Volume 17, nomor 2, Hal.86-91 Juli – Desember 2015
ISSN:0852-8349
PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ANNONA MURICATA TERHADAP KADAR NITRIC OXIDE PADA MENCIT SWISS YANG DI INFEKSI PLASMODIUM BERGHEI ANKA Maria Estela Karolina Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Jambi Kampus Pinang Masak, Mendalo-Darat Jambi 36361 Email :
[email protected] ABSTRAK Malaria masih merupakan masalah kesehatan terutama di negara-negara tropis. Penelitian membuktikan bahwa Nitric Oxide (NO) mempunyai peran protektif pada stadium eritrosit malaria dan kadar NO yang tinggi toxic bagi parasit. Ekstrak Annona muricata (daun sirsak) mengandung flavanoid, acetogenins yang salah satu fungsinya sebagai antiplasmodium secara in vitro. Penelitian ini bertujuan ntuk mengetahui pengaruh ekstrak Annona muricata terhadap kadar NOpada limpa mencit swiss betina yang diinfeksi dengan Plasmodium Berghei ANKA. Design penelitian ini adalah “Post Test only randomized Control Group Design”. Sampel terdiri dari mencit Swiss normal (K-), mencit yang diinokulasi P. berghei ANKA (K+), mencit yang diberikan ekstrak daun sirsak 100 mg/KgBB/hari (P1), mencit yang diberikan ekstrak daun sirsak 200 mg/KgBB/hari (P2), mencit yang diinokulasi P. berghei ANKA dan diberikan ekstrak 100 mg/KgBB/hari (P3), mencit yang diinokulasi P. berghei ANKA dan diberikan ekstrak 200 mg/KgBB/hari (P4). Rerata kadar NO kelompok P3 (0,93) lebih tinggi dibanding K(+) dan P4. Hasil uji Mann whitney menunjukkan bahwa kadar NO berbeda bermakna antara K(+) dengan K(-), K(+) dengan P1, K(+) dengan P2, K(-) dengan P4, P1 dengan P4, P2 dengan P4. Kata kunci: Annona muricata, P. berghei ANKA, NO PENDAHULUAN Malaria masih merupakan masalah kesehatan terutama di negara-negara tropis dan masih merupakan penyakit endemis di sebagian besar wilayah di Indonesia. Terdapat 15 juta kasus malaria dengan 38.000 kematian setiap tahunnya (WHO, 2011). Upaya pemberantasan malaria di Indonesia masih mengalami beberapa kendala antara lain timbulnya resistensi vektorterhadap pestisida, timbulnya resistensi Plasmodium terhadap obat antimalaria, pengetahuanmasyarakat terhadap malaria rendah (Zein, 2005). Mortalitas pada malaria tinggi disebabkan oleh komplikasi fatal yang sering terjadi 86
pada malaria Falciparum, misalnya terjadi blackwater fever, anemia berat, dan serebral malaria (WHO, 2011). Kematian akibat malaria disebabkan oleh lingkungan dan resistannya obat anti malaria yang sering digunakan terhadap Plasmodium (Kemenkes RI, 2011). Plasmodium berghei ANKA merupakan plasmodium yang menyebabkan malaria serebral pada tikus yang mempunyai persamaan dengan P. falciparum pada manusia (Sianny, 2007). Daur hidupnya sangat kompleks dimulai dari masuknya sporozoit dari gigitan nyamuk, kemudian parasit berkembang di dalam hati dan membentuk banyak merozoit dan menginvasi sel darah merah
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
(Susy T. 2010). Eritrosit yang terinfeksi Plasmodium menyebabkan aktivasi sel makrofag untuk mensekresikan tumor necrosis factor alpha (TNFα), nitric oxide (NO), interleukin 12 (IL-12) untuk mengaktifkan sel NK dan mensekresikan IFNγ (Louis S. 2005). NO berperan penting pada setiap stadium infeksi malaria yang merupakan antagonis dari parasit plasmodium. Beberapa penelitian mengungkapkan bahwa NO mempunyai peran protektif pada stadium eritrosit malaria dan peningkatan kadar serum NO toxic bagi parasit (Sandro, 2012). Produksi NO selama infeksi malaria dapat meregulasi keseimbangan antara sitokin pro inflamasi dan anti inflamasi (Nicholas, 1996). Sitokin pro inflamasi ( IL-12, IFNγ, TNFα ) meningkatkan sintesis NOS 2 selama respon inflamasi sedangkan sitokin antiinflamasi (TGFβ, IL-10 ) menurunkan NOS 2 (Hossein. 