g4t$ US
w
s3
t';:JC.t t B YAt..,:, .\O.2. 2t)o(t
lsolasibertahapdan identifikasiisolatbakteritermofilik
pendegradasi minyakbumidarisumurbangko Aditiawati, Astuti MeggaRatnasari Pikoli,Pingkan danDeaIndriani Jurusan Biologi, lnstitut TeknologiBandung,Labtek XI ltn. lV, Jln. Ganesa No 10. Bandung 40132
[email protected];
[email protected] e-mail:
[email protected]; Masirk:Februari2000:revisinrasuk:Juni 2000:diterima:Uesember2000
Sari Tclatr tlilakrikan isolasi bakteri temrot'ilik pendegradasirninyak brrtni dari Surnur Bangko dengan cara bertahapkarena proseclur secaralengkap.Isolasi tahapI dilakukan langsungdai crude oil di isi.;lasr biasa belum tentu dapatmengisolasibakteripendegradasi dalam medium basal Stone Mineral Salt Solution ditambah ekstrak ragi (SMSSe) pada 50"C. Isolasi tahap II dan III dilakukan dari sumber-isolatyang sama,medium basal dan kondisi kultur yang sama,tetapi medium pengisolasidiperkayadcngan minyak sisa degradasi (MSD) isolat campuran tahap sebelumnya.Pada tahap I diperoleh 4 isolat, yutu Bacillus polytnyxa, B. lichenifonnis, Bacillus sp.1, dan Pseudomonasaeruginosa;pada tahap II diperoleh3 isolat, yutu Bacillus sp.2, B. stearothermophllus,dan B. brevis; seAangkanpada tahap III hanya diperoleh i isolat, yaitu B. coagulans. Semua isolat ini nantirrya digunakan untuk mendegradasi crude oil. iiura kwtti.' bakteri;degradzsi;isolasi;isolasibertahap;minyak bumi.
Abstract A sequential isolation and isolate identification of thcrmophilic oil degrading bacteria from bangko reservoir A strrily(,rrthe isolaliorro1'tlierinuphrlicoil dcgialirrgLactcrialium thc cruclcoil (pelroleuni)of Ban3korcscrvoirhas bccn
'I'he first isolationstage ccnducbd u;r a scquentialwa-v.The converitionalisolationproceduredid not rsolatethe bacteriacolnpletely. was performeddirectly on the cmde oil sampleby using StoneMinelal Salt Solutionplus yeastextract(SMSSe),as basalmedium,at 50"C. The secondand third isolation stagesused the samesource,basalmediunr,and condition as the ilrst stage,but were enriched with a depleted-oilobtained from the crude oil degaded from the previous stage'smixed culture bacteria.Four bacterialisolates were reco.;eredfi'om the first isolation stage,identifled as Bacillus polynryxa,B. Lichetifonnis,Bacillus sp.l, and Pseudomonas aentginosa.The secondstagegave anotherthree differentbacterialisolates,identifiedas Bacillus sp.2,B. stearothennophillus,and B. brevis, *,treLeaithe thir"rl stage gave only one isolate namely llucillus t:oagLtlans.These isolates could be applied for the degradatioirof crudeoil. Ke.ywords:bacteria; crude oil; degradation; isolation; sequential isolation.
