PENGARUH PHALERIN HASIL ISOLASI DARI DAUN Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl TERHADAP EKSPRESI PROTEIN p53 SEL EVSA-T IN VITRO EFFECT OF PHALERIN ISOLATED FROM Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl. LEAVES ON EVSA-T p53 PROTEIN EXPRESSION in vitro 1)
Mae S.H. Wahyuningsih1), Sofia Mubarika1), Subagus Wahyuono2) Fakultas Kedokteran, 2)Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
ABSTRAK Phalerin merupakan senyawa glukosida bensofenon yang diisolasi dari daun mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.] menggunakan metode Bioassay guided extraction and isolation. Senyawa tersebut mempunyai efek sitotoksik terhadap sel kanker EVSA-T dengan IC50= 1,37 x 10-1 mM dan tidak toksik pada sel normal. Penelusuran mekanisme kerja Phalerin terhadap sel EVSA-T belum pernah diteliti sebelumnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian senyawa phalerin terhadap ekspresi protein p53 sel EVSA-T secara immunositokimia. Pengukuran ekspresi protein p53 sel EVSA-T, dilakukan dengan metode Immunositokimia menurut Carson (2000). Hasil penelitian menunjukkan bahwa phalerin pada dosis 500 µg/mL dapat menaikkan ekspresi protein p53 secara signifikan (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol. Kata Kunci: Phalerin, bensofenon, imunositokimia, protein p53, sel EVSA-T
ABSTRACT Phalerin is benzophenon glucosida compound isolated from the leaves of mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.] using Bioassay guided extraction and isolation method. The compound has a cytotoxic effect on EVSA-T cancer cells with IC50= 1,37 x 10-1 mM and non toxic on normal cells. The mechanism approach of Phalerin on EVSA-T cells hasn’t been known yet. The study is aimed to discover the effect of Phalerin compound on EVSA-T cells p53 protein expression using immunocytochemistry. Using immunocytochemistry method according to Carson (2000), EVSA-T p53 protein expression is measured. The result of the study has indicated that phalerin of 500 µg/mL concentration can significanly increase (p<0,05) the p53 protein expresssion compared with control. Key words: Phalerin, benzophenon, imunocytochemistry, p53 protein, EVSA-T cells.
* Korespondensi: Dr. Mae Sri Hartati Wahyuningsih, M.Si., Apt. Bagian Farmasi Kedokteran, Fakultas Kedokteran, UGM Sekip Utara Yogyakarta, telp.0274-2477 E-mail:
[email protected]
PENDAHULUAN Tanaman mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) merupakan salah satu tanaman yang secara tradisional digunakan dalam pengobatan kanker (Anonim, 2002). Phaleria macrocarpa juga sering digunakan untuk pengobatan penyakit seperti lemah syahwat, desentri, dan alergi. Selain itu kulit dan daging buahnya dapat digunakan untuk mengobati flu, dan rematik (Harmanto, 2001). Seduhan buah mahkota dewa dapat menyembuhkan kanker hati (Syariefa, 2001). Cangkang buah mahkota dewa dilaporkan dapat digunakan untuk menyembuhkan kanker payudara, rahim, paru-paru dan sirhosis hati lebih mujarab dibandingkan dengan kulit dan daging buahnya (Syariefa, 2001). Penelitian kandungan kimia P. macrocarpa belum pernah dilakukan, namun secara garis besar golongan senyawa sudah dilaporkan. Daun mahkota dewa dilaporkan mengandung alkaloida, saponin, flavonoid dan polifenol (Harmanto, 2001). Ekstrak kloroform dari daun dan biji mengandung alkaloid dan terpenoid. Dilaporkan juga senyawa yang berperan sebagai antikanker ataupun antioksidan adalah alkaloid, terpenoid, polifenol, flavonoid (Lisdawati, 2002). Menggunakan metode Bioassay guided extraction and isolation, Wahyuningsih et al., (2005a) telah berhasil mengisolasi senyawa Phalerin(4,5-dihidroksi,4’-metoksibensofenon -3-O-β-D-glukosida) dari