1
Základy pipetování
Abstrakt Úloha se týká základů laboratorní gramotnosti – pipetování roztoků různými druhy pipet za ztížených podmínek a pravidel radiochemické laboratoře. Úloha obsahuje následující dílčí části: •
přesné pipetování různých objemů automatickou pipetou a stanovení chyby
•
pipetování skleněnou pipetou – kalibrace a přesnost pipety
•
postup a pracovní návyky při pipetování za stínícím štítem
•
péče o automatickou pipetu
1.1
Úvod
1.1.1
Pipetování
Precizní a práce s různými druhy pipet a dávkovačů je jednou ze základních chemických operací v jakékoliv laboratoři. V moderních analytických, radiochemických a biochemických laboratořích se k odměřování přesných objemů roztoků nejčastěji používají pístové automatické pipety. Používají se buď pipety s fixním objemem nebo pipety s kontinuálně nastavitelným objemem (pomocí mikrometrického šroubu). Dávkování je prováděno tlačítkem, které pohybuje pístem ve válci pipety. Vzorek je nabírán do nesmáčivé (polypropylenové) vyměnitelné špičky (tzv. tipu), takže nedochází ke kontaktu s pipetovacím mechanismem [1]. V radiochemických laboratořích se obvykle používají automatické pipety, které pracují na principu nasávání a vytlačování vzduchu pomocí pístu pohybujícím se ve válci nebo kapiláře. Tento princip poskytuje velmi přesné dávkování roztoků. Výjimku tvoří pipetování kapalin o vysoké viskozitě, která může významně ovlivnit správnost a přesnost pipetování. Funkce automatické pipety Tlačítko automatické pipety má tři polohy. V klidu je tlačítko v nejvyšší pozici a lze jej postupně stlačit ke kalibrační zarážce. V následujících krocích a na Obr. 1 je znázorněn postup pipetování. 1. Nastavení požadovaného objemu – pipetovací píst je nastaven do příslušné pozice. 2. Namáčknutím pipety do první pozice dojde k vytlačení stejného množství vzduchu, jako je nastavený objem. 3. Při ponoření špičky pipety do kapaliny se píst uvolní, čímž vytvoří podtlak a dojde k nasátí nastaveného objemu kapaliny. 4. Opětovným namáčknutím pipety do první pozice dojde k vytlačení kapaliny pomocí vzduchu v pipetě. Pro úplné vyprázdnění špičky je pipeta domáčknuta do druhé pozice. V rámci pipetování existují tři základní techniky [3]: •
Přímá technika pipetování doporučená pro vodné roztoky jako pufry, zředěné kyseliny nebo zásady (pipetování reagens do roztoků). 5
Klidová pozice
1
2
3
4
První pozice
↓
↑
↓
↑
↓
↑
Druhá pozice •
•
Repetitivní technika pipetování je doporučená pro opakované dávkování stejného objemu (přidávání do zkumavek nebo na destičky). Klidová pozice
1
2
3
4
První pozice
↓
↑
↓
↑
Druhá pozice
↓
↑
Reverzní technika pipetování se doporučuje pro pipetování vzorků, které se nepřidávají nebo nemíchají s jinými roztoky. Tato technika předchází riziku tvorby pěny a bublin a využívá se tedy pro pipetování viskózních roztoků a roztoků s tendencí pěnit. Klidová pozice
1
2
3
První pozice
↓
↑
↓
Druhá pozice
↓
↑
Obr. 1: Technika přímého pipetování
6
4
5 ↑
↓
↑
Pro případy, kdy automatickou pipetu nelze použít, používáme klasické skleněné pipety. Při práci v radiochemické laboratoři nasávání roztoku do pipety zásadně nikdy neprovádíme ústy a to ani v případě neaktivního roztoku. K nasávání roztoku do pipety (skleněné) se používá buď pístových pipetovacích nástavců, pipetovacích balónků nebo injekčních stříkaček přiměřených velikostí, které se nasadí na pipetu pomocí pryžové hadičky a pístem se nasaje roztok do pipety. K opakovanému pipetování téhož objemu určitého roztoku byly zkonstruovány tzv. dávkovače, které značně urychlují sériovou práci v laboratořích.
