PENENTUAN KADAR GLUKOSAMIN DARI FERMENTASI KULIT UDANG OLEH Mucor miehei DENGAN METODE UJI NINHIDRIN DAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS (Skripsi)
Oleh MARIA ULFA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
ABSTRAK PENENTUAN KADAR GLUKOSAMIN DARI FERMENTASI KULIT UDANG OLEH Mucor miehei DENGAN METODE UJI NINHIDRIN DAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
Oleh Maria Ulfa
Pada penelitian ini dilakukan pembuatan glukosamin dengan fermentasi kulit udang dengan bantuan Mucor miehei. Mucor miehei memproduksi kitinase untuk mendegradasi kitin yang terkandung pada kulit udang menjadi glukosamin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah glukosamin maksimum yang dihasilkan Mucor miehei dalam mendegradasi kulit udang setiap hari selama lima hari waktu fermentasi. Kadar glukosamin ditentukan dengan analisis spektrofotometri UV-Vis dan uji kualitatif dengan reagen ninhidrin. Hasil uji menunjukkan filtrat hasil fermentasi memberikan hasil positif warna ungu terhadap reagen ninhidri. Larutan ini lalu di analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang (λ) 570 nm. Waktu optimum Mucor miehei untuk mendegradasi kulit udang adalah pada hari keempat dengan kadar kemurnian sebesar 4,14 % dari 1 gram kulit udang yang digunakan.
Kata kunci : Glukosamin, Mucor miehei, Ninhidrin, Spektrofotometri UV-Vis
ABSTRACT
DETERMINATION OF GLUCOSAMINE CONTENT FROM FERMENTATION OF THE SHRIMP SHELLS BY Mucor miehei USING NINHYDRIN TEST AND UV-VIS SPECTROPHOTOMETRY METHOD
By Maria Ulfa
This research was conducted to make glucosamine from fermentation of shirmp shells by using Mucor miehei. Mucor miehei produces chitinase to degrade chitin that contained in shrimp shells to glucosamine. This research aims to determine the maximum amount of glucosamine produced by Mucor miehei to degrade shrimp shells every day for five days fermentation process. Glucosamine level was determined using UV-Vis spectrophotometer and ninhydrin reagent. The results showed the filtrate from fermentation gave a positive result in purple to ninhydrin reagent. This solution was analyzed using UV-Vis spectrophotometer at wavelenght (λ) 570 nm. Optimum time of Mucor miehei to degrade the shrimp shells is on the fourth day with purity level 4.14 % of 1 gram of shrimp shells were used.
Keywords: Glucosamine, Mucor miehei, Ninhydrin, UV-Vis Spectrophotometry
PENENTUAN KADAR GLUKOSAMIN DARI FERMENTASI KULIT UDANG OLEH Mucor miehei DENGAN METODE UJI NINHIDRIN DAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
Oleh MARIA ULFA
Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS Pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Indramayu, provinsi Jawa Barat pada tanggal 1 Juni 1994, yang merupakan anak kedua dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Rema dan Ibu Khasanah. Penulis menyelesaikan pendidikan di TK Melati Puspa pada tahun 2000, Sekolah Dasar di SDN 3 Perumnas Way Kandis pada tahun 2006, Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 19 Bandar Lampung pada tahun 2009, dan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 9 Bandar Lampung pada tahun 2012. Penulis terdaftar sebagai mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Lampung pada tahun 2012 melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) Tertulis. Selama menjadi mahasiswa pernah menjadi anggota Bidang Kaderisasi dan Pengembangan Oranisasi (KPO) Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) periode 2013-2014 dan anggota Biro Kesekretariatan Himaki tahun 2014-2015. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Sains Dasar, Kimia Dasar, dan Biokimia. Pada tahun 2015 dan 2016 penulis melakukan Praktek Kerja Lapangan dan Penelitian di Laboratorium Biokimia, Universitas Lampung.
Bismillahirrohmaanirrohiim Dengan mengucap Alhamdulillahirobbil’alamin kepada Allah SWT Yang Maha Segalanya
Kupersembahkan karya kecil ini sebagai wujud tanda cinta, bakti dan tanggung jawabku kepada:
AYAH DAN IBU TERSAYANG Yang senantiasa memberikan kasih sayang, perhatian, dukungan, kesabaran, dan motivasi Serta selalu mendoakan keberhasilan Pengorbanan dan kasih sayang yang tidak tergantikan
Seluruh keluarga besar yang selalu memberikan kebersamaan, doa dan motivasi
Sahabat dan teman-temanku yang selalu ada disisiku, berbagi kebahagiaan dan kebersamaan
Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Almamater tercinta Universitas Lampung
“Happines can be found in even the darkest of times if only one remembers to turn on the light.” (Prof. Albus Dumbledore)
“Segala sesuatu yang hebat itu sederhana dan banyak yang bisa diungkapkan dengan satu kata: kebebasan, keadilan, kehormatan, kewajiban, rahmat, harapan” (Winston Churchill)
“You cannot do something just for the money. You have to do things you believe in and eventually you willl make money” (Miuccia Prada)
“.......Niscaya Allah akan meninggikan orang-orang yang beriman di antaramu dan orang-orang yang diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat. Dan Allah Maha Mengetahui apa yang kamu kerjakan” (Al-Mujaadilah:11)
ひとりでは生きていないこと 時にまた忘れがちだけど (hitori de wa ikiteinai koto toki ni mata wasuregachi dakedo) You may forget sometimes that I’m not living alone 苦しい時もすぐそばで 誰かがそばで (kurushii toki mo sugu soba de dareka ga soba de) but in hard times, someone near you 君に手を差し延べてる きっと (kimi ni te wo sashinobeteru kitto) will surely reach out a hand
世界の涙 集めたら それぞれの道に撒こう (sekai no namida atsumetara sorezore no michi ni makou) Let’s collect the world’s tears and sprinkle them on the roads 誰かの足元にいつか 花となり咲くだろう (dare ka no ashimoto ni itsuka hana to nari saku darou) Someday someone’s footsteps will bloom as flowers 綺麗な花を集めたら 幸せがあふれだして (kirei na hana wo atsumetara shiawase ga afuredashite) If we could collect the beautiful flower, we would overflow with happiness 僕らはひとつになれるよ それをいま 信じよう (bokura wa hitotsu ni nareru yo sore wo ima shinjiyou) and become one. Let’s believe in that now.
(東方神起 – In Our Time)
SANWACANA
Alhamduliillahirobbil’alamin, segala puji dan syukur bagi Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Penentuan Kadar Glukosamin Dari Fermentasi Kulit Udang Oleh Mucor Miehei Dengan Metode Uji Ninhidrin dan Spektrofotometri UV-Vis” sebagai syarat untuk mencapai gelas Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
Penulis menyadari bahwa penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari bimbingan, arahan, serta bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terimakasih kepada:
1.
Kedua orang tuaku tercinta, Bapak Rema dan Ibu Khasanah, atas segala kasih sayang, doa, waktu, kesabaran, dukungan, nasihat, keikhlasan, dan ketulusan doa yang sangat berharga bagi penulis.
2.
Ibu Dra. Aspita Laila, M.S., selaku pembimbing I atas segala bimbingan, motivasi, kesabaran,perhatian, dan ilmunya sehingga penelitian dan skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik.
3.
Bapak Prof. Dr. John Hendri, M.S., selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbngan, arahan, kesabaran, waktu, dan ilmu selama penelitian
hingga penyusunan skripsi ini, sehingga penulis dapat menyelesaikannya dengan baik. 4.
Bapak Andi Setiawan, Ph. D., selaku pembahas yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan, arahan, dan saran demi terselesainya skripsi ini.
5.
Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
6.
Bapak Mulyono, Ph. D., selaku pembimbing akademik dan Sekretaris Jurusan Kimia FMIPA Unila atas bimbingan, nasehat, dan motivasi yang telah diberikan kepada penulis.
7.
Bapak Prof. Dr. Warsito, DEA., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
8.
Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung atas seluruh ilmu yang telah diberikan kepada penulis selama mengikuti perkuliahan dikampus, semoga ilmu yang diberikan dapat bermanfaat.
9.
Keluargaku tercinta, Ang Ano, Mba Okta, Alia, Fi’i, Ang Mu dan Ang Tina, atas kebersamaannya.
10. Sahabat-sahabat terbaikku, Feiga Maharani (Ndut) dan Nindya Indah Pertiwi (Acil) atas persahatannya selama 10 tahun ini. Terima kasih sudah menjadi sahabat yang selalu ada disaat susah maupun senang, yang selalu menjadi tempat berbagi segala macam cerita dan selalu memberikan kepercayaan, motivasi, dorongan, bantuan, keceriaan, kegilaan, serta kenangan yang sangat berharga selama ini. Semoga Allah memberikan pertolongan dan membalas semua kebaikan.
