyan redukálja az extravazáció növekedést, mint ahogy különbözô egyéb NOS blokkolók is képesek az LPS-sel kiváltott érpermeábilitást

a 8.1.3.3. pontban említettük, a csontszövetben a NO. hatása valószínûleg koncentráció függô, s ezért ellentmondásos az irodalmának ezzel a területtel foglalkozó része. Az iNOS-t indukáló IL-1, TNF-α citokinek közremûködnek a csontrezorpciójának mediálásában is, az IL-1-gyel kezelt ligatúrás patkányokban extenzív alveolaris csontpusztulás figyelhetô meg (28; 107; 38; 134; 169; 312; 268; 118; 59; 344). az osteoblastokban és az osteocytákban, valamint az iNOS által termelt NO. és a következményesen képzôdô peroxinitrit szerepét feltételezik a gyulladásos csontrezorpcióban, illetve a csökkent osteoblast proliferációban, mûködésben is (134; 312; 65; 9; 59; 124; 199; 344). Kísérletes arhtritis és osteoporosis modellben a NOS blokkolás csökkenti a patológiás tüneteket, hasonlóan a kísérletes fogágygyulladáshoz, ahol a MEG az alveolaris csontdestrukcióval szemben (310; 37; III; 9; 59). A MEG pontos csontsorvadás ellenes hatásmechanizmusának a kiderítése még a további vizsgálatokra vár (lásd még 8.2.3.).

79


Meg kell jegyeznünk, hogy klinikailag egészségesnek tûnô foghúsban is elôfordulhat szubklinikus spontán ínygyulladás (167; 237; III; IV), amit a normál szájflóra okozhat. Ez lehet a magyarázata a fogágygyulladás modell kontroll oldalának iNOS aktivitására (III) és a NADPH-d pozitivitására a foghús hámjában és egyes kötôszöveti makrofágjaiban és hízósejtjeiben normál, nem gyulladást modellezô állatban is (160; II). A szájüreget a belsô környezettôl elválasztó epitheliális barrier az orális flóra elleni elsô védvonal. Az itt termelôdött NO. járulékos kémiai barriert (gázburkot) hozhat létre, hogy limitálja a baktériális transzlokációt. Az epitheliális NO. koncentráció modulálhatja az epitheliális permeábilitáson keresztül egyes anyagok szájüregi abszorpcióját is a bélcsatorna más részéhez hasonlóan (175). Érdekes módon a felsô légutakban is az iNOS konstitutívan van jelen az epitél sejtekben, valószínûleg az infekciós ágensek krónikus jelenléte miatt (195). Elképzelhetô, hogy az itt termelôdô NO. -nak mint “aerokrin mediátornak” a bronchus átmérô, tüdô keringés és ezek kapcsolásának szabályozásában is szerepe lehet (195).

.

mediált kaszkádja (az oxidatív és a nitrozatív stressz és

közös pontjainak hozzájárulása a fogágy sorvadásához)

Korábbi kísérleti eredményeink (316; 317; III; 308; 315; 318; 190; 191) és irodalmi adatok (20; 254; 345; 116; 17 stb.) alapján a fogágygyulladás kialakulásához hozzájáruló reaktív nitrogén és oxigén szpecieszeken (ezért nitrozatív és oxidatív stresszen) alapuló új ) (IV). A reaktív nitrogén szpecieszeken a NO. -ot ill. a NO. oxidált intermedierjeit kell érteni, e fogalmat a reaktív oxigén szpecieszek analógiájára

Elképzelésünk szerint a patomechanizmus egyik lehetséges magyarázata a következô: a dentális plakk domináns Gram-negatív baktériumainak (301; 278; 253; 187) sejtfal lipopoliszacharidja (LPS) az indító jel. Az LPS közvetlenül ill. immunreakciókon (253; 31; 292) keresztül indukálja az iNOS-t az íny rezidens és infiltrálódó sejtjeiben (321; III; IV). Az iNOS által termelt nagy mennyiségben keletkezô NO. -nak és a NO. valamint a szuperoxid (O 2-.) kombinációjából kialakuló peroxinitritnek (ONOO- ) szerepe van a nemspecifikus immunitásban, toxikusak a behatoló mikrobiológiai ágensekkel szemben. Alacsony celluláris L-arginin szint mellett az iNOS képes szuperoxid termelésre is (353). A lokálisan