Obr. 2: Dávkovače pro odměřování objemu kapalin Odměrné laboratorní sklo je kalibrováno na konkrétní teplotu odměřované kapaliny, označovanou jako normální teplota, a to ve dvou třídách přesnosti A (s větší přesností) a B (s menší přesností). Dovolené odchylky skutečného objemu odměrné nádoby od jmenovité hodnoty jsou pro dané třídy přesnosti stanoveny příslušnými normami. Jako normální teplota je obvykle uváděna teplota 20°C, méně často se jedná o teploty nižší (15°C, 17°C nebo vyšší (25°C). Pro běžné operace se připouštějí odchylky kolem 5 °C. V případech, kdy mimořádně záleží na výsledcích analýz, nelze na přesnost a správnost kalibrace udané výrobcem spoléhat a je třeba odměrné nádobí přezkoušet. Nejběžnější způsob spočívá v tom, že vážením zjistíme hmotnost vody potřebné k doplnění nádoby po značku (kalibrace na dolití) nebo hmotnost vody z nádoby vypuštěné (kalibrace na vylití) při určité teplotě. Objem nádoby je pak dán podílem hmotnosti vody a její hustoty při této teplotě. S použitím tabulek lze nalezený objem přepočítat na objem nádoby při libovolné teplotě. Odměrné nádobí je tedy kalibrováno buď na dolití nebo na vylití. Tento dvojí způsob kalibrace je opodstatněn tím, že při vylití kapaliny z nádoby ulpí trvale vlivem smáčivosti skla určité množství kapaliny na stěnách nádoby v podobě tenkého filmu. Vyteklý objem je pak o toto množství menší, než byl původní objem kapaliny v nádobě. Odměrné baňky a odměrné válce, sloužící k vymezení objemu kapaliny uvnitř nádoby, jsou kalibrovány na dolití, což je na nádobě vyznačeno zkratkou „IN“. Naopak pipety a byrety, u nichž potřebujeme znát přesný objem vypuštěné kapaliny, jsou kalibrovány na vylití, jejich skutečný vnitřní objem je tedy větší o množství kapaliny ulpělé na stěnách po vypuštění. Kalibrace na vylití je na nádobách vyznačena zkratkou „EX“. Poněvadž množství kapaliny trvale ulpělé na stěnách pipet a byret je závislé na způsobu a době vypouštění, je třeba velmi pečlivě dodržovat předepsaný způsob použití. Jenom tak je zaručeno, že vypuštěný objem je reprodukovatelný a odpovídá hodnotě stanovené kalibrací. [1] V úlohách se používá zjednodušený postup, při němž se předpokládá stejná teplota vzduchu i vody. Dále se zanedbává různý vztlak vzduchu u vody a závaží při vážení i roztažnost skla. Rovněž není nutno přepočítávat zjištěný objem na objem při normované kalibrační teplotě 20°C. Jediná nutná kalibrace je tedy kalibrace hustoty na teplotu vody (viz Tabulka 1). Tabulka 1: Hustota vody při různých teplotách Teplota [°C]
Hustota [g.cm-3]
Teplota [°C]
Hustota [g.cm-3]
19
0,9984
23
0,9975
7
1.2
20
0,9982
24
0,9973
21
0,9980
25
0,9970
22
0,9978
26
0,9968
Úlohy
1. Stanovte chybu pipetování skleněné pipety s použitím pístového nástavce a injekční stříkačky s hadičkou 2. Stanovte chybu pipetování pro různé dávkované objemy automatické pipety včetně kalibrační křivky 3. Ověřte přesnost pipetování při práci za stínícím štítem 4. Rozeberte, vyčistěte a znovu sestavte automatickou pipetu. Ověřte, že po sestavení správně pipetuje.
1.3
Potřeby a pomůcky
Automatická nastavitelná pipeta pro požadovaný rozsah objemů, 10 ampulek, tipy, skleněné pipety, pístový nástavec, injekční stříkačka s hadičkou, analytické váhy, teploměr, roztok luminoforu, 50% roztok ethanolu, stínící štít.
1.4
Pracovní postup
1. Proveďte kalibraci skleněné pipety o objemu 1 ml 2. Proveďte kalibraci automatické pipety pro objemy 100 µl, 500 µl a 1000 µl. Pro každý objem stanovte chybu a srovnejte s chybou deklarovanou v manuálu. 3. Ověření přesnosti pipetování při práci za stínícím štítem 4. Rozeberte, vyčistěte, znovu sestavte a ověřte správnost pipetování
8
1.4.1
Kalibrace skleněné pipety
Na analytických váhách zvažte čistou suchou kádinku. Skleněnou pipetou s nástavcem odpipetujte do zvážené kádinky 1 ml vody a známé (změřené) teplotě. Při pipetování pečlivě dbejte na to, aby se spodní okraj menisku právě dotýkal rysky. Rysku čtěte kolmo ke svisle postavené pipetě tak, aby kružnice rysky splynula v úsečku. Vodu nechte z pipety volně vytékat do kádinky. Po vyprázdnění pipety počkejte 10 sekund na stečení vodního filmu ze stěny a pak špičku pipety otřete o vnitřní stěnu kádinky. Pokud je stěna kádinky nesmáčivá, otřením špičky pipety voda z pipety nevyteče. V tomto případě se dotkněte špičkou pipety o hladinu vody v kádince. Pak pipetu vytáhněte tažením po stěně. Zbytek vody ve špičce pipety se nepočítá do udaného objemu, a proto nikdy pipetu při pipetování nevyfoukávejte. Kádinku s odpipetovaným podílem zvažte a postup opakujte s dalšími deseti odpipetovanými podíly. Pro další zpracování budete používat všech deset navážek jednotlivých pipetování. Navážky zapište do protokolu ve formě přehledné tabulky, která bude obsahovat rovněž objemy vypočtené z navážek jednotlivých pipetování (2). Pro pipetování menších objemů se často používá časově méně náročný postup - tzv. „pipetování od rysky k rysce“. S pipetou připevněnou ke gumové hadičce a injekční stříkačce si tento postup vyzkoušejte. Nasajte množství aspoň o polovinu větší než je potřebný objem. Meniskus zarovnejte ke vhodné rysce, vypočtěte ke které rysce je třeba požadovaný objem vypustit a proveďte. Příklad: Do 5 ml pipety nasajete 3 ml kapaliny (ryska 2 ml – pipeta je cejchovaná odshora), pohybem pístu vypustíte kapalinu k rysce 4 ml, čímž nadávkujete přesně 2 ml. Pro vyzkoušení napipetujte do zvážené kádinky 1,5 ml roztoku, zvažte a získanou hodnotu porovnejte s kalibrací (zopakujte 3x).
