PENGGUNAAN MIKROALGA Chlorella pyrenoidosa Chick AMOBIL UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS AIR DALAM AKUAKULTUR

J. Hidrosfir Indonesia

Vol. 5

No.2

Hal.25 - 33

Jakarta, Agustus 2010

ISSN 1907-1043

PENGGUNAAN MIKROALGA Chlorella pyrenoidosa Chick AMOBIL UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS AIR DALAM AKUAKULTUR Rini Riffiani Peneliti Bidang Mikrobiologi Pusat Penelitian Biologi-LIPI Naskah diterima : 6 Mei 2010 - Revisi terakhir 28 Juli 2010

Abstract Immobilized microalgae Chlorella pyrenoidosa was applied initially to nutrient and heavy metal removal of wastewater. Immobilized microalgae using alginate was then developed for aquaculture application, such as controlling fish water culture quality to uptake concentration of ammonium, nitrate and to increase the oxygen level in water. During immobilization, algal cell maintain their respiratory and photosynthetic activities as that cell in the normal condition. The objective of this research was to examine the role of C. pyrenoidosa immobile on controlling the water quality by measuring ammonium, nitrate, and dissolved oxygen content. Five aquariums consisted of 40 litres of water were filled with 20 Nile Tilapia (Oreothromis niloticus) with the average weight between 1.6 and 1.7 g. The immobile algae cell were packaged in two nillon porus bag (pore size was 2x3 mm in diameter) and each immobile cell had 4 millimeter in diameter. Each aquarium was added with 3000, 4000, 5000, and 6000 of immobile cell. The treatment had 2 replicates. The results showed that the aquarium filled with 4000 beads of immobile cell gave the best result. The ammonium content on the water decrease 6,626 ppm/day, nitrate content on the water decreased 13.99 ppm/ day, soluble oxygen raised 0.766 per day and fish biomass raised 1.56 g/fish for 15 days. Keywords : Immobilized, Chlorella pyrenoidosa, aquaculture, algae, ammonium, nitrate

I.

PENDAHULUAN

Akuakultur merupakan salah satu aktivitas penting untuk memenuhi kebutuhan manusia berupa produk-produk perikanan. Pada saat ini akuakultur telah memberikan kontribusi sebesar 37% dari total produksi ikan sedunia. Oleh karena itu, akuakultur merupakan usaha alternatif untuk pemenuhan kebutukan produk-produk perikanan. Pada saat ini produksi perikanan dunia masih didominasi oleh perikanan air tawar. Sistem akuakultur banyak menimbulkan dampak positif dan negatif. Penerapan sistem

intensifikasi pada budidaya tanpa memperhatikan daya dukung lingkungan dapat menghambat pertumbuhan dan mengganggu kesehatan ikan. Sebagai contoh, proses larvikultur ikan air tawar di seluruh dunia termasuk Indonesia masih menggunakan sistem konvensional yaitu sistem statis (batch). Pada sistem ini terjadi penurunan kualitas air karena relatif tidak ada pergantian air, sebagai akibatnya terjadi akumulasi senyawa toksik antara lain amonia yang berasal dari ekskresi larva ikan dan sisa pakan yang diberikan(1).

Koresponden Penulis Email: [email protected]

25

Penggunaan Mikroalga Chlorella pyrenoidosa Chick..... J. Hidrosfir. Vol. 5 (2) 25 - 33

