PERSISTENSI VAKSIN DNA PENYANDI GLIKOPROTEIN 25 YANG DIBERIKAN MELALUI PAKAN BUATAN PADA IKAN MAS Cyprinus carpio
YULIYANTI
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
PERSISTENSI VAKSIN DNA PENYANDI GLIKOPROTEIN 25 YANG DIBERIKAN MELALUI PAKAN BUATAN PADA IKAN MAS Cyprinus carpio
YULIYANTI
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Program Studi Teknologi & Manajemen Perikanan Budidaya Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul: PERSISTENSI VAKSIN DNA PENYANDI GLIKOPROTEIN 25 YANG DIBERIKAN MELALUI PAKAN BUATAN PADA IKAN MAS Cyprinus carpio adalah benar merupakan hasil karya yang belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Semua sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Januari 2011
YULIYANTI C14061431
SKRIPSI Judul
: Persistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein 25 yang diberikan melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio
Nama
: Yuliyanti
NRP
: C14061431
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Alimuddin NIP. 19700103 199512 1 001
Dr. Sri Nuryati, S.Pi, M.Si NIP. 19710606 199512 2 001
Mengetahui, Ketua Departemen Budidaya Perarian
Dr. Ir. Odang Carman, M. Sc. NIP. 19591222 198601 1 001
Tanggal Lulus :
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan ridho-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2010 s.d. November 2010 adalah vaksin DNA, dengan judul “Presistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein 25 yang diberikan melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio”. Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak yang telah mendorong dan membimbing penulis, baik ide, pemikiran, tenaga, moril maupun materil. Oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Dr. Alimuddin, selaku dosen pembimbing I 2. Dr. Sri Nuryati, selaku dosen pembimbing II 3. Dr. Widanarni, selaku dosen penguji 4. Dr. Eddy Supriyono, selaku dosen pembimbing akademik 5. Ayah, Ibu, M. Zaenuri, Inah Carinah, Muhammad Abidin dan Susy Restiani atas doa, kasih sayang, dukungan moril, maupun materil selama ini. 6. Anna Octavera, S.Pi., yang banyak membantu dalam penelitian dan penyusunan serta penulisan skripsi ini. 7. Dosen dan staf BDP yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, yang telah banyak membantu penulis dalam menyelesaikan pendidikan di IPB. 8. Sdri. Lina, Fuad, Gilang, Thami, Andhini, Jasmadi, Darmawan, Sekar, Ikbal, Sulistia, Zam Zam, Puguh, Sypeh, Nadia, Anna, Meirina, Ena, Widya dan Sofyan yang sabar membantu dan memberikan saran dalam penyusunan skripsi ini serta rekan-rekan BDP angkatan 43, 44, dan 45 yang memotivasi dan memberi semangat saat penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini.
Bogor, Januari 2011
Yuliyanti
RIWAYAT HIDUP Penulis bernama lengkap Yuliyanti, dilahirkan di Indramayu pada tanggal 20 Juli 1988 dan merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Zaenal dan Ibu Carsih. Penulis memulai jenjang pendidikan dasar di SD Negeri Lagoa 11 Pagi Percontohan dan lulus pada tahun 2000. Pendidikan lanjutan menengah ditempuh di SMP Negeri 30 Jakarta dan lulus pada tahun 2003. Pendidikan menengah atas ditempuh penulis di SMA Negeri 13 Jakarta dan lulus pada tahun 2006. Penulis diterima sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SMPB) pada tahun 2006 dan penulis memasuki Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2007. Selama kuliah penulis aktif dalam organisasi HIMAKUA sebagai anggota pada periode 2007/2008 dan sebagai staf Olahraga dan Kesenian periode 2008/2009. Penulis juga menjadi asisten untuk program Sarjana IPB mata kuliah Dasar-Dasar Akuakultur selama tiga periode tahun 2008-2010, asisten mata kuliah Nutrisi Ikan 2010, asisten mata kuliah Dasar-Dasar Genetika Ikan 2010, asisten mata kuliah Fisiologi Reproduksi Organisme Akuatik 2010, serta menjadi asisten untuk program Diploma IPB sebagai asisten mata kuliah Teknik Pemberian dan Pembuatan Pakan Ikan 2010, asisten mata kuliah Nutrisi Ikan 2010. Selain itu, penulis menerima beasiswa dari Yayasan ORBIT dari 2006-2007. Penulis pernah magang di BBAP Jepara selama 10 hari tahun 2008 serta pada bulan Juli-Agustus 2009, penulis pernah melaksanakan praktek kerja lapang dengan judul “Pembenihan Kerapu Tikus Cromilepthes altivelis di Balai Budidaya Laut Lombok”. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Departemen Budidaya Perairan, FPIK IPB, penulis melakukan penelitian yang berjudul ”Persistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein 25 yang diberikan melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio”.
