PENGOPTIMUMAN DAN VALIDASI SIDIK JARI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI EKSTRAK Phyllanthus niruri L.
WULAN TRI WAHYUNI S.
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengoptimuman dan Validasi Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ekstrak Phyllanthus niruri L. adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutif dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Februari 2010
Wulan Tri Wahyuni S. NIM G451070051
ABSTRACT WULAN TRI WAHYUNI S. Optimization and Validation High Performance Liquid Chromatographic Fingerprint of Phyllanthus niruri L. Under direction of LATIFAH K. DARUSMAN and AJI HAMIM WIGENA Split-plot mixture-mixture design has been applied for optimization of Phyllanthus niruri L. chromatographic fingerprint. The design applied for unreplicated and simultaneous optimization of extraction mixture and chromatographic mobile phase mixture. The whole-plot was extraction solvent contained varying proportion of methanol, ethyl acetate and dichloromethane in a simplex-centroid with axial design. The sub-plot was reversed phase chromatographic mobile phase in simplex-centroid design contained varying proportion of methanol, acetonitrile and acetonitrile:water (55:45 v/v). Each extract analyzed with seven mobile phase and monitored at 210, 225 and 254 nm. / < 0,4). Ratio whole plot error to subplot error smaller than 0,4 ( Correlation between extraction solvent, chromatographic mobile phase and number of peak analyzed statistically by Ordinary Least Square (OLS) method. The root mean square error of calibration (RMSEC) and root mean square error of prediction (RMSEP) at 210, 225 and 254 nm respectively were 1,86341 and 4,00759; 2,22201 and 5,28394; 1,54367 and 2,26063. Optimum codition obtained when ethyl acetate extract eluted by acetonitrile:water (55:45 v/v) and monitored at 254 nm. Validation of optimum condition performed for precision and extract stability test parameter. Precision of retention time at optimum condition was excellent, percent relative standard deviation (%RSD) were 0,0698 % - 0,3006 %. Extract stability test examined after 2,5 and 5 hours storage at 25 ˚C with protection from light, peak area of each extract component changed in different level during the storage. Keywords: optimization, validation, chromatographic fingerprint, Phyllanthus niruri L., split-plot mixture-mixture design.
RINGKASAN WULAN TRI WAHYUNI S. Pengoptimuman dan Validasi Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ekstrak Phyllanthus niruri L. dibimbing oleh LATIFAH K. DARUSMAN dan AJI HAMIM WIGENA Phyllanthus niruri L. atau meniran merupakan bahan baku obat herbal yang memiliki khasiat sebagai hepatoprotektor, antihepatitis, antioksidan, serta penghambat replikasi dan transkripsi balik HIV. Sejauh ini kualitas meniran ditentukan berdasarkan kandungan senyawa penanda tunggal dari golongan lignan atau tanin. Hal ini dinilai kurang memadai karena khasiat obat herbal disumbangkan oleh sejumlah senyawa kimia yang bekerja secara sinergis. Penggunaan sidik jari kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk kontrol kualitas obat herbal dapat menjadi pendekatan yang efektif karena dapat menjelaskan karakteristik obat herbal secara komprehensif. Diperlukan sidik jari yang informatif dan representatif untuk membangun model kontrol kualitas yang handal. Sidik jari kromatografi yang informatif dan representatif tersebut dapat diperoleh melalui pengoptimuman pelarut ekstraksi dan fase gerak kromatografi dengan bantuan rancangan statistika. Pada penelitian ini dilakukan pengoptimuman sidik jari KCKT ekstrak meniran menggunakan bantuan split-plot mixture-mixture