Beberapa jenis mikroalga yang diamobilisasi seperti, Scenedesmus quadricauta efisien digunakan sebagai agen pengontrol kualitas air dalam akuakultur. Hal ini karena beberapa mikroalga memiliki kemampuan dalam meningkatan kadar oksigen terlarut dan menurunan kadar amonium dalam air. Mikroalga membutuhkan nitrogen dalam bentuk amonium sebagai materi organik untuk fotosintesis (2). Chlorella sp. merupakan mikroalga berklorofil yang membutuhkan unsur hara makronutrisi berupa nitrogen dan fosfat. Mikroalga ini mampu hidup dengan baik pada lingkungan yang banyak mengandung unsur hara tinggi dan memanfaatkannya untuk kelangsungan proses fotosintesis, berkembang biak, dan melakukan aktivitas hidup lainnya(3). Dengan kemampuan Chlorella sp. dalam memanfaatkan unsur hara diharapkan kandungan senyawa toksik seperti amonium dalam akuakultur berkurang sehingga dapat meningkatkan kualitas air dalam akuakultur perikanan. Sel alga yang diimobilisasi pada awalnya digunakan untuk pengolahan limbah yaitu proses penurunan kadar logam berat dari limbah industri(3,4,5). Metode amobilisasi sel alga kemudian berkembang dan diaplikasikan dalam akuakultur antara lain untuk mengontrol kadar amonium dan oksigen terlarut dalam air. Sel yang diamobilisasi dapat mempertahankan aktivitas respirasi, fotosintesis, dan proses metabolisme seperti bila sel dalam keadaan normal (2). Penggunaan alginat dalam proses amobilisasi mempunyai beberapa keuntungan yaitu harganya murah, efisien, dan bersifat transparan. Dengan keadaan yang transparan amobilisasi menggunakan alginat tidak menghalangi penetrasi cahaya ke dalam sel alga sehingga proses fotosintesisnya tidak terhambat(3). II. BAHAN DAN CARA KERJA

diperbanyak dalam medium agar miring CP-1 dan disimpan dalam suhu kamar. Kultur induk C. pyrenoidosa pada medium agar miring CP-1 yang telah berumur 14 hari ditambah dengan 10 mL larutan NaCl fisiologis 0,85% secara aseptis. Suspensi tersebut dijadikan inokulum untuk kultur kocok sel C. pyrenoidosa. Kultur kocok diinkubasi dalam ruang dengan suhu kamar (26-29 OC), intensitas cahaya dari 3 buah lampu fluoresen berjarak 40 cm dari biakan (3000 lux), masukan udara dari aerator dan agitasi dengan kecepatan 80 rpm pada kondisi aseptik. Hasil kultur kocok merupakan inokulum untuk kultur sel di dalam fermentor sistem batch(6). 2.2. Penjebakan Sel (Amobilisasi Sel) Bahan yang digunakan untuk membuat sel amobil adalah natrium alginat 3% sedangkan untuk pembuatan gel adalah larutan 0,5 M CaCl2. Larutan natrium alginat disterilisasi dalam otoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit. Sel C. pyrenoidosa kemudian dipisahkan dari medium cair dengan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 4500 rpm. Sel C. pyrenoidosa yang telah dipisahkan kemudian dicampurkan dengan larutan natrium alginat. Proses amobilisasi sel C. pyrenoidosa disajikan pada Gambar 1. Campuran alginat dan sel C. pyrenoidosa diaduk secara homogen selanjutnya dilewatkan pompa peristaltik dengan ujungnya berupa syringe yang akan membentuk bulatan-bulatan. Gel dapat terbentuk dengan cara menampung keluaran dari pompa peristaltik ke dalam larutan 0,5 M CaCl2. Selanjutnya gel-gel (sel amobil) yang terbentuk dicuci dengan akuades steril, kemudian dapat langsung dipergunakan atau dapat disimpan di dalam lemari pendingin pada suhu 4OC(7,8).

2.1. Sumber Mikroba

2.3. Penggunaan sel amobil dalam akuarium

Kultur C. pyrenoidosa yang dipergunakan dalam penelitian ini diperoleh dari koleksi Laboratorium Pertanian Universitas PadjadjaranJatinangor. Kultur C. pyrenoidosa dipelihara dan

Lima akuarium berisi 40 liter air masingmasing diisi ikan nila sebanyak 20 ekor (rata-rata berat ikan 1,6-1,7 g). Sel alga amobil dibungkus dalam kantung nilon berpori-pori dengan diameter

26

Riffiani, R., 2010

Gambar .1 Skema proses amobilisasi sel C. pyrenoidosa

3 mm). Satu akuarium sebagai kontrol, tidak diberi sel C. pyrenoidosa, 4 akuarium lainnya masingmasing diberi kantung nilon berpori berisi 3000, 4000, 5000, dan 6000 butir sel alga amobil. Pada bagian atas akuarium dipasang 1 buah lampu fluoresen berjarak 40 cm (3000 lux) dan setiap akuarium diberi aerasi dari aerator. Sampling dan pemberian pakan ikan sebanyak 5 g dilakukan setiap 24 jam selama 14 hari. Penelitian ini dilakukan dengan 4x ulangan. Pengukuran yang dilakukan yaitu konsentrasi amonium, dengan metode Nessler, nitrat, konsentrasi oksigen terlarut menggunakan DO-meter YSI model 33, serta biomassa ikan dengan mengukur berat ikan sebelum dan sesudah diberi perlakuan(2).