2006). NO dapat menurunkan derajat parasitemia pada mencit yang diinfeksi plasmodium berghei, menghambat terjadinya malaria berat khususnya malaria serebral oleh enzim NOS 2 (Douglas, 2009). Sejauh ini belum ditemukannya obat malaria yang efektif. Banyak tumbuhan yang dapat dijadikan senyawa antimalaria sebagai pengganti obat malaria yang toksik bagi parasit salah satunya adalah tanaman Annona muricata (daun sirsak) (Loeki EF, 2003). Kandungan kimia dari daun sirsak salah satunya flavonoid dan acetoginin mempunyai peran sebagai antiplasmodia dan mempengaruhi kadar TNF-α dan NO (Loeki EF, et al. 2003. Shally M, 2013). Tujuan utama penelitian ini adalah mengetahui pengaruh pemberian ekstrak Annona muricata terhadap kadar NO pada mencit Swiss yang diinfeksi P. berghei ANKA. METODE PENELITIAN Ekstrak etanol daun Annona muricata di dapat dari PT.Sido Muncul. Hewan
coba yang digunakan dalam penelitian adalah mencit betina strain Swiss 36 ekor dengan umur 6-8 minggu dan berat badan 20-30 gram yang diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Bidang Layanan Penelitian Pra Klinik dan Pengembangan Hewan Percobaan UGM Yogyakarta. Mencit donor yang telah diinfeksi dengan isolat P.berghei ANKA yang diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM. Reagen pemeriksaan NO yaitu reagen griess. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratories dengan rancangan “Post Test only randomized Control Group Design”. Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei 2014 di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Sampel penelitian adalah 36 ekor mencit Swiss betina usia 6 – 8 minggu, berat badan 20 – 25 gram dengan jumlah sampel tiap kelompok 6 ekor mencit yang terdiri dari 6 kelompok yaitu : kelompok kontrol negatif (mencit sehat tanpa diinfeksi dan di terapi), kontrol positif (diinokulasi P.berghei ANKA tanpa terapi), Kelompok perlakuan 1 (diberikan ekstrak daun sirsak 100mg/KgBB/hari tanpa inokulasi), Kelompok perlakuan 2 (diberikan ekstrak daun sirsak 200mg/KgBB/hari tanpa inokulasi), Kelompok perlakuan 3 (diberikan ekstrak daun sirsak 100mg/KgBB/hari dan diinokulasi P.berghei ANKA), Kelompok perlakuan 4 (diberikan ekstrak daun sirsak 200mg/KgBB/hari dan diinokulasi P.berghei ANKA). Inokulasi dilakukan pada hari ke 7 setelah pemberian ekstrak daun sirsak. Inokuasi P. berghei ANKA diberikan secara intraperitoneal sebanyak 107 parasit dalam 0,2 ml darah untuk tiap mencit. Ekstrak daun sirsak diberikan peroral melalui sonde dengan dosis 100 mg/KgBB/hari dan 200 mg/KgBB/hari setiap hari selama 14 hari. Masing-masing kelompok perlakuan pada hari ke-14 91
Maria Estela Karolina: Pengaruh Pemberian Ekstrak Annona Muricata Terhadap Kadar Nitric Oxide Pada Mencit Swiss Yang di Infeksi Plasmodium Berghei Anka
dimatikan dan diambil limpanya dan dilakukan isolasi dan kultur limpa untuk diperiksa kadar NO. Pemeriksaan NO menggunakan kultur sel limpa yang sudah ditambahkan dengan Phytohaemagglutinin (PHA) dengan metode Griess diukur menggunakan microplate reader pada gelombang 595. Penelitian ini sudah mendapatkan Ethical Clearance dari Komisi Etik
Penelitian Kesehatan (KEPK) Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar NO diperoleh dari supernatan kultur limpa mencit Swiss yang distimulasi PHA dan diukur menggunakan microplate reader pada gelombang 595.
