EFEK JUS DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa) SEBAGAI ANTIMODIFIKASI PROTEIN PLASMA AKIBAT REAKSI GLIKOSILASI In Vitro EFFECT OF MAHKOTA DEWA LEAF JUICE (Phaleria macrocarpa) AS ANTIPROTEIN MODIFICATION BY GLYCATION OF PLASMA PROTEIN In Vitro Bambang Setiawan, Eko Suhartono Bagian Kimia Kedokteran-Kelompok Studi Radikal Bebas dan Pemanfaatan Bahan Alam, Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru
ABSTRAK Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) merupakan tanaman asli Indonesia yang digunakan sebagai tanaman obat. Penelitian tentang penggunaan mahkota dewa sebagai antipenuaan masih jarang dilakukan. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui mekanisme antioksidatif mahkota dewa dan potensinya sebagai antipenuaan in vitro. Mekanisme antioksidatif yang diukur meliputi chelating logam, scavenging H2O2 dan antioksidan total. Potensi antipenuaan dilakukan dengan mengukur aktivitas antiglikasi. Aktivitas chelating logam, scavenging H2O2 dan antioksidan total berturut-turut adalah 15,929%, 33,752%, 24,761%. Mekanisme antioksidatif tersebut mampu menghambat reaksi glikosilasi dengan aktivitas sebesar 91,434%. Disimpulkan, bahwa jus daun mahkota dewa berpotensi sebagai penghambat reaksi glikosilasi penyebab penuaan. Kata-kata kunci: chelating logam, scavenging H2O2, antioksidan total, penuaan ABSTRACT Mahkota dewa (P. macrocarpa) is an Indonesian plant as herbal medicine. Certain research to find out the effect of mahkota dewa as antiaging was very rare. Aims of this study were to know antioxidantive mechanism activity of mahkota dewa and its potency as an antiaging in vitro. Three measured antioxidantive mechanism were metal chelating, H2O2 scavenging, and total antioxidant activity. Antiaging potency was measured by antiglycation activity. Activity of metal chelating, H2O2 scavenging, and total antioxidant activity mahkota dewa are 15.929%, 33,752%, 24.761%. It’s antioxidative mechanism could inhibit glycosylation with activity 91.434%. Concluded, Phaleria macrocarpa leave juice has potency as antiaging caused by glycocylation reaction. Key words: metal chelating, H2O2 scavenging, total antioxidant activity, aging
PENDAHULUAN Modifikasi protein adalah protein yang strukturnya mengalami perubahan, ditandai oleh pembentukan senyawa dikarbonil, ikatan silang, fluoresensi, dan lain-lain (Suhartono dkk, 2004). Modifikasi protein pasca translasi dapat terjadi melalui reaksi fosforilasi, deamidasi, karbamilasi, rasemisasi, oksidasi dan glikosilasi (Ramalho dkk, 1996). Reaksi glikosilasi adalah reaksi nonenzimatik yang diawali oleh ikatan antara gugus aldehid dari glukosa dengan amino terminal-N pada protein (Suhartono dkk, 2006). Di dalam plasma, reaksi ini akan membentuk senyawa dikarbonil dan Advanced Glycation End Product (AGEs) sebagai produk modifikasi protein yang terakumulasi pada berbagai organ selama proses penuaan normal (Mary dkk, 2004). Senyawa dikarbonil dan AGEs merupakan senyawa sitotoksik yang terbentuk akibat ketidakseimbangan antara prooksidan dan antioksidan. Mekanisme prooksidatif ini melibatkan reaktivitas H2O2 dan ion logam sebagai katalisator reaksi glikosilasi (Coleman, 2000; Lapolla dkk., 2005). Dengan kata lain, untuk menghambat pembentukan senyawa dikarbonil dan AGEs diperlukan bahan antioksidan yang bersifat scavenging H2O2 dan chelating logam. Senyawa antioksidan dapat diperoleh dari makanan maupun bahan alam pada tanaman, misalnya mahkota dewa (P. macrocarpa). Mahkota dewa merupakan tanaman asli Indonesia yang dapat digunakan sebagai obat, misalnya untuk mengobati asam urat, diabetes melitus, hipertensi, dan penyakit ginjal (Winarto, 2003). Selain berperan dalam penyakit metabolik, tanaman ini juga bersifat sitotoksik dan mampu menghambat proliferasi sel kanker payudara (Purwantini dkk., 2002; Bakhriansyah., 2006). Meskipun khasiat Mahkota Dewa telah diungkap, belum ada penelitian yang mengkaji mekanisme antipenuaan mahkota dewa (P.macrocarpa) akibat reaksi glikosilasi. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dikaji mekanisma mahkota dewa (P. macrocarpa) sebagai penghambat reaksi glikosilasi penyebab penuaan.