perbedaan rata-rata dengan tingkat kepercayaan 95%, digunakan Tukey- HSD. III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Proses amobilisasi C. pyrenoidosa Proses amobilisasi yang menggunakan kultur cair C. pyrenoidosa berjumlah 5,8 x 107 sel/mL yang berumur 7 hari menghasilkan sel amobil dengan diameter 4 mm. Setiap butir sel amobil berisi 5,8 x 106 sel. Gambar 2 dapat memperlihatkan sel C. pyrenoidosa yang diamobilasi dalam alginat.

2.4. Analisis statistik Analisis data yang dilakukan meliputi analisis kualitatif maupun kuantitatif. Laju oksidasi amonium dihitung berdasarkan rumus: V NH4+ = [NH4+] t(n+1) - [NH4+] t(n) (ppm/hari) Laju oksidasi nitrat dihitung berdasarkan rumus: V NO3- = [NO3-] t(n+1) - [NO3-] t(n) (ppm/hari) Data dianalisis secara statistik menggunakan one-way ANOVA. Untuk mengetahui signifikasi 27

Gambar 2. Sel C. pyrenoidosa amobil

Penggunaan Mikroalga Chlorella pyrenoidosa Chick..... J. Hidrosfir. Vol. 5 (2) 25 - 33

Keuntungan penggunaan amobilisasi sel alga antara lain untuk menghindari alga dari pemangsaan herbivor terutama dari pemangsaan ikan dalam kultur. Selain itu sel alga yang diamobilisasi disimpan dalam suhu yang rendah yaitu 4OC, dalam keadaan gelap dapat tumbuh normal setelah 12 bulan(9). Hal ini dikarenakan selama proses penyimpan pada suhu rendah, sel menggunakan makanan cadangan berupa pati dan protein yang tersimpan di dalam organel pirenoid. Pada suhu rendah sel yang diimobilisasi mempunyai pirenoid berukuran kecil, tetapi setelah disubkultur kembali pada medium pertumbuhan, pirenoid menjadi berukuran besar kembali (2). 3.2. Konsentrasi Amonium Hasil pengukuran amonium pada kultur ikan setelah 14 hari dengan konsentrasi sel

yang berbeda tertera pada Gambar 3, yang menunjukkan bahwa penambahan C. pyrenoidosa amobil mampu menurunkan konsentrasi amonium pada kultur ikan. Pemberian alga amobil sebanyak 4.000 butir paling efektif dalam menurunkan konsentrasi amonium dibandingkan dengan pemberian alga amobil sebanyak 3.000, 5.000 dan 6.000 butir. Hal ini menunjukkan bahwa daya dukung lingkungan pada akuarium dengan 4.000 alga amobil lebih optimal dibandingkan dengan pemberian 5.000 dan 6.000 alga amobil. Pemberian alga yang terlampau melimpah dapat menyebabkan kompetisi antara sesama alga terhadap nutrisi, cahaya, dan faktor-faktor lainnya yang menyebabkan ketidakefektifan jumlah. Pemberian 3.000 sel alga amobil kurang efektif dalam penurunan konsentrasi amonium karena jumlah sel alga amobil yang terlalu sedikit. Uji statistika menunjukkan bahwa seluruh perlakuan berbeda nyata dengan kontrol.

