da;.;
1
?« 1 N.i 5
.,. ,,fs:t.:
BAB III
i:.- . - r ' - ^ - : . .
U.^;,.,,,,-
METODOLOGI PENELITIAN «
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama kurang lebih enam bulan di Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau.
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat Alat-alat
u
• «
"
•
'
< ,
.
.
.
. yang
digunakan
adalah
spektrofotometer
sinar tampak
yaitu
Spektronik Genesis I I keluaran Milton Roy Co. USA (No. Katalog 4001/4); Rotary Shaker (Stuart
Scientific Ingris); Autoklaf A l l American model 1925/KY-23D
(Wisconsin Aluminium Foundry Co. Inc., Manitowoc); Vortex mixer Genie 2 ™ (No. Katalog 12-82); p H meter 210 A Orion, tabung eppendrof; Kertas saring GF/C Whatman (No. Katalog 1882055); Pompa vakum p-169 (Fisher General Scientific Private Limited, Singapura);
Waterbath
thermostat
WK-24 (Shibata
Technologamy Ltd); Corning Sterile Syringe Filter 0.45 |im polysulfone
Scientific
(No. Katalog
6780-2504) dan peralatan biokimia standar lainnya sesuai dengan prosedur kerja.
3.2.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah CMC (karboksi metil selulosa) keluaran B D H Chemical Ltd Poole England (No. Katalog 27929), Avicel keluaran SIGMAAldrich chemical Co. St. Louis,Mo, (No. Katalog 11365), pepton (No. Katalog 1072241000), dan bahan kimia proanalisis atau bahan preparatif sesuai prosedur kerja.
3.3. Rancangan Penelitian Pada penelitian
-.iL^tn:.
ini, optimasi produksi selulase yaitu temperatur
(suhu
inkubasi) dan p H kondisi lingkungan. Temperatur produksi akan diinkubasi pada temperatur kamar dan untuk p H akan dilakukan pada p H 5.5. Penentuan temperatur
15
dan pH optimal dilihat dari produksi enzim dan analisis aktivitas selulase dari isolate T. asperellum T.N.C52, T.N.J63, L B K U R C C 20, dan L B K U R C C 21 dengan metoda Nelson-Somogyi.
•
f
Adapun secara keseluruhan rancangan metoda penelitian dapat dirangkum sebagai berikut : isolat jamur T. asperellum dari keempat jamur diremajakan kembali dalam media padat (PDA). Kemudian ditentukan kemampuan
tingkat produksi
selulase dan aviselase dari jamur T.N.C52, T.N.J63, L B K U R C C 20, dan L B K U R C C 21 secara kualitatif pada suhu 30°C, 37''C, 40"C, SO^C, 6 0 ^ , 70°C, 80°C, dan 90°C serta secara kuantitatif untuk penetuan temperatur dan p H optimum produksi enzim dalam media produksi enzim cair pada suhu kamar (30°C). U j i aktivitas selulase dilakukan berdasarkan kemampuan melepas gula pereduksi dari selulosa. Kenaikan konsentrasi
gula-gula pereduksi yang terjadi dimonitor dengan metode Nelson
Somogyi. Metode Nelson Somogyi menghasilkan larutan berwarna kompleks Cu"^ hasil reduksi oleh glukosa. Larutan berwarna yang dihasilkan diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer
sinar tampak pada panjang gelombang 500 nm.
Bagan rancangan penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.
3.4. Prosedur Penelitian
;^v;„ ,,5i., '^f.^..';; s . / - . s u ,
,
a^i-.L.:-,;.
. -
3.4.1. Pembuatan media padat untuk pemeliharaan jamur Tricoderma
-i
T.N.C52,
T.N.C63, L B K U R C C 20, dan L B K U R C C 21. Media padat Potato Dextrose Agar (PDA) dibuat sesuai bahan-bahan yang ditunjukkan tabel 1. l a b e l 1. Media PDA No.