daun P. macrocarpa. Phalerin mempunyai aktivitas sebagai imunostimulan, ditunjukkan dengan aktivitasnya meningkatkan fagositosis makrofag secara signifikan (p<0,05) (Wijonarko et al., 2005). Phalerin juga mampu melakukan penangkapan radikal DPPH dengan IC50 =837 µg/ml (Wijonarko et al.,2006). Phalerin mempunyai efek sitotoksik terhadap sel EVSA-T (kanker payudara dengan reseptor estrogen negatif) dengan nilai IC50 1,37 X 10-1 M (Wahyuningsih et al.,2005b). Meskipun phalerin secara tradisional digunakan untuk kanker dan terbukti bersifat sitotoksik, namun penelusuran mekanisme kerja sebagai antikanker belum pernah dilakukan. Berbagai proses terbentuknya sel
kanker yang disebabkan oleh tidak terkendalinya proliferasi sel, maka pengembangan obat-obat antikanker dapat diarahkan pada regulasi cell cycle dan checkpoint control (Saphiro and Harper, 1999), pemacuan apoptosis (Fisher, 1994), penghambatan angiogenesis, faktor pertumbuhan dan growth factor signalling (Gibbs, 2000). Salah satu mekanisme apoptosis dimulai dari adanya kerusakan DNA dan protein p53 sangat berperan dalam hal ini. Protein p53 merupakan protein tumor suppressor yang diaktivasi oleh adanya kerusakan DNA atau adanya stres tertentu pada sel. Protein ini dapat memacu proses apoptosis melalui peningkatan ekspresi Bax, gen yang menyandi suatu protein Bax yang berperan dalam apoptosis. Protein Bax bersama-sama dengan protein lain akan mengaktifkan cytochrom C yang dilepas dari mitokondria dan selanjutnya akan terjadi aktivasi berantai terhadap caspase 9-caspase 3, hingga apoptosis terjadi (Juin et al., 1999; Cotran et al., 1999). Pentingnya peranan protein p53 dalam pemacuan apoptosis sel kanker, maka penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian senyawa phalerin terhadap ekspresi protein p53 sel EVSA-T secara imunositokimia. METODOLOGI PENELITIAN Bahan: Phalerin (Gambar 1) diisolasi dari daun mahkota dewa oleh Wahyuningsih et al. (2005a). Bahan-bahan pelarut organik (E Merck) dengan derajat p.a. Cell line EVSA-T (Erasmus Medical Center, Belanda), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco BRL), medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma), Phosphate Buffered Saline (PBS), streptomisin, penisilin, glutamin, DMSO (E. Merck), antibody p53 {(DAKO LSAB 2 KIT) Dako Corporation}.
O 6
HO
1'
5
6' 5'
1
HO OH HO
4''
OH
3
3''
4'
2' 3'
OCH3
O
6'' 5''
2
4
O 2''
1''
OH
Phalerin 1) (
Gambar 1. Struktur kimia Phalerin
Jalannya Penelitian Pembuatan larutan stok Sebanyak 5,0 mg phalerin dilarutkan dalam dimethyl sulphoxide (DMSO) (1,0 ml) sebelum ditambahkan medium kultur sel, sehingga konsentrasi larutan stok adalah 5 mg/mL (Gibco, Grand Island, New york, USA) Kultur sel kanker Penelitian ini menggunakan sel EVSA-T. Sel dikultur dalam medium RPMI 1640 yang ditambah dengan 10% FBS, 100 µg/mL streptomisin, 100 unit/mL penisilin dan 2 mM glutamin. Uji Imunositokimia Sel EVSA-T (kepadatan 1.105/sumuran) ditanam dalam media RPMI 1640 pada plate 6 well sampai 80% konfluen. Setelah sehari medium diganti dengan senyawa phalerin konsentrasi (250 dan 500µg/mL),
diinkubasi pada suhu 37 oC, 5% CO2 selama 24, 48 dan 72 jam. Setelah periode waktu tertentu (24, 48, dan 72 jam) sel dilepaskan dari flask dengan penambahan tripsin. Suspensi sel dipindahkan pada tabung sentrifuse dan disentrifuse dengan kecepatan 1500 RPM selama 5 menit. Pelet diresuspensi dengan media, kemudian dibuat preparat apusan pada gelas obyek (poly-lysine slide). Preparat difiksasi dengan aceton (E. Merck) selama 10 menit, dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali pencucian. Gelas objek dimasukkan dalam H2O2 selama 20 menit, kemudian dicuci dengan PBS selama 5 menit.