Gambar 3 Perubahan konsentrasi amonium pada kultur ikan dengan perlakuan sel C. pyrenoidosa amobil dengan berbagai konsentrasi, suhu 23-25oC, aerasi 1,2 L/menit, intensitas cahaya 3.000-4.000 lux

Pada kontrol, tanpa penambahan C. Pyrenoidosa, terlihat adanya akumulasi amonium yang sangat tinggi. Hal ini dikarenakan tidak 28

terdapatnya C. pyrenoidosa amobil yang dapat menyerap amonium sebagai sumber nitrogen. Akan tetapi pada hari ke-9 terjadi penurunan konsentrasi

Riffiani, R., 2010

amonium, hal ini kemungkinan disebabkan adanya proses oksidasi amonium menjadi nitrit yang merupakan tahap pertama dari proses nitrifikasi. Proses ini dilakukan oleh bakteri Nitrosomonas yang dapat tumbuh secara alami dalam kultur ikan. Pertumbuhan bakteri Nitrosomonas secara alamiah dipicu oleh kehadiran amonium sebagai sumber makanannya. Sebelum bakteri ini tumbuh, amonium terakumulasi dalam akuarium. Apabila Nitrosomonas mulai tumbuh secara perlahan amonia menurun karena amonia mulai dikonsumsi oleh bakteri Nitrosomonas. Akan tetapi bakteri tersebut membutuhkan waktu sekitar 10-14 hari untuk dapat mengubah amonia menjadi nitrit (2). Berdasarkan hasil perhitungan laju rata-rata penurunan amonium tertinggi diperoleh pada perlakuan 4.000 butir alga amobil yaitu 6,52 ppm/ hari bila dibandingkan kontrol dan laju penurunan amonium terendah diperoleh pada perlakuan dengan 6.000 butir alga amobil yaitu 5,706 ppm/ hari. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian 4.000 butir alga amobil yang memiliki daya dukung lebih baik dibandingkan dengan perlakuan yang lain menyebabkan kemampuan sel dalam menyerap amonium melalui membran sel menjadi lebih cepat. Laju oksidasi amonium dapat dilihat pada Tabel 1. 3.3. Konsentrasi Nitrat Hasil pengukuran nitrat pada kultur ikan setelah 14 hari dapat dilihat pada Gambar 4 yang menunjukkan adanya peningkatan konsentrasi nitrat pada kontrol maupun pada perlakuan di awal inkubasi. Hal ini disebabkan amonium terlebih dahulu digunakan oleh C. pyrenoidosa sebagai sumber nitrogen. Pemanfaatan ammonium lebih

besar dibandingkan nitrat oleh C. pyrenoidosa (10). Terjadinya akumulasi nitrat pada awal inkubasi dikarenakan sebagian besar amonium dapat dimanfaatkan oleh C. pyrenoidosa secara langsung dan sebagian lagi mengalami proses oksidasi yang disebabkan adanya donor oksigen yang berasal dari aerasi. Pengocokan oleh udara tersebut dapat mengoksidasi amonium karena amonium merupakan struktur yang tidak stabil. Oksidasi amonium nitrit kemudian menjadi nitrat menyebabkan terjadinya akumulasi nitrat yang dapat meningkatkan kadar nitrat (11). Pemberian alga amobil sebanyak 4.000 butir paling efektif dalam menurunkan konsentrasi nitrat pada kultur ikan. Tanpa penambahan C. Pyrenoidosa mengakibatkan adanya akumulasi nitrat yang sangat tinggi. Hal ini dikarenakan tidak terdapatnya C. pyrenoidosa amobil yang dapat menyerap nitrat sebagai sumber nitrogen. Uji statistika menunjukkan bahwa seluruh perlakuan berbeda nyata dengan kontrol. Laju rata-rata oksidasi nitrat tertinggi diperoleh pada perlakuan 4.000 butir alga amobil yaitu 13,099 ppm/hari bila dibandingkan kontrol. Laju oksidasi nitrat dapat dilihat pada tabel 2. Hal ini menunjukkan pemberian 4.000 butir alga amobil yang memiliki laju penurunan amonium tertinggi juga diikuti oleh laju penurunan nitrat tertinggi. Preferensi adanya penyerapan amonium lebih dahulu dibandingkan nitrat karena amonium dapat melalui membran sel secara langsung, sedangkan nitrat mengalami proses translokasi ion karena membran tidak bersifat permeable untuk nitrat. Pori ion yang terdapat pada membran ganda fosfolipid (ionophorus), akan mempermudah terjadinya difusi ion, dalam hal ini nitrat bertukar posisi dengan ion klorida. Difusi nitrat

Tabel 1 Laju oksidasi amonium pada kultur ikan selama 14 hari dengan perlakuan sel C. pyrenoidosa amobil dengan berbagai konsentrasi, suhu 23-25oC, aerasi 1,2 L/menit, intensitas cahaya 3.000-4.000 lux