1. Pendahuluan Isolasi bakteri dari surulr rninyak bumi rnenghasilkiut isolat bakteri pendegradasiminyak bumi yang digunakan untuk meningkatkan perolehan minyak bumi dengan memanfaatkankemampuanmikoba (MEOR = Microbial Enhanr:edOil Recovery).Bakteri pendegra-dasiminyak burni ini merrghasilkanbioproduk seperti asam lemak, gas,srrrFaktari, rlan biopolirneryang dapat mr.ilingkalkan polusitas dar peilncaliilitas batuaii reservoir tbfirtasi klastik dan karbonat I7l. Pada prinsipnya, MEOR dilakukan denganmeningkatkanjumlah dan kemarnpuan bakteri in sim dan ex .\itu dalam sumur minyak. Isolat untuk hasil isolasidari surnurruinyakjuga dikernbangkzur hioremediasilingkungandan limbah minyak bttmi, baik
di air maupun di darat, sehingga keberhasilanisolasi bakteri dari sulnur minyak secara lengkap sangat dibutuhkan. Prosedur isolasi bakteri yang lazirn dilakukan biasarya hanya dapat mengisolasi bakteri pendegradasi minyak bumi yang rnendominasikultur, yailu bakteri yang rnulaurula menggunakan kornponen minyak yang rnudah terdegradasisehinggamalnpu mencapaikonsentrasiscl finggi dcrrganccpat. Isolat tcrscbutbiasanyamenrpakan pengoksidasi alkana normal karena komponen ini rlcndomirrasi ketlanyakanmrnyak burni, lebih mudah larut dalam air, dan terdifusr ke dalam membran scl bakteri [4,6,8]. Bakteri pendegradasikomponenminyak yang lebih sulit didegradasiberjurrrlahlebih sedikit dan
I'Ri](. i'tLt,\/()l J2,idu ),2a00
54
tunrbult lebiii larntiat kari;iia k-aiah bersaing dengan pendegradasi alkanayartgrnemiliki substratlcbih banyak dan lebih rrrudahdidegradasi.sehinggabakteri ini sulit terirolasr. Pt:ran bakteri ini sebenarilyapentirrg dalam melaksauakanuegradasi kornporrenmirryak lairr yang sulit dide.gradasi [.11. Bakferi penriegradasi kourpoiren rninyak yang sulit didegrada.siini dapat diperoleh dengan rnemanfaatkan kompcrrrenniinyak buini yang masih ada setelah perturnbrrlrairyarrg lcngkap hakteri pendegradasiawal [31. Oleh li:irena im, unluk memperolehisolat bakteri yang lehih lcngkap l;rituk rnenghasilkandegradasitotal minyaii hriiriri valrg lebih besar, isolasi bakteri pendcgiadasii.t.rri',ili bumi tiilakukan secara bertahap
dan III dilakukar-rdengan prose.dur dan kondisi yuiig sama,tetapi mediurnpengisolasinya(SN,'lSSc) diperkaya denganrninyak sisa tlegradasi(MSl)) tahap srbclumitl,a Isola.sitahapIl menggunakanMSD I, sedangkanisolasi tahapIII menggunakanMSD II. Prosedurisolasi baktcri secara bertahap dari minyak bumi secara garis besar dipedihatkan pada gambar I dan prosedur pemrrnian bakteri tahap I, II, dan III dapat dilihat pada gambar 2. Isolat bakteri yang diperoleh kcmudian diidentifikasi melalui pengamatanmorfologi koloni, sel, dan sejumlah uji biokimia [21.
t-{1. Isolasi fritLiii! ,.'iiir"i br:rlahapini teiah dilakukan oleh I{orowitz.(197;,) [4] dari ininyak burni dan rnenghasilkan seluirriuh isiilat yang bekerja secara bertahap, terganrung paJi keliralnpuailnyaurenggunakankomponen r-Ixnlakbtiri,i .laii ya.ligmudah sampaiyang sulit terdegratlasi.Ist,iasr takteri secara konvensionaltelah dilakukarrdari rixlyak burni suritur Bangko pada tahun 1997 dair l.rlah dipastikan bahwa fi)ntoh rninyak bumi dari sururii tlaiigko rirengandungbakteri yarlg rriarnpu mendegrada.sirniny,ak bumi. Unluk incningkatkan keunmpuarr degradasinya, dilaki.rkan isolasi bakteri secarabertahapagar cliperolchisolat lail yang bcrperan dalam rangkaian degradasi selain yang sudah diperoleh dan diketahuiunrtankerja dari mikroba hasil isolasi.