METODOLOGI 1. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas tanaman Mahkota Dewa (P. macrocarpa) yang diperoleh dari UPT Balai Benih Dinas Pertanian Banjarbaru, Kalimantan Selatan. Selain itu, bahan yang digunakan terdiri atas aquadest, buffer fosfat pH 7,4, serum darah manusia, asam asetat 20%, FeCl3, EDTA 0,2 mL, H2O2 0 mmol/L, asam askorbat, urea, 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH), TCA 20%, HCl 2,5 M, etanol-etil asetat 2 mL, FeCl2, o-fenantrolin, dan larutan glukosa 500 mg/dL. 2. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat gelas (PYREX®), pH meter (CYBERSCAN®), sentrifuse (CENTURION®), stopwatch, vortex (VM300®), oven (HETO®), mikropipet (TRANSFERPETTE®), dan spektrofotometer (BIOSYSTEMS® BTS-305). 3. Jalannya penelitian Pembuatan Jus mahkota dewa : Jus mahkota dewa dibuat dengan cara sebagai berikut, dua puluh lima gram daun mahkota dewa yang telah dihaluskan dilarutkan ke dalam 100 mL air. Campuran tersebut diblender kemudian disaring dengan kertas saring. Filtrat yang terbentuk mempunyai konsentrasi 25%. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Total : Pada tahap ini digunakan dua larutan, yaitu larutan kontrol dan larutan uji. Larutan kontrol adalah larutan tanpa jus mahkota dewa (A0), sedangkan larutan uji adalah larutan dengan jus mahkota dewa (A1). Absorbansi diukur pada panjang gelombang 390 nm dengan spektrofotometer. Pengujian aktivitas antioksidan total digunakan metode DNPH seperti yang dilakukan Koracevic dkk, (2001) dan dimodifikasi Sadikin (2001). Aktivitas antioksidan dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Aktivitas antioksidan total (%) =
( Ao − A1) x100% Ao
Pengukuran Aktivitas chelating logam : Aktivitas chelating logam diuji dengan Metode Dinis (Gulcin dkk., 2004). Pertama
dibuat larutan kontrol (Ao). Dicampurkan 0,05 mL FeCl2 mM yang ditambah dengan 0,2 mL o-fenantrolin hingga homogen. Larutan yang telah terbentuk kemudian dibiarkan selama 10 menit, setelah itu absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada λ=562 nm. Kemudian dibuat larutan uji (A1). Caranya sama dengan pembuatan larutan kontrol, tetapi ditambahkan jus mahkota dewa pada awal pembuatan larutan. Aktivitas chelating logam (%) =
( Ao − A1) x100% Ao
Pengukuran Aktivitas scavenging hidrogen peroksida : Aktivitas chelating logam diuji dengan Metode Ruch (Gulcin dkk., 2004). Pertama dibuat larutan kontrol (Ao). Ditambahkan 0,6 mL H2O2 40 mM dalam buffer fosfat pH 7,4 sedangkan pada larutan uji disertai dengan penambahan jus mahkota dewa. Absorbansi pada larutan kontrol (Ao) dan larutan uji (A1) diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada λ=230 nm. Aktivitas scavenging hidrogen peroksida (%) =
( Ao − A1) x100% Ao
Pengukuran Potensi Antiglikosilasi : Glikosilasi dibuat dengan model reaksi antara protein serum dengan glukosa. Reaksi ini akan menghasilkan senyawa karbonil yang dapat diukur dengan spektrofotometer pada λ=390 nm. Pengukuran senyawa karbonil digunakan metode DNPH yang dimodifikasi (Uchida dkk., 1998; Sadikin., 2001). Pada tahap ini digunakan dua larutan, yaitu larutan kontrol dan larutan uji. Larutan kontrol adalah larutan tanpa jus mahkota dewa (Ao), sedangkan larutan uji adalah larutan dengan jus mahkota dewa (A1). Potensi antiglikosilasi (%) =
( Ao − A1) x100% Ao