1.4.2
Kalibrace automatické pipety
Obdobný postup vážení a kalibrace jako při kalibraci pipety skleněné použijte pro kalibraci automatické pipety (max. objem 1000 µL) s nastaveným objemem 100µl, 500µl a 1000 µL (postup pipetování automatickou pipetou je popsán výše). Sestrojte kalibrační křivku.
1.4.3
Pipetování za stínícím štítem
Pro účely práce s β zářiči o aktivitách používaných v praktiku postačuje plastový stínící štít. Práci za stínícím štítem si vyzkoušejte pipetováním stejného objemu roztoku luminoforu do 10 předem zvážených ampulek. Vážením ověřte přesnost vašeho pipetování.
1.4.4
Údržba pipety
1. Nastavte pipetu do nominálního objemu (např. při objemu 2-20 µL nastavte 20 µL) 2. Pipetu rozšroubujte a sejměte dolní část 3. Rozeberte pipetu, sejměte těsnění z pístu 4. Umyjte píst 50% ethanolem 5. Povrch horní části pipety a dolní části otřete jemným čisticím prostředkem nebo destilovanou vodou a 50% ethanolem 6. Nechte všechny části uschnout (při pokojové teplotě) 7. Mírně namažte silikonovou vazelínou 9
8. Znovu pipetu sestavte a vyzkoušejte
Obr. 3: Řez pístovou automatickou pipetou
1.5
Zpracování výsledků
Z naměřených hodnot vypočtěte průměrný objem pipetovaného podílu a dále jeho interval spolehlivosti. Porovnáním deklarovaného objemu pipety a zjištěného intervalu spolehlivosti určete, zda je možno považovat deklarovaný objem pipety za správný (deklarovaný objem pipety leží uvnitř zjištěného intervalu spolehlivosti). Výpočty [2]: Výpočet pipetovaného objemu
Průměrný pipetovaný objem i=n
∑V i
m Vi = i ρ
V p= 3
i=1
n
3
Vi objem pipetovaného podílu [cm ]
Vp průměrný objem [cm ]
mi hmotnost pipetovaného podílu [g]
n počet neodlehlých měření
ρ hustota vody [g.cm-3] Interval spolehlivosti (pro n < 10)
S interval spolehlivosti [cm3]
Interval spolehlivosti (pro n ≥ 10) t S = V p ± α × sn n Vp průměrný objem pipetovaného podílu [cm3]
u0 Lordův koeficient (viz tabulka)
n počet neodlehlých výsledků
tα Studentův koeficient pro υ=n-1
Rn rozpětí výsledů (xn – x1)
S = V p ± u0 R n
(viz tabulka) sn směrodatná odchylka neodlehlých výsledků [cm3] Do závěru protokolu uveďte zjištěnou hodnotu aritmetického průměru a jeho intervalu spolehlivosti pro všechny dávkované objemy u obou kalibrovaných pipet. Rovněž uveďte, zda můžeme považovat deklarované/volené objemy pipet za správné. Tabulka 2: Koeficienty statistických parametrů pro zpracování malých souborů experimentálních dat (α = 95%) 10
n
Q krit
T krit
2
1.6
u0
tα
6,353
4,303
3
0,941
1,412
1,304
3,182
4
0,765
1,689
0,717
2,776
5
0,642
1,869
0,507
2,571
6
0,560
1,996
0,399
2,447
7
0,507
2,093
0,333
2,365
8
0,468
2,173
0,288
2,306
9
0,437
2,237
0,255
2,262
10
0,412
2,343
0,230
2,228
Použitá literatura
1. V. Setnička: aktualizace textu Obecné základy práce v analytické laboratoři; Návody pro laboratorní cvičení z analytické chemie I, J. FOGL a kol., VŠCHT Praha, 2000) 2. http://recyklatori.ic.cz/download/anal_chemie/navody.pdf 3. orion.sci.muni.cz/virtuallab/dokumenty/doc/navod_pipetovani.doc 4. V. Ullmann: Jaderná a radiační fyzika, http://astronuklfyzika.cz/JadRadFyzika6.htm
11