29

Jumlah C. pyrenoidosa amobil yang ditambahkan (butir)

Laju oksidasi amonium dibandingkan dengan kontrol (ppm/hari)

3.000

6,042

4.000

6,526

5.000

5,896

6.000

5,706

Penggunaan Mikroalga Chlorella pyrenoidosa Chick..... J. Hidrosfir. Vol. 5 (2) 25 - 33

Gambar 4. Perubahan konsentrasi nitrat pada kultur ikan dengan perlakuan sel C. pyrenoidosa amobil dengan berbagai konsentrasi, suhu 23-25oC, aerasi 1,2 L/menit, intensitas cahaya 3.000-4.000 lux

terjadi dengan mudah bila konsentrasi internal ion mendekati konsentrasi ekternal. Di dalam sel, nitrat secara kontinyu direduksi menjadi amonium(10) 3.4. Perubahan Oksigen Terlarut Pengamatan terhadap oksigen terlarut setiap hari merupakan usaha untuk mengetahui perubahan oksigen terlarut selama inkubasi. Perubahan oksigen terlarut menjadi salah satu tolok ukur kualitas air dalam kultur ikan karena berhubungan erat dengan kemampuan mikroalga dalam melakukan fotosintesis. Kisaran oksigen terlarut tertera pada Tabel 3.

Gambar 5 menunjukkan bahwa optimasi dengan pemberian alga amobil sebanyak 4.000 butir memiliki nilai rata-rata oksigen terlarut paling besar yaitu 5,36 ppm. Konsentrasi oksigen terlarut pada kontrol lebih rendah dibandingkan perlakuan dengan pemberian alga amobil. Ratarata oksigen terlarut pada kontrol lebih kecil dari 5 ppm, sedangkan pada seluruh perlakuan dengan penambahan C. pyrenoidosa amobil rata-rata lebih besar dari 5 ppm. DO normal pada kultur ikan air tawar yaitu > 5 ppm (http:// agrolink.moa.my/def/ppat/culture/diasease / dismanag.htm). Hal ini menunjukkan kemampuan dari C. pyrenoidosa untuk berfotosintesis yang

Tabel 2. Laju oksidasi nitrat pada kultur ikan selama 14 hari yang diberi perlakuan sel C. pyrenoidosa amobil dengan berbagai konsentrasi, suhu 23-25OC, aerasi 1,2 L/menit, intensitas cahaya 3.000-4.000 lux

Jumlah C. pyrenoidosa amobil yang ditambahkan (butir) 3.000 4.000 5.000 6.000

30

Laju penurunan nitrat dibandingkan dengan kontrol (ppm/hari) 8,650 13,099 7,727 10,322

Riffiani, R., 2010

menghasilkan peningkatan oksigen terlarut pada kultur. C. pyrenoidosa memiliki kemampuan berfotosintesis karena sebagian besar selnya mengandung kloroplas(11). Aktivitas C. pyrenoidosa dalam melangsungkan proses fotosintesis ini mempengaruhi ketersediaan oksigen terlarut dalam kultur ikan sebagai produk akhir dalam proses ini. 3.5. Kenaikan Berat Ikan Pengamatan terhadap berat ikan pada hari ke-14 merupakan usaha untuk mengetahui hubungan antara kualitas air yang dapat dilihat dari fluktuasi perubahannya. t Gambar 6 menunjukkan bahwa pemberian C. pyrenoidosa

amobil sebanyak 4.000 butir dapat meningkatan berat ikan paling tinggi dengan laju kenaikan berat ikan 1,56 g/ekor selama 14 hari. Hal ini disebabkan oleh kualitas air terbaik. Dengan tingginya penurunan kadar amonium dan nitrat, kualitas air dalam akuakultur menjadi meningkat, sehingga terjadi kenaikan berat ikan. IV. KESIMPULAN DAN SARAN Penambahan sel C. pyrenoidosa amobil sebanyak 4000 butir mampu menurunkan kadar amonium dengan rata-rata laju penurunan tertinggi yaitu 6,626 ppm/hari rata-rata penurunan kadar nitrat tertinggi yaitu 13,99 ppm/hari, kenaikan oksigen terlarut tertinggi yaitu 0.766

