Pengembangan Strip Test Immunokromatografi Untuk Deteksi Selektif Melamin Dengan Platform Magnetic Menggunakan Metode Annodic Stripping Voltammetry

Pengembangan Strip Test Immunokromatografi Untuk Deteksi Selektif Melamin Dengan Platform Magnetic Menggunakan Metode Annodic Stripping Voltammetry Setyowati1, Ivandini Tribidasari A.1, Endang Saepudin1 1

Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia. Email : [email protected]

Abstrak Pada penelitian ini dilakukan pengembangan strip test immunokromatografi untuk deteksi selektif melamin menggunakan platform magnetic. Strip test dibuat menggunakan membran nitroselulosa dan tersusun dari sample pad, conjugate pad, test zone, dan absorbent pad. Conjugate pad mengandung antibodi melamin berlabel nanopartikel emas (AuNP-Ab), test zone mengandung antibodi penangkap dan digunakan sebagai tempat pengukuran, sedangkan digunakan absorbent pad untuk mengarahkan aliran sampel. Untuk menahan sampel agar tidak bergerak selama pengukuran di test zone, antibodi pada test zone dimodifikasi dengan magnetic beads (MB). MB yang digunakan adalah MB yang mengandung gugus fungsi avidin. Sehingga dengan memodifikasi antibodi dengan biotin membentuk Ab-biotin, AbMB dapat terbentuk melalui interaksi avidin-biotin. Bila sampel melamin mencapai conjugate pad, melamin akan berinteraksi dengan AuNP-Ab membentuk kompleks mel-AbAuNP yang akan bergerak ke test zone dan membentuk kompleks MB-Ab-mel-Ab-AuNP. Pengukuran dilakukan dengan meletakkan batang magnet di bawah test zone sehingga komples tersebut tidak bergerak selama pengukuran. Dengan asumsi bahwa konsentrasi AuNP berbanding lurus dengan konsentrasi antibodi dan dengan demikian dengan konsentrasi melamin, pengukuran dapat dilakukan dengan metode anodic stripping voltammetry. Boron doped diamond (BDD) 0.1% digunakan sebagai elektroda kerja, kawat platina spiral sebagai elektroda pendukung, dan Ag/AgCl sebagai elektroda pembanding. Strip test dipreparasi menggunakan volume AuNP-Ab 60 µL dan Ab-MB 30 µL. Deteksi melamin pada strip test immunokromatografi dilakukan dengan volume sampel 100 µL, waktu immunoreaksi 7 menit, dan volume pelarut HClO4 0.02 M 200 µL. Kondisi elektrokimia yang digunakan adalah rentang potensial dari -500 mV sampai 1500 mV, scan rate 100 mV/s, potensial deposisi -500 mV, serta waktu deposisi 240 sekon. Limit deteksi melamin yang diperoleh adalah 150 ppm (0.15 mg melamin/mL PBS). Kata Kunci : melamin; nanopartikel emas; strip test immunokromatografi; magnetic beads; anodic stripping voltammetry; boron doped diamond

Pengembangan strip test..., Setyowati, FMIPA UI, 2015

Abstract

In this research, immunochromatographic strip test for selective detection of melamine was developed by using platform magnetic. The strip test was made from nitrocellulose membrane and composed of sample pad, conjugate pad, test zone, and absorbent pad. The conjugate pad consisted of gold nanoparticle labeled melamine antibody (AuNP-Ab), while the test zone consisted of the capture antibody and used for the measurements. In addition, there was an absorbent pad used to direct the sample flow. In order to keep the sample in the test zone, the capture antibody was immobilized at the magnetic beads (MB). The MB contained avidin functional groups. Therefore, the antibody was modified by biotin (Ab-biotin) to form antibody modified MB (Ab-MB) through avidin-biotin interaction. When the sample contained melamine reach the conjugate pad, melamine interacts to antibody to form mel-ab-AuNP complexes, which then move to the test zone and form MB-Ab-mel-Ab-AuNP complexes. The measurements were performed by placed a magnetic bar under the test zone to avoid the movements of the complexes. As per assumption that the AuNP concentration is equivalent to the antibody as well as the melamine concentrations, the measurement can be performed by Anodic Stripping Voltammetry method. Boron doped diamond (BDD) 0.1% was applied as the working electrode, while a wire platinum spiral and an Ag/AgCl system were used as the counter and the reference electrodes, respectively. The strip test were prepared by using AuNP-Ab and Ab-MB volumes of 60 µL and 30 µL, respectively. The melamine detection was performed with a sample volume of 100 µL, an immunoreaction time of 7 min, and 200 µL of 0.02 M HClO4, while the electrochemical measurements was performed in a potential range from -500 mV to1500 mV, a scan rate of 100 mV/s, a potential deposition of -500 mV and a deposition time of 240 s. Limit of detection of 150 ppm (0.15 mg melamine/mL PBS) can be achieved. Keywords : melamine; gold nanoparticles; immunochromatographic strip test; magnetic beads; anodic stripping voltammetry; boron doped diamond