11. Partner-ku, Erlita Aisyah dan Ruwaidah Muliana, atas kerja sama, kebersamaan, bantuan, dukungan, kegilaan dan motivasi yang sangat berharga selama penelitian. 12. Teman-teman Laboraturium Biokimia: Mba Windi, Kak Jeje, Mba Putri, Mba April, Mba Ana, Mba Uswatun, Kak Azis, Diani, Ayu Imani, Putri, Tira, Fifi, Meta, dan Rizal, atas kebersamaan, bantuan, dan kerja samanya selama penelitian. 13. Glucosamine’s group (Sofian, Edi, Arya, Dela, Kak Jeje, Mba Windi, Lita, dan Ruwai) atas kerjasama, bantuan, dan motivasinya. 14. Sahabat-sahabat Kak Fiona, Dewi, model Dwi, Lita, Ruwai, Ulfatun, Fenty, Ajeng, dan Intan atas kebersamaan, bantuan, dan motivasinya yang sangat berharga selama ini. 15. Teman-teman se-angkatan 2012: Adi setiawan, Aditian Sulung, Agus Ardiansyah, Ajeng Wulandari, Ana Maria Kristiani, Apri Welda, Arif Nurhidayat, Arya Rifansyah, S.Si, Atma Istanami, Ayu Imani, Ayu Setianingrum, Deborah Jovita, Derry Vardella, Dewi Aniatul Fatimah, Diani Iska Miranti, Dwi Anggraini, Edi Suryadi, Eka Hurwaningsih, Elsa Zulha, Erlita Aisyah, Febita Glysenda, Feby Rinaldo Pratama, Fenti Visiamah, S.Si, Ferdinand Haryanto Simangunsong, Fifi Adriyanthi, Handri Sanjaya, Indah Wahyu Purnama Sari, Indriyani Saney, Intan Mailani, Ismi Khomsiah, Jean Pitaloka, Jenny Jessica, Khoirul Anwar, Meta Fosfi Berliana, Muhamad Rizal Robani, Murni Fitria S.Si, Nila Amalin Nabila, Putri Ramadhona, Radius Uly Artha, Riandra Pratama Usman, Rifki Husnul Khuluk, Rizal Rio Saputra, Rizki Putriana, Ruliana Juni Anita, Ruwaidah Muliana, Siti Aisyah, Siti Nur
Halimah, Sofian Sumilat Rizki, S.Si, Sukamto, S.Si., Susy Isnaini Hasanah, Suwarda Dua Imatu Dela, S.Si, Syathira Assegaf, Tazkia Nurul, S.Si, Tiand Reno, Tiara Dewi Astuti, Tiurma Debora Simatupang,S.Si, Tri Marital, Ulfatun Nurun, Wiwin Esty Sarwita, Yepi Triapriani, Yunsi’u Nasyah, Zubaidi. 16. Seluruh Staff dan Karyawan di Jurusan Kimia FMIPA, terima kasih atas seluruh bantuan yang diberikan kepada penulis. 17. KKN Desa Mulya Jaya, Tulang Bawang Barat. 18. Seluruh keluarga besar Jurusan Kimia Angkatan 2011-2015. 19. Almamater tercinta, Universitas Lampung. 20. Semua pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Bandar Lampung, September 2016
Maria Ulfa
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................
iii
DAFTAR GAMBAR......................................................................................
iv
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ..................................................................................... B. Tujuan Penelitian.................................................................................. C. Manfaat Penelitian................................................................................
1 4 4
II. TINJAUAN PUSTAKA A. B. C. D. E. F. G. H. I. J. K.
Udang................................................................................................. Enzim ................................................................................................ Kitin ................................................................................................... Enzim Kitinase................................................................................... Enzim Kitin Deasetilase (CDA) ........................................................ Glukosamin ......................................................................................... Jamur Mucor miehei .......................................................................... Fermentasi.......................................................................................... Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) .................................. Ninhidrin ........................................................................................... Spektrofotometri UV-Vis ...................................................................
5 6 9 10 13 15 16 17 19 23 24
III. METODOLOGI PENELITIAN A.Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................... B. Alat dan Bahan ..................................................................................... C. Prosedur Penelitian............................................................................... 1. Persiapan Sampel ............................................................................. 2. Pembuatan Media ............................................................................ 2.1. Pembuatan Potato Extract ........................................................ 2.2 Media PDA (Potato Dextrose Agar) dan pertumbuhan Mucor miehei pada Media PDA ..........................................................
27 27 28 28 28 28 29
2.3. Media PDL (Potato Dextrose Liquid) dan pertumbuhan Mucor miehei pada Media PDL ........................................................... 3. Larutan Buffer Sitrat pH 4 ............................................................... 4. Pembuatan Media Inokulum Mucor miehei .................................... 5. Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) dengan Mucor miehei ............................................................................................... 6. Analisis Glukosamin dengan Spektrofotometer UV-Vis ................ 6.1 Pembuatan Standar Glukosamin .............................................. 6.2. Pembuatan Sampel Glukosamin ............................................... 6.3 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum ............................. 6.4 Kalibrasi Glukosamin Sampel....................................................
29 29 30 31 32 32 32 33 33
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. B. C. D.
Peremajaan Jamur Mucor miehei .........................................................
34
Fermentasi Kulit Udang dengan Mucor miehei ............................................ Uji Kualitatif Glukosamin dengan Ninhidrin ................................................ Analisis Glukosamin dengan Spektrofototmeter UV-Vis .............................
36 38 40
V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan ........................................................................................................ B. Saran ..............................................................................................................
46 47
DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................................
48
LAMPIRAN ..............................................................................................................
55
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
1.
Absorbansi Larutan Glukosamin Standar ...........................................................
57
2.
Absorbasni Larutan Glukosamin Hasil Fermentasi ............................................
57
3.
Konsentrasi Terukur Glukosamin Hasil Fermentasi ..........................................
58
4.
Jumlah Bobot Glukosamin Hasil Fermentasi .....................................................
59
5.
Kadar Kemurnian Glukosamin Hasil Fermentasi ..............................................
60
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1.
Struktur Kitin .....................................................................................................
9
2.
Reaksi pemutusan ikatan β-1,4 pada bagian internal mikrofibril kitin ..............
11
3.
Reaksi pembebasan unit-unit diasetilkitobiose oleh enzim eksokitinase ...........
12
4.
Reaksi pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dan menghasilkan monomer-monomer N-setilglukosmin ............................................................... 12
5.
Struktur glukosamin ...........................................................................................
15
6.
Reaksi antara ninhidrin dan asam amino ............................................................
23
7.
Skema kerja spektrofotometri UV-Vis ...............................................................
24
8.
Hasil Peremajaan Mucor miehei ........................................................................
35
9.
Hasil uji FeSO2.7H2O dan pepton dalam buffer sitrat pH 4 ...............................
38
10. Mekanisme reaksi ninhidrin-glukosamin membentuk kompleks ungu ..............
39
11. Hasil uji sampel dengan ninhidrin ......................................................................
40
12. Hasil scanning panjang gelombang maksimum larutan glukosamin standar dan sampel .........................................................................................................
41
13. Kurva standar glukosamin ..................................................................................
41
14. Struktur pepton ...................................................................................................
42
15. Grafik kadar glukosamin berbanding waktu inkubasi ........................................
43
1
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Udang adalah salah satu komoditas ekspor hasil perikanan terbesar di Indonesia. Udang biasanya diekspor dalam bentuk beku tanpa kulit dan kepala. Kulit dan kepala udang yang dibuang ini akan menumpuk dan menjadi sampah yang dapat merugikan lingkungan dan kesehatan. Padahal di dalam kulit dan kepala terdapat banyak kandungan-kandungan kimia yang dapat dimanfaatkan, seperti pembuatan glukosamin. Glukosamin dapat dibuat dari pemprosesan awal limbah kulit udang menjadi kitin.
Kitin adalah homopolimer dari β-1,4 N-asetil-D-glukosamin (GlcNAc) dan merupakan polimer yang terbanyak kedua di alam setelah selulosa. Senyawa ini ditemukan pada cangkang udang, kepiting, molusca, serangga, annelida, dan dinding sel alga dan jamur (Yurnaliza, 2002).
Monomer dari kitin adalah N-asetilglukosamin yang dihubungkan dengan ikatan glikosida pada posisi β-(1,4). Kitin mempunyai stuktur molekul berupa rantai lurus panjang (Yanming et al., 2001). Senyawa ini adalah zat padat yang tidak
2
larut dalam air, pelarut organik, alkali pekat, asam lemah dan larut dalam asamasam mineral pekat dan flouroalkohol.
Kitin dapat dihasilkan dari kulit udang melalui proses enzimatik, kimiawi, dan gabungan dari keduanya. Proses kimiawi dilakukan dengan menghilangkan mineralnya menggunakan asam dan penghilangkan protein menggunakan alkali yang dipanaskan. Proses enzimatik dapat dilakukan dengan reaksi enzimatik yang ramah lingkungan (Wibowo, 2006). Polisakarida ini dapat didegradasi secara enzimatik menjadi glukosamin dengan menggunakan enzim kitinase.