HASIL DAN PEMBAHASAN Modifikasi protein akibat reaksi glikosilasi dapat diukur secara kimia, yang ditandai oleh pembentukan senyawa karbonil. Senyawa karbonil dapat diukur dengan menggunakan DNPH. DNPH bereaksi dengan gugus karbonil untuk membentuk dinitrofenilhidrazon yang jumlahnya dapat diketahui secara spektrofotometris dengan karakteristik penyerapan maksimal pada 360390 nm. Banyak sedikitnya jumlah karbonil ini menggambarkan banyak atau sedikitnya modifikasi protein (Suhartono dkk., 2006). Pada penelitian ini, pengukuran produk kimiawi tersebut berguna sebagai penanda berlangsungnya penuaan dan merupakan model glikosilasi protein plasma (Nagaraj dkk., 1996). Potensi mahkota dewa dalam menghambat reaksi glikosilasi adalah sebesar 91,434%. Aktivitas ini diduga disebabkan oleh bahan aktifnya yang bersifat antioksidatif. Mekanisme antioksidatif mahkota dewa dinyatakan sebagai aktivitas chelating logam, aktivitas scavenging H2O2, antioksidan total dan antiglikosilasi, seperti tersaji pada Gambar 1. Aktivitas antioksidatif mahkota dewa sebagai scavenging dan chelating logam adalah sebesar 33,752% dan 15,929%. Selain itu, aktivitas antioksidan total mahkota dewa adalah sebesar 24,761%. Menurut reaksi pada Gambar 2 dan 3, potensi antioksidatif mahkota dewa diduga mampu menghambat reaksi glikosilasi melalui penghambatan pembentukan senyawa karbonil. Diduga, penghambatan reaksi glikosilasi tersebut terjadai pada beberapa titik tangkap reaksi, yakni: 1. Perubahan produk amadori menjadi produk akhir melalui jalur oksidatif melalui keterlibatan oksidan dan logam. Pada jalur ini, perubahan 2-3 enediol menjadi Nε-(carboxymethyl)lisine (CML) melibatkan aktivitas H2O2 dan logam (Mn+). Mahkota Dewa bekerja sebagai antioksidan terhadap H2O2, dan sebagai pengikat logam (Mn+).
(%)
120 100 80 60 40 20 0
91.434
33.752 15.9294
CL
S-H2O2
24.761
AT
AG
Gambar 1. Rerata potensi antioksidan mahkota dewa sebagai antipenuaan. Keterangan: CL = chelating logam; SH2O2 = scavenging H2O2; AT = antioksidan total; AG = potensi antiglikosilasi
Gambar 2. Pembentukan Nε-(carboxymethyl)lisine (CML) yang melibatkan jalur oksidatif reaksi glikosilasi (Voziyan dkk, 2003).
Gambar 3. Skema pembentukan AGEs dan jalur pintas pembentukan senyawa dikarbonil (Booth dkk., 1997)
Peredaman terhadap reaktivitas oksigen melalui jalur pintas yang berperan dalam pembentukan senyawa dikarbonil. Pada titik tangkap ini, Mahkota Dewa akan menghambat pada 3 jalur, yakni gugus aldehid-amino-dikarbonil, basa Schiffdikarbonil, dan produk amadori-dikarbonil seperti disajikan pada gambar 3. Kemampuan antipenuaan jus mahkota dewa diduga disebabkan oleh kandungan polifenolnya, yakni flavonoid. Flavonoid adalah senyawa organik polifenol yang mampu mereduki oksidan. Flavonoid bekerja sebagai antioksidan dengan beberapa cara, yakni a) pengelatan ion logam; dan b) peredaman radikal bebas. Ada dua gugus fungsi utama pada flavonoid yang menentukan potensi peredaman oksidan, yakni a) gugus katekol pada cincin B; dan b) ikatan rangkap yang berkonjugasi dengan 4-okso pada cincin C (Middleton dkk, 2000). Penelitian ini didukung oleh penelitian Sengupta dkk, (2006) yang dibuktikan bahwa flavonoid mampu menghambat reaksi glikosilasi. Mekanismenya diduga melalui aktivasi gugus hidroksil pada flavonoid yang berikatan dengan tapak karbonil reaktif dari glukosa sehingga memblokade ikatan antara glukosa dengan protein serum. Akibatnya, reaksi glikosilasi dapat dihambat. KESIMPULAN