80


túltermelôdött reaktív nitrogén és oxigén szpecieszek (pl.: NO. , O2-., ONOO- , stb.) (egyedül, kombinációban, vagy szinergizmusban) azonban nemcsak a kórokozókat pusztítják el (198; 122; 75; 352; 49; 50; 300; 260; 4), hanem a gazdaszöveteket is károsíthatják többféle mechanizmussal, mint pl.: mitokondriális respiráció gátlás, tirozin nitrálás, antioxidánsok kapacitásának kimerítése, DNS károsítás, stb. (lásd: 5.1.3., 19; 123; 20; 316; 173). .

és a peroxinitrit az LPS-sel együtt (külön is) aktiválják az indukálható

ciklooxigenázt (COX-2; 279), ill. a mátrix metalloproteinázokat (MMP; 229; 244), melyek szintén részt vesznek a parodontális károsításban (253; 187). A szabad gyökök DNS lánc törést okoznak, ami triggereli az “öngyilkos” nukleáris poli(ADP-ribóz) szintetáz (PARS) (az irodalomban polimeráznak is hívják) enzim aktiválódását. A PARS a NAD+-ot ADP-ribózra és nikotinamidra hasítja és az ADP-ribózt nukleáris fehérjékhez köti. A PARS aktiváció a NAD+-ot, ami a terminális oxidáció hidrogénátvitelének zavara miatti csökkent ATP képzôdésen keresztül szintén a sejtek energiaháztartásának összeomlásához,

--------------------------------------------------------------------------------------------------------10. ábra. Az általunk kidolgozott a fogágygyulladás pathogenesiséhez hozzájáruló oxidatív és nitrozatív stresszen és ezek interakcióján alapuló reakciósorozat sémája. Az oxidatív (baloldal) és nitrozatív (jobboldal) stressz és ezek interakciója elpusztítja a behatoló baktériumokat, azonban az oxidatív és nitrozatív reakciók és ezek következtében kialakuló túlzott enzimaktivációk/expessziók (pl.: indukálható nitrogénmonoxid szintáz (iNOS), poli(ADP-ribóz) szintetáz (PARS), mieloperoxidáz (MPO) indukálható ciklooxigenáz (COX2), mátrix metalloproteinázok (MMP)) a saját szövetek intra és intercelluláris károsításán keresztül a fogak tartószöveteinek pusztulásához vezetnek. A nitrozatív stressz keletkezésében kulcsszerepet játszik a proinflammatorikus mediátorok által indukált iNOS expressziója. -.) (*) termelésre is.

Alacsony celluláris L-arginin szint mellett

2

A nagymennyiségû nitrogénmonoxiból (NO. ) különbözô reakciókon keresztül toxikus reaktív nitrogén szpecieszek jönnek létre pl. a NO. és a O2-. kombinációjából peroxinitrit (ONOO- ) keletkezik. További részleteket lásd a szövegben.

81


82


A NO. által elpusztított Gram-negatív baktériumokból felszabaduló endotoxinok circulus vitiosusként tovább fokozhatják az iNOS indukción keresztül a nitrozatív stresszt, ami még több baktériumot/saját szövetet pusztít el. A mélyebb parodontalis tasakokba azonban még több baktérium kerülhet, ami tovább fokozza a különbözô túlmûködésük esetén már a saját

szöveti

integritásra

is

káros

enzimek

(iNOS,

COX-2,

PARS,

MMP)

indukcióját/aktivációját és a folyamat így pozitív visszacsatolással felerôsítheti önmagát (III; 190). Az endotoxinok által túltriggerelt citokinek szekréciója is hat a környezô sejtekre és .