1. PENDAHULUAN Melamin (1,3,5-triazinna-2,4,6-triamina) adalah trimer dari cyanamide (CH2N2) yang merupakan komponen sintetis yang biasa digunakan dalam skala besar pada berbagai industri kimia. Selain itu, melamin juga biasa digunakan pada produksi plastik dan resin. Melamin mempunyai sifat fisik yang tidak berwarna dan tidak berbau, sehingga keberadaannya bersama senyawa lain dalam produk pangan maupun pakan tidak dapat terlihat perbedaannya. Tingginya

nilai

nitrogen

yang

terkandung

dalam

melamin,

menyebabkan

penyalahgunaan melamin sebagai sumber nitrogen, sebagai campuran komoditas yang rendah kandungan proteinnya, agar komoditas tersebut memiliki kandungan nitrogen yang tinggi (Andersen, et al., 2008). Metode umum dari penentuan protein (metode Kjeldahl) tidak dapat membedakan antara nitrogen yang berasal dari bahan protein dengan nitrogen yang berasal dari bahan non protein, sehingga dengan adanya melamin dapat memberikan indikasi palsu bahwa komoditas tersebut mempunyai nilai total protein yang tinggi. Dengan adanya indikasi peningkatan nilai nitrogen dengan menggunakan melamin menyebabkan pengawasan terhadap melamin menjadi perhatian yang serius. Hal ini


dikarenakan berbagai peristiwa yang terjadi yang diakibatkan oleh penyalahgunaan melamin. Tahun 2004, ditemukan bahwa melamin terkandung dalam makanan kucing dan anjing di Asia. Selanjutnya, tahun 2007, ribuan kucing dan anjing di USA mati dikarenakan mengkonsumsi pakan yang telah terkontaminasi melamin. Pada September 2008, World Health Organization (WHO) dan Ministry of Health (MOH) menemukan bahwa di China telah terjadi pencampuran melamin dalam susu bayi, sehingga menyebabkan kematian sejumlah besar bayi akibat gagal ginjal. Melamin ditemukan pula pada pangan berbasis susu seperti yogurt, biskuit, dan minuman kaleng (Food and Drug Administration, 2008). Pada tahun yang sama, di Indonesia telah ditemukan adanya kontaminan melamin pada produk berbasis susu atau mengandung bahan baku dari China. Hasil pengujian yang dilakukan Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia (BPOM RI) dengan menggunakan metode LC-MS-MS menemukan kontaminan terbesar pada kembang gula susu yaitu sebesar 945.86 mg/kg (BPOM RI, 2008). Saat ini, telah banyak metode analisis yang dapat digunakan untuk menganalisis kandungan melamin, seperti gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) (Xu, et al., 2009), high-performance liquid chromatography (HPLC) (Li, et al., 2009), liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (Filigenzi, et al., 2008), capillary electrophoresis (CE) (Chen, et al., 2009), dan enzyme-linked emmunosorbent assay (ELISA) (Yin, et al., 2010). Meskipun semua metode diatas dapat mendeteksi melamin dengan selektifitas dan sensitifitas yang tinggi, namun terdapat kekurangan seperti peralatan instrumentasi yang tidak murah, waktu analisis lama, serta membutuhkan tenaga ahli dengan kemampuan analisa tinggi untuk mengoperasikannya. Atas dasar itu, baru-baru ini dikembangkan metode immunokimia untuk mendeteksi melamin. Metode immunokimia memberikan beberapa keuntungan seperti, waktu analisis relatif yang lebih cepat serta tidak membutuhkan peralatan yang mahal. Pada penelitian ini platform magnetic digunakan untuk mengimobilisasi antibodi dalam perangkat strip test. Sehingga, jika dibawah sistem sensor diberikan batang magnet, maka magnetic beads akan tertarik ke dasar elektroda sehingga antibodi seolah-olah terimobilisasi di permukaan elektroda. Diharapkan penggunaan platform magnetic dapat meningkatkan

sensitifitas

pengukuran

melamin

secara

elektrokimia

dengan

cara

mengkonsentrasikan antibodi di permukaan magnet. Sehingga pengukuran dengan elektroda BDD dapat menghasilkan sensitifitas yang lebih baik. BDD sendiri telah dikenal dalam penggunaanya karena memiliki sifat yang lebih unggul dibandingkan dengan elektroda karbon konvensional seperti jendela potensial lebar, biokompatibel, dan inert sehingga dapat