Aktivitas antioksidatif jus daun mahkota dewa (P.macrocarpa) berpotensi sebagai antimodifikasi protein plasma akibat reaksi glikosilasi penyebab penuaan. DAFTAR PUSTAKA Bakhriansyah, M., 2006, Aktivitas antiproliferasi ekstrak etanol biji mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff)Boerl) pada sel kanker payudara T47D. J Kedokt YARSI., 14(2),134-40. Booth, AA., Khalifah, RG., Todd, P., Hudson, BG., 1997, In Vitro kinetic studies of formation of antigenic Advanced Glycation End Products (AGEs), J. Biol. Chem., 272,5430-5437. Coleman, MD., 2000, Use of methaemoglobin generation
in vitro to study
antioxidant status in the diabetic erythrocyte, Biochem Pharmacol., 60(15),1409-16. Gulcin, I., Kufrevioglu, I., Oktay, M., Buyukokuroglu, ME., 2004, Antioxidant, antimicrobial, antiulcer and analgesic activities of nettle (Urtica dioica L.), J Ethnopharmacol., 90,205-15. Koracevic, D., Koracevic, G., Djrjevic., 2001, Method for the measurement of antioxidant activity in human fluids, J Clin Pathol., 54,356-61. Lapolla, A., Traldi, P., Fedele, D., 2005, Importance of measuring products of nonenzymatic glycation proteins, Clin Biochem., 38,103-15. Mary, J., Vougier, S., Picott, CR., Perichon, M., Petropoulos, I., Friguet, B., 2004, Enzymatic reactions involved in the repair of oxidized proteins. Exp. Gerontol., 39,1117-23. Middleton, E., Kandaswani, L., Theoharis, S., 2000, The effect of plant flavonoid on mammalian cells: implication for inflamation, heart disease, and cancer. Pharmacol, Rev, 52,673-751. Nagaraj, RH., Otin, MP., Monnier, VM., 1996, Ether crosslinks as a basis for protein crosslinking by the advanced maillard reaction in aging and diabetes, Arch. Biochem. Biophys., 325(2),152-158 Purwantini, I., Setyowati, EP., Hertiani, P., 2002, Uji aktivitas ekstrak etanol buah, biji, daun Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff)Boerl) terhadap Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis ekstrak aktif. Maj Farmasia Indon., 13(2),1010-6. Ramalho, J., Marques, C., Pereira, P., Mota, MC., 1996, Crystallin composition oh human cataractous lens may be modulated by protein glycation, Graefe’s Arch Clin Exp Ophtalmol., 234,232-8. Sadikin, M., Adhiyanto, C., 2001, Pengukuran konsentrasi senyawa dikarbonil. Disampaikan pada Pelatihan Radikal Bebas dan Antioksidan Dalam Kesehatan. Jakarta, 16-21 April Sengupta, B., Uematsu, T., Jacobson, P., Swenson, J., 2003, Exploring the antioxidant property of bioflavonoid quercetin in preventing DNA glycation: a calorimatric and spectroscopic study. Biochem. Biophys. Res. Commun, 339,355-61.
Suhartono, E., Setiawan, B., Edyson, Mashuri., 2004, Modifikasi protein akibat reaksi Maillard dan pengaruhnya terhadap kadar tirosin, Jurnal Profesi Medika., 4(2),20-8. Suhartono, E., Setiawan, B., 2006, Kapita selekta biokimia: radikal bebas, antioksidan, dan penyakit, Banjarmasin, Penerbit Pustaka Banua. Uchida, K., Kanematsu, M., Sakai, K., Matsuda, T., Hattori, D., Mizuno, Y., 1998, Protein bound acrolein: potential marker for oxidative stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95,4882-7. Voziyan, PA., Khalifah, RG., Thibaudeau, C., Yildiz, A., Jacob, J., Serianni, AS., 2003, Modification of proteins in vitro by physiological levels of glucose. J. Biol. Chem., 278,46616-24. Winarto, WP., 2003, Mahkota Dewa, budidaya dan pemanfaatan untuk obat. Jakarta: Penebar Swadana.