és egyéb gyulladásos mediátorok

termelését, így komplex, többszörösen pozitívan visszacsatolt hálózatok alakulhatnak ki a gyulladt parodontalis tasakok falában. Mivel a szájüreg sohasem steril, ezért ez az "önpusztítás" krónikusan fennállhat, az ördögi kör nem tud megszakadni, valamint bármilyen egyéb ok miatt kialakuló túlfokozott lokális immunreakciókban is kiváltódhat ez a mechanizmus. A szájüregben az az egyedülálló a bélcsatorna más részeivel szemben, hogy az állandóan bekerülô baktériumok szilárdan rögzülni tudnak a nem hámló fogfelszínhez és ezért a baktériumok a fog körül hosszantartó, szoros kapcsolatba léphetnek pont a fogazat legkritikusabb pontjával a fogfelszín és az íny hámszövete közötti lévô “locus minoris resistentiae” hámzárással, és gyulladást, szövetpusztulást válthatnak ki részben a fenti patomechanizmussal. A rendszeresen dohányzók rossz parodontalis állapotához hozzájárulhat az is, hogy a dohányfüstbôl a fogágyhoz kerülô nagy mennyiségû NO. végtermékgátlást fejthet ki a szöveti NOS izoenzimekre (lásd 5.1.2.1.), és így csökkentheti az iNOS gátláson keresztül a szervezet lokális védekezôképességét (236; 187). Ezt az elképzelést támasztja alá, hogy a szájüreg NO. és a nyál nitrit koncentrációja szignifikánsan alacsonyabb a dohányzóknál a nem 34; 49; 50). Másrészt a dohányfüstbôl származó NO. indukálja a NO. ellen védô NO. dioxigenáz enzimet a baktériumokban (lásd 5.2.1.) (236; 101; 100). Ez a bakteriális védekezô mechanizmus is közremûködhet a dohányzók supragingivalis plakkjában mért magasabb baktérium számhoz a nem dohányzók plakkjában mérthez képest (50). Ezért feltételezésem szerint a dohányzóknál a parodontalisan “elégtelen” mennyiségben termelt NO. (a dohányzókban a szájhigiénia elhagyása után még mindig kisebb a szájüreg NO. koncentrációja, mint a nem dohányzókban megfelelô szájhigiénia mellett (50)) már nem pusztítja el olyan hatékonyan a parodontalis plakk baktériumait, ami agresszívebb bakteriális invázióhoz, illetve egyéb szervezeti védekezô/önkárosító reakciók felrôsödéséhez is vezethet,

83


emellett természetesen a dohányfüst toxikus vegyületei közé tartozó NO. a korábban leírt reakciókon keresztül dohányzáskor direkt módon is pusztítja a parodontalis szöveteket (lásd 5.1.3.). Finom egyensúly áll fenn a szövetsérülést okozó prooxidáns mechanizmusok és az antioxidáns védekezô és reparáló szisztémák között. A gingivomucosalis szövetben is megtalálhatók a különbözô természetes antioxidánsok (57 tartalmaz SOD-t, melynek aktivitása az életkorral csökken (147). A SOD-nak szerepe lehet a peroxinitrit képzôdés megakadályozásában, mivel katalizálja a szuperoxid dizmutációját. Liposzómába zárt SOD jótékony hatásúnak bizonyult kutya parodontitis modellben (263). Az antioxidáns C-vitamin háromszor nagyobb koncentrációja a crevikuláris folyadékban, mint a plazmában (211) szintén szerepet játszhat az ínyben a reaktív nitrogén szpecieszek megkötésében (lásd még 5.2.1.1.) (349; 260). Ezenkívül a crevikuláris folyadékban olyan specifikus antioxidáns is jelen van, ami a szérumban nem detektálható (56). Ugyanakkor nem tudott minden eddigi vizsgálat különbséget kimutatni a nyál, illetve a crevikuláris folyadék antioxidáns kapacitásában fogágybeteg és egészséges egyének között (222; 114; 56). A nyál másik védôfaktora lehet parodontitisben az argináz aktivitása, ami fogágybetegekben szignifikánsan magasabb mint egészséges egyénekben (251). A nyálban a szöveti vagy a bakteriális eredetû argináz a NOS szubsztrátjának az L-argininnak ureává és L-ornitinné .

