PENGEMBANGAN METODE DIAGNOSTIK HIBRIDISASI MOLEKULER DENGAN PELACAK DNA NON RADIO-AKTIF UNTUK MENDETEKSI Peanut Stripe Virus DARI BE NIH KACANG TANAH
OLEH IFAMANZILA
96173
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERT ANIAN BOGOR BOGOR
1999
RlNGKASAN
IFA MANZILA. 1999. Pengembaogan metode diagnostik bibridisasi molekuler dengan pelacak DNA non radio-aktif untuk mendetebi PealUlt Stripe Virus dari benih kacang taoab (Dibawab bimbingan Rusmilah Suseno 5ebagsi ketua~ Sri Hendrastuti Hidayat dan Jumanto Harjo8udarmo sebagai anggota)
Telah diketahui bahwa Peanut Stripe Viru.\' dapat terbawa benih 5-20 persen. Untuk mendeteksi PStV dalam benih kacang tanah telah dicoba beberapa cara, aotara lain menggunakan cara-cara yang dapat digunakan
WItuk
mendeteksi PStV dalam
daun terinfeksi yaitu serologi dao teknik hibridisas. dot blot radio-aktif. Cara-cara tersebut belum berbasil mendeteksi PStV dalam benih.
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode diagnostik molekuler dot blot hibridisasi dengan pelacak DNA nonradio-aktif untuk mendeteksi PStV dalam benih kacang tanah yang terinfeksi PStY.
Penelitian dilaksanakan
Bioteknologi
Tanaman
Pangan
Bogor
(BALITBIO).
Penelitian
berlangsung selama 9 bulan sejak bulan April 1998 sampai dengan Desember 1998. Penelitian ini dilakukan dengan 6 tahapan, yaitu (I) Isolasi PStV dari tanamao yaog terinfeksi, (2) Inokulasi PStV pada tanaman uji. Pada tabap ini menggunakan Rancaogan Faktorial dalam Rangcangan Acak Lengkap yang terdiri alas 3 faktor yaitu varietas kacang tanah dengan 2 taraf, Isolat PStV dengan 3 taraf, dao waktu inokulasi dengan 4 tamf. Varielas kacang tanah yaog digunakan adalah varielas Gajah dao Kelinci. Isolat PStV yang digunakan adalah PStV isolat Bogor, Pasuruan,
ii
dan Jombang. Waktu inokulasinya adalah I, 2, 3, dan 4 minggu setelab tanam (mst).
Inokulasi dilakukan secara mekanik. Untuk kontrol. tanaman diperlakukan sarna tetapi tidak menggunakan sumber PStV tetapi hanya bufer. (3) Pembuatan antiserum PStV pohklonal. Pada pembuatan im menggunakan PStV mumi yang disuntikan kedalam kelinci sebanyak 50 - 100 uglpenyuntikan. Penyuntikan dilakukan 4 kali dengan mterval waktu satu minggu. Satu minggu setelah penyuntikan terakhir darah kelinei
diambil.
(4) Deteksi PStV menggunakan IEM, (5) Deteksi PStV
menggunakan DIDA, (6) Deteksi PStV dengan metode hioridisasi dengan pelacak DNA nonradio-aktif (Dietzgen, 1997). Dalam penelitian tahap (I) diperoleh hasil bahwa pada tanaman indikator C. amaranlic%r, PStV memperlihatkan gejala lesio lokal sedangkan pada tanaman
indikator P. vulgaris tidak memperlihatkan gejala lesio lokal. Teknik ini adalah cara cepat membedakan PStV dan PeMoV yang gejala dan sifatnya mirip PStY. Pada
tanaman kacang tanah yang diperuntukkan sebagai sumber inolrulum isolat virus yang digunakan memperlihatkan gejala bercak-bercak (bilur) hijau pada permukaan daun. Gejala awal dapat dilihat pada daun muda dengan bereak bijau yang samar dan tidal< beraturan. disekelilingnya tampa]( warna yang agak muda (klorosis), dan daun berkerut Lama kelamaan gejala ini memperlihatkan gejala yang khas, warna bijaunya semakin tua tidal< beraturan dan mosaik. Hasil pengamatan tahap (2) ketiga isolat mempunyai tingkat patogenisitas yang berbeda pada pengujian menggunukan tanaman indikator. Jurnlab lesio lokal tanaman yang diinokulasi PStV isolat Bogor lebib sedik.it dan pada tanaman yang
iii
diinokulasikan dengan PStV isolat Pasuruan dan Jombang. Untuk isolat Pasuruan dan Jombang relatif sarna. Pengamatan terhadap tanaman uji yaitu varietas Gajah dan Kelinci yang diinokulasi dengan PStV isolat Bogor menghasilkan jumlah polong, bobot polong dan bobotlbiji lebih bcsar dan pada tanaman yang diinokulasi dengan PStV isolat Pasuruan dan Jombang. Tanaman yang diinokulasi dengan PStV isolat Pasuruan dan Jombang menghasilkan Jumlah polons, bobot polong dan bobotlbiji berbeda tidak nyata
Hasil pengamatan tahap (3) hasil pembuatan antiserum PStV poliklonal dengan menggunakan spektrofotometer, menunjukkan bahwa konsentrasi virus mumi yang diperoleh masing-masing 143 ug/300ul, 144 ug/300ul, dan 144 ugl300ul.