Kitinase disebut sebagai poli (1,4-β[2-asetamido-2-deoksi-glukosaminide] glikano hidrolase, adalah enzim yang mendegradasi kitin menjadi monomernya Nasetilglukosamin. Terdapat dua jalur degradasi kitin di alam oleh enzim kitinase. Jalur degradasi kitin yang pertama dimulai dengan hidrolisis ikatan β-(1,4) glikosida oleh enzim endokitinase sehingga terbentuk oligomer kitin. Oligomer kitin lalu dipecah menjadi dimer N-asetilglukosamin oleh enzim kitobiosidase dan menghasilkan monomer N-asetilglukosamin oleh enzim N-asetilglukosaminidase (kitobiase). Monomen N-asetilglukosamin mengalami deasetilasi menjadi glukosamin oleh enzim N-asetil-glukosamin-deasetilase. Jalur degradasi yang kedua adalah deasetilasi kitin menjadi kitosan oleh enzim kitin-deasetilase. Kitosan terdegradasi menjadi oligomer kitosan oleh enzim kitosanase. Setelah itu oligomer kitosan akan terdegrasi oleh enzim glukosaminidase menghasilkan glukosamin (Dinter et al., 2000).
3
Enzim kitinase dihasilkan oleh mikroorganisme kitinolitik. Menurut Schomburg dkk (1991), mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim kitinolitik adalah Mucor dan Actinomycetes. Mucor merupakan fungsi tipikal saprotrop pada tanah dan serasah tumbuhan yang mampu menghasilkan enzim kitindeasetilase pada substrat kitin atau kulit crustacea dan media cair yang mengandung nutrient yang diperlukan (Ratledge, 1993). Sedangkan pada Actinomycetes, enzim kitinolitik yang dikeluarkan berupa kitinase untuk mensintesis metabolit senyawa yang memiliki aktivitas biologis dan spora dari Actinomycetes sangan esensial untuk biokonversi (Xu et al., 1996).
Menurut penelitian tentang uji efektivitas fermentasi kitin menggunakan Mucor miehei yang dilakukan oleh Siti Oktavia R (2012), menjelaskan bahwa untuk pembuatan glukosamin dilakukan fermentasi selama 5 hari menghasilkan glukosamin sebesar 55 %. Penelitian yang dilakukan oleh Yahya Arianta (2014) tentang pengaruh penambahan konsentrasi inokulum dan media terhadap efektivitas fermentasi kitin dengan Mucor miehei untuk pembuatan glukosamin, menghasilkan glukosamin dengan kadar 92 % dalam waktu fermentasi 5 hari. Sedangkan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Chintia Yolanda (2014), yaitu penetapan waktu inkubasi optimum degradasi kitin dengan Mucor miehei untuk pembuatan glukosamin yang dilakukan selama 24 jam menghasilkan rendemen maksimum sebesar 90 %. Hal ini menunjukkan bahwa untuk membuat glukosamin, substrat kulit udang harus diproses menjadi polimer kitin terlebih dahulu sebelum didegradasi menjadi glukosamin.
4
Berdasarkan hal tersebut maka pada penelitian ini akan dilakukan isolasi glukosamin dari kulit udang tanpa proses pengubahan menjadi kitin dengan cara fermentasi oleh Mucor miehei dengan waktu inkubasi 24 jam. Glukosamin mempunyai gugus amina bebas sehingga akan bereaksi positif dengan reagen ninhidrin. Filtrat yang dihasilkan tersebut kemudian diuji dengan reagen ninhidrin dan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
B. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari dilakukannya penelitian ini adalah: 1.
Menguji glukosamin dari fermentasi serbuk kulit udang oleh Mucor miehei dengan reagen ninhidrin.
2.
Menentukan kadar glukosamin yang terbentuk setiap selang waktu 1 hari fermentasi.
C. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang kadar glukosamin yang terkandung dalam larutan hasil fermentasi kulit udang yang dibantu oleh Mucor miehei.
1
II.
TINJAUAN PUSTAKA
A. Udang
Udang termasuk hewan kelas Crustacea yang terdiri atas tiga bagian tubuh, yaitu kepala, dada, dan perut. Sebagian besar udang yang dihasilkan, diekspor ke luar negeri dalam bentuk udang beku yang telah dihilangkan kulitnya. Selama ini kulit udang tersebut hanya dimanfaatkan sebagai pakan ternak mengingat kandungan proteinnya masih cukup tinggi (Elsawati, 1994).
Kulit udang mengandung protein (25% - 40%), kalsium karbonat (45% - 50%), dan kitin (15% - 20%), tetapi besarnya kandungan komponen tersebut tergantung pada jenis udangnya (Foucher et al., 2009). Hal ini menyebabkan limbah kulit udang berpotensi sebagai bahan baku dalam memproduksi kitin. Selain itu, besarnya kandungan protein dan mineral ini dapat menurunkan kualitas dari kitin, sehingga dalam pemurnian kitin komponen tersebut perlu dihilangkan. Komponen-komponen tersebut perlu dihilangkan untuk menghasilkan produk kitin yang bermutu tinggi sehingga molekul-molekulnya menjadi lebih halus (Rohani, 2000).
6
B. Enzim
Enzim adalah protein yang mengkatalisa reaksi kimiawi spesifik. Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel. Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim-substrat yang bersifat sementara, yang terurai membentuk enzim bebas dan produknya. Bekerja dengan urut-urutan yang teratur, enzim mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana. Diantara sejumlah enzim yang berpartisipasi didalam metabolisme, terdapat sekelompok khusus yang dikenal sebagai enzim pengatur, yang dapat mengenali berbagai isyarat metabolik dan mengubah kecepatan katalitiknya sesuai dengan isyarat yang diterima. Melalui aktivitasnya, sistem enzim terkoordinasi dengan baik, menghasilkan suatu hubungan yang harmonis di antara sejumlah aktivitas metabolik yang berbeda, yang diperlukan untuk menunjang kehidupan (Lehninger, 1982). Enzim akan terdenaturasi pada suhu tinggi dan kondisi ekstrim lainnya seperti tinggi rendahnya pH atau tekanan, (Suhartono, 1989).
Enzim berperan sebagai biokatalisator dalam proses biokimia, baik yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel (Poedjiadi, 1994). Lehninger (1982) menambahkan bahwa enzim adalah katalisator sejati. Molekul ini meningkatkan dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung amat lambat. Enzim tak dapat mengubah kesetimbangan reaksi yang dikatalisisnya; enzim juga tak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini.
7
Menurut Manitto (1981), bahwa tiga sifat utama dari biokatalisator yaitu : dapat menaikkan kecepatan reaksi, memiliki kekhususan dalam reagen dan produk, dapat mengontrol kinetika reaksi.
Enzim yang diperoleh dari mikroorganisme lebih menguntungkan karena mikroorganisme dapat berkembang biak dengan cepat, tidak memerlukan lahan yang luas, biaya produksi relatif murah dan mudah dikontrol (Maggy, 1990). Fungsi terpenting dari enzim adalah kemampuannya menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Kemampuan enzim mendegradasi substrat dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, pH, serta suhu (Lehninger, 1982).
Protein adalah bagian utama enzim yang dihasilkan sel, maka semua yang dapat mempengaruhi protein dan sel akan berpengaruh terhadap reaksi enzimatik. Beberapa faktor penting yang mempengaruhi aktivitas enzim antara lain : 1. Substrat (reaktan) Pada konsentrasi substrat rendah, kecepatan reaksi yang terjadi rendah. Kecepatan reaksi akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Akan tetapi setelah peningkatan substrat lebih lanjut akan tercapai suatu laju maksimum. Pada keadaan substrat yang berlebih akan terjadi kejenuhan pembentukan kompleks enzim substrat sehingga sebagian besar substrat tidak diubah menjadi produk. Penambahan substrat lebih lanjut tidak berakibat terhadap laju reaksi.
8
2. Suhu Seperti reaksi kimia pada umumnya, maka reaksi enzimatik dipengaruhi oleh suhu. Jika suhu meningkat, maka laju reaksi juga akan meningkat. Karena enzim adalah protein, maka semakin tinggi suhu mengakibatkan proses enzim tidak aktif meningkat. Umumnya enzim mengalami kerusakan (denaturasi) pada suhu di atas 50o C. 3. Derajat keasaman ( pH ) Reaksi suatu enzim dipengaruhi oleh perubahan pH karena akan berakibat langsung terhadap sifat ion dari gugus–gugus amino dan karboksilat, sehingga akan mempengaruhi bagian aktif enzim dan konformasi dari enzim. pH yang terlalu rendah atau terlalu tinggi akan mengakibatkan denaturasi dari protein enzim. 4. Penghambat enzim (inhibitor) Inhibitor dapat meminimalkan kerja enzim karena akan membentuk ikatan dengan sisi aktif enzim sehingga mengganggu proses pembentukan dan kestabilan ikatan kompleks enzim substrat. Ada beberapa cara penghambatan enzim, seperti penghambat secara bersaing (kompetitif), penghambat tidak bersaing (non–kompetitif ), penghambat umpan balik (feed back inhibitor), dan penghambat alosterik (Lehninger, 1982).