ABSTRAK YULIYANTI. Persistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein 25 yang diberikan melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio. Dibimbing oleh Alimuddin dan Sri Nuryati. Koi Herpes Virus (KHV) adalah patogen virus utama yang menginfeksi ikan mas dan koi. Serangan penyakit KHV mewabah di hampir seluruh sentra budidaya ikan mas di Indonesia dan dapat menyebabkan kematian massal. Metode vaksinasi DNA merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan untuk menanggulangi serangan KHV. Pemberian vaksin umumnya dilakukan dengan cara injeksi. Pada penelitian ini dilakukan uji persistensi vaksin DNA (pMBaGP25) yang diberikan melalui pakan buatan dan persistensinya pada beberapa jaringan ikan dianalisis menggunakan metode PCR dengan primer spesifik gen GP25. Bakteri Escherichia coli DH5α yang mengandung vaksin DNA pMBaGP25 dikultur pada empat media perlakuan yaitu 2xYT, LB polipepton, LB tripton dan TSB. Kepadatan bakteri hasil kultur dihitung menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 580 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa media kultur cair yang efisien untuk pertumbuhan bakteri adalah media LB tripton. Selanjutnya, DNA GP25 dapat terdeteksi di ginjal dan limpa ikan yang diberi pakan buatan mengandung vaksin DNA GP25. Pemberian pakan bervaksin 2 kali seminggu menunjukkan persistensi DNA di ginjal dan limfa adalah tertinggi. Dosis vaksin DNA yang dapat terdeteksi adalah 7,56 ng (dengan jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010). Kata kunci: ikan mas, KHV, vaksin DNA, GP25
ABSTRACT YULIYANTI. Persistence of DNA vaccine encoding glycoprotein 25 by oral feeding on common carp Cyprinus carpio. Supervised by Alimuddin and Sri Nuryati. Koi Herpes Virus (KHV) is a major viral pathogen that infects common carp and koi. KHV disease outbreak in almost all centre of common carp culture in Indonesia and caused mass mortality. DNA vaccination method is one of ways to cope with KHV infection. Vaccines were commonly given by injection. In this research, persistence test of DNA vaccine (pMBa-GP25) were carried out by oral feeding on common carp. DNA vaccine persistence test were done using PCR method with the specific primer for GP25 gene. Escherichia coli DH5α bacteria containing pMBa-GP25 DNA vaccine were cultured in four treatment mediums namely 2xYT, LB polypeptone, LB triptone and TSB. Bacteria densities were counted with spectrophotometer using 580 nm wave lengths. The results showed that an efficient culture media for E. coli was LB tripton. Furthermore, GP25 DNA was detected in kidney and spleen of vaccinated fish. Level of DNA vaccine that could be detected was 7,56 ng (amount of DNA copy 1,598 x 1010 copies). Keywords: common carp, KHV, DNA vaccine, GP25
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ...................................................................................
ii
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
iii
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................
iv
I.
PENDAHULUAN ............................................................................
1
II. BAHAN DAN METODE ................................................................ 2.1 Kultur cari bakteri terkonstruksi glikoprotein 25 (GP25) ........... 2.2 Perhitungan jumlah kepadatan bakteri ........................................ 2.3 Pelleting bakteri terkonstruksi .................................................... 2.4 Pembuatan dan pemberian pakan bervaksin ............................... 2.5 Pemeriksaan dan perhitungan jumlah copy plasmid pada pakan 2.6 Analisis persistensi vaksin DNA ................................................ 2.7 Analisis data ................................................................................
3 3 3 3 3 4 5 7
III. HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................ 3.1 Hasil ............................................................................................ 3.2 Pembahasan ................................................................................
8 8 10
IV. KESIMPULAN ................................................................................ 4.1 Kesimpulan ................................................................................. 4.2 Saran ...........................................................................................
14 14 14
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
15
LAMPIRAN .............................................................................................
16
DAFTAR TABEL Halaman 1. Jumlah kepadatan bakteri pada media cair TSB, 2xYT, LB-P dan LB-T ....................................................................................................
1
2. Hasil digitasi pakan bervaksin GP25 dari pengambilan 3 titik sampel
1
ii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Deteksi gen MBa-GP25 pada pakan perlakuan ....................................
8
2. Deteksi gen GP25 dan kontrol internal β-aktin pada organ target .......
9
iii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Perendaman dan pengambilan 3 titik sampel pakan perlakuan ............
16
2. Komposisi media kultur agar cair (20 ml) ...........................................
17
3. Hasil digitasi standar pMBa-GP25 .......................................................
18
4. Persamaan standarisasi pMBa-GP25 ...................................................
19
5. Perhitungan ketebalan pita DNA hasil amplifikasi pada pakan Perlakuan ..............................................................................................
20
6. Perhitungan copy plasmid pada pakan perlakuan ................................
21
7. Harga bahan penyusun media perlakuan (2xYT, LB polipepton, LB tripton, TSB) ..................................................................................