digunakan dalam analisis elektrokimia khususnya dalam pendeteksian sejumlah residu di lingkungan atau zat biologis [1]. 2. Tinjauan Pustaka 2.1 Melamin Melamin merupakan senyawa organik yang bersifat polar dengan nama IUPAC 1,3,5triazina-2,4,6-triamina dengan rumus kimia C3H6N6. Melamin memiliki berat molekul sebesar 126.12 gram/mol, berupa padatan putih dan agak sulit larut dalam air. Melamin juga dikenal dengan nama lain, diantaranya yaitu, sianuramida, sianurotriamida, sianurotriamina, isomelamin, triaminotriazin, 2,4,6-triaminotriazin, triamino-s-triazin, 2,4,6-triamino-1,3,5triazine, 2,4,6-s-triazinetriamin, dan 1,3,5-triazina-2,4,6(1H,3H,5H)-triimina.

Gambar 2.1 Struktur kimia melamin Berdasarkan strukturnya, melamin memiliki 3 gugus amina (-NH2) dan cincin aromatik s-triazin. Melamin adalah trimer dari sianamida, dan seperti sianamida, melamin mengandung 66% nitrogen (berdasarkan massa). Melamin juga merupakan metabolit dari siromazina, sejenis pestisida. 2.2 Nanopartikel Emas (AuNP) Nanopartikel emas (nanogold) merupakan partikel emas dengan ukuran berkisar antara 1-100 nm. Nanopartikel emas biasanya tersuspensi dalam cairan dan berupa koloid. Cairan tersebut memiliki warna yang berbeda-beda, bergantung pada ukuran partikel. Nanopartikel yang berukuran kurang dari 100 nm akan berwarna merah rubi, sedangkan material bulk emas berwarna kuning. Nanopartikel yang memiliki ukuran sama, dapat menghasilkan warna yang berbeda. Hal ini bergantung pada keadaan dari partikel itu sendiri. Nano partikel emas yang berukuran di bawah 30 nm, akan memberikan warna merah rubi jika partikelnya dalam keadaan tunggal dan akan memberikan warna biru sampai keabu-abuan jika partikelnya saling bergabung.


Dengan adanya perbedaan warna dari koloid partikel emas yang dihasilkan, menyebabkan koloid partikel emas ini sering digunakan pada berbagai aplikasi karena sifat optik dan sifat elektronik yang dimilikinya. Partikel ini menunjukkan surface plasmon resonance (SPR) yang kuat pada media aqueous pada panjang gelombang 520 nm. Frekuensi resonansi nanopartikel diketahui bergantung pada ukuran, bentuk, sifat material, medium lingkungan, dan interaksi dengan nanopartikel lainnya. Sintesis nanopartikel emas secara kimia diperkenalkan oleh Brust dan Turkevich. Perbedaan kedua metode tersebut terletak pada reduktor yang digunakan, dimana Brust menggunakan natrium borohidrat (NaBH4) sebagai redukor sedangkan Turkevich menggunakan natrisum sitrat. Pada penelitian ini sintesis nanopartikel emas dilakukan dengan menggunakan metode Turkevich, dengan cara mereduksi hidrogen tetrakloroaurat (HAuCl4) menggunakan natrium sitrat (Na3C6H5O7). Nanopartikel emas dapat beragregasi sehingga mengurangi luas permukaan. Oleh karena itu, diperlukan suatu modifikasi dengan menggunakan material penstabil untuk menjaga kestabilan nanopartikel emas dan mengontrol ukuran partikel. 2.3 Antibodi dan Antigen Antibodi merupakan biomolekul yang tersusun atas protein dan dibentuk sebagai respons terhadap keberadaan benda-benda asing yang tidak dikehendaki di dalam tubuh kita. Antibodi bisa juga disebut sebagai imunoglobulin (Ig). Antibodi tersusun oleh 4 rantai polipeptida (2 rantai polipeptida berat atau "heavy chain" dan 2 polipeptida ringan atau "light chain"). Antibodi mempunyai bentuk seperti huruf Y. Kedua lengan bagian atas disebut daerah variable, karena dapat berubah-ubah sesuai dengan antigen yang diikat. Sedangkan lengan bagian bawah disebut daerah constant, karena daerah tersebut tidak dapat berubah bentuk. Antigen adalah suatu substansi yang dianggap asing oleh tubuh dan akan memacu terjadinya respon imun yang akhirnya akan memacu produksi antibodi. Antigen yang berhasil masuk ke dalam tubuh akan mengaktifkan berbagai respon imun spesifik maupun nonspesifik. Jika antigen ini tidak ditangani dengan baik oleh sistem imun kita, antigen tersebut dapat menimbulkan penyakit sesuai dengan jenis penyakit yang dibawanya. 2.4 Platform Magnetic Platform magnetic, biasanya berupa magnetic beads yang telah dimodifikasi dengan avidin merupakan larutan yang mengandung manik-manik Fe3O4 dapat digunakan dalam