9
C. Kitin
Kitin merupakan suatu polimer linier yang sebagian besar tersusun dari unit-unit β-(1→4)-2-asetamida-2-deoksi-β-D-glukopiranosa dan sebagian dari β-(1→4)-2amino-2-deoksi-β-D-glukopiranosa (Kumirska et al., 2010). Kitin terdistribusi luas di lingkungan biosfer seperti pada kulit crustacea (kepiting, udang, dan lobster), ubur-ubur, komponen struktur eksternal insekta, dinding sel fungi (2240%), alga, nematoda ataupun tumbuhan (Gohel et al., 2004). Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya berasosiasi melalui ikatan hidrogen yang sangat kuat antara gugus N-H dari satu rantai dengan gugus C=O dari rantai lain yang berdekatan. Ikatan hidrogen ini menyebabkan kitin tidak larut dalam air dan membentuk serabut (fibril) (Suryanto dan Yurnaliza, 2005).
Gambar 1. Struktur kitin (Murray et al., 2003)
Kitin berbentuk padatan amorf atau kristal, berwarna putih, dan dapat terurai secara hayati (biodegradable). Kitin bersifat tidak larut dalam air, asam anorganik encer, asam organik, alkali pekat dan pelarut organik tetapi larut dalam asam pekat seperti asam sulfat, asam nitrit, asam fosfat, dan asam format anhidrat. Kitin dalam asam pekat dapat terdegradasi menjadi monomernya dan memutuskan
10
gugus asetil (Einbu, 2007). Ketika derajat N-asetilasi (didefinisikan sebagai ratarata jumlah unit N-asetil-D-glukosamin per 100 monomer yang dituliskan sebagai persentase) kurang dari 50%, maka kitin dapat larut dalam larutan asam dan kemudian disebut kitosan (Pillai et al., 2009).
Kitin dapat diproduksi secara komersial dari limbah kulit udang dan cangkang kepiting (No et all., 2000). Kulit udang mengandung protein 25- 40 %, kalsium karbonat 45-50 %, dan kitin 15-20 %, tetapi besarnya kandungan komponen tersebut tergantung pada jenis udang dan tempat hidupnya. Cangkang kepiting mengandung protein 15,60-23,90 %, kalsium karbonat 53,70- 78,40 %, dan kitin 18,70-32,20 % yang juga tergantung pada jenis kepiting dan tempat hidupnya (Marganof, 2003).
D. Enzim Kitinase
Kitinase adalah enzim yang dapat mendegradasi kitin dengan memotong ikatan glikosidik dari polimer β-1,4 N-asetil-D-glukosamin. Proses degradasi ini menghasilkan monomer-monomer N-asetilglukosamin. Di alam, proses degradasi kitin dilakukan oleh mahluk hidup penghasil kitinase seperti jamur, bakteri, Actinomycetes, tumbuhan (Matsumoto, 2006), vertebrata, moluska, arthropoda, alga dan beberapa jenis cendawan (Funkhouser and Aronson 2007). Pada jamur, kitinase berperan dalam pengaturan fisiologis saat pembelahan sel, diferensiasi, dan aktivitas mikoparasit (Gohel et al., 2006). Bakteri memanfaatkan kitinase untuk asimilasi kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen (Wu et al., 2001). Selain
11
itu, kitinase juga digunakan hewan untuk mengkonversi kitin menjadi monomer dan oligomernya, dan tumbuhan untuk mendegradasi dinding sel fungi patogen (Gohel et al., 2006).
Harman et al., (1993) dan Sahai et al., (1993) membagi kitinase dalam tiga tipe yaitu : 1. Endokitinase (EC 3.2.1.14) yaitu kitinase yang memotong secara acak ikatan β1,4 bagian internal mikrofibril kitin. Produk akhir yang terbentuk bersifat mudah larut berupa oligomer pendek N-asetilglukosamin (GIcNAc) yang mempunyai berat molekul rendah seperti kitotetraose.
Gambar 2. Reaksi pemutusan ikatan β-1,4 pada bagian internal mikrofibril kitin
2. Eksokitinase (EC 3.2.1.14) dinamakan juga kitobiodase atau kitin 1,4-βkitobiodase, yaitu enzim yang mengatalisis secara aktif pembebasan unit-unit diasetilkitobiose tanpa ada unit-unit monosakarida atau polisakarida yang dibentuk. Pemotongan hanya terjadi pada ujung non reduksi mikrofibril kitin dan tidak secara acak.
12
Gambar 3. Reaksi pembebasan unit-unit diasetilkitobiose oleh enzim eksokitinase
3. β-1,4-N-asetilglukosaminidase (EC 3.2.1.30) merupakan suatu kitinase yang bekerja pada pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dengan menghasilkan monomer-monomer GIcNAc.
Gambar 4. Reaksi pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dan menghasilkan monomer-monomer N-asetilglukosamin.
Kitinase berguna dalam produksi kitooligosakarida. Kitooligosakarida berperan sebagai pertahanan tanaman, juga digunakan dalam kesehatan manusia. Sebagai
13
contoh, kitoheksosa dan kitoheptosa memperlihatkan aktivitas anti tumor. Nasetilglukosamin berguna sebagai obat anti inflamasi. Senyawa ini dalam tubuh manusia disintesis dari glukosa dan digabungkan dengan glikoprotein dan glikosaminoglikan (Patil et al., (2000). Kitinase juga berperan dalam produksi protein sel tunggal dari limbah kitin untuk makanan hewan. Kitinase juga dapat digunakan dalam pertanian sebagai pengendalian jamur patogen tanaman dan hama serangga. Kombinasi σ-toksin dan kitinase dilaporkan lebih efektif dalam membunuh hama serangga (Patil et al., (2000).
E. Enzim Kitin Deasetilase (CDA)
Kitin deasetilase (CDA) merupakan salah satu enzim pendegradasi kitin selain kitinase. Perbedaanya yaitu, kitinase adalah enzim yang dapat menghidrolisis kitin secara acak pada ikatan glikosidiknya, sedangkan kitin deasetilase adalah enzim yang dapat mengkonversi kitin menjadi kitosan. Degradasi kitin untuk menghasilkan kitosan dapat dilakukan secara termokimia dengan menggunakan alkali kuat pada suhu tinggi. Dengan menggunakan proses ini, hasil yang diperoleh belum memuaskan karena mutu kitosan yang dihasilkan masih beragam. Selain itu, proses termokimia juga menghasilkan limbah dan produk samping yang berpotensi menjadi toksikan bagi lingkungan.
Degradasi kitin untuk menghasilkan kitosan juga dapat dilakukan secara enzimatis yaitu menggunakan enzim kitin deasetilase (CDA). Keunggulan dari teknik ini yaitu lebih mudah dikendalikan, terurai secara biologis (biodegradable), sesuai
14
lingkungan (biocompatible) dan dapat membentuk oligomer atau polimer (Tsigos et al., 2000). Enzim kitin deasetilase (CDA) dapat ditemukan pada bakteri, kapang, kamir, cacing dan serangga yang mempunyai kandungan kitosan pada dinding sel atau eksoskeletonnya. Proses enzimatis diharapkan akan lebih mudah dikendalikan, lebih efisien, spesifik dan meminimalkan produk samping. Sejumlah penelitian telah dilakukan untuk mengisolasi, mempurifikasi dan mengkarakterisasi kitin deasetilase dari sejumlah mikroba. Aplikasi enzim ini pada berbagai jenis dan kondisi substrat masih memberikan hasil yang beragam dengan parameter hasil yang belum memuaskan (Tsigos et al., 2000).
Menurut Copeland ( 2000), kultur bakteri difermentasi dalam media produksi enzim selama 2 hari pada 55oC. Enzim dipanen dengan cara sentrifugasi pada 8000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC untuk memisahkan dari sel bakteri dan sisa media. Supernatan ditambahkan amonium sulfat sampai kejenuhan 80 % sambil distirrer. Selanjutnya campuran diendapkan selama semalam pada suhu 4 o
C, lalu disentrifugasi pada 8000 rpm selama 15 menit. Filtrat dilarutkan dalam
0,02 M buffer borat pH 8 dan disimpan pada suhu 4 oC. Kadar protein enzim diuji dengan metode Lowry (Copeland, 2000), menggunakan standar BSA dan ditentukan aktivitas enzim.
15
F. Glukosamin
Glukosamin (C6H13NO5) adalah gula mengandung amina yang diperoleh dari hasil hidrolisis kitin. Di alam, glukosamin tersebar luas sebagai komponen utama dari rangka luar Crustacea, Antropoda, dan cendawan. Glukosamin juga ditemukan di matriks tulang rawan sendi dan cairan sendi manusia, bahkan di hampir semua jaringan lunak dalam tubuh manusia, konsentrasi tertinggi di tulang rawan ( Miller, 2011). Pada manusia, glukosamin sebagai salah satu komponen biosintesis glikosaminoglikan (GAG). GAG ini akan berikatan secara kovalen pada inti protein proteoglikan, salah satu komponen matriks jaringan kartilago yang akan menjaga integritas struktur dan fungsi jaringan kartilago. Glukosamin yang diproduksi oleh tubuh berada dalam bentuk glukosamin-6-fosfat dan dihasilkan dari glukosa yang mengikuti jalur biosintesis heksosamin (Oegema et al., 2002). Keberadaan glukosamin di dalam tubuh memiliki peranan penting untuk kesehatan dan kelenturan sendi (EFSA, 2009).