22
iv
I. PENDAHULUAN Ikan mas Cyprinus carpio adalah spesies ikan air tawar yang memiliki nilai ekonomis penting. Spesies inisudah tersebar luas di Indonesia dan menjadi salah satu dari 10 komoditas andalan perikanan budidaya di Indonesia. Namun, perkembangan budidaya ikan mas menghadapi kendala setelah serangan penyakit KHV (Koi Herpes Virus) mewabah di hampir seluruh sentra budidaya ikan mas di Indonesia. Koi Herpes virus (KHV) yang menyerang ikan mas dan koi pertama kali ditemukan di Israel tahun 1998 (Hedrick et al., 1999). Selanjutnya, penyakit KHV dilaporkan berjangkit di beberapa negara antara lain negara-negara Eropa dan Amerika Serikat serta Taiwan dan Jepang pada tahun 2003 (Haenen, 2003). Sejak terjangkit pertama kali di Blitar, penyakit ini telah menyebar ke hampir semua daerah di Indonesia. Virus ini mengakibatkan kematian massal yaitu kematian mencapai 80-95% populasi sehingga berdampak pada kerugian ekonomi dan sosial (Sunarto et al., 2004). Menurut Hedrick et al.(2000), penyakit KHV menyebabkan kematian yang besar dan bersifat sporadis pada ikan mas dan koi. Serangan penyakit ini menunjukkan kematian yang sangat cepat, ikan akan terlihat sakit dan akhirnya mati dalam 24-48 jam. Alternatif yang dilakukan oleh masyarakat dalam menanggulangi wabah ini adalah dengan mengunakan bahan kimia, fitofarmaka, dan penerapan biosekuriti. Namun hasil yang diperoleh tidak maksimal untuk mencegah wabah KHV. Mengingat sifat virus herpes yang berasosiasi kuat dengan sel dan sulit untuk ditanggulangi, maka langkah pencegahan perlu dilakukan. Metode yang ada untuk mendeteksi virus secara akurat masih terbatas dan virus dapat hadir dalam tubuhinang tanpa menunjukkan gejala klinis. Salah satu langkah pencegahan yang bisa dilakukan adalah dengan vaksinasi. Vaksin yang dapat diberikan berupa vaksin konvensional dan vaksin rekombinan. Solusi terhadap serangan KHV pada ikan mas di Indonesia dapat diatasi dengan pemberian vaksin DNA. Kelebihan dari vaksin DNA (Lorenzen & LaPatra, 2005) adalah bersifat generik dan sederhana, aman dan tidak menimbulkan risiko terinfeksi penyakit, dapat mencapai tujuan vaksinasi ketika
vaksinasi konvensional gagal, mengaktifkan sistem kekebalan humoral dan seluler, memberikan proteksi yang baik apabila diberikan pada stadia awal, proteksi tidak dipengaruhi oleh suhu, dan penyediaan vaksin baru dapat dilakukan dalam waktu cepat dengan biaya yang relatif murah. Vaksin DNA dapat melindungi organisme melawan penyakit dengan cara menginjeksikan DNA murni (naked DNA) untuk meningkatkan respons kekebalan. Vaksin konvensional atau vaksin yang dilemahkan memiliki keterbatasan yang dapat disempurnakan oleh vaksin DNA. Nuryatiet al.(2010) mengatakan bahwa konstruksi vaksin DNA yang mengandung sisipan gen glikoprotein 25 (GP25) untuk KHV berhasil dikembangkan menggunakan gen virus isolat asal Indonesia sebagai sumber DNA yang disisipkan ke plasmid. Perbedaan strain virus mengandung konsekuensi adanya perbedaan sekuen gen penyandi protein imunogenik seperti yang ditunjukkan pada glikoprotein ORF 25 (yang merupakan bagian virus yang bersifat imunogenik) dari KHV asal Indonesia memiliki perbedaan susunan asam amino dengan KHV asal Jepang, Amerika Serikat dan Israel. Dengan demikian vaksin DNA yang dibuat menggunakan isolat Indonesia diduga lebih efektif dibandingkan dengan isolat dari luar. Metode vaksinasi dengan pemberian vaksin DNA melalui pakan buatan pada stadia benih ikan mas diharapkan menjadi salah satu alternatif pengobatan secara massal yang dapat menangani permasalahan penyakit pada ikan yang disebabkan oleh virus. Karena menurut Lorenzen & LaPatra (2005) salah satu kekurangan vaksin DNA yaitu masih diperlukannya suatu strategi baru untuk vaksinasi secara massal. Hal ini juga diungkapkan oleh Lorenzen & LaPatra (2005) sebagai salah satu kelebihan dari vaksin DNA yaitu proteksi vaksin DNA akan lebih baik apabila diberikan pada stadia awal. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji dosis dan frekuensi pemberian vaksin DNA, persistensi DNA asing pada organ target ikan mas Cyprinus carpio serta menguji penggunaan media agar cair yang efisien untuk pertumbuhan bakteri terkonstruksi gen pMBa-GP25.
2
II. BAHAN DAN METODE 2.1. Kultur cair bakteri terkonstruski glikoprotein 25 (GP25) Bakteri Escherichia coli yang mengandung konstruksi vaksin pMBa-GP25 yang disimpan dalam gliserol pada suhu –80oC diambil menggunakan tusuk gigi steril dan digoreskan kuadran pada media padat LB polipepton + ampisilin untuk mendapatkan koloni tunggal. Sel bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam, lalu disimpan pada suhu 4oC hingga akan digunakan. Untuk perbanyakan plasmid, bakteri dikultur di media cair menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 240 rpm selama 16 - 18 jam.
2.2. Perhitungan jumlah kepadatan bakteri Bakteri E. coli terkonstruksiplasmid GP25 dikultur pada 4 jenis media cair, yaitu 2xYT, LB polipepton, LB tripton, dan TSB dengan penambahan ampisilin 1:1000. Inkubasi bakteri dilakukan menggunakan shaker dengan kecepatan 240 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam. Sebanyak 2 ml media cair yang telah ditumbuhi oleh bakteri dimasukkan ke dalam kuvet untuk menghitung kepadatan bakteri menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm.
2.3.Pelletingbakteri terkonstruksi Pelleting bakteri bertujuan untuk memisahkan sel bakteri dengan media kultur. Sebanyak 20 ml bakteri hasil kultur dituangkan secara parsial ke dalam masing-masing microtube bervolume 1,5 ml, lalu disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm dan suhu 4oC selama 30 detik. Hasil pelleting bakteri dicuci dengan 1 ml PBS sebanyak 3 kali. Setelah dicuci dengan PBS, bakteri dimatikan dengan perlakuan panaspada suhu 80oC selama 5 menit selanjutnya disentrifugasi dan diresuspensi kembali dengan PBS sebanyak 1 ml.