design. Rancangan ini diterapkan terhadap kombinasi pelarut ekstraksi dan fase gerak KCKT. Pelarut ekstraksi yang terdiri atas metanol, etil asetat, dan diklorometana disusun mengikuti rancangan mixture yang mengambil bentuk simplex-centroid dengan axial design. Sementara fase gerak KCKT terdiri atas metanol, asetonitril, dan asetonitril:air (55:45 v/v) disusun sesuai rancangan mixture dengan bentuk simplex-centroid. Panjang gelombang deteksi yang digunakan ialah 210, 225, dan 254 nm. Tanaman meniran yang digunakan diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT) Tawangmangu. Setelah dikeringkan dalam oven bersuhu 40 ˚C kadar air sampel meniran ialah sebesar 6,5696 %. Tanaman meniran asal B2P2TO-OT mengandung senyawa metabolit sekunder dari golongan flavonoid, fenol hidroquinon, steroid, tanin, saponin, dan lignan. Ekstraksi dengan teknik maserasi menggunakan sepuluh kombinasi pelarut ekstraksi memberikan rendemen ekstraksi yang beragam. Rendemen ekstraksi tertinggi ialah 7,4254 % saat digunakan pelarut metanol dan rendemen terkecil saat menggunakan diklorometana, yaitu sebesar 1,3668 %. Sepuluh jenis ekstrak meniran dipisahkan dengan tujuh kombinasi fase gerak. Pelarut ekstraksi ditempatkan sebagai whole-plot dan fase gerak KCKT sebagai sub-plot. Pengacakan dilakukan untuk menghindari galat sistematik. Ekstrak metanol terelusi ke luar kolom paling cepat karena interaksinya dengan fase diam C18 bersifat lemah. Ekstrak diklorometana memerlukan waktu yang lebih lama untuk terelusi karena interaksinya dengan fase diam C18 lebih kuat. Radiasi pada panjang gelombang ultraviolet menyebabkan terjadinya transisi elektronik dari keadaan dasar menuju keadaan tereksitasi. Pada panjang gelombang deteksi 210 dan 225 nm jumlah energi radiasi yang diserap
menyebabkan transisi elektronik n→σ*, n→л*, dan л→л*, sementara transisi elektronik yang terjadi pada panjang gelombang 254 nm ialah n→л* dan л→л*. Transisi elektronik yang terjadi pada setiap panjang gelombang deteksi mempengaruhi jumlah puncak yang dapat dideteksi pada masing-masing panjang gelombang tersebut. Jumlah puncak yang dapat dideteksi dihitung berdasarkan kriteria nilai resolusi dan rasio sinyal terhadap derau (S/N). Puncak diakui dan dihitung jika memiliki nilai resolusi ≥ 1 dan nilai S/N ≥ 3. Jumlah puncak maksimum yang dapat dideteksi pada panjang gelombang 210 nm ialah 30 buah, pada panjang gelombang 225 nm sebanyak 21 buah, sementara pada panjang gelombang 254 nm ialah 20 buah. Jumlah puncak pada panjang gelombang 210 nm dan 225 nm lebih banyak dibanding pada 254 nm. Namun demikian, perlu diwaspadai jumlah puncak yang dapat dideteksi pada panjang gelombang 210 dan 225 nm tidak seluruhnya berasal dari ekstrak meniran. Pelarut metanol masih memberikan puncak serapan yang berarti pada panjang gelombang 205 hingga 235 nm. Analisis statistika terhadap data yang diperoleh dilakukan dengan bantuan perangkat lunak MINITAB. Data yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan nisbah ragam whole-plot terhadap ragam sub-plot kurang dari 0,4 ( / < 0,4) sehingga ragam whole-plot dianggap tidak signifikan dan koefisien model regresi diduga menggunakan metode kuadrat terkecil (OLS). Interaksi linear pada model regresi secara konsisten memberikan efek yang sinergis terhadap respons. Sinergisme tertinggi pada interaksi linear dihasilkan saat ekstrak etil asetat dipisahkan dengan fase gerak asetonitril:air (55:45 v/v). Interaksi kuadratik yang fase gerak metanol dengan asetonitril pada proporsi yang sama selalu memiliki interaksi kuadratik yang sinergis dengan pelarut ekstraksi metanol, etil asetat, maupun diklorometana. Pendugaan jumlah puncak pada