Gafllbar 1 Bagan pros€dur isolasi bakleri secara beriahapdari minyak bumi
--' - -r-{ T**-m P4 "sude ofl" Eongko I I
(tidakdklerill /
/ t \
tr,,rr",u*,, {'-J
I
kocok $0"C.3- 7 h(}ri
-"-*--'1*-"---""'--f"-"" - - -t
2. Metodtilogi hdd kd3
h
h6i k{}.s
ftari ke 6
lhri k&7
Isolasi dilakukan dalali; 3 fatrap,ile:nlj;n nicnggunakan sarnpelminyak bwri (crude oll) dari surnur Bangko, Sumaterasobagai ,qurtrberisolat. Medium basal yang digunakan atlalahStcrzelr4incral Salt SoLution(SMSS) yang terdiri atas 5 g CaCO:; 2,5 g NI{aNO3; I g Na2HPOa dan TH:O; 0.-5g KftrPOa;0,5 g MgSOa.TIIzO; g [4nt-)l2."itr\'O :rallg iiilanrtkan di dalain I liter 0,2 akuades t5l" r,k-rtiak rtegi sebirnliak 0,017o (b/v) kr rialarrirnediuniSMSS sebagaisurnberN ditarrrbahkan dalam berrtuk asanr amino dan grov,th factor tambahan. N{ediuin StuISS yang mengandung ekstrak ragi ini selanjutnya discLtut SMSSe untuk rnernpermudah penyebutannya.Ke tlaiarn mctlium tersebutditambahkart minyak bnmi sebanyak2c/o(b/v) sebagaisumber karbon. pH rnediunrini adalah6,8-7. Isolasi tahap I didahului dengan pengocokan2Vo (blv) crude ctil di dalant rnedium SMSSe selama7 hari dengan kecepatan 120 lpm" Untuk keperluan isolasi, pengambilancontoh diantlil setiap hari, kemudian isola.si dilakukan deirgan metode pengenceran.Contoh diambil sebanyak I ml untuk dibiakkan di atas lempeng agar SMSSc yang rrrengandung cntde oil
Gambar2 Prosedurisolasidan oeniurnianbakt€ritahaDl. ll. dan lll
3. Hasil dan Pembahasan Isolat bakteri yang diperoleh secarabertahapdari minyak bumi Bangko di dalam medium SMSSe dengan kecepatanpengocokan 120 rpm berjumlah 8 isolat, yaitu 4 isolat dari tahap I, 3 isolat dari tahapII, dan I isolat
PROC ITB, V]L. J2, Nu. 2, 2000
qlalttiwnittulrilt:tltlr;tt:t)*ttiittltt:itt4ttll;4itttit::r/z
ls">lat lXrZ (..tttiiltr),t B,ttlrtltfutt*xlthilla| y
|trr:t* l1-l {l}adllwr vp.71
!,it1;;i:ti:.1i. ji4;:;i:ttitii;i:::M,&iii:m
1**1*tlltr t&$ttllws 1000x) Gambar3 Fotoisolatbakleripendegradasi rrinyakbumi(perbesaran Tabel 1 Karaklerislikkoloniisolatbakleri
BeVasl
Warha
P€rfiiukaah
Lobate
Raised
Kuning
Kasar
Kuning
Kasar
lsolal
Berltuk
T€[i
t_ |
Irregular
t'2
Irregular
Lobate
Raised
| -'l
Circular
Entire
Pulvinate
Bening
M€ngkilap
t4
Circular
Serrate
Flat
Hijau
Kasar
il-1
Circular
Undulate
Raised
Putih
Mengkilap
|-2
Circular
Llndrtlate
Convex
Putih
il-3
Irregular
Lobate
Raised
Krem
Kasar
ill
Circular
Entire
Convex
Coklatmuda
Mengkilap
_-. [glq]rup _
padaagarnutrisipadasuhu40" C selama24 jam Keterangan : Koloniyangdiarnatiadalahkoloniyangditumbuhkan
lrregulitr Circulur
r.k'
tobuie : l*, Enire Serrute
RerAcj
.
PulvinLte
*j I;lut
.
b
Und.ukrte hj
",.;* :
{-"\
&,N
Oorrt.x th
56
dan tahap iii. [sril;;ayrrlg drl,crili{:hparla mhlgr i arialali (isolat f-i), 14izr:illuslir'ltentformis Badllus yt:tL-,;trr1,Nt (isolat 1"2), fi;tnll.ul sp I iisolat I--l), ri;in P,reuilomonas (r:rolati .{); pailauiirapil Srtt'il.lulsp.2(isolat aeni.girr.ii.tir LI-l). ItatiLks .