Gambar 5. Struktur glukosamin
Glukosamin merupakan prekusor utama untuk biosintesis berbagai makromolekul seperti asam hialuronat, proteoglikan, glikosaminoglikan (GAGs), glikolipid, dan
16
glikoprotein. Secara struktural glukosamin adalah basa lemah sehingga sediaan glukosamin yang beredar harus distabilkan dalam bentuk garam. Glukosamin ditemukan dalam berbagai bentuk seperti glukosamin sulfat, hidroklorida, Nasetilglukosamin atau garam klorohidrat, dan isomer dekstraoratorik ( Persiani et al., 2005). Glukosamin juga ditemukan dipasaran dalam bentuk glukosamin hidroklorida (HCl), cocrystals atau coprecipitates glukosamin sulfat dan kalium atau natrium klorida ( Dahmer, 2008).
G. Jamur Mucor miehei
Jamur adalah sekelompok organisme yang digabungkan dalam takson Kingdom Fungi berdasarkan sistem Whitaker. Kingdom fungi mempunyai ciri khas yaitu bersifat heterotrof yang mengabsorbsi nutrien dan memiliki kitin pada dinding selnya. Jamur benang atau kapang adalah golongan fungi yang membentuk lapisan jaringan miselium dan spora yang tampak. Miseliumnya terdiri dari filamen tubular yang tumbuh yaitu hifa (Singleton dan Sainsbury, 2006). Jamur dapat bersifat sapotrof yaitu dengan mendapatkan nutrisi dari organisme lain yang telah mati, ada juga yang bersifat parasit dengan mengisap nutrisi dari organisme lain yang hidup, atau dengan bersimbiosis mutualisme dengan satu organisme (Sadava, 2003).
Fungi mempunyai penggunaan kitin yang berbeda dengan hewan. Hewan hanya memproduksi kitin pada bagian tertentu, misalnya sebagai rangka luar, rambut, atau kuku, sementara fungi memiliki kitin sebagai pembentuk dinding pada
17
seluruh selnya. Adanya kitin juga membantu membedakan antara fungi dan eukariota lainnya, seperti protista (Sadava, 2003).
Mucor adalah genus fungi yang berasal dari ordo Mucorales yang merupakan fungi tipikal saprotrop pada tanah dan serasah tumbuhan yang mampu menghasilkan enzim kitindeasetilase pada substrat kitin atau kulit Crustaceae dan media cair yang mengandung nutrien yang diperlukan. Mucor berkembang biak secara aseksual dengan membentuk sporangium yang ditunjang oleh batang yang disebut sporangiofor. Hifa vegetatifnya bercabang-cabang, bersifat senositik dan tidak bersepta. Ciri khas pada Mucor adalah memiliki sporangium yang berkolom-kolom atau kolumela (Singleton dan Sainsbury, 2006).
Mucor miehei sebagai salah satu anggota ordo Mucorales mempunyai talus yang berupa miselium yang lebat. Pembiakkan aseksual dilakukan dengan spora tak berflagel (Aplanospora). Aplanospora terbentuk dalam sporangium dan sporangium terletak pada ujung sporangiofor atau pada ujung cabang-cabangnya. Pembiakkan seksual pada Mucorales berlangsung dengan bersatunya dua gametangium yang berinti banyak. Gametangium terbentuk pada ujung hifa atau ujung cabang hifa (Dwidjoseputro, 1976).
H. Fermentasi
Fermentasi merupakan suatu proses yang melibatkan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk. Mikroorganisme yang biasa digunakan dalam proses
18
fermentasi yaitu bakteri, khamir dan kapang. Fermentasi pada bahan makanan, dapat meningkatkan nilai gizi bahan yang berkualitas rendah dan berfungsi dalam antinutrisi atau racun yang terkandung dalam suatu bahan makanan.
Fermentasi merupakan reaksi oksidasi reduksi yang menggunakan sumber energi dan sumber karbon, nitrogen dan pospor untuk membentuk senyawa yang mempunyai nilai ekonomi lebih tinggi serta terakumulasi dalam medium. Proses fermentasi disebabkan oleh organisme atau hasil metabolisme (Rao, 2009).
Menurut Pujaningsih (2005) faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan substrat fermentasi, adalah :
a. Kontinyuitas ketersediaan, yaitu tersedia substrat sepanjang tahun sehingga dapat disimpan dalam beberapa bulan, mutu dan komposisi relatif tetap.
b. Sifat fermentasi substrat harus dapat difermentasikan, contoh pada Tichoderma viridae yang hanya tumbuh baik pada substrat selulosa (jerami padi), tetapi tidak dapat tumbuh pada bungkil kelapa.
c. Harga substrat ekonomis dan dapat digunakan sesuai kebutuhan.
Menurut Rusmana (2008), fermentasi dibedakan menjadi dua berdasarkan cara operasinya, yaitu :
19
1. Fermentasi media cair Fermentasi media cair merupakan fermentasi yang melibatkan air sebagai fase kontinyu dari sistem pertumbuhan sel yang bersangkutan atau substrat baik sumber karbon maupun mineral terlarut atau tersuspensi sebagai partikelpartikel dalam fase cair. Contoh produk dari fermentasi media cair, seperti etanol, sel tunggal, antibiotik, pelarut organik, kultur starter, dekomposisi selulosa, beer, glukosa isomerase, pengolahan limbah cair dan sebagainya.
2. Fermentasi media padat Fermentasi media padat merupakan proses fermentasi yang berlangsung dalam substrat yang tidak terlarut dan tidak mengandung air. Contoh produk fermentasi media padat yaitu tape, tempe, oncom, koji, berbagai olahan ikan fermentasi dan sebagainya.
I.
Fermentasi Fase cair Sistem Tertutup (Batch)
Fermentasi merupakan proses dimana komponen-komponen kimiawi dihasilkan sebagai akibat adanya pertumbuhan maupun metabolisme mikroba yang mencakup proses aerob dan anaerob. Fermentasi dapat meningkatkan nilai gizi bahan yang berkualitas rendah sehingga berfungsi dalam pengawetan bahan dan merupakan suatu cara untuk menghilangkan zat antinutrisi atau racun yang terkandung dalam suatu bahan makanan. Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan dan kultur terendam (submerged). Medium kultur permukaan dapat berupa medium padat maupun medium cair. Sedangkan kultur
20
terendam dilakukan dalam media cair menggunakan bioreaktor yang dapat berupa labu yang diberi aerasi, labu yang digoyang dengan shaker atau fermentor.
Kondisi yang optimum untuk fermentasi tergantung pada jenis mikroorganisme yang digunakan. Pengendalian faktor-faktor fermentasi bertujuan untuk menciptakan kondisi yang optimum bagi pertumbuhan dan produksi metabolit yang diinginkan dari suatu mikroorganisme tertentu. Fermentasi medium cair lebih memungkinkan adanya pengendalian faktor-faktor fisik dan kimia yang mempengaruhi proses fermentasi seperti suhu, pH, dan kebutuhan oksigen (Ton et al.,2010).
Fermentasi medium cair dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu fermentasi tertutup (batch culture) dan fermentasi kontinyu (fed batch). Pada fermentasi tertutup, setelah inokulasi tidak dilakukan lagi penambahan medium kedalam fermentor, kecuali pemberian oksigen (udara steril), antibuih dan asam atau basa yang mengatur pH. Karena itu pada sistem tertutup ini, dengan sekian lamanya waktu fermentasi, laju pertumbuhan spesifik mikroorganisme semakin menurun sampai akhirnya pertumbuhan terhenti. Penurunan dan berhentinya pertumbuhan disebabkan karena dengan semakin bertambahnya waktu fermentasi nutriennutrien esensial dalam medium semakin berkurang atau terjadi akumulasi autotoksin yang mempengaruhi laju pertumbuhan atau kombinasi dari keduanya. Dengan demikian pada fermentasi tertutup jumlah sel pada fase stationer merupakan jumlah sel maksimum.
21
1.
Proses Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) Menurut Mitchel et al., (2006) tahapan–tahapan proses secara umum, antara lain : a. Persiapan substrat, dimana substrat harus dipotong, digiling, dipecahkan, atau dibuat menjadi butiran kecil. Dengan penambahan air dan nutrisi disebut dengan pra-perawatan substrat untuk menambah ketersediaan gizi. b. Persiapan inokulum, tipe dan persiapan inokulum tergantung pada mikroorganisme yang digunakan. Banyak proses fermentasi batch melibatkan bakteri, jamur dan salah satunya Actinomycetes maka digunakan spora hasil inokulasi. Tujuan dari langkah ini untuk mengembangkan sebuah inokulum dengan tingkat kelangsungan hidup mikoorganisme yang tinggi. c. Persiapan wadah, dimana wadah harus dibersihkan setelah fermentasi sebelumnya dan perlu disterilkan sebelum penambahan substrat. d. Inokulasi dan pengerjaan, pengerjaan tahapan ini dengan menyebarkan substrat pada media yang telah disterilkan secara hati–hati untuk menghindari kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. e. Proses fermentasi batch, pada proses ini banyak hal yang harus diperhatikan antara lain pH medium, suhu, dan waktu inkubasi. f. Kultivasi, pada tahapan ini memerlukan bantuan mekanis untuk memisahkan substrat padat dari medium. Penggunaan kertas saring dan sentrifugasi dapat dipakai untuk memisahkan substrat.
