DIAGNOSTIK MIKROBIOLOGI MOLEKULER
Sunaryati Sudigdoadi Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran
2015
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur dipanjatkan kehadirat Allah Subhanahuwa ta’ala atas segala rahmat dan hidayahNya, penulis dapat menyelesaikan menyusun buku ini. Buku ini merupakan tugas khusus sebagai salah satu pemenuhan mata kuliah pada Program Pendidikan Doktor, Program Pascasarjana Universitas Padjadjaran Bandung. Salah satu bidang ilmu terkait dengan Mikrobiologi saat ini yang berkembang secara pesat adalah tentang Biologi Molekuler sehingga berbagai teori molekuler dan berbagai metode molekuler dalam bidang Mikrobiologi banyak dikembangkan. Untuk itu disusunlah buku Diagnostik Mikrobiologi Molekuler ini yang mencakup teori-teori dasar Mikrobiologi Molekuler serta berbagai perkembangan metode diagnostik secara molekuler untuk dapat menentukan mikroba terkait dengan etiologi infeksi. Dengan kerendahan hati penulis sampaikan bahwa penyusunan buku ini terlaksana, sumbangan pikiran, saran, dorongan, dan bantuan lain dari berbagai pihak, serta secara khusus dorongan dari suami Prof. Dr. Sudigdoadi, dr., SpKK(K). Tak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih tak terhingga kepada Prof. Dr. H. Imam Supardi, dr., Sp.MK. (alm) selaku Promotor pada Program Doktor saat itu yang banyak memberikan dorongan kepada penulis. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih yang tak terhingga saran-saran yang sangat berharga tersebut. Akhirul kata penulis mengharapkan buku ini dapat bermanfaat untuk pembaca dikalangan peserta didik mulai dari jenjang pendidikan Strata 1, Strata 2 ataupun peserta pendidikan program Doktor.
i
DAFTAR ISI KATA PENGANTAR
i
DAFTAR ISI
iii
I. PENDAHULUAN
1
II. MAKROMOLEKUL DAN GENETIKA MIKROBA
4
2.1. Struktur Kimia Asam Nukleat
4
2.2. Struktur Kimia Protein
6
2.3. Struktur DNA
9
2.3.1. Struktur Primer Polinukleotida DNA
9
2.3.2. Struktur Sekunder Polinukleotida DNA
11
2.3.3. Denaturasi dan Renaturasi
14
2.4.Struktur dan Fungsi RNA
19
2.4.1. mRNA (messenger RNA)
22
2.4.2. tRNA (transfer RNA)
23
2.4.3. rRNA (ribosomal RNA)
26
2.5. Sintesis dan Replikasi DNA
26
2.5.1. Replikasi bersifat semikonservatif
27
2.5.2. Templat dan Primer
31
2.5.3. Inisiasi dari sintesis DNA
32
2.5.4. Leading/Lagging strands
35
2.5.5. Proofreading
38
2.6. Transkripsi
39
2.6.1. Enzim RNA Polimerase
41
2.6.2. Faktor Sigma
42
2.6.3. Sintesis RNA sel prokariot
47
ii
III. REKAYASA GENETIK DAN BIOKTEKNOLOGI
54
3.1. Sistem Kloning Gen
55
3.2. DNA Sintetik
57
IV. PRINSIP- PRINSIP DIAGNOSTIK MIKROBIOLOGI MOLEKULER
59
4.1. Pelacak (probe) asam nukleat untuk deteksi dan identifikasi penyebab infeksi
59
4.1.1. Bentuk-bentuk Hibridisasi
63
4.1.1.1. Hibridisasi Fase Cairan
63
4.1.1.2. Hibridisasi Fase Padat
65
4.1.2. Indikasi Penggunaan Pelacak di Laboratorium
67
4.1.2.1. Pelacak untuk Enterik Patogen
68
4.1.2.2. Penyakit-penyakit yang ditularkan melalui makanan
71
4.1.2.3. Patogen-patogen pada Saluran Pernafasan
71
4.1.2.4. Patogen-patogen yang ditularkan melalui kontak seksual
74
4.1.2.5. Patogen-patogen lain pada Traktus Urogenital
79
4.1.2.6. Diagnosis Sepsis Bakterial
80
4.1.2.7. Pelacak-pelacak untuk Patogen lain yang ditularkan melalui Darah
82
4.1.2.8. Penyaring Darah dan Produk Darah sebelum Transfusi
83
4.1.2.9. Pelacak-pelacak untuk Gen-gen Resistensi Antimikroba
83
4.1.3. Hibridisasi in situ
86
4.1.3.1. Persiapan Jaringan untuk Hibridisasi
86
4.1.3.2. Sistem-sistem Deteksi
89
4.1.3.3. Interpretasi
93