Pengamatan dengan mikroskop e1ektron terhadap virus murni isolat Jombang terlihat sebanyak 13 partikel atau lebih I bidang pandang sedang yang lain kurang dari 13 partikel virus. Pengamatan tersebut dilakukan sebanyak 4 kali dibang pandang. Antiserum yang diperoleh berasaJ dan virus mumi PStV isolat Jombang. Absorban hasil pemumian antiserum pada pengamatan dengan spektrofotometer adaIah 2.249.
Hasil deteksi dengan metode !EM dan DIBA (tahap 4 dan 5) terhadap daun yang terinfeksi PStV memperoleh hasil yang positif Pada !EM positif sampai pengenceran antiserum 2000 kali dan pada DIBA positif sampai pengenceran ekstrak ,ampel 500 kali. Deleksi pada metode yang sama pada biji memperlihatkan signal positif yang lemah (tidak memperlihatkan adanya reaksi). Dan basil pengamatan deteksi menggunakan metode dot blot hibndisasi dengan pelacak DNA nonradio-aktif
PStV dapat disimpulkan bahwa
metode
iv
tersebut
dapat digunakan
untuk
mendeteksi
PStV didalam
benih
dengan
menggunakan bufer ekstraksi C yang komposisinya adalah I M Tns-HCI, pH 7,6; 200 mM LiCI; 2% SDS; 20 mM EOTA; dan fenollkloroform Kepekaan mctodc tersebut untuk mendeteksi daun hingga pengenceran 2500 kali dan pada blJI sampal
pengenceran 100 kab. Deoga" metode yang sarna pula diketahui bahwa tidak semua biji yang berasal daTi tanama" kacang laoah varietas Gajah dan Kelinci terinfeksi PStV membawa PStY.
PENGEMBANGAN METODE DIAGNOSTIK HmRIDISASI MOLEKULER DENGAN PELACAK DNA NON RADiO-AKTIF UNTUK MENDETEKSI
Peanut Stripe Virus DARI BENIH KACANG TANAH
Oleh
IFAMANZILA
96173
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 1999
Judul Penelitian
Nama Mahaslswa
: PENGEMBANGAN METODE DIAGNOSTIK HIBRIDISASI MOLEKULER DENGAN PELACAK DNA NON RADIOAKTIF UNTUK MENDETEKSI Peanut Stripe Virus DAR! BENrn KACANGTANAH
IFA MANZILA
NRP
:96173
Program studi
. ENTOMOLOGI- FITOPATOLOGI
Menyetujui Komisi Pembimbing
Prof Dr. If. Rusmilah Suseno. MSc. Ketua
~JmUJik[r Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat. MSc. Anggota
Ketu. Program Studi
Entomologi- Fitopatologi
---f~~
l .
Dr. Ir.