22
2.
Keuntungan Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) Dibandingkan dengan medium padat, medium cair memiliki beberapa kelebihan, yaitu (Weites et al.,2001): a. Jenis dan konsentrasi komponen-komponen dapat diatur sesuai dengan yang diinginkan. b. Dapat memberikan kondisi yang optimum untuk pertumbuhan. c. Pemakaian medium lebih efisien.
3.
Aplikasi Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) Menurut Holker et al. (2004) dan Pandey (2000) dapat menguraikan aplikasi dari fermentasi batch secara tradisional, antara lain : a. Bir, minuman beralkohol. Sari buah yang diberi Saccaromyces cereviciae kemudian diinkubasikan didapatkan minuman beralkohol. b. Yoghurt,diproduksi dengan cara memfermentasikan air susu dengan bakteri bukan khamir. Biasanya menggunakan campuran Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus. Bakteri mengubah laktosa (gula susu) pada kondisi anaerobik. Laktosa diubah menjadi asam laktat yang bersifat menggumpalkan kasein (protein susu). c. Keju, berbagai jenis bakteri dapat digunakan untuk fermentasi susu menjadi keju, tergantung dari jenis keju yang dihasilkan. Biasanya digunakan spesies Streptococcus thermophillus dan Lactobacillus bulgaricus. Enzim yang diperlukan untuk menghasilkan keju adalah rennet yang mengandung cymosin yang bersifat menggumpalkan casein.
23
J.
Ninhidrin
Uji Ninhidrin digunakan untuk identifikasi asam amino bebas yang terdapat dalam sampel. Asam amino bebas adalah asam amino yang gugus aminonya tidak terikat. Ninhidrin adalah reagen yang berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Senyawa ini merupakan hidrat dari triketon siklik dan bila bereaksi dengan asam amino akan menghasilkan zat warna ungu. Hanya atom nitrogen dari zat warna ungu yang berasal dari asam amino, selebihnya terkonversi menjadi aldehid dan karbondioksida. Jadi, zat warna ungu yang sama dihasilkan dari semua asam amino α dengan gugus amino primer dan intensitas warnanya berbanding lurus dengan konsentrasi asam amino yang ada (Hart 2003).
Gambar 6. Reaksi antara ninhidrin dan asam amino (Wu et al, 2005).
24
K. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometer terdiri atas spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditranmisikan atau yang diabsorpsi. Spektrofotometer tersusun atas sumber spektrum yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat untuk mengukur pebedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun pembanding (Khopkar, 2002).
Spektroskopi UV-Vis melibatkan absorpsi radiasi elektromagnetik dari kisaran 200-800 nm dan kemudian eksitasi elektron ke tingkat energi lebih tinggi. Absorpsi cahaya ultraviolet/tampak oleh molekul organik terbatas hanya untuk beberapa gugus fungsi (kromofor) yang mengandung elektron valensi dari energi eksitasi yang rendah. Spektrum UV-Vis merupakan spektrum yang kompleks dan nampak seperti pita absorpsi berlanjut, hal ini dikarenakan gangguan yang besar dari transisi rotasi dan vibrasi pada transisi elektronik memberikan kombinasi garis yang tumpang tindih (overlapping) (Hunger and Weitkamp, 2001).
Gambar 7. Skema kerja spektrofotometri UV-Vis (Anonim, 2015)
25
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri ultraviolet (Rohman, 2007), yaitu:
1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Panjang gelombang yang digunakn untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang dimana terjadi absorbansi maksimum. Untuk memperoleh panjang gelombang serapan maksimum dapat diperoleh dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku dengan konsentrasi tertentu.
2. Pembuatan kurva kalibrasi Dilakukan dengan membuat seri larutan baku dalam berbagai konsentrasi kemudian asorbansi tiap konsentrasi di ukur lalu dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Kurva kalibrasi yang lurus menandakan bahwa hukum Lambert-Beer terpenuhi.
3. Pembacaan absorbansi sampel Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitan. Hal ini disebabkan karena pada kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal.
Spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel yang berupa larutan, gas, atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan pelarut yang dipakai (Mulja dan Suharman, 1995), antara lain:
26
1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya dan tidak berwarna. 2. Tidak berinteraksi dengan molekul senyawa yang dianalisis. 3. Kemurniannya harus tinggi untuk analisis.
27
III.
METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilaksanakan pada Februari sampai dengan Juni 2016, dengan tahapan kegiatan, yaitu: pengambilan sampel limbah kulit udang dari pengumpul udang di kecamatan Teluk Betung, Bandar Lampung, analisis glukosamin dilakukan di Laboratorium Biokimia, Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Dalam penelitian ini alat-alat yang akan digunakan adalah peralatan gelas Pyrex, termometer, neraca digital Wiggen Houser, Laminar Air Flow, autoclave, IncubatorMemmer-Germany/INCO2, Shaker Incubator Biosan/ES-20/60, Centrifuge Hitachi/CF 16 RX II, dan spektrofotometer UV-Vis.
Adapun bahan-bahan yang akan digunakan adalah serbuk kulit udang, glukosamin standar produk WAKO Jepang, kentang, agar for microbiology, dekstrosa, laktosa, bakto pepton, amonium sulfat ((NH4)2SO4), urea, kalium hidrogen sulfat (KHSO4), besi (II) sulfat heptahidrat (FeSO4.7H2O), kalsium klorida (CaCl2.2H2O), seng (II) sulfat heptahidrat (ZnSO4.7H2O), asam sitrat, natrium
28
sitrat, isolat Mucor miehei, kertas saring, aquades, ninhidrin, NaH2PO4.7H2O dan Na2HPO4.
C. Prosedur Penelitian
1.
Persiapan Sampel
Limbah kulit dan kepala udang dipisahkan dari badannya, dibersihkan dan dicuci dengan menggunakan air. Kulit dan kepala udang direbus selama ± 15 menit, lalu ditiriskan. Selanjutnya kulit dan kepala udang dijemur dibawah sinar matahari hingga kering, lalu dihancurkan hingga menjadi bubuk halus dan siap digunakan.
2. Pembuatan Media 2.1 Pembuatan Potato Extract
Sebanyak 200 gram kentang dikupas kulitnya lalu dipotong seperti dadu dan direbus dalam 1000 mL akuades selama 1 jam setelah mendidih. Setelah kondisi tercapai, disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh ekstrak kentang yang bening. Ekstrak kentang disimpan dalam botol reagen lalu disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121˚C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Ekstrak kentang yang telah disterilisasi, didinginkan pada suhu kamar kemudian disimpan dalam lemari pendingin (kulkas) (DZMZ, 2015).
29
2.2 Media PDA (Potato Dextrose Agar) dan Pertumbuhan Mucor miehei pada Media PDA
Sebanyak 100 mL potato extract ditambahkan 4 gram dekstrosa dan 3 gram agar dalam labu Erlenmeyer 250 mL lalu disterilisasikan dengan autoclave pada suhu 121˚C dan tekanan 2 atm selama 20 menit (DSMZ, 2015). Setelah itu media PDA ini di-UV selama 10 menit dalam Laminar Air Flow dan dituang ke dalam cawan petri. Strain jamur Mucor miehei ditumbuhkan kurang lebih selama 5 hari sampai spora jamur ini tumbuh (Alves et al., 2005).
2.3 Media PDL (Potato Dextrose Liquid) dan Pertumbuhan Mucor miehei pada Media PDL
Sebanyak 100 mL potato extract ditambahkan 4 gram dekstrosa dalam labu Erlenmeyer 250 mL lalu disterilisasikan dengan autoclave pada suhu 121˚C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Setelah itu media PDL ini di-UV selama 10 menit dalam Laminar Air Flow. Spora kultur 5 hari dipisahkan dan dimasukkan dalam media PDL dan diletakkan dalam shaker incubator dengan kecepatan 175 rpm pada suhu 30˚C selama ± 5 hari (Alves et al., 2005).
3.
Larutan Buffer Sitrat pH 4
Sebanyak 0,96 gram asam sitrat dilarutkan dalam 50 mL akuades dalam labu takar 50 mL dan dikocok hingga homogen. Larutan ini merupakan larutan stok A. Kemudian dilarutkan sebanyak 0,65 gram natrium sitrat dalam 25 mL akuades
30
dalam labu volumetrik 25 mL dan dikocok hingga homogen. Larutan ini merupakan larutan stok B.