2.4.Pembuatandan Pemberian Pakan Bervaksin Bakteri mengandung vaksin DNA dicampurkan terlebih dahulu dengan kuning telur sebanyak 1-2% volume bakteri sebelum dicampurkan ke pakan. Kuning telur berfungsi sebagai binder. Pakan yang mengandung vaksin DNA
kemudian didiamkan pada suhu ruang sampai kering. Pencampuran pakan buatan dengan vaksin DNA dilakukan sesaat sebelum pemberian pakan perlakuan. Ikan diberi pakan bervaksin dengan frekuensi pemberian 1 minggu sekali dan 1 minggu 2 kali yang diberikan secara at satiation.
2.5.Pemeriksaan dan perhitungan jumlah copy plasmid pada pakan Pemeriks aan dan perhitungan jumlah copy plasmid bakteri pada pakan bertujuan untuk mengetahui distribusi dan kemampuan pakan buatan sebagai pembawa vaksin DNA melalui perendaman.Pemeriksaan pakan perlakuan yang mengandung bakteri terkonstruksi dilakukan dengan melarutkan 3 butir pakan perlakuan yang berasal dari 3 titik sampel yang berbeda ke dalam masing-masing microtube 1,5 ml berisi 300 μl alkohol 70% selama 1 jam. Pakan diambil dari dalam microtube lalu larutan disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pellet dikering udarakan. Setelah benar-benar kering, pellet bakteri langsung digunakan dalam analisis PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR dilakukan menggunakan primer spesifik glikoprotein KHV yaitu FGP
5'-TTGTCGACATGACGGGTTGTGGGGTTTG-„3
dan
RGP
5'-
TCAGCAAGGCGGCCTTCACGG-„3. Reaksi PCR yang digunakan, yaitu dengan volume 10 μL yang mengandung 1 μL LA Buffer; 1 μL dNTPs mix; 1 μL MgCl2; 1 μL (1 pmol) masing-masing primer; 0,05 μL LATaq polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan), 1 μL DNAdan sisanya akuabides.Amplifikasi PCR dilakukan dengan program: pre-denaturasi pada suhu 95oC selama 7 menit; 45 siklus pada suhu 95oC selama 30 detik, 64oC selama 30 detik dan 72oC selama 30 detik; serta pada suhu 72oC selama 7 menit. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7%. Perbedaan ketebalan pita-pita DNA hasil elektroforesis diukur dengan menggunakan software UN-SCAN-IT gel. 6.0. Pita DNA yang memiliki ketebalan berbeda mencirikan perbedaan kandungan bakteri bervaksin dalam pakan.
Untuk mengetahui jumlah copy plasmid pada pakan perlakuan, hasil
digitasi standar pMBa-GP25 digunakan sebagai acuan untuk menentukan kisaran
4
konsentrasi DNA pada pakan perlakuan. Kemudian konsentrasi DNA dikonversi menggunakan rumus persamaan berikut ini. CP = (A) / {(1,1 x 10-15)* x 430 bp**} Keterangan: CP : Jumlah copy plasmid yang terkandung pada pakan (copy/µg) A : Hasil pengukuran ketebalan pita (software UN-SCAN-IT gel 6.0) *
: Konversi base pairs (1bp = 1,1 x 10-15 µg)
** : Ukuran pita DNA untuk situs pengenalan GP25 (430 bp)
2.6.Analisis persistensi vaksin DNA Deteksi vaksin DNA pada masing-masing organ ikan mas ini dilakukan dengan tahapan ekstraksi DNA organ, amplifikasi dengan PCR dan elektroforesis. DNA diekstraksi dari jaringan ginjal dan limpa ikan mas pada hari ke-1, hari ke-3, danhari ke-7 setelah pemberian pakan perlakuan. Sebanyak 20 – 25 mg sampel jaringan hasil perlakuan dimasukkan ke dalam setiap microtube bervolume 1,5 ml. Langkah pertama adalah melisiskan jaringan melalui penambahan200 µlCell Lysis Solution (Gentra, Minneapolis, USA) dan 1,5 µl proteinase K (20 mg/ml) dengan menggunakan micropipette ke dalam sampel jaringan kemudian dihomogenasi menggunakan vortex dan diinkubasi menggunakan Dry Thermo Unitpada suhu 55OC dan dibiarkan semalaman (overnight, 12-16 jam).Setelah melewati proses inkubasi, langkah selanjutnya adalah digesti RNA untuk penghilangan RNA. Sampel diangkat dari inkubator dan dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit. Sebanyak 1,5 µl RNAse (4 mg/ml) ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk dengan membolak-balik microtube secara perlahan sebanyak 25 kali, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Setelah itu, didiamkan dalam suhu ruang selama ±10 menit. Sebanyak 100 µl Protein Precipitation Solution ditambahkan ke dalam tube kemudian divorteks dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik kemudian sampel disimpan dalam es (on ice) selama 10 - 15 menit. Setelah itu sampel disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4OC, 12.000 rpm. Langkah keempat adalah pengendapan DNA. Supernatan hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam microtube bervolume 1,5 ml yang sebelumnya telah diisi
5
dengan 300 µl isopropanol. Selanjutnya diaduk dengan hati-hati sebanyak 50x dan disentrifuse pada suhu 4OC dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dari sampel dibuang dan ditambahkan etanol 70% (dingin) pada pellet genom serta disentrifuse kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ºC. Langkah terakhir, etanol dibuang dan dikering udarakan. Setelah kering, pellet DNA dilarutkan pada ion exchange water sebanyak 30 µl dan disimpan dalam freezer (-20 ºC) untuk digunakan pada proses selanjutnya (PCR dan elektroforesis). Amplifikasi DNA hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR. Tahap PCR diawali dengan pembuatan premix, yaitu campuran bahan pereaksi yang akan digunakan dalam proses PCR. Primer yang digunakan adalah primer spesifik glikoprotein KHV. Reaksi PCR yang digunakan, yaitu dengan volume 10 µL yang mengandung 1 µL LA Buffer; 1 µL dNTPs mix; 1 µL MgCl2; 1 µL (1 pmol) masing-masing primer; 0,05 µL LATaq polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan); 1 µL DNA genom dan sisanya akuabides. Amplifikasi PCR dengan situs pengenalan KHV : pre-denaturasi pada suhu 95oC selama 7 menit; 45 siklus pada suhu 95oC selama 30 detik, 64oC selama 30 detik dan 72oC selama 30 detik; serta 1 siklus pada suhu 72oC selama 7 menit. Selain itu amplifikasi β-aktin ikan mas dilakukan sebagai kontrol internalloading DNA. Primer yang digunakan adalah F ccAt: 5‟-ATGGTTATGGGACAGAAGGAC-3‟ dan R ccAT: 5‟CTGTGTCATCTTTTCCCTGTTGGC-3‟.