Bahan
Berat atau Volume
1
Kentang
200 gram
2
Glukosa
20 gram
3
Agar batang
17 gram
4
Akuades
1000 m L
16
Tabel 1 diatas menunjukkan zat-zat yang diperlukan untuk membuat media padat. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut : Kentang sebanyak 200 gram diiris dan dimasukkan ke dalam 500 m L akuades. Campuran dididihkan selama 20 menit dan kemudian disaring dengan kain kasa. Filtrat yang diperoleh dicampurkan dengan glukosa dan agar batang, kemudian ditambahkan akuades hingga volume 1000 mL. Larutan dipanaskan hingga agarnya larut. Media padat untuk pemeliharaan isolat T.N.C52, T.N.J63, L B K U R C C 20, dan L B K U R C C 21 disuplementasi dengan asam sitrat 0.05% (Wahyuningsih, 1998). Larutan asam sitrat dipersiapkan sebagai berikut : asam sitrat 0.025 gram dilarutkan dengan 100 m L akuades, kemudian dipindahkan ke dalam erlemeyer 250 mL yang ditutup aluminium foil. Untuk pembuatan agar miring, 4 m L larutan media agar PDA dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup kapas. Larutan asam sitrat dan media ini kemudian disterilisasi (terpisah) pada tekanan 15 lb, 121°C selama 20 menit di dalam autoklaf. Hal ini dilakukan untuk menghindari hidrolisis agar oleh asam sitrat pada suhu tinggi. Kemudian tabungtabung media dan larutan asam sitrat dimasukkan ke dalam waterbath suhu ± 60"C (supaya agar tidak membeku). Tabung-tabung media kemudian ditambahkan larutan asam sitrat 1 m L secara aseptis. Selanjutnya tabung-tabung tersebut dimiringkan dan larutan media di dalamnya dibiarkan membeku. Media ini dapat digunakan setelah 3 hari, apabila tidak ada tanda-tanda kontaminasi dan tidak ada uap air lagi. Jika media ini tidak langsung digunakan dapat disimpan dalam lemari es pada suhu 4*'C.
3.4.2. Peremajaan j a m u r Jamur stok T.N.C52, T.N.J63, L B K U R C C 20, dan L B K U R C C 21 diambil dengan jarum ose secara aseptis, kemudian diinokulasi pada media padat agar miring. Selanjutnya diinkubasi pada temperatur kamar selama 5 hari.
17
3.4.3. Pembuatan media padat untuk analisis kualitatif selulase dan aviselase Komposisi medium untuk analisis kualitatif selulase dan avilase : Tabel 2. Media selektif Bahan
No.
Berat atau Volume
1.
Kentang
2.
CMC (selulase) atau avisel (aviselase)
20 gram
3.
Agar batang
17 gram
4.
Akuades
Media padat selektif dipersiapkan
200 gram
1000 mL
sebagai berikut : kentang diiris tipis dan
dimasukkan ke dalam 500 m L akuades. Kemudian dididihkan selama 20 menit dan disaring menggunakan kain kasa. Filtrat yang diperoleh dicampurkan dengan CMC atau avisel dan agar batang yang telah ditimbang. Lalu akuades ditambahkan hingga volume 1000 mL. Larutan dipanaskan sampai agarnya larut. Cawan petri dan media yang telah dibuat disterilisasi pada tekanan 15 lb, 121°C selama 20 menit di dalam autoklaf. Setelah disterilisasi ditambahkan asam sitrat 0,05% yang telah disterilisasi sebelumnya. Larutan dituangkan ke dalam cawan petri sebanyak ±30 m L . Setelah media agarnya keras, cawan petri dibalik dengan tujuan agar uap air yang terbentuk mengering. Media dapat digunakan apabila tidak terdapat tanda-tanda kontaminasi setelah dibiarkan tiga hari dan tidak terdapat uap air.
3.4.4. Pembuatan media cair untuk produksi enzim selulase dan aviselase Media cair yang digunakan untuk produksi enzim selulase dan aviselase dari jamur T.N.C52, T.N.J63, L B K U R C C 20, dan L B K U R C C 21 dibuat dalam 1000 m L buffer asetat 0,05 M p H 5,5.
18
Table 3. Bahan-bahan pembuatan media cair No.
Berat atau volume
Bahan
1
NH4H2PO4
8 gram
2
Na2HP04
7 gram
3
KH2PO4
4 gram
4
CaCl2
1 gram
5
MgS04
1 gram
6
Pepton
0,1 gram
7
CMC (selulase) atau Avisel (aviselase)
8
Logam runut
10 gram 20 mL
* Logam runut: FeS04.7H20
: 0,25 gram
MnS04.H20
: 0,08 gram
ZnS04.7H20
: 0,07 gram
Ketiga logam ditimbang dan dilarutkan dengan 1000 m L . (Fekete dkk., 2007) Setelah media larut, lalu dimasukkan ke dalam erlemeyer dan disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 15 lb, 1210C selama 20 menit. Media diinkubasi selama 1 hari untuk melihat tanda-tanda kontaminasi. Media siap untuk ditanami. n •
' . I
3.4.5. Produksi enzim selulase dan aviselase Spora
dari
jamur
Trichoderma
(T.N.C52,
T.N.J63,
LBKURCC
20,
L B K U R C C 21) yang telah tumbuh pada agar miring ditambahkan akuades steril ± 3 mL dan dikerok menggunakan jarum ose. Suspensi jamur yang diperoleh disaring menggunakan OD660nm
glasswoll
yang telah disterilkan. Sebagian dari suspensi diukur
uutuk mcnentukau konsentrasi spora/ml. Suspensi jamur diinokulasikan ke
dalam masing-masing media cair produksi enzim yang disetarakan spora ~7xl0'^(OD660nm/0,34 m L ) (Sawitri, 2010). Rumus : ODeeonm sampel
19
^ ^
sehingga jumlah
Setelah diinokulasi, media kultur cair diinkubasi selama waktu optimum dengan meletakkan dalam rotary shaker dengan kecepatan 150 rpm. Media kultur yang telah diinkubasi, diisolasi ekstrak kasar enzim dari media kultur tersebut (media produksi enzim). Media kultur didinginkan di dalam lemari es selama 1 jam. Media kultur yang mengandung enzim dipisahkan dari janur menggunakan sentrifiigasi (dalam keadaan dingin) dengan kecepatan 9500 rpm selama 10 menit. Supematan yang diperoleh disaring dengan filter glass fiber (Whatman GF/C) dan disterilisasi menggunakan
filter
polysulfone
0,45
\im.