\t(;lrothernrophLlu,t(isaiat II-2), dan BaciLutslii'cr'ls (isolat II-3).; sedangkanpada tahap iII hanyadipeirrleirI isolat" yult Bacillus coagulans(isolat III). Gaurbar3 rll$l'liuukkan keoelapanisolat tersebut. Pada Tri;cl I ilirrngkapkantrahwa isolat I-1 dan t-2 tamlraksemlla, yaitu memiliki bentuk koloni yang tidak beraturaii\trrt:grtkt.r'),tepi lobate, berwarnakuning, dan penrrukaair yarig kasar, tidak mengkilap. Apabila kedua isolaf tersct,ut diainati secara lebih saksama,terutama bila pongamatan dilakukan dengan menggunakan mikrrrskuirlxrlerrsa obyektif 4 kali, kedua isolat tarnpak memilrki 1;rlhodatrnlrentuk koloni pada elevasi, Kcdua isolat sarira.rJrrlaitei]riliki elevasi yang naik (raiser[) mulai tlari tepi koloni, tetapi ketnrdiair nrenurtrnpada bagian tengah koliini svliinggakoloni lainpak nrerniliki lingkarandi tcngrr"hny.a" Pengamatandengan ntcnggunakan mikrr.,skophedensa obyektif 10 t
Plrt),
t :i,, \ ( i:
t:, ,t:I
'
?t)ti('
bersairtgdenganporidflgiadasialkarra)eiii: ii:iriir inuiJr:fu didegradasi[4]. Isola,si tahap II dan III ditujukan urituk mernperoleir bakteri pendegradasikornponenlain yang trdak donurran di dalam crude oil karena peran bakteri iui dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon di alam tetap penting,meskipunjumlahnya sedikit. Pada isolasi tahap II dan IlI, sumber isolat yang dipakar tetap berasal dari crude oil. Di dalam cntde oil mernangterdapatberbagai bakteri pengguna senyawa hidrokarbon yang berbeda, meskipun tidak senruanyadalam keadaanaktif [5]. Pada isolasi tahap II, rnediurn agar SMSSe yang diperkaya deuganminyak sisa degradasitahap I (lvISD D ditumbuhi beberapamacam kitloni. Koloni yang telah dimrrnikan kemudiantlinrrnbuhkankembali pada lempeng agar nutdsi dan diamati denganrnenggunakannrikroskop berlensa cibyektrf 4 rlau 10 kali. Setrlah rnerrfblogi koloninya dibandirrgl"andeiigarrrnorfblogr ktiioni isolat tahap I, baru dapat diyakini bairwa isolat yarrg bei'beda dari isolat tahapI menrpakanisolat tahapII. Pada pengamatansecara sepintas, koloni isolat II-3 rneilyeiTpiilis.;lat I-1 tlan i-2, yaitii tliiJairrltal bentuk" tepi, elevasi,dan permukaaixlya.Apahila
Fanjehg Gram rrr, etbk ,' Bbnliik,, lsolal Benluk:rr bndobpora endospora {ilm} " t-1 Batang 2 - 2 . 5 Positif Terminal Elips l:2 Balang 1 , 5- 2 , 3 Positif Sentral Elips J Negatif Terminal t-3 Batang Elips l-+
lr-l |-2 il-3 ill
Batang pendek
nq-1
Batanq 2 - 2 , 5 Batang Batang 1 R - r e Batanq 2 - 2 , 5
Keterangan:
Negatif
Tidak ada
Positif Senlral Elips-bulat Positif Terminal Elips Positif Sublerminal Elips-bulal Posilif Terminal Elips
Sel yang diwarnaiberumur24 jam,lerminal= di * di antaraujLingdan ujungsel;subterminal tengahsel; sentral= di lengahsel;elips= bulat telur
PROi r) B, \tOL.32, NO. 2, 2Un
JI
Tabel 3 l"iasilr"rjibiokirnrapada isolatbakteri Uji biokimia
lsolal bakterihasillsolasipada suhu 50"C 1"1
t-z
t -'l
li
il-1
il-3
ll-2
Glukosa
+
+
+
+
Laktosa
+
+
+
+
+
ill +
Dekstrosa Pali
+
+
L€mak
J
+
Kas€in
+
Gelatin
TSIA
Asam
+
+
+
+
Asam
Asam
+
+
Alkali
+
+ +
Alkali
+
Asam
Alkali
Asam
lndol
MR
+
VF $. Sitrat
+
FIaS Motilitas
+
Nitrat tleaksiLttmus
+
Asam
+ +
+
+
+
Reduksi Asam,gas,reduksiProieolisis Asam litmus oan curo
+
Tidak b€rubafi
Reduksi Asam gas, reduksi litnrus dan cLJrd
Keteiatigan : Sirhupengirjian 40"C selama24-48jan, + = hasilreaxsipositif;- = lrasilreaksinegatilsesuaiderrganproseduruji biokimiasecaramikrobiologis(2). Curd= dadihyangterbentukkar€napresipitasikaseindi dalam susu.