túlprodukcióját, így hozzájárulhat a saját szövetek

protekciójához, ugyanakkor a behatoló baktériumok számára kisebb ellenállást és az anyagcseréjükhöz még fontos szubsztrátokat is biztosíthat, fokozva ezzel a baktériumok invázióját a gazdaszövetbe (161; 251). Ezzel egybevág, hogy a nyál NO. tartalma egy vizsgálatban csökkent gingivitisben és parodontitisben, azonban más megfigyelések a nyál NO. antibakteriális szerepét hangsúlyozzák és a nyál NO. mennyiségének fokozódását prezentálják a különbözô gingivomucosalis betegségekben, illetve az öregedés folyamán (lásd 5.2.1.) (33; 152; 280; 241; 11; 50). A parodontitisben szenvedô betegek és az egészséges egyének között talált biokémiai eltérések nemcsak a szabad gyökök túlprodukciójának a következményei, hanem a fogágybetegség prediszpoziciós faktorai is lehetnek, melyeket a gyógyítás/megelôzés érdekében további vizsgálatokkal tisztázni kell. Az oxidatív és nitrozatív stressz és interakciójuk szerepét mutatja parodontitisben továbbá, hogy E-vitamin és szelén kezelés pozitív hatását egyre több vizsgálat bizonyítja (287; 145; 10; 337;

84


17). A fogászati klinikai gyakorlatban a fogágybetegség terápiájában már jól bevált klórhexidinnek is lehet antioxidáns és szuperoxid képzôdést csökkentô hatása is (91; 296).

8.2.3. Az iNOS szelektív blokkolása és a peroxinitrit megkötése a fogágygyulladás

Jelenleg nincs specifikus, teljesen hatékony szer az ínygyulladás kezelésére. Bár a baktériumok inicializálják a parodontalis szövetpusztulás kaszkádját, de nemcsak a az okai a fogágybetegség progressziójának. A szervezet a behatoló baktériumok elleni védekezése során túlregulálja a MMP, COX-2, iNOS, PARS, stb. enzimeket, amelyek így már a saját szöveteket is károsítják. Ezért a parodontitis kezelésének stratégiája napjainkban megváltozik. A terápia során nemcsak antimikrobiális kezelést (fogkô eltávolítás, fognyak

simítás,

per

os

metronidazol

(diagnózistól

függôen

változhat)),

hanem

enzimszupressziós kezelést is végezni kell, hogy a szervezet túlzott, saját magát károsító gyulladásos reakcióit elnyomjuk (187; 277; 104; 258). Ennek a koncepciónak elmúlt években került gyakorlati bevezetésre a szubantimikrobiális dózisú tetraciklin akár 1 éven át tartó terápiája a parodontitis túlzott MMP aktivitásának lecsökkentésére (277; 104; 258). Jelenleg ígéretes kísérleti és klinikai vizsgálatok folynak szelektív COX-2 blokkolók és citokin receptor antagonisták alkalmazásával is (29; 258; 190). az, hogy a parodontitisben fennálló ördögi kör megszakításához, a parodontalis gyulladás csökkentéséhez a túlzott iNOS aktivitást is szelektíven bénítani kell, ill. a túltermelôdött szabad gyököket, peroxinitritet is meg kell kötni (III; IV). Ilyen reményteljes szer lehet a szelektív iNOS blokkoló és peroxinitrit kötô MEG (297; 172; 304; 305; 319; III). Az iNOS szelektivitás fontos, mivel a NOS többi izoformája jótékony hatású (lásd 8.1.3.) és így elkerülhetôek a cNOS egyidejû gátlásával bekövetkezô nemkívánatos mellékhatások. Mivel a szisztémás MEG kezelés nem okozott változást középnyomásban, ezért feltételezhetjük, hogy a cNOS-ra nem hatott a kísérleteinkben (III). Vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy a MEG csökkenti a fogágygyulladás tüneteit, az ödéma képzôdést és az alveolaris csontpusztulást (III). További elônye a MEG-nek, hogy gyenge ciklooxigenáz bénító is (363), a korábbi irodalmi adatok alapján ez is kedvezô lehet a ; 258). Hasonló dózisú MEG kezelés eddig véreztetéses