berbagai aplikasi diantaranya pemurnian protein dan asam amino, mempelajari interaksi protein, immunopresipitasi, immunoassay, phage display, biopanning, drug screening dan isolasi sel. Senyawa umum yang terdapat dalam magnetic beads yaitu magnetit (Fe3O4). 2.5 Lateral Flow Immunocromatographic Assay (LFIA) Immunokromatografi alir rata (lateral flow immunochromatographic assay/LFIA) adalah suatu perangkat yang digunakan untuk mendeteksi ada atau tidaknya analit target dalam suatu sampel berdasarkan reaksi kapilaritas. Biasanya perangkat ini menggunakan matriks membran nitroselulosa[2]. Strip test LFIA terdiri dari kompoen-komponen sebagai berikut: a. Sample pad, yaitu tempat dimana sampel uji diaplikasikan. b. Conjugated pad, yatiu tempat yang mengandung antibodi spesifik untuk menangkap analit target, biasanya berkonjugasi dengan nanopartikel emas (AuNP-Ab). c. Membran reaksi, yaitu membran untuk reaksi immunokromatografi yang terbuat dari nitroselulosa. Pada membran ini diimobilisasi juga anti target-antibodi sebagai test line. Selain itu, diimobilisasi juga control line yang mengandung antibodi spesifik . d. Absorbent pad, yaitu tempat yang berfungsi untuk menyerap sampel diseluruh membran reaksi dengan daya kapiler. Berikut ilustrasi komponen-komponen srip test LFIA:

Gambar 2.2 Komponen strip test LFIA

2.6 Elektroda Boron-doped Diamond (BDD) Boron-doped diamond (BDD) merupakan alternatif dari elektroda C konvensional yang dapat memberikan respon yang stabil, waktu yang singkat, biocompatible yang baik, sensitif, selektif, dengan presisi yang tinggi untuk digunakan dan tidak mahal.

Selain itu, lebarnya jendela potensial memberikan keunggulan bagi BDD karena terbatasnya jendela potensial untuk elektrolisis air menyulitkan deteksi dari senyawa yang


teroksidasi pada potensial anodik yang relatif tinggi[3]. Adapun kelebihan lainnya elektroda BDD dibandingkan elektroda konvensional lainnya yaitu: • Stabil pada potensial anodik dan katodik ekstrim • Stabil di media kimia yang agresif • Relatif tidak sensitif terhadap oksigen terlarut • Mekanis cukup kuat untuk menahan ultrasound, microwave atau aktivasi laser • Imobilisasi bio-molekul pada permukaan berlian memungkin untuk difungsikan Hydrogenated Boron Doped Diamond (HBDD) merupakan hasil fabrikasi menggunakan Microwave Plasma Assisted Chemical Vapor Deposition (MPACVD).

3. METODE PENELITIAN 3.1

Fabrikasi Elektroda Boron-Doped Diamond (BDD) 0,1% Wafer silikon yang telah disiapkan digosokkan pada permukaan nanodiamond selama

30 menit. Wafer silikon yang telah digores kemudian disonikasi dengan isopropanol selama 5 menit sebanyak 4 kali. Kemudian ditaruh di dalam chamber instrument MPACVD dan dilakukan deposisi selama 6 jam kemudian didapatkan elektroda BDD dengan konsentrasi 0,1 % Boron. BDD tersebut dikarakterisasi dengan spektrofotometer Raman, Scanning Electron Microscope (SEM), dan X-Ray Photoelectron Spectroscopy (XPS). 3.2

Preparasi Koloid Nanopartikel Emas (AuNP) Koloid nanopartikel emas (AuNP) dibuat dengan cara 100 mL HAuCl4 0.01%

ditempatkan dalam beker gelas 100 mL kemudian dipanaskan diatas hotplate (temperatur 300oC) dengan pengadukan konstan (350 rpm) sampai mendidih. Setelah mendidih, ditambahkan 2 mL trisodium sitrat (Na3C6H5O7) 1%. Kemudian dipanaskan kembali selama 15 menit. Selanjutnya didinginkan dan diencerkan ke dalam labu ukur 100 mL dengan aquades sampai tepat tanda batas. Sol emas berwarna merah yang terbentuk menandakan bahwa sitrat telah sempurna mereduksi emas (III) menjadi emas (0). Selanjutnya, koloid nanopartikel emas (AuNP) dikarakterisasi dengan spektrofotometer UV-Vis, Transmission Electron Microscopy (TEM), dan Annodic Stripping Voltammetry (ASV). 3.3