apabila
tidak
langsung
digunakan,supematan enzim ditambahkan NaNs dengan konsentrasi 0,02% (sebagai bahan pengawet).
3.4.6. Penentuan aktivitas enzim selulase dan aviselase dari jamur T.N.C52, T.N.J63, L B K U R C C 20, dan L B K U R C C 21 Untuk penentuan aktivitas enzim sampel, substrat (CMC dan avisel) yang telah dilarutkan dalam larutan buffer asetat 0,05M p H 5,5 dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 0,5 m L selanjutnya diinkubasi dalam waterbath selama 5 menit. Tanpa mengeluarkan tabung reaksi dari waterbath, 0,5 m L larutan enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi tersebut dan ditutup dengan aluminium foil. Larutan diaduk dengan hati-hati dan diinkubasi selama 1 j a m dalam waterbath (40'^C) atau 24 jam suhu kamar sambil sekali-sekali diaduk pelan. Setelah diinkubasi, kerja enzim dihentikan dengan menambahkan 1 m L reagen Nelson-Somogyi. Sebagai kontrol, tabung reaksi diisi substrat (CMC atau avisel) yang telah dilarutkan dalam buffer asetat p H 5.5 (0.05M) tanpa enzim yang diinkubasi dalam waterbath (40°C) selama 1 j a m suhu kamar, dan setelah inkubasi ditambahkan 1 mL reagen Nelson-Somogyi. Kemudian baru ditambahkan 0.5 m L larutan enzim. Perlakuan selanjutnya sama dengan sampel. Sebagai blanko untuk sampel dan kontrol, pada tabung reaksi ditambahkan buffer asetat p H 5.5 (0.05 M ) sebanyak 1 m L , lalu ditambahkan 1 m L reagen NelsonSomogyi. Setelah sampel, kontrol, dan blanko ditambahkan reagen Nelson-Somogyi, tabung-tabung ditutup dengan kelereng. Tabung-tabung tersebut dipanaskan dalam
20
penangas air yang mendidih selama 10 menit. Setelah tabung-tabung didinginkan hingga suhu kamar, di dalam tabung ditambahkan
tersebut
1 m L reagen
arsenomolibdat, dihomogenisasikan dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, ke dalam setiap tabung ditambahkan 7 m L aquadest. Larutan dalam tabung-tabung reaksi tersebut
diaduk menggunakan
vortex
dan didiamkan selama 30 menit.
Kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No. 1 apabila terdapat endapan pada larutan. Sebagai standar, dibuat larutan glukosa dengan berbagai konsentrasi yaitu antara 0,03 mg/mL sampai dengan 0,1 mg/mL dengan metode Nelson-Somogyi. Absorbansi masing-masing larutan tersebut diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 500 nm.
3.4.7. Perhitungan aktivitas enzim Dari data absorbansi
yang diperoleh, dapat ditentukan konsentrasi gula
pereduksi yang dihasilkan. Aktivitas enzim diketahui dari gula pereduksi yang dihasilkan permililiter (^imol gula pereduksi/mL menit'').
Aktivitas enzim =
|.imol gula pereduksi sampel — \xmo\ gula preduksi kontrol ; z ; z :—; volume ektraks enzim x w a k t u inkubasi X fimol gula pereduksi m L menit
= X unit/ml ekstrak kasar enzim Satu unit ( l U ) enzim selulase adalah banyaknya enzim yang dilepaskan 1 fimol gula pereduksi permenit.
3.5. Analisis data Data dari hasil uji aktivitas enzim dianalisis secara statistik dengan analisis ragam dan dilanjutkan dengan uji Duncan Jarak Berganda (Duncan's Multiple Range Test) pada taraf 5%. Dari data indeks selulolitik dibuat tabel indeks selulolitik.
21