NO Rerata Kadar NO
1,5 1 0,5
1,15
1,38
1,14
0,93 0,47
0,67
0 Kneg
P1
P2
Kpos
P3
P4
Kelompok Perlakuan
Gambar 1. Rerata Kadar NO Produk Sel Limpa yang Distimulasi PHA in vitro Gambar 1 memperlihatkan bahwa kelompok perlakuan yang sehat yaitu K(+), P1 dan P2 didapatkan bahwa kadar NO lebih tinggi pada kelompok P1 dibandingkan dengan K(+) dan P2. Kelompok perlakuan yang diinokulasi P. berghei ANKA menunjukkan bahwa kadar NO kelompok kontrol positif lebih rendah dibandingkan kelompok P3 dan P4. Kelompok P3 lebih tinggi kadar NO dibanding dengan kelompok P4 dan kontrol positif. Penelitian ini mengamati kapasitas produksi NO sel limpa mencit swiss dengan mengukur kadar NO dalam kultur sel limpa yang dipicu mitogen PHA. Inokulasi P. berghei ANKA menurunkan kapasitas produksi NO mencit swiss hari ke 7 (Grafik 1). Kadar NO kelompok 90
kontrol positif yang diinokulasi P. berghei ANKA lebih rendah dibandingkan kelompok kelompok perlakuan yang diinokulasi P. berghei ANKA (kelompok P3 dan P4). Penelitian ini mendukung adanya kecenderungan Annona muricata memodulasi kapasitas produksi NO sel limpa (Grafik 1). Efek Annona muricata terlihat dari kadar NO kelompok P1 (penerima dosis 100 mg/KgBB/hari) lebih tinggi dibanding kontrol negatif. Efek Annona muricata cenderung meningkatkan kadar NO mencit yang diinokulasi P. berghei ANKA. Hal ini diperlihatkan oleh kadar NO yang lebih tinggi pada kelompok P3 dan P4 daripada kelompok kontrol positif yang diinokulasi P. berghei ANKA dan tidak menerima perlakuan
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
Annona muricata. Kadar NO yang rendah menyebabkan ekspresi eCAMs, aktivasi platelet, adhesi sel endotel. Aktivasi endotel seperti monosit, limfosit pRBC berinteraksi dengan eCAMs kemudian menuju pembuluh darah otak dan menghambat aliran darah. Hal tersebut menyebabkan neurotoksisitas dan edema
otak karena rusaknya sel endotel (Zanini GM, 2011). Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna diantara keenam kelompok perlakuan ( p < 0,05), selanjutnya dilakukan uji Mann Whitney untuk mengetahui kelompok yang memiliki perbedaan bermakna seperti pada Tabel 1.
Tabel 1. Uji Mann Whitney Kadar NO Perlakuan Kpos Kneg P1 P2 P3 P4
Kpos
Kneg P=0,014*
P1 P2 P=0,014* P=0,017* P=0,115 P=0,517 P=0,071
P3 P=0,084 P=0,116 P=0,075 P=0,203
P=0,372
P=0,024*
P=0,024* P=0,047*
P=0,451
Tabel 1menunjukkan bahwa kadar NO berbeda bermakna antara kelompok kontrol positif dengan kelompok kontrol negatif, kontrol positif dengan P1, kontrol positif dengan P2, kontrol negatif dengan P4, P1 dengan P4, demikian pula dengan kelompok P2 dengan P4 (p<0,05). Kadar NO antar kelompok lainnya tidak berbeda bermakna (p>0,05). Bioavabilitas NO yang rendah berperan pada mencit dengan serebral malaria menyebabkan terjadinya vasokonstriksi pembuluh darah, aliran darah dan oksigen otak sedikit (Cabrales, 2011). Kadar NO yang tinggi mampu membunuh parasit yang akan berkembang mejadi malaria serebral (Charles, 2000). Pemberian suplemen NO dari luar terbukti dapat mencegah kadar NO yang rendah dengan meningkatkan aliran darah, mencegah terjadinya vasokonstriksi, mencegah inflamasi pada pembuluh darah serta mengurangi perdarahan (Cabrales, 2011). Berdasarkan penelitian yang menggunakan ekstrak ethanol Annona muricatain vitro untuk melihat aktivitas
P4 P=0,372 P=0,024* P=0,024* P=0,047* P=0,451
sebagai antioksidan dengan kandungan acetogenins menunjukkan bahwa oksigen akan bereaksi dengan NO yang tinggi untuk menghasilkan nitrit dan peroxy nitrit dan efektif sebagai radikal bebas (Shaily, 2013). Acetogenin dapat menghambat complex I (NADH : Ubiquinone oxidoreductase) pada transpor elektron di mitokondria dan menghambat NADH oxidase pada plasma membran, dimana enzim tersebut ditemukan pada P. Falcifarum(Lannuzel, 2003). Hal tersebut menyebabkan gangguan pada ATP-synthase menginduksi terjadinya apoptosis (Lannuzel, 2003. Lauve, 2011). KESIMPULAN Pemberian ekstrak daun Annona muricata dapat meningkatkan kadar NO pada mencit Swiss yang telah diinfeksi P.berghei ANKA.