Pengamatanselanjutnyadilakukan pada karakteristik sel setiap isolat, yaitu melalui preparat yang terlebih dahulu diwarnai. Pengamatanpada senlua preparat (Tabel 2) menunjukkan bahwa semua isolat merupakan bakteri batang.Ilan4iir serrruaisolal iirerupakanbakleri Grarn positif. Istllat t-4 tampak sangat berbeda dari isolat lainnya karena nrerupakan bakteri Grarn negatil berbentukbatang pendek, tidak memiliki endospora,dan bemkuran sangat kecil, bahkan hampir menyerupai kokus. Isolat pada scnlra tahap rnernihki errdospora,kel:uali isolat I-4. Sel Gram positif berspora tersebutdiisolasi secara aerob; jadi, genus bakteri berspora ini adalah Bacilhts. Isolat I-3, meskipun terwamai Gram negatif, tetap menrpakan Racillus karena cukup memenuhi ciriciri pcnting Bticillus. Bacillus rnerupakan bakteri berbentukbatang, merriliki endospora,dan rnen4rakan setu-siltunyabakteri batang yailg aerob, sedangkan golongarr tsacillaceae batang berspora larnnya bersifat (Sporolactobacillus) atau anaerob mikroacrofilik (Clostidium) |1. tiasil u.;i triokinria yarig diperlihatkan pada Tabel 3 memperkuatdugaan bahwa kedelapan isolat merupakan spesics yar;g burtreda-bedaSetiap rrrikroba nierriiliki karakteristik biokimia tersendiri yang disebut biochenicalfingerprints. Perangkatini dikendalikanoleh aktivitas enzimatis sel dan bertanggung jawab dalam biosintesisdan biodegrada.si [2].
Dua isolarbakteri dari gerrusBacillus"yainr I-3 dan II-1, belurn berhasildiidentifikasi sampai spesies.Enarn dari kedelapan isolat telah berhasil diidentifikasi sampai spcsiesberdasarkanperbedaankarakteristiknya,terutama dari liasil uji biokimia, yarrg berpanduanpada buku Bergev'sManual of DeterminativeBacteriolog"y[1].
4. Kesimpulan Isolat bakteri yang diperoleh dari minyak bumi Surntr Bangko yang diisolasi secara t'ertahap dengan nrenggunakannredium SMSSe (Stone fuIineral Sah Solution yang mengandungekstrak ragi) adalah Bacillus polynryxa, B. Iichenfornis, Ilacillus sp.1, dan Pseudomonas aeruginosa,dari TahapI; Bacillus sp.2,B. slearoiherrnophillusdan B. brevis dari Tahap II; dan B. coagulans dari Tahap IlL Terisolasinyajenis bakteri yang berbeda pada setiap tahap isolasi menunjukkan bahwa sernua isolat bakteri yang diperoleh rnemiliki kemampuan menggunakan komponen yang berbeda di dalarncrude oil.
5. Ucapanterinrakasih Peruilis rrrerlgucapkarr terirna kirsih kcpada LIRGE dan Center Grant Jurusarr Biologi 11B 1997ll99tt atas bantuanbiayapenelilian.
PRoC.r'r'ts.v0t,. 32.Na.2.7M{)
58 6. Dattar Pustaka l.
Bucharan,R.E.& Gibbons,N.E.,Bergey'sManual af DetermirtativeBacteriology,The William and (1974). WrlkinsCo..Baltimore. 529-550
2. Capuccino,J.G. & Sherman,N., Microbiology:A lnboratory Marural, The Benjamini Cummings Publishing Co.,Inc.,California,19-179 ( 1987). J.
A
Harayanra, S., Sigiura K., Asaumi,M., Shimauchi, T., Goto, M., Sa.saki,S. &. Ishihara M., Biodegradationof Crude Oil, dalamProgram and Absvatcs in the First Asia-Pasific Marine Biotechnul.ogyConference,Shimizu, Shizuoka, Iapan,19-24 f i995). Horu)ri'ltz.A., Gutnicl! D. & Rosenberg,E., Seque.irtia-l Grovrthof Bacteriaon Crude Oil, Appl. Micrabittl.30(r) , l0-19(1975).
5 . Sharpley,
Elementary Perolewnt J.M., Miuobiology, Gulf PublishingCompany,Texas,6.5-
9s,lls-117(1966). 6. Sigiura, K., Ishihara, M.. Shimauchi,T" & Harayama, S., PhysicochemicalProporties and Biodegradability of Crude Oil, Environ. Sci. Technol.3l (1997), 45-51. Tarner, R.S., Microbial EnhancedOil Recovery from CarbonatesReservoirs,Geomicrobiol.J., 9, (i991). 169-195 Walker,J.D. & R.R. Colwell,MicrobialPetroleum Degradation: Useof Mixed HydrocarbonSubstrates, (1974) Appl.Microbiol.27(6), 1053-1060