Sebanyak 33 mL larutan stok A (asam sitrat 0,10 M) dan 17 mL larutan stok B (natrium sitrat 0,10 M) dilarutkan dalam 100 mL akuades dalam labu volumetrik 100 mL dan kemudian dicek pH-nya. Ini merupakan larutan buffer sitrat pH 4 (Mardiana, 2002).
4.
Pembuatan Media Inokulum Mucor miehei
Sebanyak 0,1 gram serbuk kulit udang dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer 100 mL, kemudian ditambahkan 0,01 gram laktosa; 0,03 gram bakto pepton; 0,14 gram amonium sulfat; 0,03 gram urea; 0,2 gram kalium dihidrogen sulfat; 0,03 gram besi (II) sulfat heptahidrat; 0,03 gram kalsium klorida; dan 0,029 gram seng (II) sulfat heptahidrat, serta dilarutkan dalam 10 mL buffer sitrat pH 4. Selanjutnya campuran diaduk sampai homogen lalu disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121˚C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Kemudian media didinginkan pada suhu ruang dalam Laminar Air Flow. Sebanyak 1 mL kultur awal dari media PDL diinokulasikan ke dalam media ini dan difermentasi pada 30˚C dalam shaker-incubator dengan kecepatan 250 rpm selama 7 hari (Chahal et al., 2001).
31
5.
Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) dengan Mucor miehei
Fermentasi batch dilakukan dengan menggunakan Shaker Incubator sistem tertutup. Substrat yang digunakan adalah serbuk kulit udang. Sebanyak 1 gram serbuk kulit udang dimasukkan dalam labu erlenmeyer 100 ml yang berisi 0,01 gram laktosa; 0,03 gram bakto pepton; 0,14 gram amonium sulfat; 0,03 gram urea, 0,2 gram kalium dihidrogen sulfat; 0,03 gram besi (II) sulfat heptahidrat; 0,03 gram kalsium klorida; dan 0,029 gram seng (II) sulfat heptahidrat, serta dilarutkan dalam 10 mL buffer sitrat pH 4. Media fermentasi ini dibuat 5 replikat. Selanjutnya media disterilisasi dengan autoklaf pada 2 atm temperatur 121oC selama 20 menit. Kemudian media didinginkan pada suhu ruang dalam Laminar Air Flow. Sebanyak 10 mL starter diinokulasikan ke dalam media ini dan difermentasi pada 30˚C dalam shaker-incubator dengan kecepatan 250 rpm selama 1-5 hari (Chahal et al., 2001).
Sejumlah hasil dari fermentasi batch, pada tiap selang waktu 1 hari, dipanaskan dengan waterbath pada suhu 70oC selama 45 menit. Kemudian dicampurkan dengan 5 ml akuades dengan membiarkan labu erlenmeyer pada rotary shaker selama 1 jam pada 200 rpm. Campuran disaring menggunakan kertas saring dan filtrat disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Semua filtrat yang diperoleh, dibekukan dalam freezer selama 24 jam.
32
6.
Analisis Glukosamin dengan Spektrometer UV-Vis
Analisis glukosamin menggunakan spektromoter ultraviolet-visible (UV-Vis) dilakukan setelah didapat filtrat hasil fermentasi.
6.1 Pembuatan Standar Glukosamin Sebanyak 0,05 gram glukosamin (Glc) standar WAKO dilarutkan dalam 50 ml akuades dalam labu ukur diperoleh konsentrasi akhir 1000 mg/L. Kemudian larutan glukosamin standar 1000 mg/L ini diencerkan hingga diperoleh konsentasi akhir msing-masing 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, dan 150 mg/L. Dari berbagai konsentrasi larutan standar ini, masing-masing diambil 4 ml lalu ditambahkan 0,5 ml larutan ninhidrin 0,8 % dan 0,5 ml larutan buffer fosfat pH 6. Larutan ini kemudian dipanaskan pada 100oC dalam penangas selama 15 menit. Setelah terbentuk warna ungu, larutan didiamkan dalam suhu kamar dan diukur dengan spektrofotomer UV-Vis pada panjang gelombang 570 nm (Wu et al., 2005).
6.2 Pembuatan Sampel Glukosamin Filtrat hasil fermentasi masing-masing diambil dan diencerkan sebanyak 30 kali dengan akuades. Larutan tersebut diambil 4 ml lalu ditambahkan 0,5 ml larutan ninhidrin 0,8 % dan 0,5 ml larutan buffer fosfat pH 6. Larutan ini kemudian dipanaskan pada 100oC dalam penangas selama 15 menit. Reaksi antar glukosamin dengan ninhidrin menghasilkan warna ungu, larutan didiamkan dalam
33
suhu kamar dan diukur dengan spektrofotomer UV-Vis pada panjang gelombang 570 nm.
6.3 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum Pemilihan panjang gelombang (λ) maksimum dilakukan menggunakan larutan glukosamin standar dan hasil fermentasi yang telah direaksikan dengan larutan ninhidrin 0,8% dan buffer fosfat pH 6. Kemudian dilakukan scanning menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada rentang panjang gelombang (λ) 450-600 nm.
6.4 Kalibrasi Glukosamin Sampel Absorbansi glukosamin dalam sampel dikalibrasikan dengan kurva glukosamin (Glc) standar menggunakan persamaan regresi linear. Hasil yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi glukosamin dalam larutan hasil fermentasi tiap selang waktu 5 hari.
47
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut. 1.
Mucor miehei memiliki potensi untuk mendegradasi kulit udang menjadi glukosamin tanpa harus merubahnya menjadi kitin.
2.
Waktu inkubasi optimum fermentasi kulit udang dengan Mucor miehei adalah hari keempat dengan kadar kemurnian glukosamin dalam sampel kulit udang, yaitu pada hari keempat sebesar 4,1442 %.
3.
Kadar kemurnian glukosamin yang dihasilkan dengan menggunakan substrat kulit udang lebih rendah dibandingkan dengan kitin karena masih terkandung protein dan mineral lain.
4.
Reagen ninhidrin memberikan reaksi positif terhadap glukosamin sehingga dapat digunakan untuk analisis spektrofotometri UV-Vis.
47
B. Saran
Dari hasil penelitian yang diperoleh, maka disarankan untuk memvalidasi adanya glukosamin dalam produk fermentasi menggunakan HPLC-ELSD agar didapat hasil kromatogram kemurnian glukosamin, serta melakukan proses deproteinasi dan demineralisasi agar kadar glukosamin maksimal.
44
DAFTAR PUSTAKA
Acumedia Manufacture. 2011. Potato Dextrose Agar (7149). Technical Service or questions involving dehydrated culture media preparation. Alves, Maria Helena, Galba M. De Campos-Takaki, Kaoru Okada, Ines Helena Ferreira Pessoa, and Adauto Ivo Milanez. 2005. Detection of extracellular protease in Mucor species. Rev Iberoam Micol. Vol. 22, pp. 114-117. Anonim. 2015. Spektrofotometri UV-Vis. http://www.valdisreinaldo.blogspot.com. Diakses pada tanggal 10 Desember 2015.
Anonim. 2016. Does the Size of a Substrate Affect How Quickly an Enzyme Acts?. http://education.seattlepi.com/size-substrate-affect-quickly-enzyme-acts5333.html. Diakses pada tanggal 16 Agustus 2016. Ariyanta, Yahya. 2014. Pengaruh Penambahan Konsentrasi Inokulum dan Media Fermentasi terhadap Efektivitas Fermentasi Kitin dengan Mucor miehei untuk Pembuatan Glukosamin (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Chahal, P. S., D. S. Chahal, and G. B. B. Lee. 2001. Production of Cellulose in Solid State Fermentation with Trichorderma reesi MCG 80 on Wheat Straw. Applied Biochemistry and Biotechnology. Vol. 57-58, pp. 433-441.
Copeland, R.A. 2000. Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols. Chapman and Hall. New York.
49
Dahmer, M., and Schiller, R. M. 2008. Glucosamine. American Family Physician Ann Intern Med. 2008;78:470-476.Dinter, S., U. Bunger, and E. Siefert. 2000. Enzymatic Degradation of Chitin by Microorganisms. In: Advances in Chitin Science.Universitat Potsdam Druckhaus Schmergow. Germany.
Dwidjoseputro, D. 1976. Pengantar Mikologi. Alumni. Bandung. 70 halaman.
DSMZ. 2015. DSMZ: List of Media for Microorganisms. https://www.dsmz.de/catalogues/catalogue-microorganisms/culturetechnology/list-of-media-for-microorganisms.html. Diakses pada 1 Desember 2015.
EFSA [European Food Safety Authority]. 2009. Scietific Opinion on the substantion of a health claim related to glucosamine hydrochloride and reduced rate of cartilage degeneration and reduced risk of development of osteoarthritis pursuant. Parma, Italy. European Food Safety Authority 7(10): 1358.
Elsawati, E. 1994. Limbah Udang Dibuang Sayang. Techner12. Bogor. Hlm. 19.