titik axial dilakukan menggunakan model regresi pada setiap panjang gelombang. Persamaan regresi juga digunakan untuk menduga jumlah puncak dari data yang digunakan membangun model. Nilai root mean square error of calibration (RMSEC) dan root mean square error of prediction (RMSEP) pada panjang gelombang 210, 225, dan 254 nm berturutturut ialah 1,86341 dan 4,00759; 2,22201 dan 5,28394; 1,54367 dan 2,26063. Nilai RMSEC dan RMSEP terkecil diperoleh pada panjang gelombang deteksi 254 nm. Berdasarkan nilai RMSEC dan RMSEP model regresi terbaik dibangun dari data pada panjang gelombang deteksi 254 nm, yaitu saat ekstrak etil asetat dipisahkan dengan fase gerak asetonitril:air (55:45 v/v). Validasi kondisi optimum dilakukan terhadap parameter presisi dan kestabilan larutan ekstrak. Parameter presisi ditentukan melalui keterulangan injeksi. Nilai persen simpangan baku relatif (%SBR) setiap waktu retensi berkisar antara 0,0698 % hingga 0,3006 %, hasil ini menunjukkan kondisi optimum memiliki ketelitian yang sangat baik. Uji kestabilan ekstrak dilakukan dengan menganalisis ekstrak sesaat setelah disiapkan (t=0), setalah penyimpanan 2,5 jam, dan 5 jam pada ruangan bersuhu 25 ˚C dan terlindung dari cahaya. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa proses penyimpanan menyebabkan perubahan luas puncak yang bervariasi pada setiap komponen ekstrak. Kata kunci: pengoptimuman, validasi, sidik jari kromatografi, Phyllanthus niruri L., split-plot mixture-mixture design
© Hak cipta milik IPB, tahun 2010 Hak cipta dilindungi undang-undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PENGOPTIMUMAN DAN VALIDASI SIDIK JARI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI EKSTRAK Phyllanthus niruri L.
WULAN TRI WAHYUNI S.
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis: Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr.
Judul Tesis Nama NIM
: Pengoptimuman dan Validasi Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ekstrak Phyllanthus niruri L. : Wulan Tri Wahyuni S. : G451070051
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, M.S. Ketua
Dr. Ir. Aji Hamim Wigena, M.Sc. Anggota
Diketahui
Ketua Program Mayor Kimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, M.S. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Ujian: 22 Februari 2010
Tanggal Lulus: 01 Maret 2010
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kapada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2009 ini ialah sidik jari kromatografi tanaman obat, dengan judul Pengoptimuman dan Validasi Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ekstrak Phyllanthus niruri L. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, M.S. dan Bapak Dr. Ir. Aji Hamim Wigena, M. Sc. selaku pembimbing, serta kepada Ibu Dr. Ir. Erfiani, M.S. atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk bergabung dalam Hibah Tim Pasca Sarjana yang telah mendanai sebagian penelitian ini. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak M. Rafi dan Ibu Utami Diah Safitri yang telah banyak memberi saran dan masukan, Bapak Eman dan Ibu Nunung dari Laboratorium Kimia Analitik IPB, Bapak M. Agung Zaim dan Ibu Nunuk dari Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB, Bapak Sadiman dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT) Tawangmangu, dan Ibu Ani Andriyati dari pascasarjana mayor statistika yang telah banyak membantu selama penelitian berlangsung. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua, bunda, seluruh keluarga, serta rekan-rekan pascasarjana mayor kimia angkatan 2007 atas segala dukungan dan doa yang diberikan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2010 Wulan Tri Wahyuni S.