Tabel 3. Rata-rata oksigen terlarut pada kultur ikan selama 14 hari dengan perlakuan sel C. pyrenoidosa amobil dengan berbagai konsentrasi, suhu 23-25oC, aerasi 1,2 L/menit, intensitas cahaya 3.000-4.000 lux Jumlah C. pyrenoidosa amobil yang ditambahkan (butir) (0) Kontrol 3.000 4.000 5.000 6.000

Oksigen terlarut (ppm) 4,6 ± 0,363 5,21 ± 0,217 5,36 ± 0,208 5,07± 0,215 5,03 ± 0,223

Gambar 5 Perubahan konsentrasi oksigen terlarut pada kultur ikan dengan perlakuan sel C. pyrenoidosa amobil dengan berbagai konsentrasi, suhu 23-25oC, aerasi 1.2 L/menit, intensitas cahaya 3.000-4.000 lux

31

Penggunaan Mikroalga Chlorella pyrenoidosa Chick..... J. Hidrosfir. Vol. 5 (2) 25 - 33

ppm/hari, dan kenaikan biomassa ikan sebesar 1,56 g/ekor selama 15 hari. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan kombinasi mikroalga C.

pyrenoidosa amobil dengan bakteri Nitrifikasi dalam kultur ikan sehingga kadar amonium, nitrat dapat lebih dapat diperkecil.

Gambar 6. Kenaikan berat ikan pada kultur ikan dengan perlakuan sel C. pyrenoidosa amobil dengan berbagai konsentrasi, suhu 23-25oC, aerasi 1.2 L/menit, intensitas cahaya 3.000-4.000 lux

DAFTAR PUSTAKA 1.

Zonneveld, H. E.A. Huisman & J. Boon.1991. Prinsip-Prinsip Budidaya Perairan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

2.

Chen C.Y. 2001. Immobilized microalga Scenedesmus quadricauda (Chlorophyta, Chlorococcales) for long-term storage and for application in fish culture water quality control. Aquaculture. 2001, 195 (1-2): 71-80

3.

B e c k e r, E . W. 1 9 9 4 . M i c r o a l g a e ; Biotechnology and Microbiologi. Cambrige University Press. Cambrige, New York.

4.

Chevalier, P., J. de la Noue. 1985. Wastewater nutrient removal with microalgae immobilized in carrageenan, Enzyme Microb. Techol. 7:621-624

5.

Wilkonson, C.S., K.H. Goulding P.K. Robinson. 1990. Mercury removal by immobilized algae in batch culture system. J. Appl. Phyco. 2:223-230.

32

6.

Kurniati, T., 1996. Pengaruh kadar mikronutrien Fe terhadap produksi zat pengatur tumbuh dan senyawa antibiotika pada kultur sel Chlorella pyrenoidosa dengan sistem terbuka. Skripsi Sarjana Biologi.ITB

7.

Romo, S, C. Perez-Martinez. 1997. The use of immobilization in alginate beads for longterm storage of Pseudanabaena galeata (Cyanobacteria) in laboratory. J. Phycol. 33:1073-1076.

8.

Wulandari, W. 1999. Konservasi Pati dari Ubijalar Menjadi Glukosa Secara Enzimatis dan Selanjutnya Menjadi Fruktosa dengan Streptomyces sp. Amobil. Skripsi Sarjana. Jurusan Biologi. FMIPA. ITB.Bandung.

9.

Faafent, B.A., von Donk, S. T. Kallqvist. 1994. In situ measurement of algal growth potensial in aquatic ecosystems by immobilized algae. J. Appl. Phycol. 6: 301-308

Riffiani, R., 2010

10. Nielsen, R. Donald & I.G.MacDonald. 1978. Nitrogen in the Environment. Academic Press,INC.p 143-169

12. Pandey, S.N. & P.S. Trivedi. 1995. A Textbook of algae. Mandras: Vicas Publishing House PVT.Ltd. Hal 113

11. Grant,W.D, & P.E. Long.1985. The nature environment and biogeochemical cycle. Volume 1. Berlin: Springler – Verlag

33

Penggunaan Mikroalga Chlorella pyrenoidosa Chick..... J. Hidrosfir. Vol. 5 (2) 25 - 33