Einbu, A. 2007. Characterisation of Chitin and a Study of Its Acid-Catalyzed Hydrolysis, Thesis for The Degree of Philosophiae Doctor. Norwegian University of Science and Technology. Dept. of Biotechnology. Noorwegian.
Foucher, J.P., G.K. Westbrook, A. Boetius, S. Ceramicola, S. Dupre, J. Mascle, J. Mienert, O. Pfannkuche, C. Pierre, and D. Praeg. 2009. Structure and Drivers of Cold Seep Ecosystems. Oceanography, 22: 92-109.
Funkhouser, J., D. & Aronson, N., N. 2007. Chitinase family GH18: Evolutionary Insights From The Genomic History Of A Diverse Protein Family. BMC Evol Biol 7: 96-111.
Gohel, V., P. Vyas, and H. S. Chhatpar. 2006. Activity staining method of chitinase on chitin agar plate through polyacrylamide gel electrophoresis. African Journal of Biotechnology. Vol. 4, pp. 87-90.
50
Harman, G.E., Crown K.H., Mitchel L., Ray M.B., Alexander D.P., Candy P., and Andrew T.. 1993. Chitinolitic Enzyme of Trichoderma hazianum: Purification of Chitobiosidase and Endochitinase Phytopathology, 2(83):313318.
Hart, H., Craine, L.E. and Hart.D.J., 2003. Kimia Organik Edisi Kesebelas. Erlangga. Jakarta.
Holker, U., M. Hofer, and J. Lenz. 2004. Biotechnological Advantages of Laboratory-Scale Solid State Fermentation with Fungi. Journal of Applied Microbiology and Biotechnology,64:175–186.
Hunger, M. and J. Weitkamp. 2001. In situ IR, NMR, EPR, and UV/Vis Spectroscopy: Tool for New Insight into the Mechanisms of Heterogeneous Catalysis. Angew-Chem Int Ed Engl. Vol. 49, pp. 2954-2971.
Khopkar, S. M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Swadaya. Jakarta.
Kumirska, J., M. X. Weinhold, J. Thoming, and P. Stepnowski. 2011. Biomedical activity of chitin/chitosan based materials influence of physicochemical properties apart from molecular weight and degree of acetylation. Polymers. Vol 3, pp. 1875-1901.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta. Hlm. 84-89.
Maggy, L.T. 1990. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.
Manitto, P. 1981. Biosintesis Produk Alami. Terjemahan Koensoemardiyah. Ellis Horwood Limited Publishers, Chichester.
Mardiana. 2002. Studi Pendahuluan Kitosans Secara Fermentasi Menggunakan Mucor miehei pada Media Kitin dari Kulit Udang Windu (Penaeus monodon) (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Marganof. 2003. Potensi Limbah Udang sebagai Penyerap Logam Berat (Timbal, kadmium dan tembaga) di perairan.
51
http://www.prodiikelautanunirow.blogspot.com. Diakses pada 15 nopember 2015.
Mas’ud, Fajriyati. 2013. Media, Isolasi, Sterilisasi, Peremajaan, dan Penyimpanan Mikroba. PPT.
Matsumoto, K.S. 2006. Fungal Chitinases, In : Guevara-Gonzales R.G and Torres-Pacheco I (Eds). Advances in Agricultural and Food Biotechnology. Reseach Signpost, India. 289-304.
Miller, K.L., and Clegg, D.O. 2011. Glucosamine and chondroitin sulfate. Rheum Dis Clin N Am. 2011; 37:103–18.
Mitchel, D., N. Krieger, and M. Berovic. 2006. Solid-State Fermentation Bioreactors. Springer-Verlag Berlin. Heidelberg.
Mulja, M. dan Suharman. 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya. Hlm.121-123.
Murray, T. A. and Sandford. 2003. Chitin and Chitosan: Sources, Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Application. Elsevier Applied Science. London, pp. 561.
No, H.K., Meyers, S.P., and Lee, K.S. 2000. Isolation and Characterization of Chitin from Crawfish Shell Waste, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1989, 37(3), 575-579.
Oegema, Theodore R., et al. 2002. Effect of Oral Glucosamin on Cartilage and Meniscus in Normal and Chymopapain-Injected Knees of Young Rabbits. Arthritis and Rheumatism. 46 (9) : 2495-2503.
Pandey, A., C. Soccoll, and D. Mitchell. 2000. New Developments in Solid-State Fermentation: I – Bioprocesses and Products. Journal of Process Biochemistry, 35: 1153–1169.
52
Patil, R.S., V. Ghormade, and M.V. Deshpande. 2000. Chitinolytic Enzymes: An Exploration. Journal of Enzyme and Microbial Technology, 26: 473-483.
Persiani, S., Roda, E., Rovati, L.C., Locatelli, M., Giacovelli, G., and Roda, A. 2005. Glucosamine oral bioavailability and plasma pharmacokinetics after increasing doses of crystalline glucosamine sulfate in man. Osteoarthritis Cartilage. 2005;13:1041-46.
Pillai, C.K.S., Paul W., Sharma, C.P. 2009. Chitin and Chitosan Polymers: Chemistry, Solubility and Fiber Formation. Program Polymer Science. 34: 641-678.
Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta. Hlm. 472.
Pujaningsih, R. 2005. Teknologi Fermentasi dan Peningkatan Kualitas Pakan.(Skripsi). Universitas Diponogoro. Semarang.
Rao, K. 2009. Fermentation Biotechnology. http://www.fbae.org. Diakses pada 15 Nopember 2015.
Ratledge, C. 1993. Biochemistry of Microbial Degradation. Kluwer Academic.
Rohani, N. 2000. Deproteinasi Kulit Udang Windu Menggunakan Isolat Bakteri Bacillus sp. (Skripsi). Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis : Spektrofotometri UV dan Tampak (visibel). Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
Rumapea, Siti O. 2012. Uji Efektivitas Fermentasi Kitin Bertahap Menggunakan Mucor miehei dan Actinomycetes ANL-4 untuk Pembuatan Glukosamin (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Rusmana, I. 2008. Sistem Operasi Fermentasi. Departemen Biologi FMIPA IPB. Bogor.
53
Sadava, Purves. 2003. Life The Science of Biology Seventh Edition, Taylor and Francis Group LLC. USA.
Sahai, A.S. and S.M. Manocha. 1993. Chitinases of Fungi and Plants : Their Involvement in Morphogenesis and Host-Parasite Interaction. Journal of FEMS Microbiology, 3(11): 317–338.
Schomburg, D. dan M. Salzmann. 1991. Enzyme Handbook 4(Hydrolase Lisozim). Spinger-Verlay Berlin Heidelberg. Jerman, pp. 307-310. Singleton, Paul dan Diana Sainsbury. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology Third Edition. John Wiley & Sons, Ltd. England.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Antar Universitas Bioteknologi. IPB. Bogor.
Suryanto, D. dan Yurnaliza. 2005. Eksplorasi Bakteri Kitinolitik : Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase pada Berbagai Jenis Bakteri dan Pemanfaatannya. USU. Medan.
Ton, N.M.N., M.D. Nguyen, T.T.H. Pham and V.V.M. Le. 2010. Influence of initial pH and sulfur dioxide content in must on wine fermentation by immobilized yeast in bacterial cellulose. International Food Research Journal, 6(3): 743-749.
Tsigos, I., dan V. Bouriotis. 2000. Purification and Characterization of Chitin Deacetylase from Colletotrichum lindemuthianum. J. Biol. Chem., 270: 26286-26291.
Weites, A.M., D.R. Gondim, and L.R.B. Gonçalves. 2001. Ethanol production by fermentation using immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae in cashew apple bagasse. Journal of Biochemistry and Biotechnology, 1(8): 209–217.
Wu, M.L., Y.C. Chuang, J.P.Chen, C. S. Chen, and M.C. Chang. 2001. Identification and Characterization of the Chitin-Binding Domains within the Multidomain Chitinase Chi92 from Aeromonas hydrophila jp 101. Appl Environ Microbiol 67 : 5100-5106.
54
Wu, Y., Hussain, M., and Fassihi R. 2005. Development of A Simple Analytical Methodology For Determination of Glucosamine Release From Modified Release Matrix Tablets. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 38 (2005) 263-269.
Xu, L., Q. Li, and C. Jiang. 1996. Diversity of Soil Actinomycetes in Yunnan, China. Journal of Applied Environmental Microbiology, 62 (1): 244-248.
Yanming, D., Congyi, X.U., Jianwei, W., Mian,W., Yusong, W.U., and Yonghong, R. 2001. Determination of degree of substitution for N-acylated chitosan using IR spectra. Science in Chine. Vol. 44, pp. 216-224.
Yolanda, C. 2014. Penetapan Waktu Inkubasi Optimum Degradasi Kitin Secara Enzimatik Oleh Mucor miehei Dengan Metode Ultraviolet-Visible Spectrophotometry (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Yurnaliza. 2002. Senyawa Kitin dan Kajian Aktivitas Enzim Mikrobial Pendegradasinya. Sumatera: FMIPA Universitas Sumatera Utara