85


shockban és arthritis modellen is elônyösnek bizonyult, mellékhatást nem okozott (305; 362; 37). Az újabb vizsgálatok alapján a szintén szelektív iNOS blokkoló dimer változata a MEGnek, a guanidinoetildiszulfid is kedvezô hatású patkány ínygyulladás modellben (317; 308). A fogászati klinikai gyakorlatban a juvenilis parodontitis terápiájában alkalmazott tetraciklin nemcsak antibiotikumként hathat, hanem a fogágy MMP aktivitását, a peroxinitrit oxidatív reakcióit is gátolhatja, szintén támogatva ezzel a mi koncepciónkat (55; 187; 6; 277; 350; 104). Kutatásainkat akkor tartanánk igazán eredményesnek, ha alapkutatás jellegû vizsgálataink

eredményei

hozzájárulnának

a

hazánkban

népbetegségnek

számító

fogágybetegség legyôzéséhez és munkánk eredményeként sor kerülhetne a MEG terápiás

86


9. KÖVETKEZTETÉSEK

1. A fogbélben és a foghúsban is megtaláható mindhárom NOS izoenzim.

2. A fogbélben vagy a foghúsban a NOS izoenzimek expressziójának/aktivitásának a a NO. paradox szerepének e szervek élet- és kórtanában. Az eddigi irodalmi és saját adatok alapján általánosságban megállapíthatjuk, hogy a többi szervhez hasonlóan a pulpában és a parodontiumban fiziológiás körülmények között jelen lévô konstitutív NOS által kis koncentrációban szintetizált NO. protektív hatású, ugyanakkor a patológiai folyamatokban upregulálódó indukálható NOS által nagy koncentrációban termelt NO. viszont már káros lehet a saját szövetekre.

A NOS anatómiai lokalizálása a fogbélben, az ínyben, a nervus alveolaris inferiorban és a ganglion trigeminaleban

3. Anatómiai vizsgálatainkban demonstráltuk, hogy a pulpa és a gingiva endotheliuma is festôdik a NADPH-diaforázzal a NOS hisztokémiai markerével, valamint, hogy a fogbélben elvétve, a foghúsban nagy számban találhatóak NADPH-d pozitív/neurális NOS immunreaktív perivascularis és szoliter axonok is. Ezek az idegrostok a NADPH-d diaforáz/neurális nervus alveolaris inferioron keresztül jutnak el az alsó fogak pulpájába és parodontalis szöveteibe, ahol szenzoros (pl. fájdalomérzékelés) és vegetatív (pl. véráramlás szabályozás) funkciókban lehet szerepük.

4. A szájképletek nNOS tartalmú szenzoros idegrostjai származhatnak a ganglion trigeminaleból. Érdekes, hogy a ganglion trigeminaleban a nNOS reaktív idegsejtek kisebbek mint a többi ganglionsejt.

5. A NOS tekintetében a fô különbség a pulpa és a gingiva között, hogy míg a fogbélben alig meg nNOS tartalmú idegrost, addig a foghúsban nNOS tartalmú idegrostok gazdag hálózata van jelen. Továbbá, míg a pulpában egészséges körülmények között nem található meg az iNOS, addig a gingivában gyulladásmentes állapotban is kimutatható.

87


A NO. szerepe a fogbél és a foghús vérkeringésének szabályozásában

6. A NO. szintézis gátlása miatt kialakuló lokális vazokonstrikció a fogbélben és a foghúsban is képes legyôzni a szisztémás vérnyomás emelkedés miatt létrejövô passzív véráramlás fokozódást. Adataink alapján megállapíthatjuk, hogy a fogbél és a foghús ereiben a szervezet nyugalomban NO. függô bazális vazodilatátor tónus pulpa erek nyugalmi tónusát fenntartó NO. fôleg az eNOS tartalmú endotheliumból és nem a csekély számú nNOS-t tartalmazó perivascularis idegekbôl származhat. Ezzel szemben a foghús bazális NO. dependens vazodilatátor tónusának kialakításában az endothel eredetû NO. mellett az idegi eredetû nyugalmi NO. felszabadulás is részt vehet.

7. A szisztémás NOS blokkolás a perctérfogat fogfrakcióját nem változtatja meg, mivel a perctérfogat és a fogbél véráramlása is arányosan lecsökken. Ez azt sugallja, hogy a fogbél vérkeringése a szervezeti átlagnak megfelelôen esik a szisztémás NOS .