Program
yang
digunakan:
pre-
denaturasi pada suhu 94oC selama 3 menit; 35 siklus pada suhu 95oC selama 20 detik, 59oC selama 20 detik dan 72oC selama 30 detik; serta pada suhu 72oC selama 3 menit. Separasi
hasil
amplifikasi
PCR
dilakukan
dengan
elektroforesis
menggunakan gel agarosa0,7%. Sample DNA hasil PCR sebanyak 3 μl dicampurkan dengan 0,5 μl loadingbuffer, lalu dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel dengan menggunakan micropipette. Setelah itu 3 μl marker DNA dimasukkan ke dalam sumur di dekat sumur sampel. Bak elektroforesis ditutup dan listrik dialirkan dengan tegangan 200 Volt dan kuat arus 70 mA. Fragmen
DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke positif. Setelah
bromophenol blue bermigrasi sampai 3/4 bagian dari panjang gel, aliran listrik
6
dihentikan. Lalu gel diangkat dan dilepaskan dari cetakannya. Gel tersebut diletakkan di atas ultraviolet illuminator untuk visualisasi DNA. Pengambilan gambar menggunakan kamera digital Canon® PowerShot A640 yang terpasang pada kotak ultraviolet illuminaor. Kamera tersebut terhubung ke komputer dan pemotretan dilakukan secara otomatis menggunakan bantuan software (image capture).
2.7 Analisis data Parameter yang diamati adalah jumlah DNA yang masuk pakan buatan, jenis media yang dapat mendukung pertumbuhan bakteri serta distribusi gen mBaGP25 pada organ target dari visualisasi hasil PCR. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan mengunakan tabel, grafik, dan gambar.
7
III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil Kepadatan bakteri yang mengandung pmBA-GP25 yang dikultur pada 4 jenis media cair menunjukkan hasil yang berbeda. Kepadatan bakteri tertinggi diperoleh dengan menggunakan media LB tripton (LB-T) dengan biaya pembuatan bahan sebesar Rp 30,30/ml (Tabel 1). Tabel 1. Jumlah kepadatan bakteri pada media cair TSB, 2xYT, LB-Pdan LB-T Media Kepadatan (106/ml) 1. TSB 14,09 ± 0,49 2. 2xYT 9,63 ± 0,11 3. LB-P 11,96 ± 1,10 4. LB-T 18,30± 2,64 Keterangan: LB-P: LB polipepton; LB-T: LB tripton No.
Biaya bahan/ ml Rp 48,00 Rp 45,87 Rp 32,86 Rp 30,30
Jumlah bakteri yang terkandung pada pakan buatan ditunjukkan oleh ketebalan pita DNA dan jumlah copy plasmid pada pakan perlakuan. Deteksi gen GP25 pada pakan perlakuan membuktikan keberhasilan distribusi vaksin DNA ke dalam pakan buatan pada pengujian 3 titik sampel (Gambar 1) dan kuantifikasi hasil digitasi pakan bervaksin MBa-GP25 (Tabel 2).
Gambar 1. Deteksi gen GP25 pada pakan perlakuantitik pengambilan ke-1 (T1), titik pengambilan ke-2 (T2) dan titik pengambilan ke-3 (T3). Tabel 2. Hasil digitasi pakan bervaksin GP25 dari pengambilan 3 titik sampel Sampel
Konsentrasi DNA GP25 pada pakan (ng/μl)
1 2 3
38,76 48,21 31,51
Jumlah Rata-rata
Ketebalan pita DNA hasil amplifikasi (ng) 4,417 5,967 3,228 13,612 4,537
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan diperoleh bahwa vaksin DNA GP25 dapat masuk ke dalam organ target(Gambar 2).Secara umum,DNA vaksin
dapat terdeteksi di setiap perlakuan. Produk visualisasi PCR yang dihasilkan dengan menggunakan primer GP25 berukuran 430 bp. Gen GP25 masih terdeteksi pada hari ke-1 dan hari ke-3 pada ginjal dan limpa setelah pemberian pakan perlakuan. Selanjutnya gen GP25 tidak terdeteksi sampai hari ke-7 setelah pemberian pakan perlakuan.
GP25
β- actin
(a)
GP25
β- actin
(b) GP25
β- actin
(c) Gambar 2.Deteksi gen GP25 dan kontrol internal β-aktin pada ginjal (G) dan limpa (L) pada hari ke-1 (a) dan hari ke-3 (b) setelah pemberian pakan perlakuan. Gen GP25 tidak terdeteksi pada semua jaringan setelah pelakuan hari ke-7 (c).