Setelah selesai dilakukan bloking serum selama 15-20 menit, selanjutnya diberi primer antibodi dan dibiarkan 1 jam dalam kotak lembab atau satu malam dalam almari es, kemudian dicuci dengan PBS selama 3-5 menit. Selanjutnya ditetesi biotinylated secondary antibody solution dan didiamkan selama 30 menit, kemudian dicuci dengan PBS selama 3-5 menit. Proses selanjutnya diinkubasi dalam streptavidin (Novostain) selama 30 menit, dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit. Preparat diinkubasi dalam kromogen 3,3diaminobenzidin/DAB (Lab Vision) selama 38 menit dan dicuci dengan PBS kemudian dibilas dengan akuades. Selanjutnya dilakukan pengecatan dengan hematoksilin (Dako) selama 3-4 menit untuk counterstain dan dicuci dengan akuades, kemudian diberi mounting dan ditutup deg glas. Ekspresi protein p53 diamati menggunakan mikroskop cahaya. Analisis hasil Kuantifikasi hasil dilakukan dengan mengamati sel yang mengekspresikan protein p53 (+) setiap 100 sel yang diamati. HASIL DAN PEMBAHASAN Penelusuran mekanisme kerja apoptosis senyawa phalerin hasil isolasi daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) dengan melihat ekspresi protein p53 sel kanker payudara (EVSA-T) menggunakan metode immunositokimia menurut Carson (2000). Protein p53 merupakan protein tumor suppresor dan mempunyai berat molekul 53 kilodalton yang diaktivasi oleh adanya kerusakan DNA atau adanya stres tertentu pada sel. Protein ini dapat memacu proses apoptosis melalui peningkatan ekspresi Bax, gen yang menyandi suatu protein Bax yang berperan dalam apoptosis (Meiyanto, 2002). Dengan metode immunositokimia ini dapat dilihat hasilnya secara kualitatif dan semikuantitatif. Secara kualitatif dilihat dari gambar preparat sel secara mikroskopik, sedangkan secara semikuantitatif dari perhitungan sel yang mengekspresikan protein p53 dan yang tidak mengekspresikan. Sel yang
3). Persentase sel yang mengekspresikan protein p53 ditentukan dengan cara menghitung jumlah sel yang mengekspresikan protein p53 dibagi 100 sel (lapangan pandang) dikalikan 100%. Hasil perhitungan persentase ekspresi protein p53 dapat dilihat tabel 1 dan Gambar 2.
mengekspresikan protein p53 ditandai dengan inti sel berwarna coklat kehitaman sedangkan sel yang tidak mengekspresikan protein p53 ditandai dengan inti yang berwarna biru. Pengamatan dengan mikroskop juga dapat dilihat adanya kerusakan-kerusakan yang terjadi pada inti sel setelah sel mendapatkan perlakuan dengan senyawa phalerin (Gambar
Tabel 1. Persentase ekspresi protein p53 sel kanker payudara (EVSA-T) setelah pemberian phalerin dosis 250 dan 500 µg/ml, inkubasi selama 24, 48 dan 72 jam. SAMPEL 24 jam 2,30 3,00 4,09
Kontrol Phalerin dosis 250 µg/ml. Phalerin dosis 500µg/ml.
% ekspresi p53 sel EVSA-T 48 Jam 72 Jam 2,33 2,47 3,03 3,23 4,17 5,90
7
% ekspresi p53
6
Kontrol 250 mg/ml. 500mg/ml.