8. A szisztémás NO. donor kezelés által kiváltott lokális értágulat a pulpában képes meghaladni a vérnyomás esés miatt létrejövô lokális szimpatikus vazokonstrikciót a korábban .

donor SNP hatásához hasonlóan. Mivel a fogbél vérkeringése szenzitív az

exogén NO. -ra, ezért feltételezzük, hogy a stimulációra bekövetkezô endotheliumból, odontoblastokból, perivascularis NO. -erg idegekbôl, illetve egyéb forrásból (pl. gyulladásos infiltrátum sejtjeibôl) történô

.

felszabadulásnak is szerepe lehet a pulpa

értónusának regulációjában.

9. A szisztémás NO. donor kezelés nem befolyásolja a perctérfogat fogfrakcióját, mivel sem a perctérfogat, sem a fogbél véráramlása nem változik szignifikánsan.

10. Az artéria alveolaris inferior nNOS tartalmú perivascularis idegrostjai és NADPH-d reaktív endotheliuma azt sugallja, hogy az artéria alveolaris inferior nemcsak egy passzív

88


“vérvezeték” a csontban, hanem potenciális helye a pulpa és a periodontium vérkeringés szerven kívüli szabályozásának, és ebben a regulációban a NO. -nak is szerepe lehet.


11. A ligatúra által kiváltott fogágygyulladás fokozza a gingivomucosalis epithelium és kötôszövet gyulladásos sejtjeinek iNOS expresszióján keresztül a NO. termelést, és a szelektív iNOS blokkoló és peroxinitritkötô MEG kezelés jótékony hatású a parodontitis tüneteire, csökkenti a következményes plazma extravazációt és az alveolaris csontdestrukciót. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a fokozott

NO.

és

peroxinitrit

termelôdésnek szerepe lehet a fogágygyulladás patomechanizmusában.

12. Parodontitisben a fokozott NO. termelôdésnek elônyös és hátrányos hatásai is lehetnek. Elônyös az antimikrobális aktivitás, immunmoduláció, microvascularis thrombosis gátlás, fokozott szöveti perfúzió, valamint az, hogy a NO. felszabadulásnak a szabaddá vált fognyakon fájdalomcsillapító, érzékenység csökkentô hatása lehet. Másfelôl hátrányos a gazdaszövettel szemben is fennálló citotoxicitása miatt. 13. A gingivomucosalis szövet fokozott NO. tartalma hozzájárulhat a parodontitis klinikai tüneteihez. A gyulladt íny vörös és duzzadt, amiben a NO. értágító és érpermeábilitás fokozó hatása is közremûködhet. Az érintésre bekövetkezô ínyvérzésben a NO. trombocita aggregáció és adhézió gátlása is részt vehet. A fokozott alveolaris csontrezorpcióhoz a NO. osteoclast stimulációja, illetve a NO. és a peroxinitrit osteoblast differenciálódást csökkentô hatása is hozzájárulhat.

14. Saját és irodalmi adatok alapján feltételezzük, hogy a fogágygyulladásban a NO. és a peroxinitrit véd az ínybe hatoló mikrobiológiai ágensekkel szemben, azonban lokálisan

nagy

koncentrációban

különbözô

.

89

mechanizmusokkal

viszont

már


15. Klinikailag egészségesnek tünô foghúsban is elôfordulhat szubklinikus, spontán ínygyulladás, amit a normál szájflóra okozhat. Ez lehet a magyarázata a fogágygyulladás modell kontroll oldalának iNOS aktivitására és immunreaktivitására, valamint a NADPH-d pozitivitásra a foghús hámjában és egyes kötôszöveti makrofágjaiban és hízósejtjeiben normál, nem gyulladást modellezô állatban is.

16. Kísérleti eredményeink és irodalmi adatok alapján a fogágygyulladás kialakulásához reaktív nitrogén és oxigén szpecieszeken (nitrozatív és oxidatív stresszen), ezek interakcióján és reakcióik következtében nem klasszikus gyulladásos enzimek (pl.: indukálható ciklooxigenáz, mátrix metalloproteináz, poli(ADP-ribóz) szintetáz) aktivációján/expesszióján alapuló új patomechanikai reakciósorozatot dolgoztunk ki.