9
3.2 Pembahasan Virus KHV menyerang semua stadia ikan mas, sehingga diperlukan penerapan berbagai metode untuk menanggulangi penyakit KHV seperti penggunaan vaksin DNA.
Lorenzen dan LaPatra (2005) menyatakan bahwa
vaksin DNA mengandung satu atau lebih gen yang memberi kode sebagian sifat antigenik suatu virus core protein atau envelope protein. Ekspresi antigen yang terjadi di dalam sel inang yang telah divaksinasi merangsang pengaktifan sistem kekebalan tubuh inang. Pada penelitian ini digunakan vaksin DNA yang mengandung gen imunogenik GP25 yang sudah diuji aktivitasnya (Nuryati, 2010). Pada penelitian sebelumnya uji aktivitas vaksin menggunakan metode injeksi. Tahapan isolasi plasmid mengambil porsi biaya yang paling mahal dibandingkan tahap kultur bakteri (Nuryati, 2010), sehingga harus ada alternatif metode transfer vaksin dengan memangkas tahapan isolasi plasmid yang memungkinkan pemberian vaksin dalam bentuk bakteri terkonstruksi. Pada penelitian ini dikembangkan metode pemberian vaksin melalui pakan buatan. Melalui metode PCR, persistensi vaksin DNA GP25 dapat terdeteksi pada organ target yaitu ginjal dan limpa. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian vaksin DNA GP25 melalui pakan buatan berpeluang sebagai alternatif metode transfer vaksin untuk mencegah virus KHV pada ikan mas. Berdasarkan hasil penelitian pendahuluan terkait dengan penentuan dosis bakteri E. coliDH5α sebagai vektor pembawa gen MBa-GP25 diperoleh dosis optimum sebesar 106 cfu/ml. Hal ini diperkuat oleh produk visualisasi PCR yang menunjukkan deteksi gen MBa-GP25 berukuran 430 bp pada organ target yaitu ginjal dengan frekuensi pemberian pakan sebanyak 1 minggu 2 kali pemberian. Munculnya pita DNA pada organ target diduga dapat menginduksi sistem imun. Untuk meyakinkan hal ini, perlu dilakukan uji tantang dengan virus KHV. Media kultur mempengaruhi kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup. Selanjutnya, hasil kultur menggunakan 4 jenis media berbeda menghasilkan konsentrasi bakteri yang berbeda. Berdasarkan hasil perhitungan jumlah kepadatan bakteri menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 580 nm, media LB tripton merupakan media yang menghasilkan bakteri paling banyak, yaitu(18,3±2,64)x106 cfu/mldan ekonomis, diikuti oleh
10
media TSB, LB polipepton dan 2xYT (Tabel 1). Dengan demikian disarankan untuk menggunakan media LB tripton untuk memproduksi bakteri E. coli mengandung vaksin DNA. Perhitungan jumlah copy plasmid bakteri pada pakan bertujuan untuk mengetahui kemampuan pakan buatan sebagai pembawa vaksin DNA melalui pencampuran secara manual. Berdasarkan hasil visualisasi produk PCR, maka distribusi plasmid GP25 pada pakan tidak merata. Jumlah copy DNA asing yang terdapat dalam pakan buatan mencapai nilai tertinggi yaitu pada titik sampel ke2dalam 3 butir pakan buatan.Dosis vaksin DNA dalam pakan buatan adalah 7,56ng (dengan jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010). Variasi kandungan bakteri dalam pakan diduga menjadi salah satu penyebabvariasi keberadaan DNA vaksin di organ ginjal dan limpa. Variasi jumlah pakan yang dimakan juga diduga menyebabkan perbedaan ketebalan pita DNA produk PCR antar individu ikan mas. Dosis vaksin DNA secara oral melalui pakan buatan sebesar 7,56 ng (dengan jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010)relatif lebih rendah dibandingkan denganpenelitian Nuryati (2010). Dosis vaksin DNA terbaik melaui injeksi yang digunakan pada uji tantang terhadap sintasan ikan mas yang diinfeksi koi herpes virus (KHV) adalah 7,5 µg(dengan jumlah copy DNA yaitu 7,8 x 1012)dan 12,5 µg (dengan jumlah copy DNA yaitu 13 x 1012) (Nuryati, 2010). Dosis yang ditemukan juga lebih rendah dibandingkan dengan yang dilaporkan oleh Zheng et al. (2006), yaitu 15 µg. Penggunaan bakteri sebagai vektor pembawa gen GP25 yang dicampurkan ke pakan buatan dapat menurunkan dosis vaksin DNA dengan metode injeksi dari 1012 menjadi 106. Namun dengan penurunan dosis tersebut, ekspresi gen GP25 belum bisa dideteksi dengan RT-PCR. Dengan demikian penelitian menggunakan dosis lebih tinggi masih perlu dilakukan. Terkait dengan tingginya biaya pembuatan vaksin DNA menggunakan metode injeksi, maka diharapkan pemberian vaksin DNA secara oral dapat menekan biaya vaksinasi. Ginjal adalah organ yang memiliki kemampuan sebagai penyaring zat-zat sisa metabolisme tubuh, memproduksi hormon erythropoietin yang membantu pembuatan
sel
darah
merah
dan
menyaring
darah.