4.1.3.4. Otomatisasi
93
4.1.3.5. Aplikasi
94
4.1.3.6. Pemakaian pada Masa yang akan datang
96
4.2. Teknik-teknik amplifikasi asam nukleat in vitro
97
4.2.1. Pengaturan Tahap untuk Teknik Amplifikasi
100
4.2.2. Sensitivitas Klinik dan Sensitivitas Analitik
101
4.2.3. Metode-metode Amplifikasi Target
104
4.2.4. Polymerase Chain Reaction
104 iii
4.2.5. Modifikasi PCR
111
4.2.5.1. Multiplex PCR
111
4.2.5.2. Point Mutation Detection
112
4.2.5.3. Nested Amplification
114
4.2.5.4. Deteksi target-target RNA
119
4.2.5.5. PCR Kuantitatif
121
4.2.6. Sistem Amplifikasi Berdasarkan Transkripsi : TAS dan 3SR
121
4.2.7. Strand Displacement Amplification (SDA)
128
4.2.8. Aplikasi Khusus dari Amplifikasi Target
133
4.3. Amplifikasi Molekul Pelacak
135
4.3.1. Amplifikasi Q Replikase dari Molekul Pelacak RNA
136
4.3.2. Amplifikasi yang tergantung DNA Ligase
140
4.3.3. Teknik amplifikasi signal
144
4.3.4. Masalah-masalah penting pada sistem Amplifikasi
145
DAFTAR PUSTAKA
147
RIWAYAT HIDUP
149
iv
DIAGNOSTIK MIKROBIOLOGI MOLEKULER
I.
PENDAHULUAN Sepanjang perkembangan ilmu pengetahuan para ilmuan selalu berusaha untuk
mengatasi kesulitan-kesulitan atau masalah-masalah yang telah dihadapi oleh ilmuan sebelumnya. Sejak ditetapkannya postulat Koch maka berarti bahwa suatu agent penyebab suatu penyakit infeksi harus dapat diisolasi pada suatu biakan murni, harus dapat diidentifikasi, menimbulkan suatu penyakit yang sama pada hewan percobaan, dan dapat diisolasi kembali pada suatu biakan murni. Selanjutnya perkembangan didalam menentukan penyebab penyakit infeksi diawali dengan mengambil bahan pemeriksaan klinik melalui prosedur-prosedur pewarnaan, isolasi dengan menggunakan medium pembenihan, melakukan reaksi-reaksi biokimiawi untuk menentukan produk-produk metabolisme, dan tes-tes serologik atau imunodiagnostik untuk mendeteksi antigen mikroba atau antibodi terhadap antigen mikroba. Pemeriksaanpemeriksaan tersebut dilakukan di bidang Mikrobiologi Kedokteran untuk tujuan diagnostik labolatorik atau tujuan-tujuan penelitian. Dengan menggunakan dogma biakan murni dapat diisolasi dan diidentifikasi penyebab suatu penyakit infeksi yaitu bakteri, jamur atau virus. Namun dengan teknik-teknik yang telah ada, diketahui bahwa beberapa organisme sangat sulit atau mungkin tidak mungkin dibiakan, sehingga harus dicari metode lain untuk dapat menetukan penyebab infeksi tersebut. Selain itu pada beberapa keadaan metode-metode untuk identifikasi sangat terbatas dalam hal sensitivitas atau spesifitas atau keduanya. Untuk menambah sensitivitas, mempercepat waktu pemeriksaan dan menentukan mikroorganisme yang sukar dibiak telah dikembangkan suatu immunoassay yang biasa dilakukan oleh laboratorium-laboratorium yang besar maupun yang kecil untuk mendapatkan hasil diagnosis yang cepat. Kemajuan di bidang biologi molekuler dan bidang pengembangan dari bioteknologi saat ini merupakan langkah baru untuk menetukan penyebab infeksi sehingga dapat digunakan sebagai alat bantu pembantu diagnosis, karena metode-metode biologi molekuler lebih sensitif, lebih spesifik, dan lebih cepat. Prinsip-prinsip dasar di bidang biologi molekuler seperti genetika molekul, faga bakteri, dan enzim-enzim bakteri melahirkan bioteknologi modern pada akhir tahun 1970. Analisis asam nukleat mendapat perhatian dalam beberapa tahun terakhir ini dan saat ini telah banyak dilakukan sebagai dasar yang rutin di dalam pemeriksaan laboratorium klinik. Keuntungan dari pelacak asam-asam nukleat adalah untuk identifikasi organisme 1