Preparasi Koloid Nanopartikel Emas-Antibodi (AuNP-Ab)


Koloid nanopartikel emas-antibodi (AuNP-Ab) dibuat dengan cara sebanyak 10 mL koloid nanopartikel emas (AuNP) dilarutkan dalam beker gelas, lalu dengan stirring lembut konstan ditepatkan ke pH 7 dengan penambahan sekitar 25 µL larutan potasium karbonat (K2CO3) 0.1 M. Kemudian sebanyak 500 µL antibodi ditambahkan ke dalam larutan tesebut diikuti dengan inkubasi selama 10 menit dalam temperatur ruang. Berikutnya, ditambakan sebanyak 3 mL larutan bovin serum albumin (BSA) 1% dan 5% (pembuatan yang kedua) dan diinkubasi kembali selama 10 menit dalam temperatur ruang dengan stirring lembut konstan. Setelah itu, larutan dipindahkan ke dalam botol sentrifuge untuk disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. Tahap akhir, larutan hasil sentrifugasi didekantasi untuk diambil koloid merah antibodi berlabel nanopartikel emas (AuNP-Ab). Kemudian koloid tersebut dilarutkan dengan 2 mL larutan buffer fosfat 0.02 M pH 7.4. 3.4

Modifikasi Antibodi-Biotin pada Magnetic Beads Melarutkan antibodi dimasukkan ke dalam kolom PD – 10 sebanyak 2.5 mL yang

sudah terlebih dahulu dicuci dengan PBS pH 7.4 sabanyak 4 kali. Larutan antibodi kemudian dicampur dengan larutan Sulfo-NHS-Biotin dan didiamkan selama 12 jam dalam suhu ruang. Larutan antibodi yang sudah direaksikan dengan biotin selama 12 jam, kemudian dihilangkan lagi garamnya dengan menggunakan kolom PD -10, kemudian antibodi disimpan dalam larutan PBS, 50 % gliserol dan 1 mg/mL BSA pada suhu – 200C. Magnetic beads yang telah mengandung gugus avidin diaktivasi dengan mencampur magnetic beads dengan PBS pH 7.4 lalu divortex selama 5 menit, kemudian PBS dipisah dari magnetic beads. Proses ini diulangi sebanyak 4 kali. Magnetic beads yang telah diaktivasi dicampur dengan Antibodi– Biotin. Campuran dikocok dengan pipet selama 5 menit dan didiamkan pada suhu 4 0C selama 12 jam. 3.5

Fabrikasi Strip Test Immunokromatografi Strip test immunokromatografi terdiri dari beberapa komponen, yaitu sample pad,

conjugate pad, nitrocellulose membrane, test zone dan absorbent pad. Semua komponen dirangkai pada backing plastic.


Gambar 2. Strip test immunochromatographic Bagian sample pad dibuat dari glass fiber filter berukuran 1 cm x 1 cm, conjugated pad dibuat dari glass fiber filter berukuran 1 cm x 1 cm, membran nitroselulosa untuk reaksi immunokromatografi berukuran 1 cm x 1.5 cm, test zone dibuat dari membran nitroselulosa berukuran 1 cm x 0.5 cm, dan absorbent pad dibuat dari glass fiber filter berukuran 1 cm x 0.5 cm. 2.6 Pengujian Melamin Standar dengan Strip Test Immunokromatografi dan Platform Magnetic secara Elektrokimia Pengujian melamin standar dengan strip test immunokromatografi dan platform magnetic yaitu dengan cara meneteskan 100 µL larutan sampel melamin standar konsentrasi tertentu (0.15; 0.3; 0.45; dan 0.6 mg/mL) pada sample pad. Sampel melamin akan bergerak secara immunokromatografi menuju conjugate pad dan membran nitroselulosa hingga akhirnya sampai pada test zone. Setelah waktu immunoreaksi 7 menit dilakukan pengukuran dengan menggunakan metode anodic stripping voltammetry dengan larutan elektrolit berupa larutan HClO4 0.02 M pada rentang potensial -500 mV sampai 1500 mV, scan rate 100 mV/s, rest time 0 s, potential deposition -500 mV, low pass 10 Hz dan deposition time 240 s.