91
Maria Estela Karolina: Pengaruh Pemberian Ekstrak Annona Muricata Terhadap Kadar Nitric Oxide Pada Mencit Swiss Yang di Infeksi Plasmodium Berghei Anka
DAFTAR PUSTAKA WHO. 2011. World Malaria Report. Global Malaria Programme WHO. Zein, Umar. 2005. Penanganan Terkini Malaria Falciparum. e-USU Repsository Universitas Sumatera Utara. Kementerian Kesehatan RI. 2011. Epidemiologi Malaria di Indonesia. Buletin jendela Data dan Informasi Kesehatan. Sianny S. Herni S. 2007. Efek anti malaria ekstrak brotowali (Tinospora crispa) Pada mencit yang diinfeksi plasmodium berghei. Wijaya Kusuma. Volume 1 issue 1, Page 13 - 22. Susy T. Khie K. 2010. Potensi buah merah sebagai antioksidan dalam mengatasi malaria berghei pada mencit strain Balb/C. Majalah Kedokteran Indonesia. Volume 60, Issue 12, page 575 – 571. Louis S. George EG. 2005. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature publishing group. Volume 5, page 735 – 722. Sandro P. Danilo RM. Bruno AQ. Et al. 2012. Oxidative stress in malaria. international journal of molecular sciences. Volume 13,Page 16346 – 16372 Nicholas MA. Brice W. Mustaq YH. Et al. 1996. Nitric oxide in Tanzanian children with malaria : inverse relationship between malaria severity and nitric oxide production/ nitric oxide synthase type 2 expression. J. Exp. Med. Volume 184,page 557 – 567. Hossein N. 2006. Immune effector mechanisms of the nitric oxide pathway in malaria : cytotoxicity versus cytoprotection. BJID. Volume 10, Issue 4,Page 283–292 Douglas JP. Peter GK. Daniela S. Et al. 2009. Blood mononuclear cell 90
nitric oxide production and plasma cytokine levels in healthy gabonese children with prior mild or severe malaria. infection and immunity. Volume 67, Issue 9, Page 4977– 4981. Loeki EF. Wongso S. Sri M. Et al. 2003. Effect of combined therapy using chloroquine and vitamin c to the peritoneal macrophage functionin balb/c strain mice infected by plasmodium berghei. Majalah kedokteran unibraw. Volume 19 Issue 3. Shaily M. Shamim A. Nilesh K. Et al. 2013. Annona muricata (the cancer killer) : a review. The global journal of pharmaceutical research. Volume 2, Issue 1, Page 1613 – 1618. Zanini GM. Cabrales P. Barkho W. et al. 2011. Exogenous nitric oxide decrease brain vascular inflammation, leakage and venular resistance during Plasmodium berghei ANKA infection in mice. Journal of Neuroinflammation.Volume 8, Issue 66, Page 1 – 9. Cabrales P. Zanini GM. Meays D. et al. 2011. Nitric Oxide Protection Againts Murine Cerebral Malaria is Associated With Improved Cerebral Microcirculatory Physiology. The Journal of Infectious Diseases.Volume 203,Page 1454 - 1463 Charles RJ. Tran TH. et al. 2000. Cerebral Malaria. Journal of Neurology neurosurgery and Psychiatry. Volume 69,Page 411 – 433 Lannuzel A. Michel G. Champy P. Et al. 2003. The mitochondrial complex I inhibitor Annonacin is toxic to mesenchephalic dopaminergic neurons by impairment of energy metabolism. Elsevier. Page 287 – 296
Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains
Lauve RYT. Febrice FB. Patrick VT. Et al. 2011. Antiplasmodial activity and toxicity profile of acetoginin enriched fraction from annona
muricata (annonaceae) growing in cameroon. Volume 134, Page 717 – 724.
91