5.9
5 4.17
4.09 4
3.23
3.03
3 3
2.47
2.33
2.3 2 1 0 24 jam
48 Jam
72 Jam
Waktu inkubasi
Gambar 2. Persentase ekspresi p53 sel kanker payudara (EVSA-T) Setelah pemberian phalerin dosis 250 dan 500 µg/ml, Inkubasi selama 24, 48 dan 72 jam.
Berdasarkan hasil uji t tingkat kepercayaan 95%, ekspresi protein p53 pada jam ke 24, 48 dan 72, tidak berbeda bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok pemberian phalerin dosis 250 µg/mL. Ekspresi protein p53 akibat pemberian phalerin dosis 500 µg/mL pada jam ke 48 dan 72 berbeda bermakna dengan kelompok kontrol. Hasil uji anova ekspresi protein p53 pada jam ke 24, 48 dan 72, menunjukkan adanya perbedaan bermakna antara kontrol, phalerin dosis 250
dan 500µg/mL. Sedangkan pada uji LSD semua perlakuan dan kontrol juga berbeda bermakna (p<0,05). Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa pemberian phalerin dosis 250 µg/mL dan 500 µg/mL, dapat menaikkan ekspresi protein p53 secara bermakna (p<0,05). Persentase ekspresi protein p53 bertambah seiring dengan waktu inkubasi sampel. Gambaran mikroskopis hasil uji immunositokimia dapat dilihat pada Gambar
3. terlihat bahwa setelah 48 jam sel mendapatkan paparan senyawa phalerin, sel EVSA-T mengekspresikan protein p53 lebih banyak dibandingkan dengan kelompok kontrol. Pemberian senyawa phalerin dosis 500 µg/mL (B), diinkubasi selama 48 jam, menunjukkan adanya perbedaan bentuk sel dengan kelompok kontrol (A). Pada kelompok sel yang mendapat perlakuan dengan senyawa phalerin, mengekspresikan protein p53 dengan inti menjadi berlobi-lobi warna coklat kehitaman. Intensitas warna coklat tersebut tergantung dari jumlah kromogen yang bereaksi dengan ensim peroksidase. Tandatanda tersebut di atas mengindikasikan sel mulai mengalami apoptosis. Tanda apoptosis ini banyak ditemukan pada sel yang mendapat perlakuan dengan senyawa phalerin dosis 500 µg/mL. Senyawa phalerin dapat menginduksi protein p53 yang
A
selanjutnya dapat meningkatkan ekspresi protein Bax. Protein Bax bersama-sama dengan protein lain akan mengaktifkan cytochrom C yang dilepas dari mitokondria dan selanjutnya akan terjadi aktivasi berantai terhadap caspase 9- caspase 3 hingga apoptosis terjadi (Meiyanto, 2002). Hasil penelitian lain dari Matsumoto (2003) terhadap senyawa benzofenon dari Garcinia Sp. mempunyai aktivitas sitotoksik serta memacu apoptosis pada Human Leukemia Cell Lines. Phalerin mempunyai kerangka dasar benzofenon seperti halnya pada tanaman Garcinia Sp. Senyawa Benzofenon yang telah disintesis juga mempunyai beberapa aktivitas antitumor pada P388 murine leukaemia dan PC-6 human lung carcinoma cell in vitro untuk komponen morpholino dan thiomorpholino benzofenon hasil sintesis dari derivat benzofenon (Kumazawa et al., 1999).
B
II
I
Gambar 3. Foto mikroskopis hasil immunositokimia ekspresi protein p53 sel EVSA-T, inkubasi 48 jam (A). Kelompok kontrol (400x) (B) Pemberian phalerin dosis 500 µg/mL Keterangan: I. Sel yang tidak mengekspresikan protein p53 II. Sel yang mengekspresikan protein p53
KESIMPULAN Phalerin dosis 250 µg/mL dan 500 µg/mL, dapat menaikkan ekspresi protein p53 secara bermakna (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol. Persentase ekspresi protein p53 bertambah seiring dengan waktu inkubasi sampel.