4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Karakterisasi Boron-Doped Diamond (BDD) Hasil karakterisasi BDD, spektrum raman yang didapat yaitu terdapat puncak pada panjang gelombang sekitar 522 cm-1 dan 1333 cm-1 yang dapat dilihat spektrumnya pada Gambar 4.1.

Gambar 4.1. Spektrum Raman BDD Karakterisasi BDD dengan instrumen SEM bertujuan untuk melihat bentuk dan struktur morfologi dari permukaan BDD.

Gambar 4.2 Hasil SEM BDD Berdasarkan Gambar 4.2 dengan perbesaran 6000 kali terlihat ukuran partikel diamond yang terdeposisi pada permukaan wafer silikon yaitu sekitar 2.5 µm. Selanjutnya, BDD di karakterisasi dengan menggunakan X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) untuk melihat struktur elektronik pada fasa padat dari BDD melalui analisis energi ikat elektron kulit dalam sampai elektron kulit luar (elektron valensi) nya.


Gambar 4.3. Spektrum XPS BDD Berdasarkan Gambar 4.3 di atas diketahui bahwa dihasilkan puncak pada energi ikatan 284 eV; 286 eV; dan 532 eV dengan rasio O/C = 2/9. Puncak pada 284 eV dan 286 eV diidentifikasi sebagai puncak ikatan C-C dan ikatan C-H pada terminal BDD (puncak C 1s). Terbentuknya ikatan C-H diakibatkan karena penggunaan gas H2 dalam proses deposisi yang berfungsi untuk membawa sumber karbon dan boron. Puncak pada 532eV diidentifikasi sebagai puncak ikatan C-O dan O-H (puncak O 1s). 4.2 Karakterisasi Koloid Nanopartikel Emas (AuNP) Spektrum UV-Vis, mengindikasikan terbentuknya nanopartikel emas (AuNP) berdasarkan panjang gelombang pada saat absorbansi maksimum.

Gambar 4.4 Spektrum UV-Vis nanopartikel emas Berdasarkan gambar di atas, diperoleh panjang gelombang untuk nanopartikel emas (AuNP) sebesar 521 nm.


Sedangkan, hasil TEM (Gambar 4.5) menunjukkan bahwa nanopartikel emas yang telah dibuat membentuk suatu kluster (kelompok) berupa bulatan dengan ukuran sekitar 15 nm dimana nanopartikel emas berada dalam kondisi yang baik (tidak teragregasi).

Gambar 4.5 Hasil TEM nanopartikel emas 4.3 Karakterisasi Koloid Nanopartikel Emas (AuNP-Ab) Hasil spektrum UV-Vis (Gambar 4.6) dari nanopartikel emas-antibodi menunjukkan terjadinya pergeseran panjang gelombang maksimum dari nanopartikel emas-antibodi terhadap nanopartikel emas.

Gambar 4.6. Spektrum UV-Vis nanopartikel emas-antibodi Hasil TEM (Gambar 4.7) menunjukkan bahwa nanopartikel emas telah diselimuti oleh antibodi dan BSA 1% dimana terlihat pada nanopartikel emas-antibodi terdapat jarak yang cukup berjauhan antara satu dengan yang lainnya.

Gambar 4.7. Hasil TEM nanopartikel emas-antibodi


Sedangkan dengan menggunakan anodic stripping voltammetry (ASV) (Gambar 4.8) diketahui bahwa keberadaan antibodi dan BSA dengan berbagai konsentrasi dalam kompleks nanopartikel emas-antibodi memberikan pengaruh terhadap proses elektrokimia nanopartikel emas. AuNP-Ab yang telah dikonjugasikan dengan BSA 1% dan 5% menghasilkan puncak oksidasi yang lebih rendah dibandingkan dengan puncak oksidasi dari nanopartikel emas. Hal ini disebabkan karena nanopartikel emas sudah terkonjugasi dengan antibodi dan BSA yang ukuran molekulnya besar. Sehingga, nanopartikel tersebut lebih sulit untuk dilepaskan menjadi bentuk Au3+.. Selain itu, pada stripping voltammogram di atas juga menunjukkan bahwa semakin banyak konsentrasi BSA yang ditambahkan kedalam kompleks nanopartikel emas-antibodi, akan semakin menurunkan puncak oksidasi.

Gambar 4.8. Hasil ASV nanopartikel emas-antibodi 4.4 Penentuan Elektrolit Pendukung Nanopartikel Emas Pada Perangkat Elektroda Strip Test Pada penelitian kali ini, penggunaan larutan elektrolit pendukung bertujuan untuk mendeposisi Au3+ menjadi Au0 pada elektroda kerja BDD dengan pemberian potensial yang lebih negatif, dimana selanjutnya Au0 akan dioksidasi kembali menjadi Au3+ dengan pemberian potensial yang lebih positif.