Limpa
berfungsi
mengakumulasi limfosit dan makrofaga, degradasi eritrosit, tempat cadangan darah, dan sebagai organ pertahanan terhadap infeksi partikel asingyang masuk ke
11
dalam darah. Oleh karena itu, ginjal dan limpa merupakan organ target yang diisolasi untuk mendeteksi gen MBa-GP25 setelah H+1, H+3 dan H+7 pemberian pakan perlakuan. Gray et al. (2002) menyatakan bahwa virus DNA lebih banyak ditemukan
pada
ginjal,
jaringan
usus
dari
ikan
yang
terinfeksi,
tetapijugaterdeteksidalamjaringanhatidanginjalpada jumlah yanglebih rendah. Selanjutnya,
Gilad
et
al.
(2004)
melaporkan
bahwa
insang,
ginjal,
danlimpaadalahorganyangpalingbanyakterinfeksi KHV. Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa DNA GP25 dapat terdeteksi setelah hari ke-1(Gambar 2a) dan hari ke-3 (Gambar 2b) setelah pemberian pakan perlakuan. Padaginjal setelah H+1 dan H+3 dengan frekuensi 1 minggu sekali pemberian, dihasilkan pita DNA yang lebih tipis dibandingkan frekuensi pemberian 1 minggu 2 kali pemberian. Selanjutnya, pada hari ke-7 setelah pemberian pakan perlakuan (Gambar 2c), gen GP25 tidak terdeteksi pada semua organ target. Hal ini mungkin disebabkan karena semua atau hampir semua plasmid DNA telah terpotong-potong oleh enzim restriksi endogenus. Dengan demikian, pemberian pakan bervaksin 2 kali seminggu diduga dapat menginduksi sistem imun ikan mas. Hal ini diperkuat oleh pendapat Gillund et al. (2008) yang menyatakan bahwa vaksin DNA yang diberikan ke ikan akan mengalami beberapa kemungkinan antara lain: a) DNA akan masuk (uptake) ke dalam sel yang ada di lokasi injeksi; b) DNA akan tertinggal di bagian luar sel (ekstraseluler); c) DNA akan didegradasi oleh enzim endonuklease di jaringan tempat injeksi, dan d) DNA terdistribusi melalui darah ke jarungan lain. Target yang diharapkan dari pemberian vaksin DNA ini adalah munculnya respons imun pada ikan yang diberi vaksin. Nuryati (2010) menyatakan bahwa vaksin DNA yang terdistribusi ke jaringan lain dan terekspresi maka vaksin DNA tersebut akan mentranslasikan glikoprotein virus KHV. Glikoprotein virus harus dipastikan tidak menginfeksi inangnya sendiri (ikan). Bila gen glikoprotein ditranslasi dan selanjutnya protein GP dikenali oleh sistem imun sehingga terbentuk antibodi dan menginduksi memori, maka vaksinasi DNA melalui pakan buatan dapat menjadi alternatif pengendalian infeksi KHV pada ikan mas dan ikan koi. Pemberian vaksin DNA GP25 melalui pakan buatan dapat terdeteksi pada ikan mas stadia benih. Hal ini sesuai dengan
12
Kordi (2004), menyatakan bahwa vaksin DNA kurang efektif diberikan pada ikan yang digunakan berumur kurang dari 2 minggu dan berat badannya kurang dari 1 g. Hal ini karena organ tubuh yang merespons kekebalan belum sempurna memproduksi antibodi. Organ tubuh ikan yang berfungsi merespons kekebalan, akan tercapai sempurna setelah 2 minggu.
13
IV. KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpulan Media kultur cair yang efisien untuk pertumbuhan bakteri adalah media LB tripton. DNA GP25 dapat terdeteksi di ginjal dan limpa ikan yang diberi pakan buatan mengandung vaksin DNA GP25. Pemberian pakan bervaksin 2 kali seminggu menunjukkan persistensi DNA di ginjal dan limpa adalah tertinggi. Dosis vaksin DNA yang dapat terdeteksi pada pakan adalah 7,56ng (dengan jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010).
4.2 Saran Perlakuan uji tantang pada ikan mas yang telah diberikan pakan buatan bervaksin DNA GP25 dengan frekuensi 1 minggu 2 kali pemberian. Penelitian menggunakan dosis vaksin lebih tinggi juga perlu dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA Gilad, O., Yun, S., Zagmutt-Vergara, F.J., Leutenegger, C.M., Bercovier, H., Hedrick, R.P., 2004. Concertrations of a koi herpesvirus (KHV) in tissue of experimentally infected Cyprinus carpio koias assessed by real-time TaqMan PCR. Diseases of Aquatic Organisms 60, 179-187. Gillund, F., Dalmo, R., Tonheim, T.C., Seternes, T., Myhr, A.I., 2008. DNA vaccination in aquaculture-Expert jugments of impacts on enviroment and fish health. Aquaculture 284, 25-34. Haenen, O.L., Way, M.K., Bergmann, S.M., Ariel, E., 2004. The emergence of koi herpesvirusand its significance to European aquaculture.Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 24, 293–307. Hedrick, R.P., Marty, G.D., Nordhausen, R.W., Kebus, M., Bercovier, H., Eldar, A., 1999. An herpesvirus associated with mass mortality of juvenil and adult koi Cyprinus carpio. Fish Health Newsl. Am. Fish. Soc., 27:7. Hedrick, R.P., Gilad, O., Yun, O., Spangenberg, J., Marty, R., Nordhausen, M., Kebus, M., Bercovier, H., Eldar, A., 2000. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenil and adult koi, a strain of common carp. J. Aquant. Anim. Health 12, 44-55. Kordi, M.G.H., 2004. Patologi Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Lorenzen, N., LaPatra, S.E., 2005. DNA vaccines for aquaculture fish. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 24(1), 201-213. Nuryati, S., Alimuddin., Sukenda., Soejoedono R.S., Santika, A., Pasaribu, F.H., Sumantadinata, K., 2010. Constraction of a DNA vaccine using glycoprotein gene and its expression towards increasing survival rate of KHV-infected Common carp Cyprinus carpio. Natur Indonesia 13, 47-52. Nuryati, S. 2010. Pengembangan vaksin DNA penyandi glikoprotein virus KHV (Koi Herpes Virus) menggunakan isolat lokal. [Disertasi]. Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor. Sunarto, A., Taukhid, Koeshayani, I., Supriadi, H., Gardenia, L., 2004. Strategi Pengendalian Koi Herpesvirus pada Ikan Mas dan Koi. Makalah pada workshop Strategi dan Pengendalian Penyakit Koi Herpesvirus pada Ikan Mas dan Koi. Zheng, F.R., Sun, X.Q., Liu,H.Z., Zhang, J.X., 2006. Study on the distribution and expression of DNA vaccine agains lymphocytis disease virus in Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Aquaculture 261, 1128-1134.