J S~ !011)'
Tanggal Lulus
--
ga,MSc. : 4 Mei 1999
Dr r Jwnanto 'osudarmo Anggota
Direktur ascasaIJana
"
RIWAYAT HIDUP
Penulis djlahirkan di Jakarta pada tanggal 21anuari 1964, daTi Ayahanda H. Abdul AZlz (Aim) dan Ibunda H). SIll Zub.edah. Pada tahun 1970 penults masuk Sekolah Dasar Negeri Pejaten Pasar Mlnggu
dan menyelesaikanny. pada tahun 1976, dilanjutkan ke SMP Negeri Islam 1 Mampang Prapatan, Jakarta dan selesai pada tahun 1979, dan dilanjutkan ke SMA Negeri 38 Jakarta dan selesai pada tahun 1982. P.da tahun 198211983 penolis di terim. di Fak. Biologi Universitas Nasion.1 Jakarta dan selesai pada tanggal14 mei 1988. Pada tahun yang sam. penolis diterim. bekeIj. pada konsoltan pertanian PPA (Posat Pengembangan Agribisnis-Jakarta) sampai tahun 1992. Sejak tahun 1993 sampai sekarang menjadi staf peneliti pada Balai Penelilian Bioteknologi Tanaman Pangan (BALITBIO) Bogor. Mulai .wal september 1996 terdaftar seb.g.i mahasiswa Program Magister Program Studi Entomologi - Fitopatologi Program Pascasarjana !PH.
KATA PENGANTAR
Pemanfaatan asam nukleat, DNA dan RNA, dalam metode praktis uotuk
deteksi alau identifikasi patogen-patogen tanaman merupakan hal yang masih baru. jika dibandingkan dengan penggunaan mctode serologt dan palolog1 klinik dalam bidang ilmu penyakit tumbuhan. Kepraktisan menggunakan metode seroiogi dalam patoiogi taoaman mempunyai keterbatasan yailu antara lain harns memilikl antiserum yang sesuai dan dibutuhkan konsentrasi virus yang cukup tinggi. Oleh
karena itu penggunaan metode pelacak DNAIRNA molekuler sebagai altematif.
dapat digunakan
Semua kebutuhan tcrsebut dikembangkan menjadi sistim
pengujian praktis, bermanfaat bagi kewatan di laboratorium dan lapang. Tulisan ini memuat serangkaian percobaan yang dilakukan untuk mengetahui keberadnan virus di dalam jaringan tanaman, daun maupun biji, menggunakan teknik dot blot hibridisasi non radio aktif. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof. Dr.!r. Rusmilab Suseno M.Sc., Ibu Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat M.Sc., dan Bapak Dr. Ir. Jumanto Hrujosudarmo, selaku komisi pembimbing atas kritik, saran dan
bimbingannya selama penelitian berlangsung hingga penulisan tesis ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kepala Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman pangan Bogor, Bapak Dr. Djoko S. Damardjati , Direktur Program Pascasarjana IPB, dan Ketua Program Studi Entomologi - Fitopatologi PPS - IPB. Ucapan terima kasih disarnpaikan pula kepada Pengelola AClAR Project
yang telah membiayai sebagian penelitian ini. Terima kasih kepada Bapak Dr. Roechan Martoatmodjo ,lbu Ir. Minantyorini, Ibu Ir. Yati Supriati MS. Ketua Kelti RPI , Wawan serta seluruh staf peneliti dan teknisi RPI dan Balitbio yang telab memberikan dorongan semaogat dan saran-saran yang sangat berguna dalaro
penelitian.
Rasa terima kasih penulis sampaikan pula kepada ternan-ternan di Program Studi Fitopatologi-Entomologi , Bapak Kikin, Bapak Edi Irwansyah dan khususnya angkatan 96/97. Penghormatan yang setinggi-tingginya dan penghargaan yang tidak tcrhingga ditujukan keharibaan yang mulia Ibunda Hj. Siti Zubaedah
AZlZ,
Ayahanda II Ahdul
Aziz (Aim), Kakak, adik dan ipar serta semua keluarga atas pengorbanan dan pengertiannya sehingga dapat mengantarkan penulis ke Perguruan Tinggi ini. Penghargaan dan terima kasih yang tidak terhingga penulis sampaikan kepada yang terkasih Mas Sandi Nugroho, yang telah banyak memberikan dorongan semangat, pengertian
dan membantu penulis dalam menyelesaikan penyusunan
tesis ini. Penulis
berharap agar tulisan 1m
akan
membawa manfaat bagi
pengembangan penelitian berikulnya.
Bogor, April 1999
Penulis