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 23 November 1982 dari ayah bernama Bajang Saepudin dan ibu bernama Titi Rohayati. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2001 penulis menyelesaikan studi di SMU Negeri I Cibadak dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten dosen Kimia Dasar I sebanyak dua kali, yaitu pada semester pendek (matrikulasi) tahun ajaran 2003/2004 dan semester reguler pada tahun ajaran yang sama. Penulis juga menjadi asisten praktikum Kimia Analitik IV pada tahun ajaran 2004/2005 dan menjadi Penanggung Jawab Praktikum (PJP) semester ganjil Kimia Tingkat Persiapan Bersama (TPB) pada tahun ajaran 2005/2006. Pada tahun 2006 penulis berhasil menyelesaikan pendidikan sarjana dan mendapatkan penghargaan sebagai lulusan terbaik di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai tenaga pengajar di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Tahun 2007 penulis lulus seleksi masuk Sekolah Pascasarjana IPB dan mendapatkan dana pendidikan dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi melalui program Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) untuk melanjutkan studi pada Program Magister Mayor Kimia.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ................................................................................................xii DAFTAR GAMBAR...........................................................................................xiii DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................xiv PENDAHULUAN Latar Belakang ............................................................................................ 1 Tujuan Penelitian ......................................................................................... 3 TINJAUAN PUSTAKA Phyllanthus niruri L. (Meniran) .................................................................. 4 Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)................................. 5 Pengoptimuman Pelarut Ekstraksi dan Fase Gerak KCKT dengan Split-Plot Mixture-Mixture Design .............................................................. 6 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................................... 11 Alat dan Bahan ............................................................................................ 11 Metode Penelitian........................................................................................ 11 HASIL DAN PEMBAHASAN Preparasi dan Ekstraksi Phyllanthus niruri L. (meniran) ........................... 15 Pengoptimuman Kondisi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan Pemisahan Ekstrak Meniran ........................................................................ 18 Analisis Data Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)........ 22 Validasi Kondisi Optimum ......................................................................... 27 SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 29 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 30 LAMPIRAN ......................................................................................................... 35
DAFTAR TABEL Halaman 1 Jumlah puncak maksimum pada panjang gelombang 210, 225, 254 nm ....... 21 2 Persamaan regresi pada panjang gelombang 210, 225, dan 254 nm ..........…. 23 3 Nilai RMSEC dan RMSEP pada 210, 225, dan 254 nm…....................................25
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Tanaman Phyllanthus niruri L. ..................................................................... 4 2 Simplex-lattice, simplex-centroid, simplex-centroid dengan axial design..... 8 3 Mixture-mixture design untuk pelarut ekstraksi (a) dan mixture design untuk fase gerak KCKT (b)...................................................................................... 9 4 Komposisi pelarut ekstraksi sesuai mixture design ...................................... 13 5 Komposisi fase gerak KCKT sesuai mixture design ..................................... 13 6 Titik percobaan yang digunakan untuk membangun model regresi ............ 14 7 Simplisia meniran sebelum dihaluskan (a) dan setelah dihaluskan (b) ........ 16 8 Rendemen ekstraksi meniran ......................................................................... 18 9 Kromatogram ekstrak metanol (a) dan diklorometana (b)............................. 20 10 Grafik hubungan jumlah puncak terdeteksi dengan jumlah puncak dugaan pada panjang gelombang deteksi 254 nm ................................................... 25 11 Sidik jari KCKT ekstrak etil asetat meniran pada panjang gelombang deteksi 254 nm ............................................................................................. 26 12 Kontur plot ekstrak etil asetat pada panjang gelombang 254 nm ............... 27 13 Perubahan luas puncak masing-masing komponen ekstrak akibat penyimpanan .............................................................................................. 28
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alir penelitian ...................................................................................... 35 2 Penentuan kadar air meniran berdasarkan metode gravimetri evolusi .......... 36 3 Uji fitokimia serbuk kering meniran ............................................................ 36 4 Pemayaran ekstrak meniran dengan spektrofotometer ultraviolet berkas ganda pada panjang gelombang 200-400 nm Bagan alir penelitian ........................ 36 5 Pengacakan terhadap whole dan sub-plot, menunjukkan urutan eksperimen dengan KCKT ............................................................................................... 38 6 Jumlah puncak hasil pemisahan ekstrak meniran dengan KCKT fase terbalik pada panjang gelombang deteksi 210, 225, dan 254 nm ............................. 39 7 Profil hubungan pelarut ekstraksi, fase gerak KCKT, dan jumlah puncak maskimum pada 210 nm (a), 225 nm (b), dan 254 nm (c) ........................... 41 8 Plot kuantil-kuantil pada panjang gelombang 210, 225, dan 254 nm............ 42 9 Grafik hubungan jumlah puncak terdeteksi dengan jumlah puncak dugaan pada panjang gelombang 210 nm (a) dan 225 nm (b)..................................... 43 10 Waktu retensi komponen kimia dalam ekstrak etil asetat meniran pada enam kali ulangan injeksi dengan fase gerak asetonitril:air (55:45) .......... 44 11 Luas puncak komponen kimia dalam ekstrak etil asetat meniran setelah penyimpanan ................................................................................... 44