Gambar 4.9 Penentuan larutan elektrolit nanopartikel emas


Berdasarkan gambar di atas, dapat diketahui bahwa larutan elektrolit yang tepat bagi nanopartikel emas, yaitu larutan HClO4 002 M. Hal ini dikarenakan larutan HClO4 memiliki nilai pemisahan sinyal dari background-nya (S/B) lebih tinggi dan merupakan suatu oksidator kuat (agen pengoksidasi kuat), sehingga HClO4 akan mampu mengoksidasi nanopartikel emas dengan kuat. 4.5 Penentuan Potensial Deposisi Optimum Dan Waktu Deposisi Optimum Nanopartikel Emas Pada Perangkat Elektroda Strip Test Potensial deposisi adalah potensial yang dibutuhkan untuk mereduksi ion logam yaitu Au3+ menjadi unsur netralnya berupa Au0 dan kemudian mengoksidasi Au0 menjadi Au3+ kembali. Sedangkan, waktu deposisi optimum adalah waktu yang dibutuhkan untuk mereduksi ion logam yaitu Au3+ menjadi unsur netralnya berupa Au0 dan kemudian mengoksidasi Au0 menjadi Au3+ kembali.

Gambar 4.10 (a) Voltamogram potensial deposisi optimum, (b) Voltamogram waktu deposisi optimum Berdasarkan gambar voltamogram di atas dapat diketahui bahwa potensial deposisi optimum dan waktu deposisi optimum nanopartikel emas adalah -500 mV dan 240 s. 4.6 Penentuan Limit Deteksi Konsentrasi Nanopartikel Emas Batas deteksi (LOD / Limit of Detection) ditentukan untuk mengetahui konsentrasi minimum dari nanopartikel emas (AuNP) yang dapat dideteksi oleh elektroda BDD pada perangkat elektroda strip test.


a

b

Gambar 4.11 (a) Voltamogram limit konsentrasi nanopartikel emas, (b) Kurva kalibrasi linear 4.7 Penentuan Limit Konsentrasi Penambahan Magnetic Beads Berdasarkan gambar voltamogram di bawah ini (Gambar 14) dapat diketahui bahwa magnetic beads yang dapat ditambahkan pada perangkat strip test immunokromatografi sebesar 5µL. a

b

Gambar 4.12 (a) Voltamogram penentuan limit konsentrasi magnetic beads, (b) Kurva kalibrasi linear 4.8 Pengujian Melamin Standar Menggunakan Strip Test Immunokromatografi Dengan Platform Magnetic Secara Elektrokimia Pengujian melamin dengan menggunakan strip test immunokromatografi dengan magnetic beads dilakukan dengan meneteskan 100 µL larutan melamin standar pada sample pad yang terbuat dari glass fiber filter. Kemudian sampel melamin yang berada pada sampel pad dibiarkan bergerak akibat adanya gaya kapilaritas menuju conjugated pad. Pada conjugated pad inilah nantinya melamin akan bertemu dengan antibodi berlabel nanopartikel emas (AuNP-Ab) yang sebelumnya sudah diimobilisasi membentuk kompleks melaminantibodi-nanopartikel emas (mel-Ab-AuNP). Setelah melewati conjugate pad, kompleks ini akan terus bergerak melalui membran nitroselulosa hingga sampai pada tezt zone. Pada test zone inilah, kompleks yang mengandung melamin akan ditangkap oleh antibody-magnetic beads (Ab-MB) sehingga membentuk kompleks

antibodi-melamin-antibodi-nanopartikel

emas


(MB-Ab-mel-Ab-AuNP).

Sedangkan kompleks yang tidak mengandung melamin di dalamnya akan terus bergerak menuju absorbent pad. Tahap akhir dari pengujian ini yaitu, dilakukan pelarutan kompleks MB-Ab-mel-Ab-AuNP yang terdapat pada test zone dengan menggunakan larutan elektrolit pendukung berupa larutan HClO4 0.02 M dan selanjutnya dilakukan pengukuran secara elektrokimia dengan menggunakan metode anodic stripping voltammetry.