17. Az iNOS szelektív blokkolása és a peroxinitrit megkötése a szervezet túlzott védekezési reakciójának csökkentésén keresztül a fogágygyulladás potenciális új gyógymódja lehet. Célunk, hogy hazánkban népbetegségnek számító fogágybetegség legyôzéséhez munkánk eredményeként

a MEG terápiás alkalmazására!

90


10. KÖSZÖNETNYiLVÁNÍTÁS

Mindenekelôtt hálás vagyok feleségemnek, kisfiamnak és szüleimnek a megértésükért,

Köszönetettel és tisztelettel emlékezem néhai Prof. Dr. Kovách Arisztídre. Ô irányított a professzionális kutatói pálya felé, a tudományos gondolkodásmódom kialakításában folyamatosan útmutatást adott, biztosította a nemzetközi tapasztalatszerzésemet és Ô irányította a figyelmemet többek között az értekezés témájára is. Sajnálom, hogy mind lényegrelátásban, kritikai érzékben, alaposságban, mind a munkához való hozzáállásban már

Hálámat szeretném kifejezni a kutatómunka feltételeit biztosító SE Klin Kutató és Humán Élettani Intézet volt és jelenlegi igazgatójának, Prof. Dr. Monos Emilnek és Prof. Dr. Kollai Márknak a folyamatos támogatásukért. Külön kiemelem a “kissé vontatottan készülô” PhD disszertációm befejezésére tett folyamatos ösztönzésüket, megírásának leghatékonyabb múzsája a határidô volt. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Sándor Péter témavezetômnek a megfontolt szakmai tanácsaiért, állandó bíztatásáért, ami nélkül talán nem is készült volna el ez ával tartozom Dr. Szabó Csabának az “ínycsiklandó” szakmai tanácsaiért, hogy a “fogas kérdéseimbe ne törjem bele a fogam“, folyamatos segítségéért, közös nemzetközi kutatási programok kidolgozásáért, kurrens kísérleti anyagok beszerzéséért. i Prof. Dr. Zelles Tivadart, aki diákköri vezetômként bevezetett a

Külön köszönet illeti közvetlen munkatársaimat Dr. Balla Istvánt, Dr. Benedek Pétert, Dr. Burghardt Beátát, Prof. Dr. Csillag Andrást, Dr. Dézsi Lászlót, Prof. Dr. Fazekas Árpádot, Prof. Dr. Fehér Erzsébetet, Dr. Györfi Adrienne-t, Dr. Haskó Györgyöt, Dr. Horváth Ildikót, Dr. Ivanics Tamást, Dr. Ligeti Lászlót, Dr. Marczis Jánost, Dr. Nádasy Györgyöt, Prof. Dr. Rosivall Lászlót, Dr. Andrew Salzman-t, Dr. Ottlakán Aurélt, Dr. Pál Miklóst, Dr. Pék Lászlót, Dr. Robert Stachlewitz-et, Dr. Garry Southan-t, Dr. Varga Gábort, Dr. Vass Zoltánt, Dr. Virág Lászlót, Prof. Dr. Zelles Tivadart, akikkel az elmúlt évek során együtt dolgozhattam, gondolkozhattam, s akik kiváló munkájukkal segítettek és “ínyenc”

91


Köszönettel tartozom a Klinikai Kísérleti Kutató és Humán Élettani Intézet valamennyi munkatársának is a segítôkészségükért, a jó hangulatért. Köszönöm a bizalmat azoknak a hazai és nemzetközi kutatási alapoknak (OTKA, ETT, NIH), ösztöndíj bizottságoknak (Dr. Madzsar József, Dr. Fodor Erzsébet, Dr. Varga István és Bán Zoltán alapítvány pályadíj, Bolyai János Kutatási Ösztöndíj, Robert Frank Award, Eötvös Kutatási Ösztöndíj, Soros Alapítvány és Unilever utazási támogatás), amelyek anyagi támogatást nyújtottak a munkámhoz. Fejet hajtok a tudományos haladásért feláldozott kísérleti állatok elôtt is.

Felmerülô kérdéseivel, ötleteivel kérem, hogy keressen meg! (Tel: 210-0306; email: [email protected])

92

Ph.D. Értekezés. Dr. Lohinai Zsolt

Recommend Documents