Lampiran1. Pencampuran dan pengambilan 3titik sampel pakan perlakuan T1
T2
T3
16
Lampiran 2. Komposisi media kultur agar cair (20 ml) No. 1.
Jenis Media 2XYT
Komposisi NaCl 0,5% Yeast Ekstrak 1% Polypepton 1,6% Mili Q water
0,1 g 0,2 g 0,32 g 20 ml
Jumlah
2.
LB Polipepton
NaCl 1% Yeast Ekstrak 0,5% Polypepton 1% Mili Q water
0,2 g 0,1 g 0,2 g 20 ml
3.
LB Tripton
NaCl 1% Yeast Ekstrak 0,5% Tripton 1% Mili Q water
0,2 g 0,1 g 0,2 g 20 ml
4.
TSB
Pancreatic Digest of Casein Papaic Digest of Soyabean Meal Sodium Chloride Dipotassium Hydrogen Phosphate Dextrose (Glucose)
0,8 g
17
Lampiran 3. Hasil digitasi standar pMBa-GP25 Sample 1 2 3 4
Konsentrasi DNA GP25 awal (ng/μl) 63,663 35,731 9,477 5,988
Ketebalan pita DNA hasil amplifikasi (ng) 10,00 1,00 0,10 0,01
18
Lampiran 4. Persamaan standarisasi pMBa-GP25
Konsentrasi DNA Gp25 awal (ng/µl)
12 10 8 y = 0.164x - 1.939 R² = 0.829
6 4 2 0 0 -2
10
20
30
40
50
60
70
Ketebalan pita hasil amplifikasi (ng)
19
Lampiran 5. Perhitungan ketebalan pita DNA hasil amplifikasi pada pakan perlakuan Persamaan dalam perhitungan standarisasi pMBa-GP25: y = 0,164x – 1,939 Ketebalan Pita DNA pada Pengujian Titik Sampel ke-1 : y = 0,164x – 1,939 y = 0,164 (38,75582) – 1,939 y = 4,4169ng
20
Lampiran 6. Perhitungan copyplasmid pada pakan perlakuan Persamaan dalam perhitungan jumlah copy plasmid: CP = (A) / {(1,1 x 10-15)* x 430 bp**} Keterangan: CP : Jumlah copy plasmid yang terkandung pada pakan (copy/ng) A : Hasil pengukuran ketebalan pita (software UN-SCAN-IT gel 6.0) *
: Konversi base pairs (1bp = 1,1 x 10-15 µg atau 1 bp =1,1 x 10-12 ng)
** : Ukuran pita DNA untuk situs pengenalan GP25 (430 bp)
Diketahui : Kebutuhan pakan untuk 10 ekor ikan mas = 1,2045 g Jumlah pakan untuk 1 ekor ikan mas
= 0,12045 g = 15 butir
Plasmid DNA yang terkandung pada 1 butir pakan = 0,504151 ng Plasmid DNA yang terkandung pada 15 butir pakan = 15 x 0,504151 ng = 7,56 ng
Jumlah copy plasmid pada pakan perlakuan : CP = (A) / {(1,1 x 10-12) x 430 bp} = 7,56ng / {(1,1 x 10-12)* x 430 bp} = 1,598 x 1010
21
Lampiran 7. Harga bahan penyusun media perlakuan (2xYT, LB polipepton, LB tripton, TSB) Media
2xYT
LB polipepton
LB tripton
TSB
Komposisi Bahan
Bobot Bahan 1 Botol (g)
Jumlah Bahan yang Digunakan
Harga Bahan Total (Rp)
Harga Bahan (Rp)
%/100 ml
g/100 ml
500 g
Polipepton
500
1,6
1,6
888000
100 ml 2841,6
1 ml 28,42
1 ml
Ekstrak ragi
500
1,0
1,0
660000
1320,0
13,20
425,0
4,25
45,87
1776,0
17,76
NaCl
500
0,5
0,5
Polipepton
500
1,0
1,0
425000 888000
Ekstrak ragi
500
0,5
0,5
660000
660,0
6,60
NaCl
500
1,0
1,0
425000
850,0
8,50
Tripton
500
1,0
1,0
760000
1520,0
15,20
660,0
6,60 8,50
Ekstrak ragi
500
0,5
0,5
660000
NaCl Pancreatic Digest of Casein Papaic Digest of Soyabean Meal
500
1,0
1,0
425000
850,0
500
4,0
4,0
600000
4800,0
Sodium Chloride Dipotassium Hydrogen Phosphate
48,00
32,86
30,30
48
Dextrose (Glucose)
22