Gambar 4.13 Ilustrasi strip test immunokromatografi dengan platform magnetic

a

b

Gambar 4.14 (a) Voltamogram limit konsentrasi deteksi melamin, (b) Kurva kalibrasi linear Berdasarkan gambar 4.14 (a) diketahui bahwa limit konsentrasi minimum melamin yang dapat dideteksi dengan menggunakan strip test imunoktomatografi dengan magnetic


beads sebesar 0.15 mg/mL atau 150 ppm. Dengan adanya penambahan magnetic beads pada perangkat strip test ini menghasilkan puncak oksidasi yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan yang tidak menggunakan magnetic beads. Hal ini dikarenakan, penambahan magnetic beads dapat mengkonsentrasikan analit target dengan magnet dan meminimalkan efek matriks dari sampel yang digunakan. Penggunaan sejumlah besar antibody-magnetic beads yang tersebar dalam larutan, memungkinkan terjadinya kompetisi untuk mengikat melamin dan nanopartikel emas. Sedangkan, berdasarkan gambar 4.14 (b) dapat diketahui hubungan antara konsentrasi melamin yang diukur dengan puncak oksidasi nanopartikel emas yang dihasilkan memiliki linearitas yang cukup tinggi dengan nilai R2 = 0.9778. Dengan membandingkan pengujian antibodi dengan melamin termodifikasi magnetic beads dapat dilihat bahwa sistem dengan menggunakan antibodi terimobilisasi magnetic beads lebih baik dalam deteksi melamin. Hal ini dapat dilihat bahwa slope konsentrasi antibody-magnetic beads lebih besar dibandingkan dengan sistem antibodi. Sehingga dapat disimpulkan bahwa sistem antibody-magnetic beads lebih selektif dibanding dengan sistem antibodi. 5. KESIMPULAN Perangkat strip test immunokromatografi dengan platform magnetic dapat digunakan untuk mendeteksi melamin dengan menggunakan metode anodic stripping voltammetry (ASV) dengan larutan elektrolit HClO4 0.02 M, potensial deposisi optimum -500 mV, waktu deposisi optimum 240 sekon dan limit konsentrasi minimum nanopartikel emas dan nanopartikel emas-antibodi yang dapat terukur sebesar 0.1 µL. Konsentrasi minimum melamin yang dapat dideteksi oleh perangkat strip test immunokromatografi dengan platform magnetic sebesar 150 ppm (0.15 mg melamin / mL PBS) dengan slope R2 = 0.9778. Dimana konsentrasi melamin yang terukur pada strip test immunokromatografi dengan platform magnetic berbanding linear dengan konsentrasi antibodi dan nanopartikel emas-antibodi. DAFTAR PUSTAKA [1] Tribidasari A., et al. Preparation and Characterization of Polycrystalline Chemical Vapor Deposited Boron-doped Diamond Thin Films. [2] Ijeh, Michael. (2011). Covalent Gold Nanoparticle-Antibody Conjugate for Sensitivity Improvement in LFIA. A dissertation submitted to the Mathematics, Informatics and Natural SciencesFaculty of Hamburg University.


[3] Fujishima, A., Y. Einaga, T.N. Rao and D.A. Tryk. (2005). Diamond Electrochemistry.

Amsterdam: Elsevier B.V. [4] Bakhadir Rismetov, Tribidasari A. Ivandini, Endang Saepudin, Yasuaki Einaga. (2014). Electrochemical detection of hydrogen peroxide at platinum-modified diamond electrodes for an application in melamine strip tests. Diamond & Related Materials 48, 88–95. [3] Fatimah, Annisa. (2010). Studi Pengembangan Immunosensor Aunp (Interaksi Nanopartikel dengan Protein). Karya Utama Sarjana Kimia. Departemen Kimia FMIPA UI. [4] FDA (U.S. Food and Drug Administration) News. (2008). FDA Issues Interim Safety and Risk Assessment of Melamine and Melamine-Related Compunds in Food. [6] Jinchao Shen, Yang Zhang, Hong Yang, Yan Yang, Zhiguo Zhou, Shiping Yang. (2014). Detection of melamine by a magnetic relaxation switch assay with functionalized Fe/Fe3O4 nanoparticles. Sensors and Actuators B 203, 477–482. [7] Mega, Arasy. (2013). Studi Optimasi dan Aplikasi Strip Test Immunokromatografi untuk Deteksi Selektif Melamin. Karya Utama Sarjana Kimia. Departemen Kimia FMIPA UI. [8] Muhammad Sajid, et al. (2014). Design, formats and applications of lateral flow assay: A literature review. King Saud University [9] Prio, Wiyogo. (2013). Pengembangan Strip Test Immunokromatografi untuk Deteksi Selektif Melamin dan Studi Kuantifikasinya Menggunakan Metode Anodic Stripping Voltammetry. Karya Utama Sarjana Kimia. Departemen Kimia FMIPA UI.


Pengembangan Strip Test Immunokromatografi Untuk Deteksi Selektif Melamin Dengan Platform Magnetic Menggunakan Metode Annodic Stripping Voltammetry

Recommend Documents