UCAPAN TERIMA KASIH Penulis menyampaikan terima kasih kepada Direkturat Jenderal Pendidikan Tinggi, Dep. Dik. Nas. atas bantuan dana melalui penelitian Hibah Bersaing XI. Terima kasih juga diberikan kepada Mbak Yuli yang telah membantu penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2002, Dicari karena khasiatnya dihindari karena racunnya, http://www. aranormal. Web.id/obat/t_obat/b_dewa_01.htm Carson, F.L., 2000, Histotechnology, A selfinstructional text, P.242-244. Chicago, ASCP Press. Cotran, R. S., Kumar, V, and Collins, T., 1999, Pathologic basic of disease, 6th ed. Saunders Comp., Philladelphia, 18-25 Fisher, D.E., 1994, Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold, Cell. 78, 539-542. Gibbs, J.B., 2000, Anticancer drug targets: growth factors and growth factor signalling, J. Clin Invest, 105, 9-13 Harmanto, N., 2001, Makutodewa Obat Pusaka Para Dewa, 7-13, Agro Media Pustaka, Jakarta. Wijanarko H., Wahyuningsih M.S.H., Mubarika S., Ganjar, I. G and Wahyuono S., 2005, Aktivitas phalerin hasil isolasi dari daun mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff). Boerl] sebagai pemacu fagositosis makrofag in Vitro. MOT, 10(33) 11-15. Wijanarko H., Wahyuningsih M.S.H., Mubarika S., Ganjar, I. G and Wahyuono S, 2006, Aktivitas antiradikal phalerin hasil isolasi dari daun mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff). Boerl], MOT, 11(35).16-20. Juin, P., Hueber, A. O., Littlewood, T., and Evan, G., 1999, c-Myc-induced sensitization to apoptosis is mediated through cytochrome c release, Gene & Dev. 13:1367-1381 Keshet, E., and Bens Sasson, S.A., 1999, Anticancer drug targets: approaching angiogenesis, J. Clin. Invest., 104(11), 1497-1501. Kumazawa, E., Hirotani, K., Burford, SC., Kawagoe K., Miwa, T., Mitsui I and Ejima, A., 1999, Synthesis and antitumor activity of novel benzophenone derivatives, Chem. Pharm. Bull., 45(9), 1470-1474 Lisdawati, V., 2002, Buah Makutodewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl). Toksisitas, efek antioksidan dan efek antikanker berdasarkan uji penapisan Farmakologi, www. Mahkotadewa.com Matsumoto, K., Akao, Y., Kobayashi,E., Ito, T., Ohguchi, K., Tanaka, T., Linuma, M and Nozawa, Y., 2003, Cytotoxic Benzophenone derivatives from Garcinia Species display a strong apoptosisinducing effect against human Leukemia
cell lines, Biol. Pharm. Bull., 26 (4), 569571. Meiyanto, E. 2002, Biologi Molekuler, Buku ajar, Proyek QUE Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Shaphiro, G. I. And Harper, J. W., 1999, Anticancer drug targets: cell cycle and chekpoint control, J. Clin. Invest., 104, 1645-1653. Syariefa, E., 2001, Seduhan Makuto Dewo Atasi Kanker Hati, Majalah Trubus, XXXII, (383), 52-53. Wahyuningsih, M.S.H., Mubarika, S., Gandjar, I. G., Hamann, M.T., Rao.,K.V., and Wahyuono, S. 2005a, Phalerin, A New benzophenoic glucoside isolated from the methanol extract of Mahkota Dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff). Boerl.] leaves. MFI, 16 (1) 51-57. Wahyuningsih, M.S.H., Mubarika S., Wayan T. Artama., Ganjar, I. G and Wahyuono S., 2005b, Sitotoksisitas phalerin hasil isolasi dari daun mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff). Boerl] terhadap berbagai sel kanker manusia in Vitro. MOT, 10(32).5-9.
